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Staphylococcus (S.) aureus ist vor allem bekannt als einer der Haupterreger nosokomialer Infektionen weltweit. Die Mechanismen, mit denen S. aureus und das Immunsystem des Wirtes miteinander interagieren sind komplex und bis heute nicht vollständig verstanden. Ziel der vorliegenden Dissertation war es daher, bekannte Virulenzfaktoren von S. aureus und Proteine, deren Funktion für das Bakterium bisher unbekannt ist, hinsichtlich ihrer Immunogenität und ihrer Fähigkeit, Interaktionen mit Zellen und Plasmafaktoren des humanen Blutes einzugehen, zu charakterisieren. Die Entwicklung und Anwendung eines für den Organismus S. aureus spezifischen Proteinmikroarray war eines der Hauptziele dieser Arbeit, welches unter der Bezeichnung Staph-Toxin-Ag verwirklicht wurde. Der Array trug bis zu 62 S. aureus-Antigene und zeigte sich als geeignet zur Charakterisierung und Quantifizierung von Antikörperantworten in verschiedenen humanen und murinen Wirtsproben, wie Blutplasma und -serum sowie anderen extrazellulären Flüssigkeiten wie Nasensekret und Bauchwasser von gesunden und infizierten Probanden. Im ‚Protein-Interaktionsassay‘ wurde der Staph-Toxin-Ag dazu verwendet, Interaktionen von S. aureus-Proteinen zu humanen Blutplasmaproteinen zu identifizieren – Faktor H, Fibronektin, Fibrinogen, Plasminogen und Vitronektin. Der Staph-Toxin-Ag wurde in zwei unabhängigen globalen Studien angewendet, welche die S. aureus spezifischen Antikörperantworten von gesunden humanen Probanden untersuchten, darunter Träger und Nicht-Träger von S. aureus. In der ersten Studie wurden die IgG-Antworten in den Blutplasmen, in der zweiten Studie die Antikörperantworten der Klassen IgG und IgA, hier in den Nasensekreten der Probenaden charakterisiert. In beiden Studien wurde wie erwartet eine enorme Heterogenität der detektierten Antikörperantworten innerhalb der Kohorten beobachtet, die unabhängig vom Trägerstatus bestand. Vergleichende Analysen der IgA- mit den IgG-Antworten in den Nasensekreten konnten den Grad der Heterogenität noch einmal deutlich erhöhen. Für keinen der untersuchten Probanden stimmten die S. aureus-Antigen-Muster beider Antikörperklassen vollständig überein. Für die untersuchten S. aureus-Träger wurden im Durchschnitt höhere Antikörperlevel nachgewiesen als für die Nicht-Träger. Statistische Analysen (Mann-Whitney U-Test) der gemessenen IgG- bzw. IgA-Level identifizierten insgesamt zehn Antigene, gegen die die Testgruppe der Träger im Vergleich signifikant höhere Antworten zeigte. Für das virulenzassoziierte Protein IsaA (Immunodominant staphylococcal Antigen A) wurden die beschriebenen Unterschiede in beiden globalen Studien und für beide untersuchten Antikörperklassen identifiziert. Die stärksten und häufigsten Antikörperantworten konnten gegen Proteine aus zwei funktionellen Gruppen – die nicht-egc-Superantigene (SEB, SEC, TSST-1) und die Komplement- und Koagulationsinhibitoren (SCIN, Efb, Sbi, SSL-7, SACOL1169) – detektiert werden. Mindestens 60 % der untersuchten Probanden zeigten spezifische IgG- und/oder IgA-Antworten gegen Komplementinhibitoren. Hingegen konnten für Superantigene vor allem Antikörperspezifitäten der Klasse IgG detektiert werden. Für den Komplementinhibitor Sbi (S. aureus Binder of IgG) wurde eine Lücke in den IgG-Antworten beobachtet. Beide funktionelle Gruppen werden folglich bei der Invasion des Wirtes von S. aureus in vivo