Refine
Document Type
- Doctoral Thesis (3) (remove)
Has Fulltext
- yes (3) (remove)
Is part of the Bibliography
- no (3) (remove)
Keywords
- Asthma bronchiale (1)
- CRMP2 (1)
- MICAL (1)
- Redoxreaktion (1)
- Thioredoxin (1)
- protein interaction (1)
- redox relay (1)
Institute
Survival, development, and function of cells depend on numerous signaling pathways or-
chestrating the response to external and internal stimuli. Besides the well-established signaling through reversible phosphorylation, the concept of specific, spatio-temporal redox modifi-
cations of protein cysteinyl and methionyl side chains that regulate the biological function of these proteins is supported by an overwhelming amount of data. Although the specific reduction of protein redox modifications has been studied intensively, the oxidation of protein side chains was thought to be a result of so-called ‘oxidative stress’. However, this term has been increasingly challenged, since signaling pathways depend on specific, spatio-temporal oxidation of target proteins, most likely catalyzed by specific enzymes. The discovery of MICAL (molecule interacting with CasL) proteins evinced
the first examples of specific oxidases in signal transduction in the redox regulation of cellular functions.As part of the semaphorin signaling pathway, MICAL proteins were characterized to stereospecifically oxidize methionyl residues in actin, thereby regulating actin deolymerization, a process important in neurogenesis and cell migration. This oxidation can be reversed by the specific methionine-R-sulfoxide eductase B1. Besides the regulation of actin dynamics, MICALs are involved in the regulation of cell proliferation and
apoptosis, and the production of hydrogen peroxide may qualify them as specific oxidases also for cysteinyl residues.
The target specificity of thioredoxin family proteins is determined by electrostatic compatibility
(2021)
The thioredoxin (Trx) family of proteins comprises many key enzymes in redox signaling, that catalyzes specific reversible redox reactions, e.g. dithiol-disulfide exchange reactions, (de-)glutathionylation, trans-nitrosylation, or peroxide reduction. With the analysis of a large number of proteins, as well as a certain redox couple in [article 1] and [article 4], we demonstrated that electrostatic complementarity is the major distinguishing feature that controls the specific interactions of Trxs with their target proteins. The primary aim of this work was to determine the importance of this specific interaction and the prediction, modulation, and engineering of functional redox interactions of Trx family proteins. To understand the role of electrostatic complementarity for the mammalian Trx1-TrxR complex, we generated more than 20 hTrx1 mutants and systematically engineered the electrostatic potential within and outside the contact area with TrxR [article 1]. The effects of these specific alterations distributed all over the protein surface were analyzed by enzyme kinetics, differential scanning fluorimetry (DSF), circular dichroism (CD) spectroscopy, and MD simulations. Trx family proteins have a broad and very distinct substrate specificity, which is a prerequisite for redox switching. In [article 4], we comprehensively compared the classification of various redoxins from all kingdoms of life based on their similarity in amino acid sequence, tertiary structure, and electrostatic properties. These similarities were then correlated to the existence of common interaction partners. Our analyses confirmed that the primary and tertiary structure similarities do not correlate to the target specificity of the proteins as thiol-disulfide oxidoreductases. However, we demonstrated that the electrostatic properties of the protein from both Trx or Grx subfamilies is the major determinant for their target specificity.
Although structurally very similar, CxxC/S-type or class I Grxs act as oxidoreductases and CGFS-type or class II Grxs act as FeS cluster transferases. In [article 3], we re-investigated the structural differences between the two main classes of Grxs to solve the mystery of the missing FeS transferase activity of the CxxC/S-type and the lack of oxidoreductase activity of the CGFS-type Grxs. The presence of a distinct loop structure adjacent to the active site is the major determinant of the Grx function. We confirmed that the function of Grxs can be switched from oxidoreductase to FeS cluster transferase by construction of a CxxC/S-type Grx with a CGFS-type Grx loop and vice versa. Results of several in vitro and in vivo assays together with the detailed structural analyses indicate that not a radically different substrate specificity accounts for the lack of activity, but rather slightly different modes of GSH binding, which is an essential nucleophile required in redox and iron homeostasis.
Various processes within the cell depend on GSH, including redox reactions, reversible posttranslational modifications, and iron metabolim. GSH is not only important in the export of FeS precursors from mitochondria, but it is also an essential cofactor for cluster binding in iron sulfur Grxs. In [article 2], we discussed the role of GSH and iron sulfur Grxs in iron metabolism, the physiological role of CGFS-type Grx interactions with BolA- like proteins, and the cluster transfer between Grxs and recipient proteins. The first well characterized physiological function of a Grx-BolA hetero complex is presented with the Grx3/4-Fra2-mediated regulation of iron homeostasis in yeast.
In synopsis, the results presented and discussed in these articles and the manuscript support the concept of electrostatic properties as the main determinant in substrate specificity towards functional predictions in Trx family proteins. The mathematical model presented here showed significantly accuracy and precision in function prediction. We are aware that our findings are focused on Trx family proteins as a particular family of proteins, but by using a machine learning strategy this mathematical model is being trained with numerous different protein models for better efficacy and accuracy, that may lead to new insights also in the specific interactions of other protein families. The new concept for the substrate specificity determinant doesn’t eliminate previously described aspects for molecular recognition, instead it reveals a deeper understanding of the protein-protein interaction. The 3D structural elements of a protein play a significant role in the specificity and function. We have been able to activate an inactive protein by replacing defined structural elements. Elimination of the loop structure from CGFS-type Grx5 transformed it from an FeS transferase into an oxidoreductase and the activity was further increased by modification of the active site. We believe that the present findings may be useful to investigate proteins in great detail regarding their function based on structure and electrostatic properties. Understanding the nature of the specific interactions may enable us to specifically modify the signal transduction pathways.
