92C40 Biochemistry, molecular biology
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Chiral amines represent high-value fine chemicals serving as key intermediate products in pharmaceutical, chemical and agrochemical industries. In the past decades, application of amine transaminases (ATAs) for stereoselective amination of prochiral ketones emerged to an environmentally benign and economically attractive alternative to transition metal-catalyzed asymmetric synthesis to afford optically pure amines at industrial scale. However, the restricted substrate scope of wild-type transaminases prohibited the conversion of particularly sterically demanding substrates, making protein engineering indispensable. The following thesis covers elaboration of a novel assay for transaminases (Article I) and identification and development of transaminase variants in order to achieve biocatalytic preparation of a set of pharmaceutically relevant model amines, ideally in optically pure form for both stereoisomers, preferentially using asymmetric synthesis and most preferably using isopropylamine as cost-efficient amine donor co-substrate (Article II-IV). The aforementioned target amines and the corresponding precursor ketones (see Scheme 4.1) were conceived and provided by the company F. Hoffmann-La Roche to attain suitable biocatalysts for a variety of potential intermediates for active pharmaceutical ingredients. Protein engineering of the transaminase scaffolds investigated in this thesis comprised: Initial screening for suitable starting enzyme scaffolds, structure-guided rational design of these scaffolds to enable bulky planar substrate acceptance, elaboration of a sequence motif, verification of the motif and preparative-scale asymmetric synthesis reactions (Article II). For non-planar and structurally different target substrates, namely spatially bulky or bi-cyclic bridged substrates, the transaminase variants were specifically refined and a different evolutionary route had to be pursued (Article III and Article IV). These results (Article II) represent not only the first successful endeavor to engineer a PLP-fold type I amine transaminase (commonly denoted as (S)-selective) for the conversion of highly sterically demanding substrates, but also generally expanded the scope of available fold type I amine transaminases by enzymes having a novel and exceptionally broad substrate spectrum. Aside from structure-guided rational protein engineering, as well non-rational methods, such as site-specific saturation mutagenesis or directed evolution, were applied for protein-engineering. In order to do so for all of the target compounds, a novel high-throughput solid phase activity assay for transaminases that was actually developed during the master thesis, was refined and published (Article I). In the context of this thesis, the same assay principle was as well adapted for quantification of specific activities in liquid phase (Article III). A comparison of different methodologies for developing agar plate assays and a detailed step by step protocol of our transaminase assay are illustrated in a book chapter.
In der vorliegenden Arbeit sollen bekannte und neuartige Inhibitoren der Glutathionperoxidasen sowohl in ihrer Eigenschaft als Inhibitor, als auch deren Effekte in Tumorzellen näher charakterisiert werden. Dabei standen zu Beginn die Mercaptobernsteinsäure sowie Tiopronin besonders im Fokus. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen effektiv bovine Glutathionperoxidase inhibieren, wobei die Effektivität sowohl in IC50-Werten als auch in Inhibitionskonstanten (Ki) ausgedrückt werden konnten. Durch Adaption des GPx-Assays auf humane GPx-Aktivität konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Mercaptobernsteinsäure in der Lage ist, humane GPx-Aktivität zu reduzieren, allerdings nicht Tiopronin. Kombinationen von Mercaptobernsteinsäure mit Wasserstoffperoxid auf Tumorzellen zeigten erhöhte Akkumulationen reaktiver Sauerstoffspezies in Relation zu Zellen, die nur mit Wasserstoffperoxid inkubiert wurden. Die Glutathionperoxidase könnte in zellulären Systemen durch Mercaptobernsteinsäure gehemmt sein. Entsprechende Kombinationen mit Tiopronin zeigten den gegenteiligen Effekt, Tiopronin scheint als Antioxidans zu fungieren. Auch Kombinationen von Tiopronin mit Cisplatin, Doxorubicin und Methotrexat zeigten teilweise Wirkungsverluste der Zytostatika. Weiterführend wurde im Rahmen der Arbeit eine neue Klasse von Inhibitoren der Glutathionperoxidase identifiziert, die Pentathiepine. Durch unterschiedliche heteroaromatische Grundkörper sowie verschiedenen Substituenten konnten interessante Struktur-Wirkungsbeziehungen detektiert werden. Bei der Charakterisierung der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Glutathionperoxidase stellte sich heraus, dass es sich offenbar um irreversible- sowie kompetitive Inhibitoren handelt. Die inhibitorischen Eigenschaften sind dabei in Bezug auf inhibitorische Potenz sowie Selektivität aller bisher bekannten Inhibitoren überlegen. Pentathiepine zeigen aber auch auf zellulärer Ebene interessante Eigenschaften, da sie in einer Vielzahl verschiedener Tumorzellen viabilitäts- bzw. proliferationsinhibierende Eigenschaften besitzen, mit IC50-Konzentrationen im unteren mikromolar-Bereich. Korrelationsanalysen zeigten, dass offenbar die Proliferationsinhibition der Pentathiepine mit der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Glutathionperoxidase einhergeht. Weiterführend konnte gezeigt werden, dass Pentathiepine massiv reaktive Sauerstoffspezies in den Zellen induzieren und Apoptose auslösen. Die Apoptose-Einleitung wurde durch Annexin-V/Propidiumiodid-Markierung, Detektion von PARP-Spaltprodukten sowie durch die Bestimmung der Mitochondrien-Funktionalität durch Visualisierung des mitochondrialen Membranpotentials bestätigt. Zusammenfassend scheint eine Apoptoseauslösung über den intrinsischen Signalweg vorzuliegen. Durch die Zelllinie HAP-1 sowie deren Glutathionperoxidase-1 ausgeknockten Variante konnten Zytostatika identifiziert werden, auf die knockout-Zellen besonders sensitiv reagieren. Zu diesen gehören Cisplatin-Analoga, Lomustin und Temozolomid. In Kombinationsuntersuchungen mit diesen Zytostatika konnte gezeigt werden, dass für die Kombination von Cisplatin mit Pentathiepinen kein positiver Effekt resultiert. Die Zytotoxizität von Cisplatin wurde dabei in verschiedenen Tumorzellen durch die gleichzeitige Inkubation mit Pentathiepinen abgeschwächt. Kombinationen von Lomustin bzw. Temozolomid mit Pentathiepinen und Mercaptobernsteinsäure führten zu signifikanten Wirkverstärkungen in den untersuchten Zelllinien. Zusammenfassend lässt sich verfassen, dass die neuen Glutathionperoxidase-Inhibitoren ein nützliches Werkzeug zur Aufklärung biologischer Prozesse in Tumorzellen in Bezug auf den Umgang mit oxidativem Stress darstellen können. Gezeigt wurde, dass die kombinatorische Gabe von Inhibitoren der Glutathionperoxidase mit verschiedenen Tumortherapeutika durch eine verstärkte Toxizität aussichtsreich erscheint und in Hinblick auf die häufig sehr schlechten Prognosen verschiedener Tumorerkrankungen, die Tumortherapie durch Zusatz von Pentathiepinen verbessert werden könnte.
Cyanobakterien sind eine vielversprechende Quelle an strukturell diversen und biologisch hochaktiven Naturstoffen für die Entwicklung neuer Wirkstoffe. Bislang konnte die Strukturklasse der [7.7]Paracyclophane nur in fädigen Cyanobakterien der Gattungen Nostoc und Cylindrospermum nachgewiesen werden. Vorangegangene Arbeiten zeigten, dass gerade die Carbamidocyclophane chemisch und biologisch interessante Verbindungen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vor allem die Carbamidocyclophane produzierenden Cyanobakterien Nostoc sp. CAVN2 und Nostoc sp. CAVN10 unter besonderer Berücksichtigung der strukturellen Vielfalt an biosynthetisierten Metaboliten sowie deren antimikrobieller Aktivität umfassend charakterisiert. Um das biosynthetische Potenzial auf der metabolischen Ebene zu untersuchen, wurde im Vorfeld eine spezifische [7.7]Paracyclophan-Analytik etabliert, die skalierbare Methoden für alle Aufarbeitungsschritte beinhaltet. Die Optimierung endete in einem validierten sowie arbeits- und zeitsparenden einstufigen Extraktions- und Aufreinigungsverfahren mittels eines Zweiphasensystems und anschließender LC-UV-Analyse, um biologische Proben reproduzierbar zu analysieren und enthaltene Carbamidocyclophane zu quantifizieren. Kultivierungsstudien zum Einfluss der Temperatur an metabolisch aktiven und defizienten Nostoc-sp.-CAVN10-Kulturen ergaben einen direkten Zusammenhang zwischen der Biomassezunahme und der Temperaturerhöhung. Im Gegensatz dazu zeigten die einzelnen Carbamidocyclophan-Gehalte ein eher differenzierteres Bild über die verschiedenen Wachstumsphasen und Temperaturen hinweg. Da nur eine geringe Korrelation zwischen der spezifischen Wachstumsrate und der spezifischen Carbamidocyclophan-Produktionsrate ermittelt werden konnte, ist eine Relevanz dieser Verbindungen für den primären Zellstoffwechsel nicht ersichtlich. Bei Kultivierungsexperimenten an Nostoc sp. CAVN2 hatte der Zusatz von Chlorid- oder Bromid-Ionen eine drastische Erhöhung der Basalrate und Strukturdiversität der [7.7]Paracyclophane zur Folge. Das gleichzeitige Vorhandensein beider Halogenide im Medium zeigte kompetitive Effekte, wobei Chlorid als Substrat für den Halogenierungsprozess favorisiert wurde. Mit Hilfe eigens entwickelter Kultivierungsprozedere und Separierungsstrategien konnten insgesamt 25 Verbindungen aus Stamm CAVN2 isoliert und strukturell aufgeklärt werden. Dabei bilden die Carbamidocyclophane H–U neue chlorierte, bromierte und nicht halogenierte Naturstoffe. Zusätzlich konnten aus Stamm Cylindrospermum stagnale PCC 7417 neben den bekannten Cylindrocyclophanen A, B und D die drei neuen Cylindrofridine A–C erhalten werden. Diese stellen den Cylindrocyclophanen strukturell eng verwandte lineare Mono- und Dialkylresorcinole dar. Die vergleichende Evaluierung der Bioaktivität von 30 Reinsubstanzen ergab, dass viele Verbindungen sehr starke antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien zeigen – besonders gegen Antibiotika-resistente Kokken mit minimalen Hemmkonzentrationen von oftmals deutlich unter 1 µM. Dabei bedingten die verschiedenen Substituenten (Carbamoyl- und Acetoxy-Reste sowie Hydroxygruppen oder Halogene) z.T. signifikante Aktivitätsunterschiede. Die Zytotoxizität der [7.7]Paracyclophane ist vor allem an das Vorhandensein des Makrozyklus gebunden, da lineare Derivate (Cylindrofridine B/C) kaum biologisch aktiv waren. Eine Ausnahme stellt dabei das nicht zytotoxische, aber antimikrobiell aktive Cylindrocyclophan-D-Monomer Cylindrofridin A dar. Die phylogenetische Analyse der 16S-rDNA-Daten bestätigte die morphologisch-taxonomische Identifizierung der Stämme CAVN2 und CAVN10 als Cyanobakterien der Gattung Nostoc und ergab weiterhin, dass alle Carbamido- und Cylindrocyclophane produzierenden Nostoc-Stämme Bestandteil einer monophyletischen Gruppe sind, die phylogenetisch distinkt zu anderen [7.7]Paracyclophan-Produzenten ist. Des Weiteren konnten keine Nukleotidunterschiede zwischen Stamm CAVN2 und CAVN10 auf den untersuchten Markergen-Sequenzen festgestellt werden, was beide auf der phylogenetischen Ebene als identisch erscheinen lässt und sie somit nur metabolisch aufgrund der strukturellen Diversität und Quantität an [7.7]Paracyclophanen differenzierbar sind. Mit Hilfe von molekulargenetischen Analyseverfahren und bioinformatorischer Auswertung konnte in Stamm CAVN2 das Carbamidocyclophan-Biosynthesegencluster mit einer Gesamtgröße von ca. 26,9 kbp identifiziert werden. Dieses beinhaltet 13 offene Leserahmen (cabA-cabM), wobei das Gen cabL für eine putative Carbamoyltransferase codiert. Ein neuer Halogenase-Typ in Verbindung mit einer Tandem-ACP-Domänen-Struktur in der Typ I Polyketidsynthase CabD könnte für die Ausbildung halogenierter Derivate verantwortlich sein. Der Nachweis eines codierenden Bereichs mit Rieske-Domäne (cabM) lässt eine direkte oxidative intermolekulare Makrozyklisierung bei der Assemblierung vermuten.
