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Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung von Methoden zur absoluten und relativen Proteinquantifizierung. In darauf aufbauenden Studien sollten diese Methoden für die Untersuchung physiologisch relevanter Fragestellungen in Bakterien genutzt werden. Zum tieferen Verständnis der Bakterienphysiologie ist es unabdingbar, Mengenänderungen von Proteinen hochaufgelöst darstellen zu können. Relative Proteinquantifizierung erlaubt dabei die Untersuchung von Änderungen der Menge eines Proteins zwischen verschiedenen Proben eines Experiments. Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit wurden 2D PAGE und gelfreie massenspektrometrische Methoden in einer Studie (Tefon et al. 2011, Artikel I) angewendet, um Oberflächen- und Immunoproteine zweier Vakzinationsstämme des humanpathogenen Bakteriums Bordetella pertussis zu charakterisieren. Die relative Proteinquantifizierung erlaubt zwar Rückschlüsse auf die Mengenänderung eines Proteins zwischen verschiedenen Bedingungen, ermöglicht aber nur bedingt Aussagen über die absolute Menge der Proteine. Gerade absolute Proteinmengen und damit Proteinkonzentrationen sind jedoch Grundvoraussetzung für ein zielorientiertes Verwenden der gewonnenen Daten nicht nur im Kontext der Systembiologie. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, in der durch Kombination zweier etablierter Proteomik-Methoden die absolute Quantifizierung für einen großen Teil der cytosolischen Proteine eines Organismus ermöglicht wird. In dieser Methode werden ausgewählte Proteine, deren genaue Konzentration durch gerichtete Massenspektrometrie bestimmt wurde, für die Kalibration von hoch auflösenden 2D Gelen genutzt (Maass et al. 2011, Artikel II). Um das Potential dieses Verfahrens zu verdeutlichen, wurde es für die Analyse der Anpassung von Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus an Glukosehunger angewendet. Dabei konnten für 467 Proteine von B. subtilis in drei Zeitpunkten Proteinkonzentrationen bestimmt werden. Für die Etablierung der Methoden waren verschiedene Vorarbeiten nötig: I) Selektion geeigneter Kalibrationsproteine, II) Selektion geeigneter Standardpeptide und Optimierung der massenspektrometrischen Parameter zu deren absoluten Quantifizierung, III) Selektion eines geeigneten, proteinunspezifischen und hoch sensitiven Gelfarbstoffes, IV) Testung verschiedener Zellaufschlussmethoden und Etablierung einer Methode zur Bestimmung der Zellaufschlusseffizienz, V) Testung verschiedener Proteinbestimmungsmethoden zur genauen Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration im komplexen cytosolischen Extrakt und VI) Optimierung der vollständigen enzymatischen Spaltung aller Proteine vor der massenspektrometrischen Analyse. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass sich die Kalibration der 2D Gele für die Ermittlung absoluter Daten zwischen Gelen übertragen lässt, was den Aufwand für große Zeitreihenexperimente deutlich reduziert. Die Genauigkeit und der dynamische Bereich 2D-gelbasierter relativer und absoluter Proteinquantifizierung kann durch eine erhöhte Reproduzierbarkeit, Auflösung und Sensitivität der Gele verbessert werden. Die Etablierung von HPE-Gelen führte zu 25 % mehr detektierbaren und damit quantifizierbaren Proteinspots und Proteinen bei deutlich erhöhter Reproduzierbarkeit (Moche et al. 2013, Artikel III). Die zusätzlich höhere Anzahl von Gelen mit quantifizierbarer Qualität verringert außerdem den Zeit- und Kostenaufwand vor allem für komplexe experimentelle Ansätze. Die neue Methode zur gelbasierten absoluten Proteinquantifizierung wurde in einer Folgestudie angewendet, um die Konzentrationen von mehr als 700 Proteinen von B. subtilis während der physiologisch relevanten Anpassung an verschiedene Stressbedingungen, nämlich Glukosehunger und Hitzestress, zu bestimmen (Maaß et al. 2014, Artikel IV). Der Vergleich der beiden Stressbedingungen ermöglicht eine Unterscheidung der generellen von der spezifischen Stressantwort, wobei die Analyse der Daten durch Berechnung der Proteinkosten und der Ressourcenverteilung auf verschiedene metabolische Pfade und regulatorische Einheiten unterstützt wurde. Da die Nutzung von 2D PAGE zur Proteinquantifizierung auf im Gel detektierbare Proteine beschränkt ist, ist es für eine höhere Proteomabdeckung sinnvoll, gelbasierte Methoden mit gelfreien Methoden zu ergänzen. Deshalb wurde eine Methode zur labelfreien MS-basierten absoluten Quantifizierung von Proteinen im großen Maßstab entwickelt und etabliert. In dieser gel- und labelfreien Quantifizierungstechnik wurde datenunabhängige, parallele Fragmentierung aller zeitgleich eluierenden Vorläufermoleküle (LC-MSE) genutzt. Auch für diese Methode der absoluten Proteinquantifizierung bildeten die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Probenaufbereitungsverfahren die Grundlage (Muntel et al. 2014, Artikel V).
