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Die vorliegende Arbeit untersucht genetische Risikofaktoren der chronischen Pankreatitis (CP) mithilfe von Next-Generation Sequenzierungsdaten einer Primärkohorte und spezifischer Genotypisierung von Kandidatengenen in einer Validierungskohorte. Es sollten neue Risikovarianten identifiziert, bereits bekannte bestätigt und mögliche Synergismen bei trans-heterozygoten Merkmalsträgern aufgezeigt werden. Anhand einer Kandidatengen-Liste, u.a. aus dem Bereich der Proteasen, der Primärziliengene, des Immunsystems und des Fettstoffwechsels, wurden aus den Genom-Sequenzdaten einer Primärkohorte aus Patienten mit idiopathisch-chronischer Pankreatitis (ICP) und pankreasgesunden Kontrollprobanden potenzielle Risikovarianten für die CP zur Validierung ausgewählt. Die Auswertung der Sequenzdaten ergab vier Varianten mit signifikanter Häufung unter den ICP-Patienten (p.V579M [IFT74], p.H3215Y [FAT4], c.1023-8C>T [MAP2K1], p.F20L [FLII]), sowie drei weitere Varianten (p.S65C [HFE], p.F224L [IFT74], p.S522L [ZNF18]), die in der Primärkohorte eine ähnliche Verteilungs-Tendenz zeigten. Im Rahmen einer anschließenden Überprüfung der Sequenzvarianten mittels Real Time-PCR in einer größeren Validierungskohorte bestehend aus ICP-Patienten, Patienten mit alkoholisch-chronischer Pankreatitis (ACP) und gesunden Kontrollen konnten die Ergebnisse der Primärkohorte nicht bestätigt werden. Zwei Varianten (c.1023-8C>T [MAP2K1], p.F20L [FLII]) wurden jedoch ausschließlich bei Patienten mit CP nachgewiesen. In der erweiterten Primärkohorte wurden auch Prävalenz und Synergismen bekannter Risikovarianten für die CP überprüft. Es konnte die SPINK1-Variante p.N34S als Risikofaktor für alkoholisch-chronische Pankreatitis bestätigt werden (p=0,006). Die CTRC-Variante p.G60G kam im rezessiven Vererbungs-Modell signifikant häufiger bei Patienten mit ICP vor (p=0,02), unter den ACP-Patienten wurde das Signifikanzniveau jedoch nicht erreicht (p=0,05). In der Gruppe der CP-Patienten mit p.N34S-Mutation war das trans-heterozygote Vorliegen von p.G60G/p.N34S signifikant mit chronischer Pankreatitis assoziiert, sowohl für heterozygote als auch homozygote Träger der p.G60G-Mutation (p=0,005 bzw. p>0,0001). Somit konnte p.G60G ebenfalls als Risikofaktor für eine CP bestätigt werden. Die vermutlich Proteinfehlfaltungs-assoziierte CPA1-Variante p.E283K wurde bei einem ICP-Patienten, nicht jedoch bei pankreasgesunden Kontrollen, nachgewiesen. Auch das trans-heterozygote Vorliegen von CTRC- und CFTR-Varianten in dieser Kohorte war signifikant mit idiopathisch-chronischer Pankreatitis assoziiert (p=0,03). Für die Identifizierung neuer Risikovarianten waren die zur Verfügung stehenden NGS-Daten der Patientenkohorte nicht ausreichend, jedoch konnte ein erhöhtes CP-Risiko für spezifische Risikoallele und insbesondere trans-heterozygote Merkmalsträger nachgewiesen werden.
