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Marine algae produce complex polysaccharides, which can be degraded by marine heterotrophic bacteria utilizing carbohydrate-active enzymes. The red algal polysaccharide porphyran contains the methoxy sugar 6-O-methyl-D-galactose (G6Me). In the degradation of porphyran, oxidative demethylation of this monosaccharide towards D-galactose and formaldehyde occurs, which is catalyzed by a cytochrome P450 monooxygenase and its redox partners. In direct proximity to the genes encoding for the key enzymes of this oxidative demethylation, genes encoding for zinc-dependent alcohol dehydrogenases (ADHs) were identified, which seem to be conserved in porphyran utilizing marine Flavobacteriia. Considering the fact that dehydrogenases could play an auxiliary role in carbohydrate degradation, we aimed to elucidate the physiological role of these marine ADHs. Although our results reveal that the ADHs are not involved in formaldehyde detoxification, a knockout of the ADH gene causes a dramatic growth defect of Zobellia galactanivorans with G6Me as a substrate. This indicates that the ADH is required for G6Me utilization. Complete biochemical characterizations of the ADHs from Formosa agariphila KMM 3901T (FoADH) and Z. galactanivorans DsijT (ZoADH) were performed, and the substrate screening revealed that these enzymes preferentially convert aromatic aldehydes. Additionally, we elucidated the crystal structures of FoADH and ZoADH in complex with NAD+ and showed that the strict substrate specificity of these new auxiliary enzymes is based on a narrow active site.
Die Hälfte der globalen Primarproduktion wird in den Ozeanen realisiert und dabei wird ein großer Anteil des fixierten CO2 genutzt, um Algenpolysaccharide zu synthetisieren. Diese Kohlenhydrate dienen als wichtige Kohlenstoff- und Energiequelle für marine Nahrungsnetze, wobei sie von kohlenhydrataktiven Enzymen zu monomeren Zuckern umgesetzt werden. Da bisher wenig über den enzymatischen Abbau von Algenpolysacchariden in den Ozeanen bekannt ist, war es das Ziel dieser Arbeit, zu einem tieferen Verständnis dieser Prozesse beizutragen.
O-Methylierungen stellen stabile Modifikationen an Zuckern in marinen und terrestrischen Polysacchariden dar. Es wurde in Artikel I gezeigt, dass Cytochrom P450 Monooxygenasen eine wichtige Funktion in enzymatischen Abbausystemen aus marinen Bakterien für Agar haben, wobei diese Enzyme die oxidative Demethylierung von 6-O-Methyl-D-galaktose, einem Monomer aus Rotalgenpolysacchariden, katalysieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass es sich bei der P450-Subfamilie CYP236A um die zweite beschriebene Gruppe von kohlenhydrataktiven Monooxygenasen handelt. Die charakterisierten P450s sind hochspezifisch für 6-O-Methyl-D-galaktose und akzeptieren keine typischen P450-Substrate. Um die molekularen Faktoren für den spezifischen Umsatz dieses polaren Substrates aufzuklären, wurde Proteinkristallografie genutzt (Artikel II). Die Kristallstruktur der P450 Monooxygenase aus Z. galactanivorans mit gebundenem Substratmolekül zeigt, dass sowohl Wasserstoffbrückenbindungen als auch hydrophobe Interaktionen an der Substraterkennung beteiligt sind, was zusätzlich durch ITC sowie Mutationsstudien bestätigt wurde.
Schnellwachsende Grünalgen der Gattung Ulva führen weltweit zu gefährlichen Algenblüten. Ein Hauptbestandteil der gebildeten Biomasse stellt das anionische Polysaccharid Ulvan dar. Bisher war der enzymatische Ulvanabbau kaum verstanden, was die sinnvolle Nutzung von Ulva-Biomasse erschwerte. Die detaillierte biochemische Charakterisierung einer Ulvanlyase auf F. agariphila wird in Artikel III gezeigt. Dieses Enzym katalysiert den ersten Schritt im Ulvanabbau und die biochemischen Parameter stimmen mit den Umweltbedingungen in Küstenbereichen des gemäßigten Ozeans überein, dem Habitat, aus dem dieses Bakterium isoliert wurde. Alle nachfolgenden Schritte im kompletten enzymatischen Ulvanabbau wurden aufgeklärt und sind in Artikel IV zum ersten Mal beschrieben. Insgesamt 13 Enzyme aus den Klassen der Polysaccharidlyasen, Glykosidhydrolasen sowie Sulfatasen agieren in einer komplexen Kaskade zusammen, um schlussendlich monomere Zucker aus Ulvan bereitzustellen.
