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Das Neuroblastom ist eine pädiatrische Tumorerkrankung, die ihren Ursprung in undifferenzierten Nervenzellen des sympathischen Nervengewebes hat. Das ereignisfreie 5-Jahresüberleben von Hochrisikopatienten liegt trotz der Einführung neuer gegen das Disialogangliosid GD2-gerichteter Antikörpertherapien weiterhin nur bei ca. 50 %. Daher ist es wichtig, die Biomarker zu finden, die helfen, Patienten zu identifizieren, die bisher noch nicht von den etablierten Therapieansätzen profitieren. In dieser Arbeit wurden immunologische und genetische Parameter untersucht, die möglicherweise als Biomarker für das Ansprechen auf eine GD2-gerichtete Immuntherapie in Kombination mit Interleukin 2 (IL-2) dienen können. Dafür wurde der Einfluss der zytotoxischen NK-Zellen, Granulozyten (Eosinophile und Neutrophile) und regulatorischen T-Zellen (Treg) sowie der Zytokine IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-18 und CCL2 auf die antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) und dem ereignisfreien Überleben analysiert. Weiterhin wurde die Rolle von patientenspezifischen FCGR2A-H131R und 3A-V158F-Polymorphismen sowie die Killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) und KIR-Liganden (KIRL)-Genotypen bei einer Immuntherapie evaluiert.
53 Patienten haben bis zu fünf Zyklen Immuntherapie erhalten. Ein Zyklus beeinhaltete zunächst fünf Tage 6×106 IU/m2/Tag IL-2-Behandlung (Tage 1 - 5), gefolgt von einer Langzeitinfusion von dem anti-GD2-Antikörper ch14.18/CHO (Tage 8 - 18) in Kombination mit 6×106IU/m2/Tag IL-2 (Tage 8 – 12). Die Zahl der Effektorzellen und die Zytokinserumkonzentrationen wurden mittels Durchflusszytometrie ermittelt und die FCGR-Polymorphismen und KIR/KIRL-Genotyp mit einer validierten Real-Time-PCR bestimmt. Die ADCC wurde mittels eines Calcein-AM basierten Zytotoxizitätstest erfasst.
Die IL-2-Monotherapie an den Tagen 1-5 steigerte die Zahl der NK-Zellen, der Treg und der Eosinophilen stark im Vergleich zum Basiswert (Zyklus 1, Tag 1). Die Expansion der Neutrophilen wurde hingegen erst nach dem Start der Antikörperbehandlung beobachtet (Tag 15). IFN-γ, IL-6, IL-10, IL-18 und CCL2 erreichten ihre Spitzenkonzentrationen ebenfalls erst während der Antikörpertherapie. Überraschenderweise korrelierte weder die NK-Zell- noch die Granulozytenzahl mit der ADCC und dem ereignisfreien Überleben der Patienten. Hingegen zeigten Patienten mit einer starken Expansion der Treg signifikant niedrigere IFN-γ-Serumkonzentrationen sowie ein schlechteres ereignisfreies Überleben im Vergleich zu Patienten mit niedriger Treg-Zahl. Außerdem hatten Patienten mit hoher IL-18-Serumkonzentration währender der Antikörpertherapie ein signifikant verbessertes Überleben verglichen mit Patienten mit niedriger IL-18-Serumkonzentration. Zusammenfassend wurde eine starke Induktion der Treg beobachtet, die invers mit der IFN-γ-Serumkonzentration und dem ereignisfreien Überleben der Patienten korrelierte.
