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Im Rahmen dieser Arbeit wurde ausgehend vom nicht zytopathogenen (nzp) Wildtypvirus BVDV-2 Stamm 890 (v890WT) erstmalig ein infektiöser cDNA Volllängenklon (p890FL) konstruiert. In vitro synthetisierte RNA des Volllängenklons p890FL replizierte nach Transfektion in bovine Zellen autonom und aus dem Überstand transfizierter Zellkulturen konnte infektiöses Virus (v890FL) isoliert werden. Die in vitro Charakterisierung ergab ein ähnliches Wachstumsverhalten des rekombinanten Virus v890FL im Vergleich zum Wildtypvirus v890WT. Im Tierexperiment zeigte v890FL jedoch einen geringfügig attenuierter Phänotyp gegenüber dem Wildtypvirus v890WT. Mit Hilfe des nzp Volllängenklons p890FL konnte zudem gezeigt werden, dass auch ein nzp BVDV-2 -Stamm stabil messbare Mengen an freiem NS3-Proteins bilden kann, wie es bisher nur für zytopathogene (zp) BVDV Stämme beschrieben worden ist. Der Volllängenklon p890FL diente weiterhin als Basis für die Etablierung zweier Deletionsmutanten, p890dNpro und p890dC, welche sich jeweils durch eine partielle Deletion des Nichtstrukturproteins Npro bzw. durch eine partielle Deletion des Kapsidproteins C auszeichnen. Die Deletion der Autoprotease Npro resultierte in einem verminderten viralen Wachstum auf Interferon-kompetenten bovinen Zellen, auf Interferon-inkompetenten Zellen können jedoch mit dem rekombinanten Virus v890FL vergleichbare Titer erreicht werden. Die Deletion des Strukturproteins C resultierte in der Bildung eines sogenannten Replikons, die in vitro synthetisierte virale RNA von p890dC war zwar in der Lage nach Transfektion in bovinen Zellen autonom zu replizieren, jedoch können keine Virusnachkommen isoliert werden. Für die Generierung infektiöser Virusnachkommen (sogenannter „Pseudovirionen“) wurde das Replikon p890dC unter Verwendung der Helferzelllinie WT-R2 in trans komplementiert und zu (einmal infektiösen) Pseudovirionen verpackt. Beide Deletionsmutanten offerieren einen neuartigen Ansatz in der Etablierung von sicheren und effizienten BVDV-2 Vakzinen und stellen einen wichtigen Schritt bei der Entwicklung neuer BVDV-Impfstoffe dar. Der infektiöse cDNA Volllängenklon p890FL ist mit seiner 228 nt großen Insertion im NS2-kodierenden Bereich zudem ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung von Insertionen im NS2/3 und dem Verständnis für die Ursachen der Zytopathogenität von Pestiviren.
Hantaviren gehören zu den „Emerging Viruses“ mit einer weltweiten Verbreitung. Sie sind Erreger von Zooanthroponosen und werden von Nagetieren auf den Menschen übertragen. Humane Hantavirusinfektionen können je nach Erreger schwerwiegende Erkrankungen mit einer Letalitätsrate von bis zu 50 % hervorrufen. In den Jahren 2004/2005, 2007 und auch in diesem Jahr wurde in einer Reihe europäischer Staaten, einschließlich Deutschland, ein deutlicher Anstieg der Zahl der humanen Hantavirusinfektionen beobachtet. In Deutschland waren hauptsächlich Baden-Württemberg, Bayern, Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen betroffen. Zu den Risikogruppen zählen Personen, welche aufgrund ihres Berufes in engen Kontakt zu dem Reservoirwirt und dessen Ausscheidungs¬produkten kommen und somit auch gegenüber den Viren besonders exponiert sind. Die Hanta¬virus¬diagnostik basiert größtenteils auf serologischen Nachweismethoden wie Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) und Western Blot-Tests. Um humane Hantavirusinfektionen in Deutschland mit hoher Sensitivität und Spezifität zu diagnostizieren, wurden in dieser Arbeit serologische Testverfahren für die in Europa vorkommenden Hantaviren