Heart Failure is currently the most common cardiac disorder and a major public health concern worldwide. The adult mammalian heart harbors a subpopulation of cardiac progenitor cells (CPC) that are capable of improving cardiac function. The scope of this study was to delineate the molecular phenotype of a subpopulation of CPCs characterized by the expression of the stem cells antigen-1 surface marker (Sca-1+) and to further identify molecular alterations occurring under heart failure conditions. In order to understand the underlying cellular mechanisms an integrated approach of proteomics and transcriptomics-based techniques were employed. The first step towards achieving this goal was to unravel the native Sca-1+ cell characteristics of freshly isolated progenitor cells derived from healthy adult murine hearts. The proteome map of Sca-1 cells was established using a gel-based mass-spectrometry (gel LC-MS/MS) approach. For better interpretation, a comparison with the protein profiles of cardiomyocytes and Sca-1- cells obtained under similar experimental conditions was performed. All three cell-types were morphologically different in size and structure, which was also evident from their protein expression profiles. We observed that Sca-1+ cells lack endothelial-like and cardiac contractile phenotypes, unlike Sca-1- cells and cardiomyocytes, respectively. Functional assessment of both protein and gene expression profiles revealed a possible role of Sca-1+ cells in cell adhesion, migration, and proliferation. CPC remain in a dormant state under physiological condition unless challenged by myocardial injury. Previous studies revealed that resident Sca-1+ cells home to the injured myocardium but not to the healthy heart and further differentiate into functional cardiomyocytes. We investigated the molecular background of this behavior of adult Sca-1+ cells under heart failure condition which might provide a better insight into their cardiogenic potential in a pathological milieu. The double transgenic α-myosin heavy chain (MHC)-cyclin T1/Gαq overexpressing mouse was chosen as a model for heart failure. Using the comparative gene expression profiling we could detect the differential regulation of 197 genes with at least a 2-fold difference. Among these BDNF mRNA levels were 5-fold higher in the Sca-1+ cells derived from transgenic mice (Cyc+) in comparison to that of wild-type controls (Wt+). This difference was also observed at protein level. The substantially higher expression of BDNF during heart failure prompted us to investigate its regulatory effect on Sca1+ cells. In this current study we were able to show that small amounts of exogenous BDNF stimulated the migratory potential of Cyc+ cells. This effect was not seen in treated Wt+ cells. Furthermore, pulsed SILAC was employed to monitor BDNF mediated changes following treatment. After BDNF treatment, 58 proteins were differentially regulated of which proteins related to cell proliferation were reduced in level in Cyc+ cells while they displayed increased levels in Wt+ cells. Findings from bromodeoxyuridine (BrdU) assays and immunoblotting indicated that BDNF might initiate a differentiation program by repressing cell proliferation in Cyc+ cells. Taken together, it could be shown that the BDNF effect on protein synthesis of Cyc+ and Wt+ cells varied considerably, suggesting an improvement of the cardiogenic potential of Sca-1+ cells under pathological conditions. Aldosterone levels are known to be elevated during heart failure. In this part of study it was hypothesized that endocrine factors associated with heart failure might influence the migration of CPC, thereby possibly restoring the cardiac function of diseased hearts. It could be shown that high concentrations of aldosterone, similar to those found in the plasma of heart failure patients, induced the migration of Sca-1+ cells by up to 60% when compared to control, while physiological levels had no significant influence. In addition, it could be demonstrated that the aldosterone stimulus led to the activation of the mineralocorticoid receptor (MR) expressed on Sca1+ cells, which in turn facilitated migration. This was supported by application of MR antagonist eplerenone, which significantly reduced the aldosterone-induced increase in cell migration while a glucocorticoid antagonist exhibited no inhibitory effect. Hence, the results support the potential role of aldosterone in the mobilization of CPC. It is currently believed that the beneficial effects of cell-based therapies on cardiac repair are imparted to a large degree via paracrine mechanisms. We therefore focused on understanding the influence of pathophysiological levels of aldosterone on the extracellular environment of Sca-1+ cells. MS-based secretome profiling of cells treated for 24h with aldosterone treatment revealed higher levels of proteins associated with extracellular matrix remodeling and IGF signaling. Additionally, galectin-1 and gelsolin were significantly increased in level under pathological conditions indicating a possible paracrine tissue repair of Sca-1+ cells. To conclude, the global proteome and transcriptome profiles generated here revealed the molecular phenotype of Sca-1+ cells which may be used for future reference. The comparative microarray study provided deeper insight into the endogenous changes in mRNA expression during heart failure and delineated the cardiogenic characteristics of Sca-1+ cells. Moreover, the data presented here shed new light on the potential role of BDNF in regulating the mobilization and proliferation of CPCs. Our study on the influence of aldosterone on the migration and the extracellular proteome of CPCs provided new insights on the beneficial effects of this mineralocorticoid on cardiac cells.
Carbamoylasen und Hydantoinasen werden im „Hydantoinase-Prozess“ großindustriell zur Synthese enantiomerenreiner Aminosäuren eingesetzt. Durch Verwendung einer Hydantoin-Racemase kann eine Ausbeute von theoretisch 100 % erreicht werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, wie die beteiligten Enzyme mittels Protein-Design, an neue Substrate angepasst werden können. Dabei wurde die Carbamoylase aus A. aurescens einem gene-shuffling mit den eng verwandten beta-Ureidopropionasen aus S. kluyveri und A. tumefaciens unterzogen. Weiterhin wurde ein durch Dockingexperimente gestütztes rationales Design durchgeführt und auf dieser Basis gezielte Mutationen im aktiven Zentrum der Carbamoylase eingebracht, sowie fokussierte Bibliotheken des aktiven Zentrums erzeugt. Es konnte die Akzeptanz von β-Aminosäurederivaten als Substrat in dieser Carbamoylase erreicht werden. Das aktive Zentrum einer Hydantoinase aus Ochrobactrum spec. wurde ebenfalls mittels rationalem Design vergrößert um eine Akzeptanz von 5,5-disubstituierten Hydantoinen zu ermöglichen. Die Aktivitätsmessung gegenüber den neuen Substraten wurde in einem mehrstufigen Assaysystem durchgeführt. Dieses System basierte auf einem auf Ammoniummangel beruhenden Wachstumsassay, einem NADH Assay mit Glutamat-Dehydrogenase als Kopplungsenzym, sowie auf direktem HPLC Nachweis.
Die in dieser Arbeit durchgeführten Kristallstrukturanalysen der ersten bakteriellen Chalconisomerase (CHI) bilden die Grundlage für das strukturelle Verständnis der Flavonoiddegradation von Eubacterium ramulus. Das Enzym zeigt eine offene und eine geschlossene Lid-Konformation, die das aktive Zentrum vollständig vom Solvens abgrenzt. Durch SAXS-Messungen konnte gezeigt werden, dass sich diese beiden Konformationen im Solvens in einem dynamischen Gleichgewicht befinden und nur eine geringe Energiebarriere zur Schließung überwunden werden muss. Die Lokalisation des aktiven Zentrums konnte durch Cokristallisation mit dem Substrat (2S)-Naringenin bewiesen werden. Der Reaktionsmechanismus konnte durch Mutagenese-Studien und spezifischen 1H/2H-Austausch durch NMR bewiesen werden. Trotz jeglicher fehlender funktionaler Verwandtschaft zeigt die Tertiärstruktur der bakteriellen CHI große Ähnlichkeiten zu der ferredoxin-like Faltung der Chloritdismutase aus Dechloromonas aromatica und dem mit Stress verbundenen Protein SP1 aus Populus tremula. Ein Vergleich der bakteriellen CHI mit der pflanzlichen CHI von Medicago sativa zeigt, dass deren 3D-Struktur in keinem verwandtschaftlichen Verhältnis steht. Dies suggeriert eine konvergente Evolution der beiden Chalconisomerasen ausgehend von unterschiedlichen Vorläuferproteinen. Anhand von Strukturaufklärungen der (R)-selektiven Amin-Transaminase aus Aspergillus fumigatus konnten erste Informationen über die strukturellen Voraussetzungen zur (R)-Selektivität dieser neuen Enzymklasse gewonnen werden. Die in silico Experimente zeigen, dass ähnlich zu den BCATs und D-ATAs das aktive Zentrum der (R)-ATA in eine große und eine kleine Bindetasche unterteilt ist. Dies konnte strukturell über den Inhibitorkomplex verifiziert werden. Die De-/Protonierung des Substrates durch das katalytische aktive Lys179 kann ausschließlich von der si-Seite erfolgen, sodass es zur Bildung des (R)-Enantiomers kommt. Der Mechanismus zur Bindung polarer Substrate (dual substrate recognition) wurde durch einen kovalenten Inhibitorkomplex und Mutagenese-Studien belegt und ist auf ein konserviertes Arginin im active site loop zurückzuführen.