Die Entstehung und Entwicklung der akuten Pankreatitis in BPI-Knockout Mäusen im Taurocholat-Modell
(2023)
Die akute Pankreatitis kann einen schweren, lebensbedrohlichen Verlauf nehmen. Dabei bestimmen vor allem die Komplikationen der Pankreatitis wie Multiorganversagen und Sepsis die Mortalität. Eine wichtige Rolle in der akute Pankreatitis nimmt das Immunsystem ein. Neben dem Ausmaß der lokalen Schädigung im Pankreas bestimmt das Immunsystem die weitere Entwicklung der Pankreatitis und die damit einhergehende systemische Reaktion. Sowohl eine überschießende pro- als auch anti- inflammatorische Reaktion können eine Schädigung anderer Organe und bakterielle Infektionen begünstigen. Das bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) ist ein Protein, welches sich hauptsächlich in den azurophilen Granula neutrophiler Granulozyten befindet. Durch seine Struktur wirkt es anti-mikrobiell und kann zudem eine überschießende Immunantwort verhindern. In der akuten Pankreatitis könnte das BPI aufgrund der beschriebenen Funktionen neben der antimikrobiellen Wirkung auch Einfluss auf die Entwicklung der Immunreaktion nehmen. Um die Rolle des Bactericidal/permeability-increasing Protein in der Entwicklung und dem Verlauf der experimentellen akuten Pankreatitis zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit C57BL/6-Mäuse mit einem Knock-out des BPI-Genes mit C57BL/6 Wildtyp-Mäusen verglichen. In beiden Gruppen wurde durch Taurocholat-Injektion eine Pankreatitis induziert. Die Gruppen wurden bezüglich des lokalen Schadens im Pankreas und bezüglich der systemischen Immunreaktion untersucht. In der Taurocholat-induzierten Pankreatitis in BPI -/- Mäusen konnte eine zunächst mildere Pankreatitis als in der Vergleichsgruppe nachgewiesen werden. Durch eine geringere Leukozyteninfiltration trat eine mildere Pankreatitis auf. Am ehesten scheint die Ursache im veränderten Verhalten bzw. Fehlen der neutrophilen Granulozyten zu liegen. Im weiteren Verlauf der Erkrankung trat eine deutliche Zunahme der Ausprägung der Pankreatitis auf. Neben der verstärkten Schädigung der Pankreata der BPI -/- Mäuse ist eine verstärkte bakterielle Translokation aufgetreten. Auffällig war in dieser Phase der Erkrankung der vermehrte Nachweis von Makrophagen und des Chemokins MCP-1, welches vor allem den Makrophagen und der Pro-Inflammation zuzuordnenden ist. Gemeinsam könnten sie ursächlich für die deutliche Zunahme der Pankreatitis in den BPI -/- Mäusen sein. Insgesamt lag aber kein signifikanter Unterschied in den systemischen Komplikationen oder der Mortalität vor, sodass die Rolle des BPI in der akuten Pankreatitis vor allem in der lokalen Immunantwort anzunehmen ist.
Zusammenfassung
Die chronische Pankreatitis ist eine durch wiederkehrende Entzündungsschübe gekennzeichnete Erkrankung des Pankreas, die meist mit einem ausgeprägten Verlust der endokrinen und exokrinen Organfunktion verbunden ist. Der Übergang einer akut rekurrierenden in eine chronische Form ist meist fließend.
Trotz der prinzipiell unbekannten Ätiologie sind mit Mutationen in u.a. dem SPINK1- und CFTR- Gen bereits genetische Risikofaktoren für die Entstehung einer idiopathischen Pankreatitis beschrieben. Für die bisher am umfangreichsten untersuchte Leu26Val-Mutation im CTSB existieren unterschiedliche Konklusionen in indischen und europäischen Arbeitsgruppen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Patientenkohorten auf Sequenzvarianten im Bereich des Promotors, der 5’UTR und des Translationsstartes des CTSB als Risikofaktoren für die idiopathische Pankreatitis und deren möglicher Einfluss auf die Entstehung von Spleißvarianten und die Genexpression untersucht und mit lokalen Blutspendern sowie der europäischen Kontrollkohorte des 1000-Genome-Projektes verglichen. Hierfür wurden 278 Patienten mit einer idiopathisch chronischen und 83 Patienten mit einer idiopathisch akut rekurrierenden Pankreatitis mittels bidirektionaler Sanger-Sequenzierung und Taqman-Assays genotypisiert.
Besonders hervorzuhebende SNP sind die beiden Missense-Varianten c.76C>G (Leu26Val) und c.157A>G (Ser53Gly) sowie der zwar nur bei einem Patienten detektierte, aber direkt innerhalb der Exon-/Intron-Grenze lokalisierte c.-100+1G>A. Die Varianten c.76C>G und c.157A>G zeigten bei Pankreatitis-Patienten eine signifikant geringere Prävalenz als bei den Kontrollen. Für weitere Varianten fanden sich keine signifikanten Assoziationen mit der idiopathischen Pankreatitis.
Bei der Haplotypenanalyse kam der Haplotyp TCGCG mit den mutierten Allelen der beiden Missense-Mutationen ebenfalls bei Pankreatitis-Patienten signifikant seltener als bei den Kontrollen vor.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Grundlage für die Untersuchung der Assoziation zwischen unterschiedlichen Transkriptionsstartpunkten im Promotorbereich des CTSB-Gens und der Genexpression geschaffen. Hierfür wurden Reportergenkonstrukte aus dem pEGFP1-Vektor, SV40-Promotor und den Spleißvarianten 1, 2 und 4 des CTSB in HEK293- und PatuT-Zellen stabil transfiziert und die Genexpression mittels Fluoreszenzmikroskopie gezeigt.
