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Redox modifications of specific cysteinyl and methionyl residues regulate key enzymes and signal-transducing proteins in various pathways. Here, we analyzed the effect of redox modifications on protein structure screening the RCSB protein data bank for oxidative modifications of proteins, i.e. protein disulfides, mixed disulfides with glutathione, cysteinyl sulfenic acids, cysteinyl S-nitrosylation, and methionyl sulfoxide residues. When available, these structures were compared to the structures of the same proteins in the reduced state with respect to both pre-requirements for the oxidative modifications as well as the structural consequences of the modifications. In general, the conformational changes induced by the redox modification are small, i.e. within the range of normal fluctuations. Some redox modifications, disulfides in particular, induces alterations in the electrostatic properties of the proteins. Solvent accessibility does not seem to be a strict pre-requirement for the redox modification of a particular residue. We identified an enrichment of certain other amino acid residues in the vicinity of the susceptible residues, for disulfide and sulfenic acid modifications, for instance, histidyl and tyrosyl residues. These motifs, as well as the specific features of the susceptible sulfur-containing amino acids, may become helpful for the prediction of redox modifications.

Das humane Glutaredoxin 2a (Grx2a) gehört zur Proteinfamilie der Thioredoxine. Es ist eine Oxidoreduktase mit der Fähigkeit zur Katalyse von Redoxreaktionen sowie zur Komplexierung eines [2Fe-2S]-Clusters. Grx2a besitzt ein Cys-Ser-Tyr-Cys-Motiv im aktiven Zentrum, wobei insbesondere das N-terminale Cystein essentiell für die enzymatische Aktivität im Mono- und Dithiolreaktionsmechanismus ist. Der [2Fe-2S]-Cluster wird im enzymatisch inaktiven Grx2a-Holoproteinkomplex durch die N-terminalen Cysteine des aktiven Zentrums von zwei Grx2-Monomeren und zwei nicht-kovalent gebundene GSH-Moleküle komplexiert. Unter oxidierenden Bedingungen und bei Abnahme der Menge an reduziertem GSH kann der [2Fe-2S]-Cluster nicht mehr komplexiert werden. Der Grx2a-Holoproteinkomplex dissoziiert in die enzymatisch aktive Apoproteinform, bei der das N-terminale Cystein des aktiven Zentrums für Reaktionen zur Verfügung steht. Auf diese Weise fungiert das Grx2a als Redoxsensor. Mutationen innerhalb und außerhalb des aktiven Zentrums des Grx2a sorgen für eine Veränderung der Proteinstruktur, der Redoxaktivität sowie der Fähigkeit zur Bindung des [2Fe-2S]- Clusters. Eine Überexpression von Grx2 in Tumorzellen führte zu einer Resistenz dieser Zellen gegenüber doxorubicinvermittelter Zelltoxizität. Die hierfür verantwortlichen Mechanismen sind bisher nicht sicher geklärt. Ziel dieser Arbeit war daher die Schaffung von Voraussetzungen, um den Einfluss der Eigenschaften des Grx2a auf dessen Funktion im kontrollierten Zelltod bzw. in der Zellprotektion zu untersuchen. Das Hauptaugenmerk lag hierbei auf der Oxidoreduktaseaktivität des Grx2a, der Fähigkeit zur Katalyse von Redoxreaktionen im Mono- und Dithiolreaktionsmechanismus und der Fähigkeit zur Komplexierung des [2Fe-2S]- Clusters. Hierfür wurden im Rahmen dieser Arbeit mittels Mutagenese-PCR Plasmide hergestellt, welche für Grx2a-Mutanten mit unterschiedlicher enzymatischer Aktivität und Fähigkeit zur Komplexierung des [2Fe-2S]-Clusters kodieren. Die Mutation des N-terminalen Cysteins des aktiven Zentrums zu Serin (C77S) führt zu einem enzymatisch inaktiven Grx2a, welches zudem die Fähigkeit zur Bindung des [2Fe-2S]- Clusters verliert. Die Veränderung des Serins des aktiven Zentrums zu Prolin (S78P) verursacht den Verlust der Fähigkeit zur [2Fe-2S]-Clusterbindung und somit auch der Bildung des enzymatisch inaktiven Grx2a-Holoproteinkomplexes. Hieraus resultiert eine gesteigerte Oxidoreduktaseaktivität. Bei Mutation des C-terminalen Cysteins des aktiven Zentrums zu Serin (C80S) sind nur noch Reaktionen des Monothiolmechanismus möglich, sodass sich eine reduzierte enzymatische Gesamtaktivität des Grx2a zeigt. Die Fähigkeit zur [2Fe-2S]-Clusterkomplexierung bleibt dabei unbeeinträchtigt. Die Mutation eines Threonins außerhalb des aktiven Zentrums zu Arginin (T135R) führt zu einer verminderten