Viele als endokrine Disruptoren (EDCs) bezeichnete Schadstoffe gelangen in die Umwelt und können Veränderungen in der Entwicklung und der Funktion des Hormonsystems von Menschen und Tieren hervorrufen. Sie liegen häufig in niedrigen, physiologisch wirksamen Konzentrationen, sowie als Substanzgemische in komplexen Umweltproben vor. Zum Nachweis dieser Umweltchemikalien bedarf es der Entwicklung neuer, effizienter, benutzerfreundlicher und hoch sensitiver Detektionsmethoden. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Validierung von zwei neuen bioanalytischen Testsystemen, welche das biologische Potential von EDCs zuverlässig bestimmen. Das erste System, der neue Arxula adeninivorans yeast androgen screen (A-YAS) Assay, ermöglicht die Detektion von (anti-)androgenen Aktivitäten von EDCs als Reinsubstanzen sowie von Umweltproben. Dieser in vitro Bioassay basiert auf transgenen A. adeninivorans-Zellen, welche konstitutiv das Gen des humanen Androgenrezeptors (hAR) exprimieren. Das induzierbare Gen des Reporterproteins Phytase K (phyK, aus Klebsiella sp. ASR1 stammend) steht unter Kontrolle des aus A. adeninivorans stammenden Glucoamylase(GAA)-Promotors, welcher durch die Insertion von hormone responsive elements (HREs) modifiziert wurde. Bei Anwesenheit von (anti-)androgen wirkenden Substanzen bindet ein Dimer des hAR-Liganden-Komplexes an die HRE-Sequenzen und reguliert die Reportergenexpression. Das gebildete Reporterprotein Phytase K wird in das Medium sezerniert und ermöglicht die photometrische Bestimmung der Absorption als Maß der rekombinanten Enzymaktivität, welche mit der Konzentration der (anti-)androgen wirkenden Substanzen korreliert. Die Xplor®2-Transformations-/Expressionsplattform wurde verwendet, um mitotisch stabile und resistenzmarkerfreie Hefetransformanden zu generieren und geeignete Vertreter als Biokomponenten des Assays zu selektieren. Der A-YAS Assay ist benutzerfreundlich, schnell (Inkubationszeiten zwischen 5 h und 24 h) und als Hochdurchsatzmethode im 96-iger Mikrotiterplattenformat anwendbar. Für die Referenzsubstanz 5α-Dihydrotestosteron wurden ein Wert für die mittlere effektive Konzentration (EC50) von 277,1 ng/l sowie Nachweis- und Bestimmungsgrenzen von 56,5 ng/l bzw. 76,5 ng/l bestimmt. Damit ist der A-YAS Assay der derzeit sensitivste Hefezell-basierte Assay zur Detektion von androgenen Aktivitäten. Darüber hinaus wurden die androgenen und anti-androgenen Aktivitäten verschiedener weiterer EDCs (natürlich vorkommende Androgene und Östrogene, Pharmazeutika, Biozide) ermittelt. Der A-YAS Assay stellt ein robustes Testsystem dar und kann zur Bestimmung der androgenen Äquivalentwerte (AEQs) von komplexen Umweltproben wie Urinen eingesetzt werden. Die durch den Bioassay ermittelten AEQs mehrerer Rinderurinproben korrelierten gut mit den AEQs, welche durch GC-MS Analyse der gleichen Proben bestimmt wurden. Das zweite in dieser Arbeit entwickelte Testsystem ist ein zellfreies Verfahren, welches der rezeptorselektiven Anreicherung und Detektion von östrogen und androgen wirkenden Substanzen dient. Dazu wurden sowohl die vollständigen als auch die für die Ligandenbindungsdomäne (LBD) codierenden Gensequenzen vom humanen Östrogenrezeptor α (hERα) und von hAR mit der codierenden DNA-Sequenz für einen Polyhistidin-Tag (His-Tag) fusioniert. Durch die Wahl geeigneter Expressionssysteme erfolgte die Synthese rekombinanter, N- bzw. C-terminal mit einem His-Tag fusionierte Rezeptorproteine in vier unterschiedlichen Wirtsorganismen, dem Bakterium Escherichia coli BL21(DE3), den Hefen A. adeninivorans und Hansenula polymorpha sowie der Pflanze Nicotiana benthamiana. Zur maximalen Akkumulation von rekombinantem Protein wurden die Kultivierungsparameter der einzelnen Organismen optimiert. Eine Reinigung der nach Zellaufschluss extrahierten Proteine erfolgte durch die Metall-affine Interaktion von His-Tag-Fusionsproteinen mit Ni(II)-Nitrilotriacetat(Ni-NTA)-Gruppen in der immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC). Die in E. coli BL21(DE3)/pET-23a(+)-LBD-hERα synthetisierte, C-terminal mit einem His-Tag fusionierte LBD von hERα (LBD-hERα-6Hp) konnte nach IMAC-Reinigung mit hoher Reinheit (>90 %) und in einer Konzentration von bis zu 4 mg/ml erhalten werden. Die Anwendung unterschiedlicher Ligandenbindungsassays wies die Funktionsfähigkeit des rekombinanten Proteins nach. Durch Immobilisierung auf einer Chipoberfläche und Integration in einer Durchflusszelle wurde LBD-hERα-6Hp zum einen in einem Anreicherungsverfahren eingesetzt, welches Analyte von bisher unbestimmbaren in detektierbare Konzentrationen überführt. Die spezifische Bindung von 17β-Estradiol (17β-E2) wurde anhand der im östrogen-sensitiven nAES-P Assay (Kaiser et al., 2010) bestimmten Wiederfindungsraten von 17β-E2 bestimmt, welche sich nach Inkubation in der Durchflusszelle verringerten. Durch Integration einer optischen Messmethode (Lumineszenz) wurde ein kompetitives Detektionsverfahren entwickelt. Durch den Einsatz von LBD-hERα-6Hp wurde die spezifische Bindung von 17β-E2 gezeigt. Das Detektionsverfahren kann zur sensitiven Bestimmung der hormonellen Aktivitäten von EDCs als Reinsubstanzen sowie in Umweltproben eingesetzt werden. Darüber hinaus könnte das Anreicherungsverfahren als Vorstufe von kostenaufwändigen Nachweisverfahren wie der GC-MS Analyse verwendet werden.
In summary, the transcriptome data demonstrated that acute RAP for 7h induces significant changes in the expression of several left atrial genes, including those reflecting ANG II-mediated oxidative stress, tissue remodeling, and energy depletion. Furthermore, the results from the dronedarone study demonstrated that this drug is capable of attenuating most of RAP-induced changes in oxidative stress-related gene expression. Accordingly, the haemodynamic parameters also showed that dronedarone reduced RAP-induced microvascular flow abnormalities. This view is supported by the observation that in the used porcine model of acute AF, dronedarone decreased RAP-dependent PKC phosphorylation, NADPH isoform expression, F2-isoprostane release and IκBα phosphorylation. Additionally, the results of the irbesartan study indicate that ET-1 contributes to AF-dependent atrial fibrosis by synergistic activity with ANG-II to stimulate SGK1 expression and enhance phosphorylation of the SGK1 protein which, in turn, induces CTGF. The latter has been consistently associated with tissue fibrosis. In support of this view, in vitro analyses using HL-1 cells verified CTGF induction after short episodes of RAP and additionally in response to exogenous addition of ET-1. Accordingly, irbesartan was shown to attenuate most of the RAP-dependent changes in atrial or ventricular gene expression.
The soil bacterium Bacillus subtilis is capable of surviving most of the ensuing environmental stress conditions. The dynamic nature of the soil habitat is manifested with varying amounts of nutrients, frequent flooding, drying and variation of other growth parameters like temperature, acidity, aeration etc. In order to survive in these conditions, B. subtilis has evolved to employ very complex adaptational responses. These adaptational responses are often multi-faceted; hence comprehensive understanding of the adaptational responses requires generation and integration of data on multi-omics level. Hence, multi-omics based detailed analysis was performed for the molecules involved in the central carbon metabolism (CCM) and proline biosynthesis pathway. In the current study two major stress conditions were extensively investigated: 1) energy limitation/starvation which is achieved by limiting glucose in the growth medium, 2) osmostress resulting from frequent drying out of soil which is simulated by adding 1.2 M NaCl to the growth medium. In addition to osmostress, the naturally available osmoprotectant glycine betaine (GB) was supplemented to understand the simultaneous influence of osmostress and osmoprotection on cellular physiology. To measure absolute protein abundances by mass spectrometry, a targeted approach (SRM –single reaction monitoring) using stable heavy isotope labeled artificial standard proteins known as QconCATs was optimized and implemented in the current study. The SRM technique in combination with QconCAT provided absolute quantitative data with high dynamic range for the 45 targeted CCM proteins. Transcriptome data was obtained from microarray analysis. The resulting data were integrated with the other omics data sets obtained by metabolome and flux analysis. As part of a joint study conducted by the BaCell-SysMO and BaSysBio consortia which aimed for the genome wide mapping of transcription units and previously unannotated RNAs of B. subtilis by means of tiling array hybridizations, mRNA samples from growth at high and low temperatures (51°C and 16°C) and in the presence of 1.2 M NaCl, shake flask experiments during transition from exponential growth to the stationary phase, and high density batch fermentation. Time course analysis of B. subtilis transitioning from exponential to stationary phase was investigated by high cell density fed-batch fermentation (glucose limitation) and batch fermentation (glucose exhaustion) with glucose as a limiting factor. A multi-omics analysis of the CCM for the batch fermentation was performed and the time course data was integrated and visualized. In conclusion, pathway based multi-omics data were generated, integrated and visualized as a prerequisite for systems biology approaches and for a better understanding of the complex adaptational responses of B. subtilis.