Die Patienten mit den hochaffinen FCGR2A-131H- und 3A-158V-Polymorphismen zeigten einen höhere ADCC und ein verlängertes ereignisfreies Überleben gegenüber den Patienten mit den FCGR2A-131R- und 3A-158F-Polymorphismen. Patienten mit aktivierenden KIR (Genotyp B/x), insbesondere dem KIR2DS2, zeigten eine gesteigerte ADCC und ein verlängertes ereignisfreies Überleben verglichen mit den Patienten mit dem inhibitorischen KIR-Genotyp ohne aktivierende KIR (Genotyp A/A). Entsprechend hatten Patienten mit dem vorteilhaften KIR2DS2 und hochaffinen FCGR-Polymorphismen die stärkste Induktion der ADCC und das längste ereignisfreie Überleben im Vergleich zu Patienten mit inhibitorischen KIR-Genotyp und niedrigaffinen FCGR-Polymorphismen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass KIR- und FCGR2A- und 3A-Genotypen die ADCC sowie das Ansprechen auf eine ch14.18/CHO-basierte Immuntherapie in Kombination mit IL-2 beeinflussen und daher in Zukunft als Biomarker für diese Therapie dienen können.
Schließlich erwiesen sich FCGR-Polymorphismen in Kombination mit der Treg-Zahl als Biomarker zur Identifizierung von Patienten, die kein Ansprechen auf die Immuntherapie gezeigt hat.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass immunologische und genetische Parameter als prädiktive Biomarker einer antikörperbasierten Immuntherapie bei Patienten mit Hochrisikoneuroblastom verwendet werden können, um Patienten zu identifizieren, die von der bisherigen Immuntherapie nicht profitieren würden. Für solche Patienten müssen alternative Therapieoptionen angeboten werden um einen schnellen Rückfall der Erkrankung zu verhindern.
Thematik:
Die vorliegende Single-Center-Studie ist auf die Prävention der schwer behandelbaren NEC beim VLBW-Frühgeborenen ausgerichtet. Um die vulnerable frühkindliche Mucosa vor versorgungs- sowie überlastungsbedingter Ischämie zu schützen, gilt es eine effektive Behandlung der Frühgeborenenanämie und zugleich den potentiell schädigenden Einfluss der Transfusionstherapie, von der diese Patienten häufig betroffen sind, zu identifizieren. Es wird die Hypothese formuliert, dass eine Volumenüberlastung durch Transfusion ein „capillary clotting“ und in der Folge die NEC auslösen oder negativ beeinflussen kann oder aber im Gegenteil ein primär ischämischer Schaden bei einer eher restriktiven Transfusionsstrategie als aggravierender Faktor der NEC möglich scheint. Die Fragestellung konzentriert sich auf die „Transfusionsdynamik“ (Volumen/Zeit) während der akuten klinischen Phase der Erkrankung bei enteral ernährten VLBW-Frühgeborenen. Wirken sich Schwere der Anämie und restriktives Transfundieren negativ auf die NEC-Rate aus? Oder ist im Gegenteil eine schnelle, volumenreiche EK-Bluttransfusion assoziiert mit der Entstehung der NEC und einem schlechterem Outcome? Welches ist die ideale Ernährungsstrategie während einer transfusionsbedürftigen Anämie, um das unreife Darmepithel zu unterstützen ohne es zu überfordern und lässt sich ein NEC erschwerendes Zusammenspiel beobachten?
Studiendesign:
Es werden 3 Patientenkollektive (NEC, Kontrollen, laparotomierte Patienten ohne NEC) der Geburtsjahrgänge 2002-2009 analysiert. Umfassende klinische Daten werden deskriptiv dargestellt. Der Kostaufbau wird im Rahmen einer Fall-Kontroll-Analyse ausgewertet. Die transfusionsbegleitende Ernährung wird für das NEC-Kollektiv bezogen auf die Mortalität in der Gruppe miteinbezogen. Die Auswertung der Transfusionsdynamik erfolgt mittels individuellem „Dynamikquotienten“ pro Patient (kumulierte Volumina auf kumulierte Zeit) und auf Basis der individuellen Mittelwerte mittels Rangsummentestung nach Kruskal-Wallis und Man-Whitney-U bezogen auf Morbidität (NEC/Nicht-NEC) und Mortalität im Gruppen-vergleich. Hämatokrit vor Transfusion und Hämoglobin zum Erkrankungszeitpunkt werden ergänzend in die Betrachtungen miteinbezogen.