exprimiert. Komplementinhibitoren sind darüber hinaus offensichtlich für S. aureus von besonderer Relevanz bei der Kolonisierung der Naseschleimhaut. Zahlreiche neue Erkenntnisse konnten gewonnen werden zu Proteinen, die von S. aureus sekretiert werden, deren Funktion für das Bakterium jedoch bisher unbekannt ist. Gegen zehn dieser Proteine wurden mithilfe des Staph-Toxin-Ag spezifische IgG- und/oder IgA-Antworten nachgewiesen, besonders häufig gegen die Antigene SACOL0479, SACOL0480, SACOL0985 und SaurJH1_2034. Dies zeigte, dass diese Proteine durch S. aureus in vivo synthetisiert werden und dass sie immunogen wirken. Im ‚Protein-Interaktionsassay‘ konnten für 20 der sekretierten Proteine mit unbekannter Funktion Interaktionen mit humanen Blutplasmafaktoren nachgewiesen werden. In durchflusszytometrischen Analysen mit humanem Vollblut wurden für sieben Proteine – SACOL0021, SACOL0742, SACOL0908, SACOL0985, SACOL1788, SACOL1802 und SACOL2197 – spezifische Bindungen an PMNs (Polymorphonuclear Leukocytes) und/oder Monozyten gezeigt. In der vorliegenden Dissertation wurden mithilfe immunologischer und durchflusszytometrischer Methoden potentielle neue Virulenzfaktoren, Vakzinkandiaten sowie diagnostische Biomarker identifiziert. Neben der wissenschaftlichen Anwendung ist der Proteinarray Staph-Toxin-Ag durch seine Eigenschaften prädestiniert für einen Einsatz als Screening-Methode in der diagnostischen Medizin.
Glutaredoxine (Grxs) gehören zur Enzymgruppe der Oxidoreduktasen und sind Teil der Thioredoxin-Familie. Grxs katalysieren die reversible (De-)Glutathionylierung von Proteinen und die Reduktion von Protein-Disulfiden. Diese Aktivitäten sind entscheidend für diverse redoxvermittelte Signaltransduktionsprozesse in den verschiedenen Kompartimenten der Zelle. Zudem werden sie im Zusammenhang mit der neuronalen Entwicklung, neurodegenerativen Erkrankungen und der Krebsentstehung und -progression gesehen. Säugetiergenome kodieren vier Grxs (Grx1, Grx2, Grx3 und Grx5) mit zytosolischer, nukleärer oder mitochondrieller Lokalisation. Von humanem Grx2 wurden bisher drei Isoformen charakterisiert. Das mitochondrielle Grx2a wird ubiquitär exprimiert, während die nukleären und zytosolischen Isoformen Grx2b und Grx2c ein Vorkommen in Testes und Krebszellen aufweisen. Grx2c ist an der Aussprossung von Axonen beteiligt und daher entscheidend für die Hirnentwicklung. Die Überexpression von Grx2c in HeLa-Zellen führt zu einem elongierten Phänotyp mit filopodienartigen Ausläufern, der in vorangegangenen Studien gut beschrieben wurde. Als potentielles Ziel der Grx2c-Wirkung wurde das Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) identifiziert. In der Tat konnte ein Thiol-Disulfid-Schalter in CRMP2 ermittelt werden. Grx2c wurde als spezifische Reduktase identifiziert, während MICALs (molecule(s) interacting with CasL) als potentielle Oxidasen dieses Schalters vermutet werden. Basierend auf diesen vorangegangenen Ergebnissen erarbeiteten wir die Hypothese, dass der Thiol-Disulfid-Schalter in CRMP2 die Interaktion des Proteins mit Regulatoren der Aktinpolymerisation und -verzweigung (das heißt Sra1/Cyfip1 und wave regulatory complex) kontrolliert und dadurch die Dynamik des Zytoskeletts beeinflusst. Hauptsächliches Ziel der Arbeit war die Überprüfung dieser Hypothese. Besonders die Protein-Protein-Interaktionen und deren Abhängigkeit vom CRMP2-Redoxstatus sollten untersucht werden. Unter Verwendung von