In der vorliegenden Arbeit sollten zwei verschiedene Wirkstoffklassen auf ihre Fähigkeit Apoptose und Autophagozytose zu aktivieren analysiert werden. Dabei wurden 39 Sigma-Rezeptor-Liganden, die an der Universität Münster (Arbeitsgruppe von Prof. Bernhard Wünsch) synthetisiert wurden, zunächst auf ihre antiproliferativen Eigenschaften in acht humanen Krebszelllinien untersucht. Anhand der Struktur-Wirkungs-Beziehungen konnte gezeigt werden, dass sich große, raumfüllende Substituenten an beiden N-Atomen des Piperazin-Grundgerüstes positiv auf die Hemmung des Zellwachstums auswirken. Da die Multiple Myelom Zellinie RPMI 8226 eine hohe Dichte an Sigma-Rezeptoren exprimiert, wurde sie für weitere Versuche herangezogen. Als repräsentative Liganden wurde das Enantiomerenpaar (S)-11 und (R)-11 für weitere Versuche ausgewählt, da es neben einer guten Affinität zu beiden Rezeptor-Subtypen auch antiproliferierende Eigenschaften in der RPMI 8226-Zelllinie zeigte. Die Behandlung führte zur zeitabhängigen Induktion der Apoptose, die mit den typischen Charakteristika wie morphologische Membranausstülpungen, Annexin-V positive Zellen und der Chromatinkondensation einherging. Die Detektion von aktivierter Caspase-3, -8 und -9 im Durchflusszytometer deutete zunächst auf eine Beteiligung beider Signalwege der Apoptose hin. Da im Western Blot keine Caspase-9-Spaltprodukte detektiert werden konnten und auch die Vorinkubation mit den Caspase-Inhibitoren z-VAD-FMK und M50054 keinen Effekt auf die Apoptoserate bewirkte, scheinen die Caspasen im Sigma-Ligand-vermittelten Zelltod eine untergeordnete Rolle einzunehmen. Die frühe Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials verbunden mit der zunehmenden Konzentration des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF) im Zytosol der RPMI 8226-Zellen deuten ebenfalls auf eine Caspase-unabhängige Form der Apoptose hin, die besonders für Sigma(2)-Agonisten bereits beschrieben ist. Und auch in diesem Projekt zeigen die Sigma-Liganden zytotoxische Aktivitäten, wenn sie eine Affinität zum Sigma(2)-Rezeptor aufweisen. Neben der Apoptose konnten (S)-11 und (R)-11 auch die Autophagozytose induzieren. Dieser Prozess scheint jedoch der Apoptose nachgeschaltet zu sein und weist darauf hin, dass es sich nicht um einen Schutzmechanismus der Zelle handelt, sondern eher in einer direkten Form des programmierten Zelltodes vom Typ II begründet ist. Dieser ist bisher noch nicht für Sigma-Rezeptor-Liganden beschrieben und könnte einen Vorteil gegenüber anderen Vertretern dieser Wirkstoffklasse darstellen. Eine Gemeinsamkeit von Sigma-Ligand-induzierter Apoptose und Autophagozytose liegt in ihrer Aktivierung durch die Lipidperoxidation. Es wurde ein sehr früher Anstieg von LPO-Produkten detektiert, der sich nur durch das lipophile Antioxidans alpha-Tocopherol beeinflussen ließ. Desweiteren konnte die antiproliferierende Wirkung von (S)- 11 und (R)-11 im MTT-Assay komplett blockiert werden, und auch die Apoptoseraten wurden durch den Radikalfänger signifikant erniedrigt. Die Hemmung der LC3-II-Expression im Western Blot durch alpha-Tocopherol verdeutlicht auch hier die Beteiligung der LPO an der Autophagozytose. Als Vertreter einer weiteren Wirkstoffklasse wurde der phtoaktivierbare Pt(IV)-Komplex FM 165, der in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Peter Sadler (Universität Warwick, UK) synthetisiert wurde, untersucht. Die antiproliferierenden Eigenschaften der photoaktivierbaren Pt(IV)-Verbindung können nicht mit der Apoptose als Zelltodmechanismus begründet werden. In diesem Fall ließen sich keine morphologischen Charakteristika nachweisen und auch die Annexin-V Anfärbung fiel negativ aus. Die weiteren Untersuchungen zeigten jedoch auch die Aktivierung der Autophagozytose durch Expression von LC3-II und p62 im Western Blot. Eine Hemmung lysosomaler Enzyme durch die Protease-Inhibitoren E64d und Pepstatin A führte zu erhöhten LC3-II-Konzentrationen sowie einer p62-Akkumulation. Im Gegensatz zu den Sigma-Rezeptor-Liganden deutet dies eher auf eine vollständige Verlaufsform hin. Da die Autophagozytose bereits nach 6 h-Behandlung mit FM 165 detektiert wurde, ist es nicht ausgeschlossen, dass es sich zunächst um eine zellschützende Funktion handeln könnte. Auch beim FM 165 scheinen oxidative Vorgänge eine wichtige Rolle hinsichtlich der Autophagozytose-Aktivierung zu übernehmen. Nach erfolgter Photoaktivierung der Zellen ließen sich ansteigende ROS Konzentrationen verzeichnen, die nach 2 h deutlich wurden und somit noch vor der Autophagozytose entstehen.
Ziel dieses Projektes war die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Senkung der Harnsäurekonzentration im Blutserum von Patienten mit Hyperurikämie und der damit verbundenen Verringerung der Anzahl von schmerzhaften Gichtanfällen. Dafür sollten Purine in Lebensmitteln mit einem Gemisch aus purinabbauenden Enzymen zu dem gut löslichen Allantoin abgebaut werden. Durch diesen neuen Ansatz ist eine abwechslungsreiche Ernährung von Hyperurikämiepatienten ohne oder mit reduzierter zusätzlicher medikamentöser Behandlung zur Senkung der Harnsäurebildung, Erhöhung der Harnsäureausscheidung bzw. enzymatischen Reduktion von Harnsäure möglich. Die Analyse des Wachstumsverhaltens von Arxula adeninivorans LS3 zeigte die Vermehrung des Zellmaterials in einer Kultivierung mit Adenin als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle bzw. mit Hypoxanthin und Harnsäure als alleiniger Stickstoffquelle. Die Fähigkeit des Wachstums mit Adenin, Hypoxanthin oder Harnsäure als alleiniger Stickstoffquelle bestätigte das Vorhandensein des Purinabbauweges in der nicht-konventionellen Hefe A. adeninivorans LS3. Das Guanin-Deaminase-Gen (AGDA) aus A. adeninivorans LS3 kodierte für ein Protein aus 475 Aminosäuren, das in der Zelle als Dimer vorlag (55 kDa je Untereinheit). Das Guanin-Deaminase-Protein (Agdap) zeigte eine Homologie auf Aminosäureebene zwischen 44 und 55 % zu anderen pilzlichen Guanin-Deaminasen. Beim Wachstum auf Medien mit Adenin, Hypoxanthin oder Guanin als alleiniger Stickstoffquelle erfolgten eine Induktion der Genexpression des AGDA-Gens sowie eine intrazelluläre Akkumulation des Guanin-Deaminase-Proteins in der Vakuole wie auch dem Zytoplasma der Hefezelle. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die biochemische Charakterisierung der Uratoxidase. Das Uratoxidase-Gen (AUOX) aus A. adeninivorans LS3 lag auf Chromosom 4 und kodierte für das Uratoxidase-Protein (Auoxp) mit 306 Aminosäuren. Bei dem Auoxp handelte es sich um ein 35 kDa großes Protein, das als Dimer in der Zelle vorlag. Ein Vergleich mit anderen pilzlichen Uratoxidasen ergab eine Homologie von 61 bis 65 % auf der Ebene der Aminosäuresequenz. Das Enzym zeigte konservierte Sequenzmotive, die in den Uratoxidasen einer Vielzahl von Organismen beschrieben wurden. Die AUOX-mRNA-Konzentration stieg bei Wachstum auf Medien mit Harnsäure, Adenin und Hypoxanthin als alleiniger Stickstoffquelle. Die Akkumulation von Auoxp zeigte einen Maximalwert nach achtstündiger Kultivierung im Medium mit Harnsäure und zeitlich verschoben mit den Stickstoffquellen Adenin bzw. Hypoxanthin (nach 12 Stunden). Der biotechnologische Einsatz der purinabbauenden Enzyme der Hefe A. adeninivorans erforderte eine Überexpression der Uratoxidase- bzw. der Guanin-Deaminase-Gene in transgenen A. adeninivorans-Stämmen aufgrund zu niedriger, natürlicher Expressionshöhe im Wildtypstamm LS3. Als Transformations-/Expressionssystem fand das etablierte Xplor®2-Vektorsystem Verwendung. Diese Plattform bietet den Vorteil, dass keine Resistenzgene in die Hefe übertragen werden. Die Hefen wurden mit unterschiedlichen Expressionsmodulen transformiert, um die optimalen Expressionsbedingungen für die Guanin-Deaminase bzw. die Uratoxidase zu ermitteln. Vergleichende Untersuchungen bezüglich der Integrationshäufigkeit, dem Wirtsorganismus (homolog/heterolog) und der optimalen Expression (konstitutiv/induziert) zeigten, dass A. adeninivorans ein geeigneter Organismus für die Expression des Guanin-Deaminase- bzw. Uratoxidase-Gens darstellte. Für weiterführende Analysen erfolgte die nähere Untersuchung der Hefetransformanden mit der höchsten Guanin-Deaminase-Aktivität bzw. der über einen längeren Zeitraum konstant hohen Uratoxidase-Aktivität. Das über den C-terminalen His-Tag gereinigte rekombinante Protein zeigte eine hohe Übereinstimmung der biochemischen Eigenschaften (Substratspektrum, intrazelluläre Lokalisation, usw.) im Vergleich zum endogenen Protein der Hefe A. adeninivorans LS3 (nach induzierter Genexpression). Die rekombinanten Enzyme des Purinabbauweges (Uratoxidase, Guanin-Deaminase, Adenin-Deaminase und Xanthin-Oxidoreduktase) bewirkten nach deren Zugabe zu einem reinen Puringemisch aus Adenin, Guanin, Xanthin, Hypoxanthin und Harnsäure eine Reduktion der Konzentration sämtlicher Purine. Das Gemisch aus purinabbauenden Enzymen der Hefe A. adeninivorans belegte bei ersten Anwendungen in einem Lebensmittel (Rinderbrühe) die abbauende Wirkung auf sämtliche, im Lebensmittel befindlichen, Purine. Es gelang in dieser Arbeit, den Puringehalt eines Lebensmittels mit in transgenen A. adeninivorans-Stämmen hergestellten Proteinen enzymatisch abzubauen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten Aptamere selektiert und charakterisiert werden, die an PF4 binden. PF4 ist ein kleines Cytokin, das aufgrund seiner Beteiligung an der Heparin induzierten Thrombozytopenie von gesteigertem klinischen Interesse ist und dessen biologische Funktion noch weitgehend unklar ist. Aptamere können aufgrund ihres breiten Anwendungsspektrums einen Beitrag leisten unbekannte Funktionen von Proteinen aufzuklären bzw. pathogene Effekte von Proteinen zu verhindern.Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche Selektionen durchgeführt. In einer ersten Selektion wurden die Bedingungen so angepasst, dass vor allem Sequenzen im Pool verblieben, die besonders große Komplexe mit PF4 bilden. Solch große Komplexe aus PF4 und Heparin stellen das Hauptantigen der HIT dar und durch strukturelle Untersuchungen könnten Vorhersagen getroffen werden, welche therapeutisch eingesetzten Aptamere potentiell immunogen wirken könnten. Nach Analyse der Sekundärstrukturen der erhaltenen Sequenzen durch Faltungsprogramme konnten neben stäbchenförmigen Sekundärstrukturen vor allem three- und four-way junctions als dominierende Sekundärstrukturmerkmale identifiziert werden. Auf Grundlage dieser Resultate wurde ein Modell entwickelt, wonach die Ausbildung großer Komplexe zwischen RNA und PF4 durch das Vorhandensein mehrerer Helices in einem Molekül RNA gefördert wird und dadurch große Netzwerke aus RNA und PF4 entstehen. Um einen Anhaltspunkt zu erhalten, welches der selektierten Aptamere eine erhöhte Neigung zur Komplexbildung aufweist, wurden die Bindungseigenschaften zunächst qualitativ im Gelshift-Assay bei erhöhten NaCl-Konzentrationen untersucht. Dabei kristallisierten sich fünf Aptamere heraus, die auch bei NaCl-Konzentrationen höher als die der finalen Selektionsrunde noch zur Bindung fähig waren.Diese Sequenzen wurden mittels Photonenkorrelationsspektroskopie untersucht um Aussagen zur Komplexgröße und Stabilität zu erhalten. Basierend auf den Ergebnissen der PCS erfolgte die Synthese zweier Derivate der vielversprechendsten Sequenz. Für alle drei Konstrukte konnte die Komplexbildung im Gelshift Assay nachgewiesen werden. In einer zweiten Selektion wurden die Bedingungen so gewählt, dass an deren Ende spezifisch bindende Aptamere erhalten wurden. Zunächst erfolgte ein Vergleich der Bindungseigenschaften der in dieser Selektion erhaltenen Aptamere mit denen der vorangegangenen Selektion. Dabei konnten deutlich Unterschiede mittels Gelshift-Analyse nachgewiesen werden. Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten wurde versucht einen eigenen Sensorchip aufzubauen unter Verwendung vonPolyethylenglykol. Auch dies führte nicht zum gewünschten Erfolg und führte dazu, dass versucht wurde die Dissoziationskonstanten durch Immobilisierung von PF4 zu bestimmen. Durch die Struktur von PF4, in der die Monomere nichtkovalent miteinander verbunden sind, gelang es wiederum nicht eine stabile Oberfläche zu generieren, wodurch sich die Verwendung des Biacors zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten als ungeeignet herausstellte. Aus diesem Grund wurde versucht die Dissoziationskonstanten durch CD-Spektroskopie zu ermitteln. Nach Auswertung der Spektren konnte festgestellt werden, dass durch die Bindung der RNA an PF4 eine Strukturänderung im Protein induziert wird, durch die der Anteil antiparalleler β-Faltblätter zunimmt und der Anteil α-helikaler Bereiche und β-Turns abnimmt. Gleichzeitig wurde deutlich, dass sowohl spezifische- als auch elektrostatische Interaktionen einen Beitrag zur Bindung der Aptamere an PF4 leisten, wobei bei hohen Konzentrationen der Beitrag der elektrostatischen Wechselwirkungen überwiegt. Durch diese Kombination aus spezifischen und elektrostatischen Wechselwirkungen ist eine genaue Bestimmung der Dissoziationskonstanten nicht möglich und für die Aptamere konnte nur ein erster Anhaltspunkt, bestimmt werden.