Ergebnisse:
Die Analyse der Transfusionsdaten zeigt eine große Bandbreite der verabreichten Volumina pro Stunde und Kilogramm Körpergewicht in allen 3 Kollektiven. Die NEC-Patienten zeigten eine signifikanten Mehrbelastung an Transfusion bezogen auf die mittlere kumulierte Transfusionsdauer (p=0,0130, 95%KI) und den „Dynamikquotienten“ (p=0,0376, 95% KI) für das mittlere kumulierte Volumen auf Zeit in Stunden. Auf die Mortalität hatte dies im Gruppenvergleich keine statistisch signifikante Auswirkung. Ein signifikanter Einfluss der Ernährung bis Erkrankung und während Transfusionstherapie auf die Mortalität innerhalb der NEC-Gruppe konnte nicht gefunden werden. Als Zufallsbeobachtungen zeigte das NEC-Kollektiv der Studie eine interessante infektiologische Komponente in Form einer gehäuften Belastung mit pathogenen Keimen in Stuhl- (82%)- und Blutproben (47%).
Schlussfolgerung:
In der Studie zeigte sich ein typisches VLBW- und NEC-Kollektiv bezogen auf Inzidenz und Mortalität sowie Assoziation mit geringem Geburtsgewicht und Gestationsalter. Die vorliegenden Studienergebnisse lassen eine infektionsgetriggerte NEC im Kollektiv möglich erscheinen. Die modellhafte Größe des „Dynamikquotienten“ zeigte zudem eine signifikante Transfusionsbelastung in der NEC-Gruppe auf, welche in größeren Studien mit mehr konfirmativer Aussagekraft weiter untersucht werden sollte.
Als hochmaligner Tumor stellt das Neuroblastom ausgehend vom sympathischen Nervensystem den häufigsten soliden, extrakraniellen Tumor des Kindesalters dar. Aufgrund seiner heterogenen Charakteristik und teils höchst aggressiven Wachstums bedarf es besonders im Hinblick auf die hohe Rezidivrate von Hochrisikopatienten neuer innovativer Therapien, die einen langanhaltenden Anti-Tumoreffekt induzieren. Durch zunehmende Erkenntnisse auf dem Gebiet der Tumorimmunologie sind dabei besonders immuntherapeutische Behandlungsstrategien immer weiter in den Vordergrund gerückt. Diese führen zur spezifischen Aktivierung des körpereigenen Immunsystems verbunden mit der Erkennung und Eliminierung der Tumorzellen. In der Praxis ist eine wirksame Anwendung der aktiven Immuntherapie jedoch mit einigen Herausforderungen verbunden. Dazu gehören die Identifikation von geeigneten Tumorantigenen, die optimale Aufnahme, Prozessierung und Präsentation der Antigene durch Immunzellen sowie die Überwindung der Immuntoleranz zur Induktion zytotoxischer und Gedächtnis-T-Zellen. Auch die natürlichen Regulationsmechanismen sollten nicht außer Acht gelassen werden, da diese einerseits die anti-tumoralen Effekte einer resultierenden Immunantwort eindämmen können, jedoch andererseits gesundes Gewebe vor einer Autoimmunreaktion schützen. Ziel dieser Arbeit war es daher die bereits bekannte präklinische Wirksamkeit einer Tyrosinhydroxylase (TH)-gerichteten Immuntherapie gegen das Neuroblastom durch eine zusätzliche Immunstimulation mit dem Zytokin IL-15 und einer Immuncheckpoint-Blockade zu verbessern. Dafür wurde ein bicistronisches DNA-Vakzin generiert, welches sowohl für die cDNA der TH als auch die von IL-15 kodiert. Um dabei die Herstellung und MHC-I-vermittelte Präsentation antigener TH-Peptide, effektiv zu gestalten und die Immunigenität des Vakzins zu erhöhen, erfolgte die upstream-Kopplung einer modifizierten Ubiquitin-Sequenz an die der xenogenen TH. Die Integration der IL-15-Sequenz in das DNA-Vakzin ermöglicht eine auf die Mikroumgebung der Antigenpräsentation beschränkte lokale Applikation und kann so die Aktivierung zytotoxischer T-Zellen unterstützen ohne systemische Zytokin-bedingte Nebenwirkungen zu verursachen. Nach der Generierung des Vakzins erfolgte die In-vitro-Charakterisierung