Thioredoxine (Trxs) bilden eine Familie ubiquitärer Oxidoreduktasen, welche durch posttranslationale Redox-Modifikationen von Cysteinyl-Thiolgruppen sowie die Regulation der intrazellulären Wasserstoffperoxidgehaltes die zelluläre Redoxantwort steuern. Es ist bekannt, dass Thioredoxine, Glutaredoxine (Grxs) und Peroxiredoxine (Prxs) wesentliche Signalwege von Inflammation, Proliferation und Apoptose beeinflussen und somit in vielen Pathologien, insbesondere bei entzündlichen Erkrankungen wie dem allergischen Asthma, eine entscheidende Rolle spielen. Derzeit sind vorwiegend die intrazellulären Funktionen der Proteine der Trx-Familie in Gesundheit und Krankheit umfassend untersucht, doch die extrazellulären Funktionen bei der Redox-Signalübertragung bleiben bis zum heutigen Tage weitestgehend im Dunkeln. In dieser Arbeit haben wir uns daher zum Ziel gesetzt, Verteilung und Funktion von Proteinen der Trx-Familie in der Regulation der Immunantwort zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf dem extrazellulären Vorkommen und den damit verbundenen Eigenschaften liegt.
Allergische Atemwegsentzündungen sind durch bronchiale Obstruktion und chronischen Umbau sowie Hyperreagibilität der Atemwege gekennzeichnet. Die Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies in der bronchialen Flüssigkeit der Lunge und die sich daraus ergebenden Veränderungen des Redoxzustands in den bronchialen Epithelzellen sind in den letzten Jahren in den Fokus der Asthmaforschung gerückt. Mehrere Studien beschrieben eine positive Wirkung von Trx1 und Grx1 in Atemwegsinfektionen, so würde eine Th2-typische Immunmodulation reduziert und verringere in der Folge den Umbau der Atemwegsstruktur – eine zentrale Pathologie des Asthmas.
In dieser Studie untersuchten wir die Expressionsniveaus von Proteinen der Trx-Familie in Lungengewebe und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit in einem Mausmodell der Ovalbumin (OVA) induzierten allergischen Atemwegsentzündung. Wir konnten eine Zunahme von Grx2 und Prx4 in intrazellulären Proben aus der Mäuselunge nach einsetzen der induzierten Atemwegsinfektion zeigen. Ausschließlich unter OVA-induzierter Inflammation wurde in diesen Proben eine zweite Isoform von Grx2, zytosolisches Grx2c, nachgewiesen. Die Behandlung von Mäusen mit intraperitoneal appliziertem, rekombinantem Grx2 parallel zur Induktion der Entzündung mit OVA, hatte eine entzündungshemmende Wirkung, die zu einer Verringerung des asthmatischen Phänotyps in der Immunhistochemie und einer signifikanten Reduktion der Gesamtzahl der Entzündungszellen, besonders der eosinophilen Granulozyten führte. Die Verabreichung der rekombinanten Grx2C40S-Mutante, der die Fähigkeit zur Katalyse des Dithiol-Reaktionsmechanismus fehlt, hatte nicht die gleiche entzündungshemmende Wirkung. Eine zusätzlich durchgeführte His-Tag-Färbung zeigte eine Aufnahme von rekombinantem Grx2 in die Epithelzellen und Makrophagen der entzündeten Lunge. Die Färbung von Lungenabschnitten für HIF1- und Pro-Caspase3 nahm nach Beginn der allergischen Atemwegsentzündung zu und ging bei den mit dem wildtyp Grx2 behandelten Mäusen deutlich zurück.
In den extrazellulären Fraktionen war die Konzentration von Trx1, Grx1, Prx2 und Prx4 unter Entzündungsbedingungen erhöht, zudem konnte Prx4 in dieser Studie erstmals nur in der Entzündung, nicht aber bei gesunden Mäusen nachgewiesen werden. In-vitro-Experimente, bei denen Makrophagen aus Balb/c-Mäusen stimuliert wurden, sollten Aufschluss über die Funktionen von Trxs und Grxs in der Immunantwort geben. Grx2 und Trx1 wurden als potenzielle Stimulatoren von Makrophagen identifiziert, die die Sekretion von RANTES, IL-6, IL-10 und TNF-α induzieren, während die Zytokinspiegel von IL-4 und INF-γ nicht verändert wurden. Bei kombinierter Verabreichung von Redoxinen mit LPS/IFN-γ, die einen Entzündungszustand nachahmt, wurde gezeigt, dass Trx1 die Zytokinspiegel von TNF-α und INF-γ im Vergleich zu LPS/IFN-γ allein senkt. Die Behandlung mit Trx1/LPS/IFN-γ induzierte die Produktion von IL-6 und RANTES auf ein Niveau vergleichbar mit der alleinigen Stimulation durch LPS/IFN-γ.
Diese Arbeit beleuchtet Proteinveränderungen von Thioredoxinen, Glutaredoxinen und Peroxiredoxinen in einem Mausmodell für allergische Atemwegsentzündungen mit besonderem Schwerpunkt auf der extrazellulären Verteilung und Funktion der Proteine. Wir zeigen, dass die Veränderungen der Proteinspiegel selektiv reguliert werden und zu einem fein abgestimmten Netzwerk von Partnern in der Redox-Signalgebung beitragen und somit Potenzial für mögliche Therapieansätze bieten.