Dilated Cardiomyopathy is a chronic myocardial disease characterized by progressive depression of contractile function and ventricular dilatation. It is the leading cause of heart failure and the most common reason for heart transplantation. Besides genetic causes, viral infection and autoimmune response are considered to play a major role in the etiology of the disease. Among different viruses that cause the disease, Coxsackievirus B3 (CVB3) is predominantly associated with the development and progression of the disease. Moreover, Coxsackievirus induced myocarditis in the mouse mimics human myocarditis and dilated cardiomyopathy. In the murine model, the disease progresses over a period of 90 days from acute myocarditis to chronic myocarditis and further develops into dilated cardiomyopathy and congestive heart failure. Though much is known about the progression of the disease, the molecular events occurring after infection with CVB3 are not completely understood. In the current study, comparative proteomic analysis of A.BY/SnJ mouse hearts 84 days post infection (84 d p.i.) with CVB3 and age-matched non-infected mouse hearts was performed. 2D-DIGE and gel-free LC-MS/MS were used to characterize the changes occurring at the molecular level and Western Blot analysis as well as immunohistochemical staining was carried out for validation of results. A total of 101 distinct proteins were identified as displaying dilated cardiomyopathy-associated changes in A.BY/SnJ mouse hearts 84 d p.i. compared to age matched controls. Comprehensive analysis by both DIGE and gel-free proteomics revealed proteins related to lipid metabolism (18%), carbohydrate metabolism (14%), cell morphogenesis (14%) and respiratory electron transport chain (9%) to display significantly altered levels in diseased mouse hearts. The significant increase in extracellular matrix proteins observed in mouse hearts 84 d p.i. indicated extensive fibrosis. On the other hand, proteins related to energy metabolism were identified at lower levels in infected mouse hearts than in controls. These proteomics data and the decrease in activities measured for complexes I-IV of the respiratory electron transport chain in A.BY/SnJ mouse hearts 84 d p.i compared to age matched controls, indicate a diminished energy supply in the dilated hearts of CVB3 infected mice. Furthermore, proteins associated with muscle contraction were identified at lower levels in mouse hearts 84 d p.i. compared to age matched controls indicating compromised myocardial contractility due to virus induced dilated cardiomyopathy. While extracellular matrix proteins and contractile proteins were identified in the DIGE analysis, proteins of lipid metabolism which are mostly mitochondrial in origin and have a pI > 7 were identified by gel-free proteomics indicating the advantages of both methods. Gel based analysis also aided in the identification of protein isoforms/ species which allows conclusions on post translational modifications and protein processing. Thus, the current study also identified infection related changes in the phosphorylation of selected proteins. Phosphospecific staining of the gels demonstrated increased phosphorylation of myosin regulatory light chain - ventricular isoform, actin - aortic smooth muscle isoform, heat shock protein 90B, and heat shock protein beta-1 in infected mouse hearts. Extensive degradation of proteins was not observed in the dilated heart. As described earlier, virus induced dilated cardiomyopathy develops over a period of 90 days in the murine model during which the mice also grow and undergo aging. Since aging is one of the factors influencing the susceptibility of animals to disease, age dependent changes in the proteome of mouse hearts were also studied by comparing 4 months old (84d) A.BY/SnJ mice with 1 month old mice as controls. Complementary analyses by 2D-DIGE and gel-free LC-MS/MS analysis revealed 96 distinct proteins displaying age associated differences in intensity. These proteins are related to lipid metabolism (19%), protein transport (17%) and electron transport chain (12%). Mitochondrial proteins such as carnitine-o-palmitoyltranferase 1, carnitine-o-palmitoyltranferase 2, and carnitine-O-acetyltransferase involved in lipid metabolism and transport were identified at significantly higher levels indicating higher energy demand in 4 months old mice compared to controls. This conclusion is complemented by observation of decreases in the levels of respiratory electron transport chain proteins especially of subunits of ATP synthase as a member of complex V. Furthermore, an increase in intracellular transport proteins was also observed in 4 months old mouse hearts compared to one month old controls. An increase in the level of vesicular transport proteins likely constitutes a secondary effect leading to endoplasmic reticulum associated protein degradation. In the two studies described above, altered mitochondrial functioning and thereby decreased energy/ATP production was very prominent indicating the role of mitochondria in health and disease. The exchange of ADP/ATP across the mitochondrial membrane is carried out by the carrier protein adenine nucleotide translocase1 (ANT1). To improve understanding of the influence of ANT1 in the heart, comparative proteomic analysis using gel-free LC-MS/MS was performed with hearts of 3 months old rats over-expressing ANT1 using hearts from age-matched wild type animals as controls. A total of four hundred and thirty three proteins were identified with at least two peptides, of which eighty seven proteins displayed small but significant (p<0.05) changes in intensity. Proteins related to integrin linked kinase signalling and myocardial contraction displayed increased levels whereas proteins of the mitochondrial respiratory electron transport chain displayed decreased levels in ANT1 overexpressing hearts compared to wild type animals. Oxyblot analysis performed to study changes in the protein oxidation did not reveal any significant difference in the oxidative state of the proteins between the wild type and transgenic animals. To understand the influence of ANT1 overexpression in virus induced dilated cardiomyopathy, comparative proteomic analyses was performed for the mitochondrial fractions from the hearts of 8 months old rats of the wild type and ANT1 transgenic animals infected with CVB3. Of a total of 370 identified proteins, 83 proteins displayed altered levels in ANT1 overexpressing animals compared to controls. Proteins related to mitochondrial electron transport chain, fatty acid metabolism, contractility and cell structure displayed decreased levels in the infected transgenic animals compared to controls indicating decreased energy metabolism and myocardial contractility besides compromised cell structure. Besides viral causes of dilated cardiomyopathy, autoimmunity also plays a major role in the development of myocarditis and dilated cardiomyopathy. Therefore proteomic analyses of experimental models of autoimmune myocarditis generated by active immunization of rats with peptides of FcγIIa receptor -CEPPWIQVLKEDTVTL (peptide 1) designated as FcR animals and CRCRMEETGISEPI (peptide 2) designated as FcR2 animals- was performed. Of the 303 proteins identified with at least two peptides by gel-free LC-MS/MS analysis. 43 proteins displayed intensities greater than 1.2 fold in FcR rat hearts and 49 proteins displayed intensities greater than 1.2 fold in FcR2 rat hearts compared to animals injected with KLH adjuvant treated as controls. The majority of the alterations (>70%) were observed in both autoimmune models. Thus, immunization leading to an induction of the acute phase response signalling was observed in both experimental setups. Furthermore, the increased amount of proteins such as lumican or procollagen alpha 1, type 1 indicated the presence of fibrosis after immunization independent of the peptide used. In summary, using proteomics the current thesis addresses the changes in protein profiles of two models of dilated cardiomyopathy, namely, virus induced dilated cardiomyopathy and autoimmunity induced dilated cardiomyopathy in mouse and rat models of disease. 2D-DIGE and gel-free LC-MS/MS analysis are complementary techniques which provided a comprehensive view of the changes in the protein profile of hearts of the different animal models. Altered mitochondrial function resulting in decreased energy metabolism and compromised myocardial contractility were prominent in viral models of cardiomyopathy whereas intense acute phase response signalling was observed as a characteristic feature of autoimmune dilated cardiomyopathy. Altered mitochondrial function was also prominent in age associated changes in the heart of A.BY/SnJ mice indicating the role and influence of mitochondria in health and in disease.