durch Transfektion von CHO-Zellen mit dem DNA-Vakzin, wobei die Plasmid-vermittelte Synthese der ubiquitinierten TH und Freisetzung von bioaktivem IL-15 bestätigt wurden. Die Evaluierung der anti-tumoralen Eigenschaften in vivo erfolgte in einem syngenen Mausmodell, wobei attenuierte S. typhimurium SL7207 als orales Applikationsvehikel für das DNA-Vakzin dienten, die durch die Stimulierung des mukosalen Immunsystems dem DNA-Vakzin eine gesteigerte Immunogenität verleihen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der S. typhimurium-vermittelte Genransfer sowie die effektive Expression der im Vakzin enthaltenen Gene in den APC der Peyer Plaques nachgewiesen werden. Weiterhin konnten die durch zytotoxische T-Zellen vermittelte anti-tumoralen Effekte einer TH-basierten Immuntherapie, repräsentiert durch ein reduziertes Primärtumorwachstum sowie verminderter Metastasierung, durch die Ko-Expression von IL-15 in einem syngenen Mausmodell gesteigert werden. Interessanterweise führte die Immuncheckpoint-Blockade durch eine anti-PD-1-AK-Therapie sowohl mit als auch ohne Kombination mit dem DNA-Vakzin zu einem signifikanten Anstieg der anti-tumoralen Effekte. Dieses Ergebnis unterstreicht die nachteilige Rolle immunregulatorischer Mechanismen bei der Ausbildung einer zellulären Immunantwort durch eine Immuntherapie, was ergänzend durch den Nachweis immunsuppressiver Zytokine in der Tumormikroumgebung bestätigt wurde. Bei der Anwendung von Behandlungsstrategien zur aktiven Immunisierung ist daher die Blockierung der natürlichen Regulationsmechanismen sowie der tumor-induzierten Immunsuppression von enormer Bedeutung.
Zusammenfassend war das in dieser Arbeit generierte xenogene DNA-Vakzin in der Lage durch die Ko-Expression von IL-15 die NB-spezifischen Effekte der TH-gerichteten Immuntherapie zu steigern. Des Weiteren konnten mittels einer anti-PD-1-gerichteten Immuncheckpoint-Blockade immunregulatorische Prozesse unterbunden und dadurch die CTL-vermittelten anti-tumoralen Effekte der Target-gerichteten DNA-Vakzinierung verstärkt werden. Gerade bei schwach immunogenen Tumoren wie dem Neuroblastom sind Kombinationstherapien notwendig, welche eine TAA-gerichtet Immunantwort zur Induktion eines Immunologischen Gedächtnisses in Gang bringen und gleichzeitg die Regulationsmechanismen unterbinden, um so eine effektive Tumorbekämpfung zu ermöglichen. Diese vielversprechende Vakzinierungsstrategie könnte somit neuer immunologischer Ansatz für eine adjuvante Erhaltungstherapie für eine minimale Resterkrankung bei refraktären Neuroblastompatienten darstellen.
Background and Aim: High-risk neuroblastoma (HR-NB) is associated with a dismal prognosis despite the utilization of multimodal treatment, including therapy with an anti-GD2 monoclonal antibody (mAb). Here we investigated the use of an anti-idiotypic vaccine (ganglidiomab) in patients with HR-NB with or without relapse. Ganglidiomab is a murine monoclonal anti-idiotypic antibody and a structural mimic of GD2.
Patients and Methods: In this compassionate use program, seven HR-NB patients (two with relapsed disease) who achieved complete remission after salvage therapy were enrolled. They received 6-22 subcutaneous vaccine injections every two weeks. Each subcutaneous vaccine injection consisted of 0.5mg of ganglidiomab with 1.67mg aluminum as adjuvant. The immune response was quantified by ELISA methods. We investigated the vaccine-induced antibody response against ganglidiomab (vaccine), against ganglidiximab (a human-mouse chimeric variant of ganglidiomab), as well as against GD2, in immunized patients and determined the time to relapse or progression to last follow-up.