Dobrava-Belgrad-Virus (DOBV), Puumalavirus (PUUV) und Tulavirus (TULV) etabliert und validiert. Weiterhin wurden Protokolle zur Durchführung seroepidemiologischer Studien und für den Einsatz der neuen Testsysteme in der Diagnostik entwickelt. Gemäß dieser Protokolle wurden die Tests bei seroepidemiologischen Untersuchungen eingesetzt und lieferten Auf¬schluss über die Hantavirusprävalenz in verschiedenen Bevölkerungsgruppen in unter¬schiedlichen Gebieten Deutschlands. Auf der Basis Hefe exprimierter Nukleokapsidproteine (N-Proteine) von PUUV, Stamm Vranica-Hällnäs (PUUV-Vra) und Stamm Niederbayern (PUUV-Bava), DOBV, Stamm Slovenia (DOBV-Slo), und TULV, Stamm Moravia wurden ELISA und Western Blot-Tests zum Nachweis von humanen IgM- und IgG-Antikörpern entwickelt. Die Validierung mit deutschen und internationalen Seren ergab für die neuen Tests eine Sensitivität zwischen 94 % und 100 % und eine Spezifität von 96-100 %. Bei der Validierung der Tests mit Seren aus Finnland erreichte die Sensitivität 89-100 % und die Spezifität 95-100 %. Der Anteil an Seren, bei denen keine eindeutige Einteilung in „reaktiv“ oder „nicht reaktiv“ erfolgen konnte, lag bei maximal 2,7 %. Die indirekten DOBV-Slo- und PUUV-Vra-IgG/IgM-ELISA und Western Blot-Tests wurden durch INSTAND e.V. im März, September 2009 und April, September 2010 zertifiziert. Die TULV spezifischen Tests konnten aus Mangel an Referenztests und damit fehlender Referenzseren nicht validiert werden. Für die epidemiologischen Studien wurde das indirekte ELISA-Format eingesetzt, da das capture ELISA-Format in seiner diagnostischen Sensitivität schlechter als das indirekte Format abgeschnitten hatte. Die jeweiligen Western Blot-Tests und Immunfluoreszenztests dienten als Bestätigungstest. Die seroepidemiologische Studie bei 484 humanen Serumproben aus einem PUUV-Endemiegebiet in Niedersachsen zeigte eine Hanta-virusprävalenz von 7 %. Dieser Wert entspricht etwa dem Vierfachen der durchschnitt¬lichen Prävalenz des gesamten Bundesgebietes (1-2 %). Die Untersuchung von 178 Personen aus einem PUUV-Ausbruchsgebiet in Bayern ergab eine Hantavirusseroprävalenz von etwa 11 %. Interessanterweise waren 40 % der positiv getesteten Seren aus¬schließlich mit dem TULV-Antigen reaktiv. Es wurden auch die Seren von 208 in Bayern statio¬nierten Soldaten untersucht. Obwohl diese zu einer der Risikogruppen gehören, lag die Hantavirusprävalenz lediglich bei 2 %. Dagegen ergab eine Studie bei Wald¬arbeitern aus Branden¬burg dass 9 % der 563 ge¬testeten Personen Hantavirus spezifische Antikörper besaßen. Von diesen waren 43 % aus¬schließlich in den TULV-Tests reaktiv und 33 % reagierten exklusiv mit dem DOBV-Slo-Antigen. Eine ¬epidemiologische Studie bei Primaten aus dem deutschen Primatenzentrum in Göttingen zeigte, dass 12 % von den 251 getesteten Tieren mit mindestens einem der verwen¬deten Antigene reagierten. Dies stellt den ersten Nachweis von natürlichen Hantavirusinfektionen bei Primaten dar. Die Ergebnisse der epidemiologischen Studien zeigen die Bedeutung der Verwendung „homologer“ Antigene für eine hochsensitive serologische Diagnostik. Aus diesem Grund sollte zukünftig das PUUV-Bava Antigen für den serologischen Nachweis von Hantavirusinfektionen in Deutschland eingesetzt werden. Die epidemiologische Bedeutung des TULV muss weiter erforscht werden. Daher sollten bei zukünftigen epidemiologischen Studien die jeweiligen Serumproben auch auf TULV reaktive Antikörper untersucht werden. Mit den hier entwickelten serologischen Testverfahren wird es zukünftig möglich sein, Hantavirusinfek¬tionen mit hoher Sensitivität und Spezifität zu diagnostizieren.