Der effiziente intrazelluläre Transport viraler Nukleokapside ist eine grundlegende Voraussetzung für eine erfolgreiche Virusinfektion. Aufgrund seiner engen Verwandtschaft zum humanpathogenen Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) und seiner Eigenschaft zur einfachen gentechnischen Veränderung stellt das Pseudorabies Virus (PrV) ein geeignetes Modell zur Untersuchung molekularer Mechanismen der Replikation und des Neurotropismus von Herpesviren dar. Der intrazelluläre Transport herpesviraler Kapside erfolgt aktiv entlang von Mikrotubuli durch zelluläre Motorproteinkomplexe. Die hieran beteiligten viralen Proteine konnten bisher jedoch nicht eindeutig identifiziert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Funktionen viraler Proteine im intrazellulären Transport von PrV. In erster Linie wurde die Rolle von PrV pUL35 und pUL37 untersucht, die auf intrazytoplasmatischen Kapsiden an der Oberfläche liegen und der Interaktion mit zellulären Proteinen zugänglich sind. Neben der Charakterisierung der Virusreplikation nach Deletion der einzelnen Gene in vitro und in vivo wurde auch der intrazelluläre Transport von GFP-markierten Mutanten zum Zellkern untersucht. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden Kapsid- und eng mit dem Kapsid assoziierte Proteine in yeast two-hybrid Studien analysiert, um virale und zelluläre Interaktionspartner zu identifizieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen: (1) PrV pUL35 und pUL37 sind für die Virusreplikation in vitro nicht essentiell. Die Replikation von UL35- bzw. UL37-Mutanten war jedoch vermindert. In Abwesenheit von funktionellem pUL35 und pUL37 gleichzeitig trugen die beiden Mutationen unabhängig voneinander zu einem verstärkten Phänotyp bei. Beide Proteine scheinen demnach in unterschiedliche Prozesse der Virusreplikation involviert zu sein. (2) Die N-terminale EGFP-Fusion von pUL35 zum Zweck der Fluoreszenzmarkierung viraler Kapside resultierte im Funktionsverlust des Proteins. Die Inkorporation in Kapside wurde aber nicht beeinträchtigt. Für die Interaktion von PrV pUL35 mit dem Kapsid könnte der konservierte C-Terminus des Proteins relevant sein. (3) Auch in Abwesenheit eines funktionellen pUL35 werden PrV Kapside effizient transportiert. PrV pUL35 kommt somit keine entscheidende Rolle beim intrazellulären Transport viraler Nukleokapside zu. Die verzögerte Neuroinvasion von UL35-Mutanten in vivo lässt jedoch eine möglicherweise akzessorische Funktion von pUL35 vermuten. (4) PrV pUL37 ist für den intrazellulären Transport viraler Nukleokapside nicht essentiell, erhöht jedoch deutlich dessen Effizienz. Der positive Einfluss auf den retro- und anterograden Transport viraler Kapside lässt darauf schließen, dass pUL37 in Transportprozesse während des Viruseintritts und der Freisetung involviert ist. (5) Der N-Terminus von PrV pUL36 interagierte im yeast two-hybrid System mit den Untereinheiten Rp3, LC8 und Tctex1 des Dynein-Motorproteinkomplexes. PrV pUL36 könnte daher für den MT-abhängigen Transport viraler Nukleokapside relevant sein.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden BVDV-Mutanten mit Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der E(rns)-kodierenden Genomregion ausgehend von den infektiösen cDNA-Klonen pA/BVDV und pA/BVDV/Ins- (Meyers et al., 1996) generiert. Die meisten Veränderungen verhinderten die Entstehung infektiöser Virionen, so dass nichtessentielle Regionen im E(rns)-Protein nicht identifiziert werden konnten. Eine Ausnahme stellen die Aminosäuren 105-108 dar, deren Substitution im Zusammenhang mit adaptiven Mutationen toleriert wurde. Mit Hilfe von Zelllinien, die die BVDV-Strukturproteine konstitutiv exprimieren, konnte eine Mutante mit einer kompletten E(rns)-Deletion und einer internen EMCV-IRES im Genom effizient trans-komplementiert und sogenannte DISC-Viren erhalten werden. Außerdem wurden Plasmide für die Expression der BVDV-Strukturproteine (C, E(rns), E1, E2) hergestellt, mit deren Hilfe erstmals ein nicht-prozessiertes E(rns)-E1-Protein mit 60-65 kDa identifiziert werden konnte, das für mindestens 3 h relativ stabil in transfizierten Zellen vorlag. Durch Mutation der P3-Position eines SPP-Motivs gelang es, sowohl in pCITE-2a(+)-Expressionsplasmiden als auch in BVDV-Vollängen-Mutanten die Spaltung dieses E(rns)-E1-Proteins zu verhindern. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die E(rns)-E1-Spaltung essentiell für die Bildung infektiöser Viren ist. Bicistronische Mutanten wurden genutzt, um zu zeigen, dass das E(rns)-E1-Protein selbst jedoch nicht notwendig, aber förderlich für Entstehung infektiöser Virionen ist. Weiterhin konnte mittels eines im Rahmen dieser Arbeit generierten polyklonalen Bungowannah Virus-E(rns)-spezifischen Kaninchenserums, das E(rns)-Protein des atypischen Pestivirus Bungowannah Virus in Western Blot-Analysen mit etwa 38 kDa detektiert werden. Da jedoch kein Bungowannah Virus-E(rns)-E1-Protein nachgewiesen werden konnte, spielt E(rns)-E1 möglicherweise keine oder eine untergeordnete Rolle im Bungowannah Virus-Replikationszyklus. BVDV-E(rns)-Deletionen im CP7-Hintergrund konnten erfolgreich mit Bungowannah Virus-E(rns) komplementiert werden, wenn Bungowannah Virus-E(rns) und BVDV-E1 unabhängig von einer E(rns)-E1-Spaltung exprimiert wurden. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war es schließlich, eine effiziente Methode zur Konzentrierung und Reinigung infektiöser BVDV aus infizierten Zellen zu etablieren. Zum ersten Mal wurden BVDV-Mutanten mit FLAG-markierten E(rns)- und E2-Proteinen generiert, so dass erstmalig BVDV mittels Affinitätschromatografie gereinigt und elektronenmikroskopisch untersucht werden konnten. Mittels Negativkontrast-Elektronenmikroskopie wurden sphärische Partikel mit Durchmessern von 43-58 nm dargestellt. Sowohl durch affinitätschromatografische Virusreinigung als auch durch immunelektronenmikroskopische Untersuchungen konnte eine Assoziation von E(rns)- und E2-Proteinen mit der BVD-Virushülle demonstriert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellte Methode kann als Basis für weiterführende Untersuchungen zur Morphogenese von Pestiviren genutzt werden.
Ziel der Arbeiten war es, ein Hefe basiertes Testsystem zu entwickeln, mit dem in komplexen Proben (Urin, Milch, Ab-, Brack-, See-, Mineralwasser, Lebensmittel, Kosmetika und pharmazeutische Formulierungen) mit möglichst geringem Aufwand/Probevolumen/Kosten estrogene Aktivitäten be-stimmbar sind. Der entwickelte neue Arxula adeninivorans Estrogen-Screen (nAES-Assay) ermöglicht die Detektion estrogen-wirksamer Substanzen als Summenparameter. Der In vitro-Assay basiert auf transgenen A. adeninivorans-Zellen mit zwei Expressionsmodulen (Rezeptorgenmodul mit TEF1-Promotor – hERa-Gen – PHO5-Terminator, Reportergenmodul mit Arxula eigenen GAA-Promotor – phyK/ATAN1-Gen – PHO5-Terminator). Durch die Insertion zweier "Estrogen-Response-Elemente" (EREs) in die GAA-Promotorregion wurde diese zum Estrogen induzierbaren Promotor GAA2xERE–107 modifiziert. Als Reporter wurden zwei nicht-konventionelle Gene benutzt, die Klebsiella sp. ASR1 abgeleitete PhytaseK (phyK-Gen) und die Tannase (ATAN1-Gen) aus Arxula. Um die Genmodule in das Arxula Genom zu integrieren wurde die Transformations-/Expressionsplattform Xplor® 2 mit den Selektionsmarkermodulen ALEU2-/delALEU2-Promotor – ATRP1-Gen verwendet. Vorteil dieser Plattform ist, dass keine dominanten Resistenzmarker (HPH1(r)) in die Hefe übertragen werden und sich mitotisch stabile Hefetransformanten selektieren lassen. Xplor® 2 ermöglicht zudem die komplette Eliminierung aller E. coli-Plasmidbestandteile einschließlich Resistenzgene (Kan(r), Amp(r)). Die im Rahmen der Arbeit selektierten Transformanten wurden bezüglich ihrer Robustheit und Anwendbarkeit als biologische Komponente für den nAES-Assay geprüft. Anhand der auf PhytaseK und Tannase als Reporter basierenden zwei Varianten des nAES-Assays (nAES-P, nAES-T), wurde eine "Standard Operation Procedure – SOP" erstellt, was die Nutzbarkeit des Assays vereinfacht. Die Testplattform umfasst 96-well Arbeitsstandard, lyophilisierten Hefezellen und der validierten Testprozedur mit passender, von der quo data GmbH Dresden entwickelen Auswertesoftware Bioval®. Die Verwendung von A. adeninivorans G1212 [aleu2 atrp1::ALEU2] mit unikal integrierter Kassette in Verbindung mit dem Selektionsprotokoll ermöglichte eine ~2-fache Verbesserung der Messparameter des nAES im Vergleich zum konventionellen A-YES. Die zwei nAES Assay genutzten Reportervarianten wurden hinsichtlich Temperatur-, pH-Optimum und Anwendbarkeit in verschiedenen Proben charakterisiert. So eignet sich nAES-P besser für die Messung von Brack- und Seewasserproben, während der nAES-T die höhere Robustheit gegenüber NaCl aufweist. nAES-T und nAES-P erreichen bei der Bestimmung von estrogenwirksamen Substanzen in Urin und Abwasserproben mit 6–25 h Assaydauer, Nachweis-, Bestimmungsgrenze und EC50-Wert für 17b-Estradiol von 2,8; 5,9; 33,2 ng/l (nAES-P) bzw. 3,1; 6,7; 39,4 ng/l (nAES-T) ähnliche Charakteristika. Dem gegenüber sind die Substratspezifität und der dynamische Messbereich innerhalb der beiden Varianten annähernd gleich. Daraus ergibt sich, dass sich der nAES-Assay basierend auf der nicht-konventionellen Hefe A. adeninivorans besonders für die Analyse von komplexen Umweltproben und im regulatorischen Sektor (Abwasserkontrolle, Steroidanalytik, REACh) eignet. In ersten Versuchen mit Realproben, wie Abwasser zeigten sich durchschnittliche estrogene Belastungen des Abwassers von < 6 ng/l. In Direkteinleitern ohne jegliche Behandlung konnten 17b-Estradiol estrogenequivalente-Aktivitäten (nAES-EEQ) von 8–70 ng/l detektiert werden. Die zusätzliche Messung von 47 Rinderurinen mit dem nAES-Assay auf estrogen-wirksame Substanzen ergab eine gute Korrelation zur parallel durchgeführten chemischen Analysen (ana-EEQ) mit GC/MS. Dies unterstreicht den praktischen Nutzen der nAES-EEQ Ergebnisse. In Kälberurin wurde ein durchschnittlicher nAES-EEQ von 800 ng/l und in Rinderurinen (älter als 24 Wochen) von 13000 ng/l bestimmt. Auch Testserien mit Mineralwasser und Eluaten aus dazugehörigen Verpackungsbestandteilen dokumentierten mit nAES-EEQs von < 6 ng/l die Praxistauglichkeit des nAES Assays. Damit hat sich dieser Assay als ein relativ schneller Assay zu Messung estrogener Aktivitäten in komplexen Probenmatrices (inklusive inhibitorischer Bestandteile), wie Urin und Abwasser, ohne aufwendige Aufkonzentrierungen und Vorbehandlungsschritte erwiesen. Die Vorteile zu vergleichbaren Assays und zelllinienbasierten Testsystemen sind seine leichte Handhabung und das Vorhandensein einer bereits erprobten/validierten Testprozedur.
