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Encephalitides induced by lyssa-, borna- and astroviruses: molecular detection and characterization

  • Encephalitis is a severe inflammatory disease of the brain which often has a fatal outcome or can lead to subsequent damages. In around two-thirds of all human encephalitis cases, the causative agent is, despite improved diagnostics, unknown today. Aim of this work was the development, improvement and validation of diagnostic methods, improvement of sampling strategies and the development of optimized systems for characterization of three viruses causing viral encephalitis. The main burden of RABV lies in developing countries, were standard diagnostic tools are often not realizable. Therefore, simple and rapid diagnostic tests for the use under resource limited settings, so called point-of-care tests (POCT), are favorable. Commercially available lateral flow device (LFD) based immunodiagnostic tests were analyzed and failed in terms of sensitivity compared to the standard FAT and RT-qPCR (Paper I). Therefore, molecular RABV alternative targeting genome tests were developed and combined with rapid nucleic acid extraction methods. The new HighSpeed RT-qPCR and RPA assays together with magnetic bead based automated or manual extraction methods delivered a specificity between 100% and 97.2% and a limit of detection of 10 or 1,000 genome copies per reaction, respectively and seem suitable as novel POCT (Paper II). Recently, a novel zoonotic VSBV-1, responsible for fatal encephalitis of three squirrel breeders, was detected. For further investigations of this new virus, methods for an in-vivo sampling approach of squirrels were established. They were useful to identify animals harboring this dangerous virus, and new sequence data could be obtained from the VSBV-1 positive animals. Until now, 3.5% of all investigated squirrels were VSBV-1 RNA positive and two subfamilies (Sciurinae and Callosciurinae) are affected. The pathogen occurs not only in Germany, but also squirrel holdings and zoological gardens in the Netherlands and Croatia were tested positive, indicating a serious human health threat of this virus (Paper III and IV). With the help of a metagenomic approach, astroviruses were detected to be associated to encephalitis in cattle and sheep. These viruses were detected in a cow in Germany (Paper V), and in brain samples from two sheep in the United Kingdom (Paper VI). In both cases, the sequences generated by high-throughput-sequencing (HTS) were confirmed by specific RT-qPCRs, which could be used for subsequent screening approaches. Together, methods for the detection of three different encephalitis viruses were developed, validated and applied for different sample material.
  • Die Enzephalitis ist eine entzündliche Erkrankung des Gehirns, die oftmals tödlich verläuft oder Folgeschäden hervorruft. Trotz verbesserter diagnostischer Methoden wird auch gegenwärtig bei zwei Drittel aller Enzephalitiden die Ursache nicht ermittelt. Ziel dieser Arbeit war es, für drei mit Enzephalitis im Zusammenhang stehende Viren Nachweisverfahren zu entwickeln, zu verbessern und zu validieren, Beprobungsmethoden zu verbessern und Systems für die Viruscharakterisierung zu optimieren. Die Standardmethoden der Tollwut-Diagnostik kommen in Entwicklungsländern oftmals nicht zum Einsatz. Abhilfe könnten so genannte „point-of-care tests (POCT)“ schaffen, welche für den schnellen und einfachen Feldeinsatz konzipiert sind. Ein Beispiel sind lateral-flow-device (LFD) basierte immundiagnostische Schnelltests. Diese wurden in einer Studie hinsichtlich ihrer Performance untersucht, wobei sich erhebliche Schwächen in der Sensitivität zeigten (Paper I). Daher wurden molekularbiologische POCT entwickelt und zusammen mit angepassten Magnetpartikel-basierten Schnellextraktionsverfahren getestet. Die entwickelte High-Speed RT-PCR und die recombinase polymerase amplification (RPA) lieferten eine Nachweisempfindlichkeit von 10 bzw. 1.000 Genomkopien pro Reaktion und eine Spezifität zwischen 100% und 97,2% (Paper II). Als weiteres Virus wurde das kürzlich neu entdeckte VSBV-1 untersucht, welches für die tödliche Enzephalitis dreier Bunthörnchenzüchter verantwortlich ist. Um die Verbreitung dieses Virus innerhalb der Hörnchenpopulation untersuchen zu können, wurden zwei in-vivo-Beprobungsmethode etabliert. Unter Zuhilfenahme dieser Methoden konnten mehrere VSBV-1-Infektionen in Hörnchen (aus den Unterfamilien Sciurinae und Callosciurinae) in Privathaltungen und Zoologischen Gärten in Deutschland, den Niederlanden und Kroatien identifiziert werden (ca. 3,5% aller beprobten Hörnchen). Dies weist auf eine ernstzunehmende Gefahr der Übertragung des Virus auf Menschen hin (Paper III und IV). Des Weiteren wurden mithilfe von high-throughput sequencing (HTS) und Metagenomanalyse zwei neue Astroviren identifiziert, die einen Neurotropismus anstatt der bekannten gastrointestinalen Pathogenese aufweisen. Dies betraf einerseits eine Kuh (Paper V) und andererseits zwei Schafen (Paper VI). Zur Charakterisierung wurden spezifische RT-qPCR Systeme sowie eine in-situ Hybridisierung entwickelt und eingesetzt. Zusammenfassend konnten neue Methoden zur Detektion und Charakterisierung von drei unterschiedlichen Enzephalitis-Viren entwickelt, validiert und für unterschiedliches Probenmaterial angewendet werden.

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Metadaten
Author: Kore Schlottau
URN:urn:nbn:de:gbv:9-002853-1
Title Additional (English):Encephalitides induced by lyssa-, borna- and astroviruses: molecular detection and characterization
Title Additional (German):Enzephalitiden induziert durch Lyssa-, Borna- und Astroviren: Molekulare Detektion und Charakterisierung
Advisor:PD Dr. Rainer G. Ulrich
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2017/07/26
Granting Institution:Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät (bis 31.05.2018)
Date of final exam:2017/07/17
Release Date:2017/07/26
Tag:Astrovirus
GND Keyword:Bornavirus, Encephalitis, Tollwutvirus
Faculties:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie
DDC class:500 Naturwissenschaften und Mathematik / 570 Biowissenschaften; Biologie