Results: Among the patients enrolled, 6/7 showed an immune response against ganglidiomab as well as an anti-ganglidiximab seroconversion. The non-responding patient had a haploidentical stem cell transplantation as part of the previous treatment, which is associated with B-cell immunodeficiency. However, an anti-GD2 seroconversion was only seen in 2/7 patients. Common toxicities were self-limited, including injection-related local reactions. No fever, pain, neuropathy, or grade 3/4 toxicities occurred during or post-treatment. All immunized patients did not experience a relapse or progression of their neuroblastoma with a median range of 56 months and 16 days from the first vaccine dose to the last follow-up, which contrasts with what is expected from historical control cohorts.
Conclusions: This is the first in man use of the anti-idiotype vaccine ganglidiomab in HR-NB patients. The vaccine was well-tolerated, and none of the vaccinated patients experienced a relapse or progression. These findings provide an important basis for the design of prospective clinical trials.
Das Neuroblastom (NB) stellt als Tumor des sympathischen Nervenstranges den häufigsten extrakraniellen soliden Tumor des Kindesalters dar. Ein Bedarf innovativer Therapien, welche eine effektive Anti-Tumorantwort induzieren, ergibt sich aus dessen heterogener Charakteristik, höchst aggressivem Wachstum und trotz Therapien hohen Rezidivraten der high-risk-Patient*innen. In den letzten Jahren konnten durch zunehmende Erkenntnisse im Bereich der Tumor- immunologie verschiedene immuntherapeutische Verfahren etabliert werden. So stellt die Anti-GD2-Therapie (ch14.18/CHO) einen zentralen klinischen Pfeiler der multimodalen Therapie des high-risk-NB dar. Hierbei werden Anti-GD2-AK verab- reicht, die das NB-spezifische Antigen GD2 erkennen, was zur gezielten Aktivierung des körpereigenen Immunsystems hauptsächlich durch NK-Zellen mit anschlie- ßender Tumorzelllyse führt. Herausforderungen ergeben sich aus der Überwindung der immuninhibitorischen Tumorumgebung sowie der Reduzierung natürlicher Regulationsmechanismen.
Vorherige Arbeiten der Arbeitsgruppe haben eine Anti-GD2-Immuntherapie abhängige Induktion des Immuncheckpoints PD-1/PD-L1 sowie der regulatorischen myeloiden CD11b+-Zellen (MRC) gezeigt. Für die vorliegende Arbeit war nun die Rolle der CD11b+ MRC von besonderem Interesse. Hierfür wurden CD11b+ Zellen in einem syngenen NB-Mausmodell mittels Anti-CD11b-AK blockiert oder durch 5-FU selektiv depletiert, was zu einem deutlich reduzierten Tumorwachstum und verbessertem Überleben führte. Zusätzlich wurde mittels RT-PCR die relative Gen- expression MRC-modulierender Gene (Arg1, CCL2, GM-CSF, IDO, IFNγ, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-10, M-CSF, M-CSFR, iNOS, TGF-β1 und VEGF-A) in der Tumormikroumgebung sowie der Milz evaluiert. Hier wurde eine Reduktion der modulierenden Gene nicht nur in der Tumormikroumgebung, sondern sogar peri- pher durch die Depletion von MRC nachgewiesen. Somit konnte eine negative Rolle der MRC beim NB bestätigt werden.
Diese Ergebnisse stellten eine Grundlage für die kombinierte Immuntherapie aus Anti-GD2-AK und MRC-Depletion dar. Eine Steigerung der antitumoralen Wirksam- keit im Vergleich zu den entsprechenden Monotherapien wurde gezeigt. Dabei wurden eine verbesserte Überlebenswahrscheinlichkeit und ein reduziertes Tumor- wachstum festgestellt. Die vorliegenden Ergebnisse liefern daher die Grundlage für einen neuartigen kombinierten Therapieansatz, um die immer noch schlechten Überlebenschancen der high-risk-Patient*innen zu verbessern.