Tertiary alcohols have become interesting targets for organic synthesis themselves or as building blocks for valuable pharmaceutical compounds. However, the synthesis of optically pure tertiary alcohols is still a challenge both chemical and enzymatic means. Enzymes containing the GGG(A)X motif in the active site region have been known to show activity towards these sterically demanding substrates. Several tertiary alcohols have been resolved with high enantioselectivity by using this biocatalytic synthetic route. This thesis aims at providing a better understanding of enantiorecognition of GGG(A)X motif hydrolases in the enzymatic synthesis of enantiomerically enriched tertiary alcohols. Kinetic resolution of a wide range of tertiary alcohols using hydrolases provided insights on factors that can influence enantioselectivity of GGG(A)X motif enzymes. Additionally, a newly proposed chemoenzymatic method to synthesize protected alpha,alpha-dialkyl-alpha-hydroxycarboxylic acids has broadened the application of these enzymes to synthesize optically pure tertiary alcohols. Newly found biocatalysts through functional screening, database mining and rational protein design approaches provided a better enzyme platform for optically pure tertiary alcohol resolution.
Zunächst sollte Aktivität der Phenylalanin-Ammonium-Lyase aus Petroselinum crispum (pcPAL) zur nicht-oxidativen Desaminierung des korrespondierenden Alkohols von Phenylalanin, Phenylalaninol generiert werden. Dazu wurden hochdurchsatzfähige Methoden zur Selektion, wie auch zur Durchmusterung von Mutantenbibliotheken etabliert. Es wurde fokussierte, gerichtete Evolution durchgeführt und zwei Mutantenbibliotheken mit Mutationen im Bereich der Bindungsstelle des Substrates erfolglos auf Aktivität durchsucht. Computersimulationen führten zur Annahme, dass Phenylalaninol wahrscheinlich nicht ausreichend im aktiven Zentrum gebunden werden konnte. Aus diesem Grund wurde eine zusätzliche Wasserstoffbrücke durch Verwendung von Tyrosinol als Substrat und der pcPAL-Phe-137-His Mutante eingeführt, welche nach Computersimulationen in der Lage war das Substrat ausreichend zu stabilisieren. Tatsächlich konnte durch die Einführung einer zweiten Wasserstoffbrücke durch rationales Proteindesign erstmals Aktivität gegenüber einem Aminoalkohol generiert werden. Durch Verwendung der Tyrosin-Ammonium-Lyase aus Rhodobacter sphaeroides (rsTAL), dessen Wildtyp bereits ein Histidin an der korrespondierenden Position 137 (His-89 der rsTAL) besitzt, konnte vergleichbare Aktivität gegenüber Tyrosinol erreicht werden. Durch die Analyse der Substratbindung im aktiven Zentrum wurde ein neues Konzept für den Reaktionsmechanismus der aromatischen Aminosäure-Ammonium-Lyasen, basierend auf der Aminosäureposition 484 (pcPAL) entwickelt. Sequenz- und Strukturvergleiche zeigten eine substratabhängige Konservierung der Position 484 (pcPAL). Enzyme mit einer Präferenz für Phenylalanin besaßen stets ein Glutamat, Tyrosin umsetzende Enzyme stets ein Asparagin an der entsprechenden Position. In silico Mutagenesen und Computersimulationen zeigten, dass ein Glutamat an der Position 484 (pcPAL) die Aminogruppe des Substrates bindet, wodurch die prosthetische, elektrophile MIO-Gruppe nur den aromatischen Ring in einer Friedel-Crafts ähnlichen Reaktion angreifen kann. Befand sich ein Asparagin an Position 484 (pcPAL) konnte die MIO Gruppe die Aminogruppe des Substrates erreichen und die nicht-oxidative Desaminierung über den E1cB Mechanismus mit einem MIO-Amino-Addukt durchführen. Somit wurde postuliert, dass die Ammonium-Lyasen und -Mutasen aromatischer Aminosäuren in Abhängigkeit der Aminosäure an Position 484 (pcPAL) entweder den Friedel-Crafts-Mechanismus (mit Glu-484) oder den E1cB Mechanismus (mit Asn-484) katalysieren können. Durch die Verwendung von m-Tyrosin als „Mechanismusindikator“ und Verwendung der Glu-484-Asn-Mutante der pcPAL konnten experimentelle Hinweise erbracht werden, die die Annahmen aus der Computersimulationen unterstützten. Als Grund für die unkonventionelle, bisher einzigartige „mechanistische Promiskuität“ wurde ein unterschiedliches Konzept der Substratstabilisierung in PAL und TAL vermutet. Tyrosin wird durch Wasserstoffbrücken der p-Hydroxylgruppe und der Carboxylgruppe im aktiven Zentrum gebunden, während Phenylalanin keine Möglichkeit bietet, den Phenylring eindeutig zu orientieren. Daher ist ein Glutamat an der Position 484 zur Substratbindung notwendig. Neben der pcPAL wurde die rsTAL zur Desaminierung von Tyrosinol getestet und zeigte ebenfalls pcPAL-ähnliche Aktivitäten. Versuche, durch fokussierte, gerichtete Evolution und rationales Proteindesign aller Aminosäuren der Carboxyl- und Aminobindetasche, eine aktivere Mutante zur Umsetzung von Tyrosinol zu identifizieren, scheiterten. Computersimulationen wiesen auf ein Wasserstoffbrückennetzwerk hin, dessen Störung sich stets durch verminderte oder zerstörte Aktivität äußerte. Somit musste festgestellt werden, dass in der Carboxyl- und Aminobindetasche keine Mutationen erlaubt sind, die Tyrosinol besser im aktiven Zentrum binden könnten. Daher wurden alternative Substrate untersucht. Tyrosinamid konnte ebenfalls langsam durch die pcPAL-Phe-137-His Mutante und die rsTAL desaminiert werden. Die biotechnologisch bedeutenderen Aminierungsreaktionen wurde gegenüber verschiedenen para-substituierten Zimtsäureanaloga untersucht und mit der korrespondierenden Desaminierungsreaktion verglichen. Die pcPAL setzte Phenylalanin in der natürlichen Desaminierungsreaktion 10-fach schneller um als Zimtsäure aminiert werden konnte. p Nitro-Zimtsäure stellte sich aufgrund der elektronischen Effekte des Substituenten als besonders geeignetes Substrat für die Aminierungsreaktion heraus, welches 9-fach schneller durch die pcPAL aminiert wurde als Zimtsäure. Durch fokussierte, gerichtete Evolution konnten drei Mutanten identifiziert werden, die aufgrund geringerer, sterischer Hinderungen bis zu 1,7-fach gesteigerte Aktivität gegenüber p-Nitro-Zimtsäure zeigten. Verglichen mit der natürlichen Desaminierungsreaktion der pcPAL gegenüber Phenlyalanin, konnte die Phe-137-Val Mutante p Nitro Zimtsäure sogar 1,5-fach schneller aminieren. Somit konnte die Aktivität der Aminierungsreaktion, ausgehend vom pcPAL-Wildtyp gegenüber Zimtsäure, um das 15-fache erhöht werden. Die pcPAL-Phe-137-Val Mutante wies geringere Substratinhibierung sowie höhere Aktivitäten gegenüber einigen Substraten auf. In präparativen Biokatalysen wurde die hohe Aktivität und Enantioselektivität (eep ≥ 97%) der Mutante, besonders in der asymmetrischen Aminierung von p-Nitro-Zimtsäure zu p-Nitro-L-Phenylalanin, erfolgreich auf einen größeren Maßstab übertragen.
Im Laufe der letzten Jahre hat sich herausgestellt, dass Transportproteine einen entscheidenden Beitrag zur Absorption, Verteilung und Elimination zahlreicher Endo- und Xenobiotika leisten. Vor allem die hepatobiliäre Elimination nimmt eine Schlüsselrolle in systemischen Clearance-Prozessen ein. Vor dem Hintergrund, dass immer mehr hochmolekulare und metabolisch stabile Stoffe Eingang in die Arzneistoffentwicklung finden und diese vorwiegend hepatobiliär eliminiert werden, wurde es erforderlich, differenziertere Kompartimentmodelle zu entwickeln, um singuläre Substanzeffekte auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Gerade Interaktionen zwischen simultan verabreichten Arzneistoffen können zu erheblichen Nebenwirkungen durch Veränderung pharmakokinetischer Eliminationsprozesse in Kombination mit erhöhter oder eingeschränkter Bioverfügbarkeit führen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, für die frühe Arzneistoffentwicklung ein In vitro-Modell auf Basis des pharmakokinetischen Standardtiermodells der Ratte zu konzipieren, welches eine einfache Analyse hepatobiliärer Elimination auf indirektem Weg über die Interaktion mit fluoreszierenden Modellsubstraten ermöglicht. Die Zielvorgabe wurde umgesetzt, indem auf Basis literaturbeschriebener Methoden ein In vitro-Rattenhepatozytenmodell etabliert wurde. Hierfür war es zunächst unerlässlich, geeignete Kultivierungsbedingungen zu identifizieren und zu optimieren. Es konnte gezeigt werden, dass primäre Hepatozyten nur befähigt wurden, sich in vitro zu repolarisieren und eine in vivo-ähnliche Morphologie anzunehmen, wenn sie eingebettet zwischen zwei extrazellulären Kollagenmatrices kultiviert wurden. Diese sogenannte Sandwichkultivierung der Zellen und die Supplementierung des Zellkulturmediums mit dem Glukokortikoid Dexamethason erwiesen sich hierfür als wesentliche Faktoren. Die Hepatozyten reformierten sich folglich innerhalb von 96 Stunden unter Ausbildung eines vollständigen und sehr einheitlichen Gallengangssystems, welches nahezu jeden Hepatozyten umschloss. Nach Etablierung der Zellkultur wurden die sandwichkultivierten Hepatozyten hinsichtlich der Proteinexpression, ausgewählte Transportproteine und Cytochrome umfassend, über einen Kultivierungszeitraum von 10 Tagen charakterisiert, um die Validität des Zellsystems zu gewährleisten. Unter Bei-behaltung der optimierten Kultivierungsbedingungen konnte mit zunehmendem Repolarisierungsstatus der Zellen ein Anstieg der apikalen Transportproteinexpression unter Begleitung einer Erhöhung der molekularen Masse der Transportproteine verzeichnet werden. Als Grund für die Molekulargewichtszunahme im Laufe des Redifferenzierungsprozesses der Zellen konnte die posttranslationale N-Glykosylierung am Beispiel der Transportproteine P-gp, Mrp2 und Bcrp identifiziert werden. Verifiziert wurden die Proteinexpressionsdaten, die apikalen Effluxtransporter P-gp, Mrp2, Bsep und Bcrp betreffend, über die Bestimmung der funktionellen Aktivität unter Verwendung fluoreszierender Modellsubstrate über einen Kultivierungszeitraum von 8 Tagen. Diese funktionelle Aktivität der Transportproteine wurde durch das Erscheinen fluoreszierender Moleküle in den Lumina der Gallenkanälchen ersichtlich und nahm mit voranschreitender Maturierung des Gallenkanalnetzwerkes sowie mit Verstärkung der Transportproteinexpression, gekoppelt mit dem Grad der N-Glykosylierung, zu. Die Selektivität der einzelnen Modellsubstrate wurde mittels in der Literatur beschriebener Substrate und Inhibitoren untersucht und bestätigt. Auf Basis der funktionellen Charakterisierung wurde im Anschluss eine indirekte In vitro-Methode entwickelt, welche die Voraussetzung schuf, Interaktionspotentiale von Arzneistoffen mit Effluxtransportproteinen zu evaluieren. Die Inhibition eines apikalen Transportproteins resultierte dabei prinzipiell in Abhängigkeit der eingesetzten Substanzkonzentration in einer Reduktion des eliminierten fluoreszierenden Modellsubstratanteils, was mit einer Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz korrelierte. So konnte aufgezeigt werden, dass bekannte Inhibitoren und Substrate die Transport-proteinaktivität konzentrationsabhängig reduzierten, ohne dass der sichtbare Effekt auf toxische Effekte der eingesetzten Substanzen zurückzuführen war. Dies konnte mittels des Zelltoxizitätsmarkers Alamar blue nachgewiesen werden. Clonidin, welches nicht als ABC-Transportersubstrat beschrieben worden ist, interagierte erwartungsgemäß auch mit keinem der Transportprozesse. Der Einsatz eines derartigen In vitro-Systems in der frühen Arzneistoffentwicklung könnte helfen, geeignete Arzneistoffkandidaten auszuwählen, welche ein geringes Potential aufweisen, mit hepatobiliären Effluxsystemen zu interagieren, um die Gefahr schwerer Arzneimittelnebenwirkungen zu minimieren.