Fähigkeit zur Bindung des [2Fe-2S]-Clusters und zu einer verringerten Stabilität des Grx2a-Holoproteinkomplexes. Hieraus resultiert wiederum eine erhöhte enzymatische Aktivität. Die Plasmide pEGFP-N1- Grx2aC77S, pEGFP-N1-Grx2aS78P, pEGFP-N1-Grx2aC80S und pEGFP-N1-Grx2aT135R konnten erfolgreich etabliert werden. Es erfolgte die Transfektion der Plasmide mittels Elektroporation in Panc-1-Zellen, welche kein endogenes Grx2a exprimieren. Nach Behandlung mit Doxorubicin und anschließenden Zellviabilitätstests ergab sich der Verdacht, dass der Verlust der Fähigkeit zur [2Fe-2S]-Clusterkomplexierung bei erhaltener Oxidoreduktaseaktivität mit der zellprotektiven Funktion des Grx2a assoziiert ist. Die Ergebnisse ließen sich jedoch nicht reproduzieren. Um die Plasmide auch in Zellen mit endogener Grx2a-Expression sinnvoll verwenden zu können, musste zunächst die Herunterregulierung dieses zelleigenen Grx2a mittels siRNA erfolgen (Knockdown). Damit die durch die Plasmide kodierten Grx2a-Mutanten nicht ebenfalls von dieser Herunterregulierung betroffen sind, war die Schaffung siRNA-resistenter Plasmide notwendig. Durch Einbringen von stillen Punktmutationen im Bereich der siRNA-Bindungssequenz des Grx2a wurde dies erreicht. Die siRNA-resistenten Plasmide pEGFP-N1- Grx2a-siRNAres, pEGFP-N1-Grx2aC77S-siRNAres, pEGFP-N1-Grx2aS78P-siRNAres und pEGFP-N1-Grx2aC80S-siRNAres konnten erfolgreich etabliert werden. Bei dem Plasmid pEGFP-N1-Grx2aT135R befindet sich die eingebrachte Mutation (T135R) im Bereich der siRNA-Bindungssequenz, sodass hierdurch bereits eine siRNA-Resistenz erzielt wird. Mittels spezifischer siRNA erfolgte die Herunterregulierung des endogenen Grx2 in HeLa-Zellen sowie die Transfektion der siRNA-resistenten Plasmide mittels Elektroporation. Erste Ergebnisse nach Behandlung mit Doxorubicin und anschließenden Zellviabilitätstests deuten ebenfalls darauf hin, dass für die zellprotektive Funktion des Grx2a der Dithiolreaktionsmechanismus von Bedeutung ist. Zudem scheint der Verlust der Fähigkeit zur [2Fe-2S]-Clusterkomplexierung bei erhaltener oder sogar erhöhter Oxidoreduktaseaktivität eine Rolle in der zellprotektiven Funktion des Grx2a zu spielen. Die genaue Evaluation bedarf jedoch weiterführender Untersuchungen.

Thioredoxine (Trxs) bilden eine Familie ubiquitärer Oxidoreduktasen, welche durch posttranslationale Redox-Modifikationen von Cysteinyl-Thiolgruppen sowie die Regulation der intrazellulären Wasserstoffperoxidgehaltes die zelluläre Redoxantwort steuern. Es ist bekannt, dass Thioredoxine, Glutaredoxine (Grxs) und Peroxiredoxine (Prxs) wesentliche Signalwege von Inflammation, Proliferation und Apoptose beeinflussen und somit in vielen Pathologien, insbesondere bei entzündlichen Erkrankungen wie dem allergischen Asthma, eine entscheidende Rolle spielen. Derzeit sind vorwiegend die intrazellulären Funktionen der Proteine der Trx-Familie in Gesundheit und Krankheit umfassend untersucht, doch die extrazellulären Funktionen bei der Redox-Signalübertragung bleiben bis zum heutigen Tage weitestgehend im Dunkeln. In dieser Arbeit haben wir uns daher zum Ziel gesetzt, Verteilung und Funktion von Proteinen der Trx-Familie in der Regulation der Immunantwort zu untersuchen, wobei der Schwerpunkt auf dem extrazellulären Vorkommen und den damit verbundenen Eigenschaften liegt. Allergische Atemwegsentzündungen sind durch bronchiale Obstruktion und chronischen Umbau sowie Hyperreagibilität der Atemwege gekennzeichnet. Die Anhäufung reaktiver Sauerstoffspezies in der bronchialen Flüssigkeit der Lunge und die sich daraus ergebenden Veränderungen des Redoxzustands in den bronchialen Epithelzellen sind in den letzten Jahren in den Fokus der Asthmaforschung gerückt. Mehrere Studien beschrieben eine positive Wirkung von Trx1 und Grx1 in Atemwegsinfektionen, so würde eine Th2-typische Immunmodulation reduziert und verringere in der Folge den Umbau der Atemwegsstruktur – eine zentrale Pathologie des Asthmas. In dieser Studie untersuchten wir die Expressionsniveaus von Proteinen der Trx-Familie in Lungengewebe und bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit in einem Mausmodell der Ovalbumin (OVA) induzierten allergischen Atemwegsentzündung. Wir konnten eine Zunahme von Grx2 und Prx4 in intrazellulären Proben aus der Mäuselunge nach