Neuroblastoma (NB) is an aggressive, poorly immunogenic tumor in childhood. Therapy for high-risk NB remains challenging. Immunotherapy with anti-GD 2 antibody ch14.18/CHO effectively prolongs the survival of NB patients.
Killer-immunoglobulin-like receptor (KIR)/human leucocyte antigen (HLA) mismatch and Fc gamma receptor (FCGR) polymorphisms are reported to affect antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) induced by monoclonal antibodies. To determine whether FCGR polymorphisms and KIR/HLA mismatch are associated with the survival following ch14.18-based immunotherapy, genotyping methods that allow for genotype determination of FCGR2A, -3A, -3B, KIR2DL1, 2DL2, 2DL3, and 3DL1 have been established and applied to the analysis of 53 NB patients treated with ch14.18/CHO.
High-affinity polymorphisms of FCGR2A (H131) and FCGR3A (V158) were associated with improved survival. Importantly, patients displaying both the FCGR3A-V158 and FCGR2A-H131 alleles exhibited significantly improved event-free survival. No association was found between KIR/HLA genotypes or FCGR3B alleles and patients’ survival in our patient cohort.
In conclusion, impact of FCGR2A and -3A genotypes in response to ch14.18/CHO immunotherapy in combination with IL2 was demonstrated. FCGR2A and -3A might therefore provide a prognostic marker when conducting ch14.18/CHO-based immunotherapy.
Jährlich erkranken in Deutschland etwa 130 Kinder neu an einem Neuroblastom. Mit einem Anteil von 7 % aller malignen Tumorerkrankungen im Kindesalter stellt es damit den häufigsten soliden extrakraniellen Tumor bei Kindern unter 15 Jahren dar. Leider ist zum Zeitpunkt der Erstdiagnose bereits jedes zweite Neuroblastom metastasiert und die Diagnose für fortgeschrittene Stadien noch immer besonders schlecht. Die Verbesserung von Lebenserwartung und -qualität dieser Patienten ist somit von großer Bedeutung und Gegenstand gegenwärtiger Forschung. In den letzten Jahren zeigten sich bereits große Erfolge auf dem Gebiet der Tumorimmunologie. Nach dem Prinzip der passiven Immunisierung wird der monoklonale Antikörper ch14.18/CHO (Dinutuximab beta) eingesetzt, welcher sich gegen das auf Neuroblastomzellen hoch exprimierte tumorassoziierte Antigen GD2 richtet. Die Wirksamkeit wurde in mehreren klinischen Studien bestätigt, zeigte jedoch auch erhebliche Nebenwirkungen dieser Therapie, insbesondere in Form neuropathischer Schmerzen.
Diese Arbeit zeigt die Ergebnisse eines unizentrisch an der Universität Greifswald durchgeführten Programms mit dem Ziel, die Nebenwirkungen durch eine veränderte Applikationsart zu senken. Verabreicht wurde eine verlängerte kontinuierliche Infusion von ch14.18/CHO in Kombination mit subkutaner Applikation von Proleukin (IL-2) und oraler Isotretinoin (13-cis-RA)-Gabe. Gemessen an der Schmerzintensität und dem Morphinbedarf der Patienten konnte ein niedriges Schmerzniveau mit stark rückläufiger Tendenz im Therapieverlauf beobachtet werden. Im Studienvergleich war eine Schmerzreduktion messbar. Es ließen sich ein Anstieg der Antikörper- und Effektorzellspiegel sowie eine korrelierende anti-tumorale Aktivität über den gesamten Behandlungszeitraum von sechs Monaten verzeichnen. Hohe zytolytische Werte in der ADCC in vitro korrelierten mit einem verbesserten Outcome der Patienten in Form eines längeren EFS und OS. In Zusammenschau der Daten bestätigt dies eine effektive Immuntherapie bei Langzeitinfusion des Antikörpers. Bei kontinuierlicher Infusion des Antikörpers und niedrigen Nebenwirkungen ist in Zukunft eine ambulante Therapie mit gesteigerter Lebensqualität für die Patienten denkbar.