Kunststoffähnliche Polymere wie Polyhydroxyalkanoate (PHA) fanden in den letzten Jahren immer größere Berücksichtigung zur Substitution von Kunststoffen. Die attraktivsten Vertreter dieser Biopolymere sind dabei das Poly-3-hydroxybutyrat (PHB),das Poly-3-hydroxyvalerat (PHV) und das Poly-3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat(PHBV). Für eine kostengünstige Herstellung von PHA sind allerdings biotechnologisch etablierte Erzeuger notwendig. Für eine umweltfreundliche Produktion bieten sich Hefen an. Viele Hefen sind im Gegensatz zu den PHA-synthetisierenden Prokaryoten weder virulent noch pathogen. Allerdings verfügen sie nicht über die notwendige genetische Ausstattung zur PHA-Synthese. In der vorliegenden Arbeit wurden die Gene der PHB- bzw. PHBV-Synthese aus Cupriavidus necator und Methylobacterium extorquens in das Hefegenom von Arxula adeninivorans integriert. Es wurden die Gene phbA (kodiert für eine ß-Ketothiolase), phbB (kodiert für eine Acetoacetyl-CoA-Reduktase) und phbC aus C. necator sowie phaC aus M. extorquens genutzt, wobei die beiden letzteren für PHA-Synthasen kodieren. Für die Integration dieser PHA-Gene wurden sog. YIEC (Yeast Integration Expression Cassettes) konstruiert, mit welchen die Gene in die 25S-rDNA von A. adeninivorans integriert werden konnten. Es wurden jeweils die PHA-Synthasegene phaC oder phbC mit phbA und phbB aus Cupriavidus necator integriert. Dadurch entstanden die sog. 3-fach-Transformanten (3-fach/phaC und 3-fach/phbC). Ebenso wurden die PHA-Synthasegene einzeln integriert, wodurch die sog. 1-fach-Transformanten (1-fach/phaC und 1-fach/phbC) entstanden. Im Mittelpunkt der durchgeführten Arbeiten standen die Bestimmungen der Enzymaktivitäten der rekombinanten PHA-Synthasen, die Determinierung von PHA sowie die Untersuchungen der Veränderungen der Stoffwechselintermediate durch die Integration der PHA-Gene. Bevor die vier PHA-Transformanten generiert worden waren, waren in einer Machbarkeitsstudie die PHA-Gene phbA und phbB integriert und die Expression der rekombinanten Enzyme mit Enzymaktivitätsassays nachgewiesen worden. In den vier verwendeten PHA-Transformanten (1-fach/phaC, 1-fach/phbC sowie 3-fach/phaC und 3-fach/phbC) wurden phbAp und phbBp mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen. Die Expression der PHA-Synthasegene wurde in den PHA-Transformanten durch Enzymaktivitätsassays vorgenommen. Die PHA-Transformanten wurden mit Glukose, Acetat, Ethanol, Propion- und Buttersäure alleinig und im Shift von Glukose auf eine andere Kohlenstoffquelle kultiviert. Dabei wurde festgestellt, dass Ethanol generell von den PHA-Transformanten nicht verwertet werden kann. Parallel zu den Analysen des Wachstumsverhaltens wurden die Enzymaktivitätsassays durchgeführt. Dabei konnten neben der Glukosekultivierung erstmals auch bei Acetatkultivierung Aktivitäten der rekombinanten PHA-Synthasen nachgewiesen werden. Sowohl bei der Glukose- als auch der Acetatkultivierung zeigten die vier PHA-Transformanten verschiedene Verläufe der Aktivitäten. Für die Transformante, in welche das PHA-Synthasegen phaC aus Methylobacterium extorquens integriert worden war (1-fach/phaC), wurden sowohl für die Glukose- als auch die Acetatkultivierung die Aktivitätswerte für die PHA-Synthasen bestimmt. Für die Transformante, welche das PHA-Synthasegen phbC aus Cupriavidus necator trägt (1-fach/phbC), konnten nur bei Glukosekultivierung PHA-Synthaseaktivitäten bestimmt werden. Diese wurden während der Kultivierung geringer. Für die 3-fach-Transformante 3-fach/phaC konnten PHA-Synthaseaktivitäten sowohl für die Glukose- als auch die Acetatkultivierung bestimmt werden, die während der beiden Kultivierungen geringer wurden. Für die Transformante, welche alle drei PHA-Gene inklusive des PHA-Synthasegens phbC (3-fach/phbC) trägt, wurden während der Glukosekultivierung gleich bleibende und während der Kultivierung mit Acetat stark steigende PHA-Synthaseaktivitäten ermittelt. Mit einer Färbemethode sollte in den 1-fach-Transformanten PHB nachgewiesen werden. Dazu wurden die Farbstoffe BODIPY 493/503 und Nilrot, die speziell intrazelluläres PHB bzw. Neutrallipide färben, verwendet. Es konnte mit BODIPY 493/503 kein intrazellulär eingelagertes PHB detektiert werden. Daher handelt es sich bei den Einlagerungen um Lipide. Für eine genauere Analyse der die durch die Integration der PHA-Gene entstehenden Stoffwechselprodukte wurde eine GC/MS-Methode entwickelt. In ersten Messungen zeigte sich für die PHA-Transformanten ein Peak, der die gleiche Retentionszeit wie 3-Hydroxyvalerat (3HV), das Monomer von PHV hatte. Dieser Peak wurde auch im Kontrollstamm G1212k detektiert. Da Cupriavidus necator mit der Kohlenstoffquelle Lävulinsäure (LäS) das PHA Poly-4-hydroxyvalerat produziert, wurde Lävulinsäure in der gaschromatographischen Methode als Referenzsubstanz eingesetzt. Dabei zeigte sich, dass LäS die gleiche Retentionszeit hat wie 3HV. Anschließend wurden die Massenspektren von 3-Hydroxybutyrat (3HB), dem Monomer von PHB, sowie 3HV und LäS verglichen. Dabei erwies sich, dass der Peak gleicher Retentionszeit nicht für 3HB oder 3HV steht, sondern für LäS. Es konnten somit in keiner der PHA-Transformanten 3HB oder 3HV nachgewiesen werden. Anhand der GC/MS-Daten wurde allerdings ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene den Stoffwechsel der Hefe A. adeninivorans stärker beeinflusst als die alleinige Integration der PHA-Synthasegene. Daher wurden Citrat, Succinat, Malat und Fumarat (als Summenparameter für Maleinsäure und Fumarsäure) sowie die Fettsäuren Palmitin-, Stearin- und Linolensäure als weitere Referenzsubstanzen eingesetzt. Es zeigten sich je nach Wahl der Kohlenstoffquelle und der Kultivierungsbedingungen Unterschiede zwischen 3-fach-Transformanten und Kontrollstamm G1212k. In der Glukosekultivierung als auch der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) konnten die meisten Unterschiede zwischen PHA-Transformanten und G1212k festgestellt werden. Es wurden z. B. für die Glukosekultivierung in den 3-fach-Transformanten höhere Gehalte an Fettsäuren detektiert. Daraus lässt sich eine unterstützende Wirkung der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese zur Fettsäurebiosynthese ableiten. Bei der Acetatkultivierung wird neben der PHA-Synthese und der Fettsäurebiosynthese das zentrale Zellintermediat Acetyl-CoA auch im Glyoxylatweg genutzt. Der Glyoxylatweg findet zwar in den Peroxisomen und nicht wie PHA- und Fettsäuresynthese im Zytosol statt, wird aber in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle und durch die Aktivitäten des Zitronensäurezyklus geregelt. Die höheren Gehalte an Citrat bei der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) geben daher einen Anhaltspunkt zur Nutzung des Glyoxylatweges. Aufgrund der erhöhten Fettsäuregehalte während der Glukosekultivierungen und der Nutzung des Glyoxylatweges bei Kultivierung mit Acetat wird ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene dazu führt, dass vermehrt Acetyl-CoA genutzt und Acetoacetyl-CoA, das erste Zwischenprodukt der PHA-Synthese, gebildet wird. Im Zytosol der Zellen findet aber auch der Mevalonatweg für die Isoprensynthese statt. Daher liegt sowohl eine Konkurrenz um Acetyl-CoA als auch um Acetoacetyl-CoA vor. Diese Konkurrenzen führen dazu, dass keine PHA-Synthese in den PHA-Transformanten stattfindet. Deswegen wird postuliert, dass stattdessen die Fettsäuresynthese, der Glyoxylatweg und der Mevalonatweg unterstützt werden. Intensivere Untersuchungen der Stoffwechselwege in A. adeninivorans müssen noch klären wie Zitronensäurezyklus und Glyoxylatweg sowie Fettsäure- und Isoprensynthese in dieser Hefe gesteuert werden können, um ein „metabolic engineering“ zur PHB-Synthese, wie es in S. cerevisiae bereits möglich ist, auch in A. adeninivorans zu realisieren. Dazu müssen nach der Expression der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese auch die Intermediate der Stoffwechselwege gezielter nutzbar und konkurrierende Enzymaktivitäten inhibiert werden.