Die Transkription von Genen der Phospholipidbiosynthese in S. cerevisiae wird durch ein ICRE (inositol/choline responsive element) genanntes UAS-Element aktiviert, welches durch die Phospholipid-Vorstufen Inositol und Cholin (IC) gesteuert wird. ICRE-Motive werden durch ein Heterodimer der bHLH-Proteine Ino2 und Ino4 erkannt, wobei Ino2 über zwei Transkriptionsaktivierungsdomänen (TAD) die Expression vermittelt, während Ino4 dem Kernimport des Komplexes dient. Negativer Regulator ist Opi1, der mit Ino2 interagiert. SUA7 (TFIIB) wird durch die Interaktion mit Ino2 an den Promotor rekrutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen durchgeführt, um ein Heterodimer aus heterolog exprimiertem Ino2 und Ino4 über chromatographische Methoden zu reinigen. Es wurde eine affinitätschromatographische Strategie entwickelt, die es gestattet, epitopmarkiertes Ino2 und Ino4 von einem Großteil der Fremdproteine abzutrennen. Mit größeren Zellmengen könnte es künftig gelingen, ein Ino2/Ino4-Heterodimer zu reinigen und es nach Kristallisierung zusammen mit einem ICRE-Motiv einer Röntgenstrukturanalyse zugänglich zu machen. Unter Verwendung genomischer Sequenzdaten von S. cerevisiae wurden in dieser Arbeit weitere Gene identifiziert, die ICRE-Motive in ihrer Promotorregion tragen, aber keine offensichtliche Rolle bei der Phospholipidbiosynthese spielen. Untersuchungen zeigten, dass die ICRE-tragenden Gene FAR8, RSF1, YEL073C und URA8 relativ stark, die Gene ARG4, ERG20, GPD2 und VHT1 nur moderat durch IC beeinflusst werden. Für das in S. cerevisiae stark IC-abhängige INO1 Gen (50-fache Derepression bei IC-Mangel) wurde gezeigt, dass drei distinkte ICRE-Motive für diese Regulation verantwortlich sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden mit Transkriptomanalysen anderer Gruppen verglichen und die Aussagekraft von in silico-Recherchen bewertet. Candida albicans ist eine opportunistisch pathogene Hefe. Auch C. albicans ist in der Lage, Inositol, Cholin und Fettsäuren de novo zu synthetisieren. Ein Funktionshomolog zu INO1, das CaINO1, vermag eine entsprechende Nullmutation in S. cerevisiae zu komplementieren. Ebenso wurden in C. albicans die Gene CaCHO1, CaFAS1 und CaFAS2 für die Synthese von Cholin bzw. Fettsäuren identifiziert. Ferner besitzt C. albicans das dem Opi1-Protein strukturell und funktionell ähnelnde CaOpi1, welches ebenfalls in der Lage ist, eine IC-abhängige Genregulation in S. cerevisiae zu vermitteln. Die in silico Identifikation potentieller C. albicans Orthologer zu INO2 sowie zu INO4 gab Anlass zu der Annahme, dass die Regulation der Phospholipidbiosynthese in S. cerevisiae und C. albicans konserviert vorliegt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein unkonventionelles Intron im mutmaßlichen CaINO4 Gen identifiziert und durch RT-PCR eine intronfreie cDNA des CaINO4 Gens erhalten. Mit den Produkten der mu tmaßlichen Gene CaINO2 und CaINO4 wurden Protein/DNA- und Protein/Protein-Interaktionen untersucht und mit der Situation in S. cerevisiae verglichen. CaIno2 und CaIno4 sind in der Lage zu heterodimerisieren und an ICRE-Motive aus S. cerevisiae zu binden, jedoch konnte keine Bindung an den CaINO1 Promotor gezeigt werden. Weiterhin ist das Heterodimer der C. albicans-Proteine in der Lage, einer S. cerevisiae ino2 ino4 Doppelmutante ein Wachstum auf IC-freiem Medium zu ermöglichen. Keines der Gene kann jedoch allein die jeweils entsprechende ino2 oder ino4 Einfachmutation komplementieren. Weder CaIno2 noch CaIno4 interagieren mit CaOpi1, hingegen interagiert CaIno2 mit Opi1, ebenso CaOpi1 mit Ino2. Ferner interagiert CaIno2 wie auch CaIno4 mit CaSua7, nicht jedoch mit Sua7. Es konnte keine Interaktion zwischen Ino2 bzw. Ino4 mit CaIno4 bzw. CaIno2 festgestellt werden, ebensowenig eine Homodimerisierung der Proteine. Ähnlich wie Ino2 enthält auch CaIno2 zwei Transkriptionsaktivi erungsdomänen an entsprechenden Positionen und vergleichbarer Aktivierungsleistung. Es gelang im Rahmen dieser Arbeit nicht, homozygote Mutationen der Gene CaINO2 und CaINO4 durch Gendisruption in die diploide Hefe C. albicans einzuführen, es konnten lediglich heteroallele Mutanten hergestellt werden. Dieser Befund ist ein Hinweis auf eine Rolle von CaIno2 und CaIno4 bei der Aktivierung essentieller Gene in C. albicans. Daher wurde mit Genaktivierungstests nach der CaIno2/CaIno4-Konsensusbindesequenz gesucht und diese dann verwendet, um potentielle Zielgene in silico zu identifizieren. Als Konsensussequenz wurde das Motiv BWTCASRTG erhalten. Dieses Motiv wurde weder vor CaINO1, CaFAS1 oder CaCHO1 gefunden, jedoch zeigte sich eine deutliche Häufung des UAS-Elements vor mitochondrialen Genen, vor Genen der Ergosterolbiosynthese und besonders vor einer Vielzahl von Genen ribosomaler Proteine. Es kann aus diesen Daten gefolgert werden, dass CaIno2 und CaIno4 für die Aktivierung anderer, vermutlich essentieller Zielgene erforderlich sind als ihre Orthologen aus S. cerevisiae, während CaINO1 durch bisher unbekannte Faktoren reguliert wird.