Bacillus subtilis has been extensively used as a microbial cell factory for industrial enzymes due to its excellent capacities for protein secretion and large-scale fermentation. This bacterium is also an attractive host for biopharmaceutical production. However, the secretion potential of this organism is not fully utilized yet, mostly due to a limited understanding of critical rearrangements in the membrane proteome upon high-level protein secretion. Recently, it was shown that bottlenecks in heterologous protein secretion can be resolved by genome minimization. Here, we present for the first time absolute membrane protein concentrations of a genome-reduced B. subtilis strain (“midiBacillus”) expressing the immunodominant Staphylococcus aureus antigen A (IsaA). We quantitatively characterize the membrane proteome adaptation of midiBacillus during production stress on the level of molecules per cell for more than 400 membrane proteins, including determination of protein concentrations for ∼61% of the predicted transporters. We demonstrate that ∼30% of proteins with unknown functions display a significant increase in abundance, confirming the crucial role of membrane proteins in vital biological processes. In addition, our results show an increase of proteins dedicated to translational processes in response to IsaA induction. For the first time reported, we provide accumulation rates of a heterologous protein, demonstrating that midiBacillus secretes 2.41 molecules of IsaA per minute. Despite the successful secretion of this protein, it was found that there is still some IsaA accumulation occurring in the cytosol and membrane fraction, leading to a severe secretion stress response, and a clear adjustment of the cell’s array of transporters. This quantitative dataset offers unprecedented insights into bioproduction stress responses in a synthetic microbial cell.
A Metabolic Labeling Strategy for Relative Protein Quantification in Clostridioides difficile
(2018)
Although the nose, as a gateway for organism–environment interactions, may have a key role in asthmatic exacerbation, the rhinobiome of exacerbated children with asthma was widely neglected to date. The aim of this study is to understand the microbiome, the microbial immunology, and the proteome of exacerbated children and adolescents with wheeze and asthma. Considering that a certain proportion of wheezers may show a progression to asthma, the comparison of both groups provides important information regarding clinical and phenotype stratification. Thus, deep nasopharyngeal swab specimens, nasal epithelial spheroid (NAEsp) cultures, and blood samples of acute exacerbated wheezers (WH), asthmatics (AB), and healthy controls (HC) were used for culture (n = 146), 16 S-rRNA gene amplicon sequencing (n = 64), and proteomic and cytokine analyses. Interestingly, Proteobacteria were over-represented in WH, whereas Firmicutes and Bacteroidetes were associated with AB. In contrast, Actinobacteria commonly colonized HCs. Moreover, Staphylococcaceae, Enterobacteriaceae, Burkholderiaceae, Xanthobacteraceae, and Sphingomonadaceae were significantly more abundant in AB compared to WH and HC. The α-diversity analyses demonstrated an increase of bacterial abundance levels in atopic AB and a decrease in WH samples. Microbiome profiles of atopic WH differed significantly from atopic AB, whereby atopic samples of WH were more homogeneous than those of non-atopic subjects. The NAEsp bacterial exposure experiments provided a disrupted epithelial cell integrity, a cytokine release, and cohort-specific proteomic differences especially for Moraxella catarrhalis cultures. This comprehensive dataset contributes to a deeper insight into the poorly understood plasticity of the nasal microbiota, and, in particular, may enforce our understanding in the pathogenesis of asthma exacerbation in childhood.