Die gezeigten Identifizierungen und Charakterisierungen von neuen kohlenhydrataktiven Enzymen tragen nicht nur zu einem besseren Verständnis der Vorgänge im marinen Kohlenstoffkreislauf bei, sondern bilden zudem die Grundlage für zukünftige biotechnologische Prozesse. Eine effiziente enzymatische Depolymerisation der Algenpolysaccharide ist nötig, um Bioraffineriekonzepte basierend auf Algenkohlenhydraten zu realisieren. Dabei können über mikrobielle Fermentation Biokraftstoffe der zweiten Generation oder andere nützliche Produkte hergestellt werden.
Enzymatic degradation and recycling can reduce the environmental impact of plastics. Despite decades of research, no enzymes for the efficient hydrolysis of polyurethanes have been reported. Whereas the hydrolysis of the ester bonds in polyester‐polyurethanes by cutinases is known, the urethane bonds in polyether‐polyurethanes have remained inaccessible to biocatalytic hydrolysis. Here we report the discovery of urethanases from a metagenome library constructed from soil that had been exposed to polyurethane waste for many years. We then demonstrate the use of a urethanase in a chemoenzymatic process for polyurethane foam recycling. The urethanase hydrolyses low molecular weight dicarbamates resulting from chemical glycolysis of polyether‐polyurethane foam, making this strategy broadly applicable to diverse polyether‐polyurethane wastes.
Abstract
Certain hydrolases preferentially catalyze acyl transfer over hydrolysis in an aqueous environment. However, the molecular and structural reasons for this phenomenon are still unclear. Herein, we provide evidence that acyltransferase activity in esterases highly correlates with the hydrophobicity of the substrate‐binding pocket. A hydrophobicity scoring system developed in this work allows accurate prediction of promiscuous acyltransferase activity solely from the amino acid sequence of the cap domain. This concept was experimentally verified by systematic investigation of several homologous esterases, leading to the discovery of five novel promiscuous acyltransferases. We also developed a simple yet versatile colorimetric assay for rapid characterization of novel acyltransferases. This study demonstrates that promiscuous acyltransferase activity is not as rare as previously thought and provides access to a vast number of novel acyltransferases with diverse substrate specificity and potential applications.
Metabolic engineering enables Bacillus licheniformis to grow on the marine polysaccharide ulvan
(2022)
Background
Marine algae are responsible for half of the global primary production, converting carbon dioxide into organic compounds like carbohydrates. Particularly in eutrophic waters, they can grow into massive algal blooms. This polysaccharide rich biomass represents a cheap and abundant renewable carbon source. In nature, the diverse group of polysaccharides is decomposed by highly specialized microbial catabolic systems. We elucidated the complete degradation pathway of the green algae-specific polysaccharide ulvan in previous studies using a toolbox of enzymes discovered in the marine flavobacterium Formosa agariphila and recombinantly expressed in Escherichia coli.
Results
In this study we show that ulvan from algal biomass can be used as feedstock for a biotechnological production strain using recombinantly expressed carbohydrate-active enzymes. We demonstrate that Bacillus licheniformis is able to grow on ulvan-derived xylose-containing oligosaccharides. Comparative growth experiments with different ulvan hydrolysates and physiological proteogenomic analyses indicated that analogues of the F. agariphila ulvan lyase and an unsaturated β-glucuronylhydrolase are missing in B. licheniformis. We reveal that the heterologous expression of these two marine enzymes in B. licheniformis enables an efficient conversion of the algal polysaccharide ulvan as carbon and energy source.
Conclusion
Our data demonstrate the physiological capability of the industrially relevant bacterium B. licheniformis to grow on ulvan. We present a metabolic engineering strategy to enable ulvan-based biorefinery processes using this bacterial cell factory. With this study, we provide a stepping stone for the development of future bioprocesses with Bacillus using the abundant marine renewable carbon source ulvan.