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Tumorbiologische Charakterisierung der Tumorprogressionsfaktoren miR-1 und HSP27 im CAM-Modell
(2021)
Der HET-CAM-Assay kombiniert die Vorteile von Zellkultursystemen und Tiermodellen, indem er leicht und rasch durchzuführende, vergleichsweise kostengünstige Untersuchungen in einem physiologischen Umfeld gestattet, ohne zu den Tierversuchen zu zählen. Das schwach ausgebildete Immunsystem des Hühnerembryos und die starke Vaskularisierung der CAM ermöglichen es, onkologische Prozesse wie das Tumorwachstum und die Angiogenese zu analysieren. In dieser Arbeit wurden verschiedene Durchführungen des Assays getestet und schließlich eine Methode entwickelt, mit der sowohl maternale als auch gentechnisch veränderte Varianten der PC-Zelllinien LNCaP und PC-3 auf der CAM inokuliert und das Tumorwachstum induziert werden konnten. Nach der Etablierung dieses Modell-Systems wurden die tumorprogressiven Effekte der Mikro-RNA miR-1 und des Hitzeschockproteins HSP27 in ovo evaluiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass beide Faktoren Einfluss auf die Progression der PC-Tumoren auf der CAM hatten. Für miR-1 konnte erstmals die in der Literatur beschriebene tumorsuppressive Wirkung durch die Inhibition der Angiogenese in einem in vivo-Modell für das PC nachgewiesen werden. Zudem schien ihre Überexpression einen anti-proliferativen Effekt zu haben. Hinsichtlich der Funktionen von HSP27 deuteten sich Tendenzen an. Auch hier wurden erstmals angiogene Prozesse in einem in vivo Modell für das PC analysiert. Diese Untersuchungen bestätigten die postulierten tumorbiologischen Eigenschaften von HSP27 als Onkogen durch die Förderung der Angiogenese, aber auch der Proliferation.
Die Umgestaltung der Tumor-Mikroumgebung, die Modulation nicht-maligner Zellen sowie die Induktion des metastatischen Potentials sind essentielle Vorgänge im Rahmen der Tumorprogression. Exosomen sind extrazelluläre Vesikel eines Durchmessers von 50-150 nm, welche im Rahmen des interzellulären Informationsaustauschs eine möglicherweise maßgebliche Rolle in Tumorwachstum und Malignitätssteigerung innehaben. Ein genaueres Verständnis ihrer Funktion könnte zu neuen diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten in der Onkologie verhelfen. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Charakterisierung von Exosomen aus Prostatakarzinom (PCa)-Zellen auf molekularer und funktioneller Ebene. Exosomen aus den PCa-Zelllinien LNCaP, PC-3 und PC3-HSP27 wurden anhand Ultrazentrifugation angereichert. Es erfolgte eine Validierung der Präparationsmethode mittels dynamischer Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie. Das exosomale Transkriptom wurde anhand DNA-Microarray, das exosomale Proteom anhand Massenspektrometrie analysiert. Der Auswirkung von PCa-Exosomen auf ihre Umgebung wurde mittels MTT-Vitalitätstest und LDH-Zytotoxizitätstest nachgegangen. Anhand der SILAC-Methodik erfolgte der Nachweis einer Aufnahme exosomaler Proteine in canine Zellen. Die Analyse der exosomalen Nukleinsäuren- und Protein-Zusammensetzung zeigte, dass Exosomen einerseits einen Fingerabdruck des Zytoplasmas der Ursprungszelle darstellen und, dass andererseits eine spezifische Anreicherung von Membranproteinen stattfindet. Dabei erschien vor allem die Inkorporation kleiner Proteine keinem bestimmten Sortierungsmechanismus zu unterliegen. Die Zellkultur-Experimente ließen auf einen Wachstums-inhibierenden Effekt der Exosomen kanzerösen Ursprungs auf nicht-maligne Zellen schließen. Des Weiteren konnte eine Aufnahme exosomaler, humaner Proteine in canine Zellen nach einer Inkubationszeit von 6 h nachgewiesen werden. In der Zusammenschau weisen die Ergebnisse auf eine bedeutende Funktion der Exosomen im Rahmen der Modulation der PCa-Mikroumgebung hin. Exosomen ist die Induktion multipler Effekte in Tumor-assoziierten Zielzellen zuzuschreiben, unter anderem die Regulation des Zellwachstums.