HeLa-Zellen und Grx2c-exprimierenden HeLa-Zellen (HeLa-Grx2c-Zellen) konnte mittels Immunopräzipitation und unter Verwendung quervernetzender Substanzen keine direkte Interaktion zwischen Sra1/Cyfip1 und CRMP2 festgestellt werden. Es zeigte sich jedoch eine Co-Immunopräzipitation von Sra1/Cyfip1 und MICAL2, was für eine direkte Interaktion der beiden Proteine spricht. Des Weiteren fanden sich bei Betrachtung von Bandenmustern nach in vivo Quervernetzung Anhaltspunkte für eine indirekte Interaktion von CRMP2 und MICAL2. Die Auswertung von Western Blots ergab teils deutliche kompensatorische Änderungen im Expressionsmuster der untersuchten Proteine bei Überexpression von Grx2c in HeLa-Zellen. So kam es zur Erhöhung der Sra1- und Beta-Aktin-Menge, während sich die MICAL2-Menge in der Zelle verringerte. Unter Berücksichtigung der Ergebnisse wurde ein neues Modell erstellt, welches auf einer indirekten Interaktion von CRMP2, MICAL2 und Sra1/Cyfip1 via Plexin A (Teil des Semaphorin3A-Rezeptors) beruht. In diesem Modell wirken MICAL2 über Oxidation und Grx2c über Reduktion von CRMP2, was zu konformationellen Änderungen des CRMP2s führt. Die oxidierte, geschlossene Konformation inhibiert Sra1 über Bindung an MICAL2, während die reduzierte, offenere Konformation zu einer Freigabe und Aktivierung von Sra1 führt und letztendlich in der Aktinpolymerisation und -verzweigung mündet. Dieser Mechanismus hat eine entscheidende Bedeutung in der Pathogenese verschiedenster Krebserkrankungen und neurodegenerativer Erkrankungen. Die weitere Beleuchtung der Rolle des Redoxschalters in CRMP2 und die genaue Kenntnis dessen Involvierung in spezifische Signalwege wie der Sema3A-Signalkaskade, basierend auf dem neu erstellten Modell, könnten zukünftig bei der Verwirklichung gezielter pharmakologischer Therapien gegen Krebserkrankungen und neurodegenerative Erkrankungen eingesetzt werden.
In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Interaktion der Rabiesvirus Polymerase L und des Hendravirus Matrixproteins M mit zellulären Proteinen und intrazellulären Strukturen durchgeführt. Mit ASS1 und DLC1 wurden zwei zelluläre Proteine identifiziert, die direkt oder indirekt mit der Rabiesvirus Polymerase L interagieren. Zellkulturuntersuchungen zum Einfluss von ASS1 auf die Rabiesvirus Replikation lieferten bisher keinen Hinweis auf eine Beeinflussung der Polymerasefunktionen und die Diskussion möglicher Mechanismen einer Interferenz mit der NO-Synthese in infizierten Organismen blieb spekulativ. Für DLC1 wurde erstmals gezeigt, dass das L Protein des Rabiesvirus ein Konsensusmotiv für die Bindung von DLC1 enthält und die Effizienz der viralen Primärtranskription durch die Anwesenheit dieses Motivs beeinflusst wird. Vergleichende Untersuchungen mit Virusmutanten, in denen das in L identifizierte Motiv und ein bereits beschriebenes DLC1-bindendes Motiv in P mutiert waren, zeigten, dass beide Motive in vergleichbarer Weise die virale Primärtranskription beeinflussen. Die Kombination entsprechender Mutationen hatte jedoch keinen additiven Effekt auf die Polymeraseaktivität. Für die Funktionalität des Rabiesvirus Polymerasekomplexes P/L im Rahmen der viralen Primärtranskription scheint eine Interaktion mit beiden Komponenten des Komplexes erforderlich zu sein. Quantitative Analysen zur Verteilung von in die Zelle eingedrungenen Viruspartikeln zeigten, dass eine Akkumulierung viraler Ribonukleoproteine (RNP) nur in Anwesenheit