Anhand dieser Arbeit erscheinen Sequenzvarianten im CTSB zwar weiterhin möglich, wenn auch unwahrscheinlich als Risikofaktoren für die idiopathische Pankreatitis. Anhand der erstellten Reportergenkonstrukte kann der Hypothese zur unterschiedlichen Aktivität des CTSB in pankreatischem Gewebe, hervorgerufen durch verschiedene Spleißvarianten des Gens, weiter nachgegangen werden.
Acute pancreatitis (AP) is one of the most common and widely increasing gastrointestinal
diseases leading to hospitalization without specifically available therapy. Among various
etiologies, biliary origin is the most common cause. However, the effects of BAs, given
systemically, on AP remains elusive. A detailed characterization of the mechanisms through
which BAs contribute to the pathogenesis and severity of AP will greatly improve our
understanding of the underlying pathophysiology and may facilitate the development of
treatment, early identification of complications, and prevention for AP. In this view, the roles of
different circulating BAs using in vitro-to-in vivo models were investigated and the underlying
mechanisms through which BAs modulate the severity of AP were addressed. The impact of
hydrophobic and hydrophilic BAs on both, isolated acinar cells and different animal models
induced by repetitive injections of caerulein or L-arginine, ligation of the pancreatic duct (PDL)
or combined bile and pancreatic duct ligation (BPDL), were tested. Disease severity was
assessed by biochemical and histological parameters. Serum CCK concentrations were
determined by enzyme immunoassay. The binding of CCK1 receptor was measured using
fluorescent-labeled CCK. Human BA profiles in AP patients were quantified and that were
correlated with etiology as well as clinical course. In acinar cells, hydrophobic BAs mitigated
the damaging effects of CCK. The same BAs further enhanced pancreatitis in L-arginine and
PDL-based pancreatitis whereas they ameliorated pancreatic damage in the caerulein and
BPDL models, in which CCK was involved. The chemical effect of BAs on protease trypsin
was also observed, however, it was similar between hydrophobic and hydrophilic compounds.
Mechanistically, the binding affinity of the CCK1 receptor was significantly reduced by
hydrophobic BAs. In patients, the sum of hydrophobic but not hydrophilic BAs correlated with
the etiology and severity of AP.
Post-endoscopic retrograde cholangiopancreatography (ERCP) pancreatitis (PEP) was
reported to be related with CCK and several pharmaceutical agents have been used to prevent
this most common and potentially severe complication, but those are of limited benefit. In this
regard, our multicenter multinational randomized control trial was designed to compare the
efficacy of indomethacin and N-acetylcysteine (NAC) for the prevention of PEP. A total of 432
ERCP patients from 6 countries were recruited and randomly assigned to receive either NAC
(group A, 84 cases), indomethacin (group B, 138 cases), NAC + indomethacin (group C, 115
cases) or placebo (group D, 95 cases) two hours before procedure. The rate of PEP in groups
A, B and C in comparison with placebo were 10.7%, 17.4%, 7.8% vs 20% (p = 0.08, 0.614 &
0.01, respectively).
Among complications of AP, infection of pancreatic necrosis is one of the most severe
consequence that mostly necessitates interventional therapy. A model to identify parameters
that are useful for the prediction of infected necrosis at an early stage was developed. A
retrospective analysis was conducted in 705 AP patients, who underwent contrast-enhanced computed tomography (CT scan). Both laboratory and clinical parameters were analyzed for
an association with infected pancreatic necrosis, which was microbiologically confirmed. A
logistic regression analysis with stepwise inclusion of significant variables was used to develop
a prediction model. We tested the model quality by receiver operating characteristics analysis.
We found a significant association between 11 parameters with an infection including albumin,
creatinine, C-reactive protein (CRP), and alcoholic etiology, which were independent variables
in the final predictive model with an area under the curve of 0.819.
In the same cohort in which we developed the prediction model above, 89 AP cases with
necrotic complications diagnosed by CT scan were identified. These complications with high
morbidity and mortality required endoscopic drainage, which possibly accompanies severe
adverse events. All complications which occurred in patients who underwent those procedures
and their associated features were retrospectively analyzed. Positive necrosis cultures and a
larger diameter of the intervened necroses were significant factors associated with the
occurrence of adverse events, in which the former was the most significant predictor with Odds
Ratio of 6.1.
The entire work demonstrated that hydrophobicity of BAs and the involvement of CCK are
relevant for the clinical course of AP. Systemic BAs may affect the severity of AP by interfering
with the binding of the CCK1 receptor. Oral NAC is effective for prevention of PEP and the
combination of NAC plus indomethacin resulted in the lowest PEP rate. A model using albumin,
creatinine, CRP, and alcoholic etiology can differentiate infected and sterile pancreatic
necrosis and control of infection is crucial for successful endoscopic drainage therapy in
complicated AP. The exact pathophysiologic mechanisms, especially in CCK-related pathways,
and the potential impact of BAs in human AP, in particular in preventing PEP, need to be investigated in further studies.