Influence of single amino acid polymorphisms on the in vitro convertibility of goat prion protein
(2010)
Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are fatal neurodegenerative disorders which include, among others, scrapie and bovine spongiform encephalopathy (BSE). The causative agent is composed mainly of a misfolded isoform of a cellular prion protein (PrPC), denoted prion protein scrapie (PrPSc). Genetically determined PrPC polymorphisms can modulate the convertibility of PrPC to PrPSc and thus lead to prolonged TSE incubation times or even complete resistance of the animal. In sheep, such polymorphisms are located at codons 136, 154 and 171. Several disease-associated amino acid polymorphisms also exist in caprine PrPC. However, due to their large number and the limited number of goats carrying them, it is difficult to assess their specific impact on TSE susceptibility in vivo. The susceptibility can be simulated in vitro by a cell-free conversion assay, in which the conversion efficiency of recombinant PrPC is determined. In this study, twelve caprine PrPC variants (M112T, M137I, L141F, I142M, H143R, N146S, N146D, R151H, R211Q, Q215R, Q222K and wild-type PrPC (denoted INRQ) were produced by using PCR mutagenesis amplification and expressed in E. coli M15 cells and purified on Ni-NTA agarose columns. The renatured PrPC variants had molecular masses of approx. 23 kDa and the expected conformation as determined by CD spectroscopy. These variants were then subjected to a cell-free conversion assay using different BSE and scrapie strains. Cross species (mouse and goat) cell-free conversion studies were performed and specific monoclonal antibodies were used to discriminate the exogenous PrPSc molecules used to seed the reaction and newly converted PrPres. The studies with the mouse-adapted strain Me7 revealed that polymorphisms M137I, H143R and L141F did not influence the conversion of PrPC in a significant manner. However, the reduced conversion rate of the variant I142M (harbouring a methionine at position 142 instead of isoleucine) correlated with longer scrapie incubation times in goats with this polymorphism. The polymorphisms M112T, R151H and Q211R showed also reduced conversion rates in comparison to INRQ, an effect that related well to reduced scrapie susceptibility of such goats in vivo. Polymorphisms N146S, N146D and Q222K were to date extremely rarely found in scrapie affected goats. It was intriguing to see that these amino acid substitutions also abolished the in vitro conversion efficiency completely as did the Q215R polymorphism, which had not yet been associated with scrapie resistance in vivo. Results of cell free conversion studies with mouse adapted BSE prions (BSE/Bl6 strain) correlated well with the results obtained with Me7, although the results with BSE/Bl6 showed more variation. Again it was possible to observe a reduction in the conversion with I142M, R151H and R211Q and no or almost no conversion with N146S, N146D and Q222K and with Q215R respectively. In subsequent experiments, caprine PrPC variants were directly biotinylated so that goat or sheep scrapie as well as cattle, sheep or goat BSE derived PrPSc could be used. In these assays I142M, H143R and R211Q clearly reduced the conversion of PrPC with ovine and caprine scrapie isolates, whereas R151H did not influence the conversion efficiency of biotin-tagged PrPC. Conversion with scrapie isolates showed a marked reduction or no conversion in the case of N146S and N146D which correlated again with the Me7 data and the in vivo observations. In the case of bovine BSE isolates, the cell-free conversion mimicked the species barrier observed in vivo. BSE material from cattle barely converted any caprine PrPC variant into PrPres, whereas BSE from sheep converted all variants including the resistance-associated N146S and N146D, suggesting that the resistance is also prion strain specific. A marked reduction in the conversion rate was also observed with I142M and, less pronounced, with H143R and R211Q corroborating the protective role of these polymorphisms against TSEs. When co-incubated, resistance-associated variants N146D, N146S and Q222K produced a dominant negative effect on the conversion of the susceptible wild-type PrPC genotype (INRQ). In a similar way, the incubation of I142M and H143R also reduced the amount of PrPres in a mixture with INRQ. In conclusion, the cell-free conversion assay results show that the caprine PrP polymorphisms M112T, I142M, R143H, N146S, N146D, R151H, R215Q and Q222K correlated clearly with the in vivo susceptibilities of the goats carrying these polymorphisms. Apart from practical implications, like the possibility of breeding TSE resistant goats, these data indicate that scrapie resistance is modulated by thermodynamic changes affecting PrPC-PrPSc interactions and the formation of conversion intermediates.