des DLC1 Motivs in P erfolgte, und dass dies unabhängig von Mutationen in L war. Dies deutete darauf hin, dass die P-abhängige Akkumulierung von RNPs in frühen Phasen der Virusinfektion und die P und L abhängige Steigerung der Primärtranskription zwei funktionell voneinander trennbare Prozesse sind. Neben der DLC1 abhängigen Regulation der viralen Primärtranskription zeigten Untersuchungen zur Regulation der DLC1 Mengen in virusinfizierten Zellkulturen, dass die zelluläre DLC1 Genexpression durch die Anwesenheit der DLC1 Motive in P und in L reguliert wird. Diese Erkenntnisse und neuere Erkenntnisse zur Autoregulation der DLC1 Genexpression zeigen, dass die Bindung von DLC1 an beide Proteine des P/L Polymerasekomplexes, sowie die Retention von DLC1 in viralen Inclusion Bodies vermutlich die Verfügbarkeit an freiem DLC1 limitiert, und damit eine DLC1 abhängige Inhibition des DLC1 Genexpression regulierenden Transkriptionsfaktors ASCIZ aufhebt. Inwieweit dieses Modell einer virusabhängigen DLC1 Regulation zutrifft, weitere über einen derartigen Mechanismus regulierte Zellgene betroffen sind und diese einen Einfluss auf die Virusreplikation haben, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. Darüber hinaus wurde mittels Fluoreszenzprotein-markiertem L von Rabies- und verwandten Lyssaviren erstmals gezeigt, dass die virale Polymerase an Mikrotubuli akkumuliert und diese reorganisiert. Die Abhängigkeit der Mikrotubuli-Lokalisation von einem intakten DLC1 Motiv in L deutete darauf hin, dass DLC1 ein Faktor bei der Rekrutierung von L an die Mikrotubuli ist. Auch für das Hendravirus M-Protein wurden mittels Affinitätschromatographie und Analyse von M haltigen Proteinkomplexen potentielle Interaktionspartner identifiziert. Dabei zeigte sich, dass nukleäres ANP32B Hendravirus M entweder direkt oder indirekt bindet. Aufgrund einer ANP32B-abhängigen Kernretention von M und der hier gezeigten Analysen zur Interaktion dieser Proteine, kann davon ausgegangen werden, dass ANP32B eine nukleäre Zielstruktur für das Hendravirus M darstellt. Ebenso kann davon ausgegangen werden, dass die Interaktion entweder direkt die Virusreplikation oder pro oder antiviral wirkende Mechanismen der Wirtszelle beeinflusst. Im Hinblick auf Funktionen von ANP32B beim Crm1 vermittelten Kernexport von mRNAs, der Regulation der zellulären Genexpression und der Apoptoseregulation erscheint eine weiterführende funktionelle Charakterisierung der entsprechenden ANP32B abhängigen Mechanismen sinnvoll. Auch wenn die Rolle von ANP32B im Replikationszyklus von Hendraviren noch nicht geklärt ist, zeigten Untersuchungen mit M Proteinen anderer Paramyxoviren (Newcastle Disease Virus und Bovines Respiratorisches Synzytialvirus), dass die Interaktion mit ANP32B in mindestens zwei unterschiedlichen Virusgattungen innerhalb der Unterfamilie der Paramyxovirinae konserviert ist. Daher wird angenommen, dass die Interaktion mit ANP32B Teil eines bei Paramyxoviren konservierten Mechanismus ist. Zusammenfassend wurde mit den in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen ein wesentlicher Beitrag zur Aufklärung von wirtszellabhängigen Funktionen viraler Proteine geleistet. Mit der Identifizierung von zellulären Zielproteinen der Rabiesvirus Polymerase und paramyxoviraler Matrixproteine wurde eine wichtige Grundlage für weiterführende Arbeiten zu den involvierten molekularen Mechanismen und deren Relevanz im infizierten Wirt geschaffen.