Nachweis der Expression von Adrenorezeptoren auf murinen und humanen Pankreaskarzinomzelllinien
(2013)
Das Pankreaskarzinom ist eine der bösartigsten Krebserkrankungen des Menschen und gehört zu den häufigsten Krebstodesursachen. Die heute zur Verfügung stehenden Therapiemöglichkeiten sind begrenzt und nicht zufriedenstellend. Es ist umso wichtiger neue und alternative Therapieansätze zu erforschen, um in Zukunft den Patienten eine bessere Prognose und Präventionsmaßnahmen zu ermöglichen. Generell scheint Stress und die dadurch bedingte Ausschüttung von Stresshormonen eine wichtige Rolle in der Tumorpathogenese zu haben. Es konnte bereits bei einigen anderen Tumorentitäten gezeigt werden, dass Stress, vermittelt über Katecholamine und die konsekutive Aktivierung von Adrenorezeptoren zu einer Proliferation, Invasion und Migration von Tumorzellen führen kann. Ebenso konnte ein inhibitorischer Effekt auf das Tumorwachstum nach der Behandlung mit entsprechenden Antagonisten, also Adrenorezeptor-blockierenden Substanzen, beobachtet werden. Obwohl es diese Erkenntnisse bereits gibt, sind die zu Grunde liegenden Pathomechanismen auf molekularer und zellulärer Ebene nur unzureichend erforscht. Ein Verständnis gerade dieser Pathomechanismen bildet jedoch die Grundlage für die Entwicklung neuer Therapieoptionen. Die vorliegende Arbeit charakterisiert murine und humane Pankreaskarzinomzellen auf zellulärer Ebene bezüglich des Vorhandenseins von Adrenorezeptoren. Die verschiedenen Pankreaskarzinomzelllinien wurden mit drei unterschiedlichen wissenschaftlich etablierten Methoden auf die Genexpression und das Vorhandensein der Rezeptoren untersucht. Zunächst wurde mittels des Real-Time-PCR-Verfahrens die Genexpression der Rezeptoren auf den Zellen ermittelt und quantifiziert. Im folgenden Schritt wurden die Adrenorezeptoren außerdem auf Proteinebene mit Hilfe der Western Blot-Methode auf den Tumorzellen dargestellt. Abschließend konnten die Rezeptorproteine in der Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen und so veranschaulicht werden. Die Arbeit konnte zeigen, dass sowohl alpha- als auch beta-Rezeptoren bei den murinen und den humanen Karzinomzelllinien exprimiert werden. Zum Teil konnten Unterschiede bezüglich des Vorhandenseins der Subtypen der Adrenorezeptoren ausgemacht werden. Der beta1-Adrenorezeptor wurde nur bei den humanen Karzinomzelllinien MiaPaCa-2 und BXPC-3 nachgewiesen, wohingegen der beta2-Rezeptor bei allen untersuchten Zelllinien nachgewiesen werden konnte. Die Expression des alpha1b-Adrenorezeptor wurde bei den murinen Zelllinien 6606PDA, 6606liver und DT7265 und der humanen Zelllinie BXPC-3 nachgewiesen. Der alpha1d-Rezeptor wurde nur bei murinen Zelllinien, d.h. bei 6606PDA, 6606liver, TD1, TD2, DT7265 gefunden. Die Expression des alpha2a-Adrenorezeptors wurde mit Ausnahme der humanen Zelllinie BXPC-3 bei allen anderen untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien nachgewiesen werden, wohingegen der alpha2b-Adrenorezeptor nur bei den humanen Zelllinien nachgewiesen werden konnte. Welche Bedeutung diesen Unterschieden in Qualität und Quantität zukommt, bleibt weiterhin offen. Sicher ist, dass jede der Pankreaskarzinomzelllinien mit Stressrezeptoren ausgestattet ist. Welche Funktion sie haben und wie groß ihre Bedeutung für die Tumorpathogenese ist, muss in weiteren Studien untersucht werden. Möglicherweise könnten die Adrenorezeptoren der Pankreastumorzellen als Angriffspunkt neuer Therapien dienen.