einsetzen der induzierten Atemwegsinfektion zeigen. Ausschließlich unter OVA-induzierter Inflammation wurde in diesen Proben eine zweite Isoform von Grx2, zytosolisches Grx2c, nachgewiesen. Die Behandlung von Mäusen mit intraperitoneal appliziertem, rekombinantem Grx2 parallel zur Induktion der Entzündung mit OVA, hatte eine entzündungshemmende Wirkung, die zu einer Verringerung des asthmatischen Phänotyps in der Immunhistochemie und einer signifikanten Reduktion der Gesamtzahl der Entzündungszellen, besonders der eosinophilen Granulozyten führte. Die Verabreichung der rekombinanten Grx2C40S-Mutante, der die Fähigkeit zur Katalyse des Dithiol-Reaktionsmechanismus fehlt, hatte nicht die gleiche entzündungshemmende Wirkung. Eine zusätzlich durchgeführte His-Tag-Färbung zeigte eine Aufnahme von rekombinantem Grx2 in die Epithelzellen und Makrophagen der entzündeten Lunge. Die Färbung von Lungenabschnitten für HIF1- und Pro-Caspase3 nahm nach Beginn der allergischen Atemwegsentzündung zu und ging bei den mit dem wildtyp Grx2 behandelten Mäusen deutlich zurück. In den extrazellulären Fraktionen war die Konzentration von Trx1, Grx1, Prx2 und Prx4 unter Entzündungsbedingungen erhöht, zudem konnte Prx4 in dieser Studie erstmals nur in der Entzündung, nicht aber bei gesunden Mäusen nachgewiesen werden. In-vitro-Experimente, bei denen Makrophagen aus Balb/c-Mäusen stimuliert wurden, sollten Aufschluss über die Funktionen von Trxs und Grxs in der Immunantwort geben. Grx2 und Trx1 wurden als potenzielle Stimulatoren von Makrophagen identifiziert, die die Sekretion von RANTES, IL-6, IL-10 und TNF-α induzieren, während die Zytokinspiegel von IL-4 und INF-γ nicht verändert wurden. Bei kombinierter Verabreichung von Redoxinen mit LPS/IFN-γ, die einen Entzündungszustand nachahmt, wurde gezeigt, dass Trx1 die Zytokinspiegel von TNF-α und INF-γ im Vergleich zu LPS/IFN-γ allein senkt. Die Behandlung mit Trx1/LPS/IFN-γ induzierte die Produktion von IL-6 und RANTES auf ein Niveau vergleichbar mit der alleinigen Stimulation durch LPS/IFN-γ. Diese Arbeit beleuchtet Proteinveränderungen von Thioredoxinen, Glutaredoxinen und Peroxiredoxinen in einem Mausmodell für allergische Atemwegsentzündungen mit besonderem Schwerpunkt auf der extrazellulären Verteilung und Funktion der Proteine. Wir zeigen, dass die Veränderungen der Proteinspiegel selektiv reguliert werden und zu einem fein abgestimmten Netzwerk von Partnern in der Redox-Signalgebung beitragen und somit Potenzial für mögliche Therapieansätze bieten.

Tissue sections, which are widely used in research and diagnostic laboratories and have already been examined by immunohistochemistry (IHC), may subsequently provide a resource for proteomic studies, even though only small amount of protein is available. Therefore, we established a workflow for tandem mass spectrometry-based protein profiling of IHC specimens and characterized defined brain area sections. We investigated the CA1 region of the hippocampus dissected from brain slices of adult C57BL/6J mice. The workflow contains detailed information on sample preparation from brain slices, including removal of antibodies and cover matrices, dissection of region(s) of interest, protein extraction and digestion, mass spectrometry measurement, and data analysis. The Gene Ontology (GO) knowledge base was used for further annotation. Literature searches and Gene Ontology annotation of the detected proteins verify the applicability of this method for global protein profiling using formalin-fixed and embedded material and previously used IHC slides.

Introduction Proteasome inhibition is first line therapy in multiple myeloma (MM). The immunological potential of cell death triggered by defects of the ubiquitin-proteasome system (UPS) and subsequent perturbations of protein homeostasis is, however, less well defined. Methods In this paper, we applied the protein homeostasis disruptors bortezomib (BTZ), ONX0914, RA190 and PR619 to various MM cell lines and primary patient samples to investigate their ability to induce immunogenic cell death (ICD). Results Our data show that while BTZ treatment triggers sterile type I interferon (IFN) responses, exposure of the cells to ONX0914 or RA190 was mostly immunologically silent. Interestingly, inhibition of protein de-ubiquitination by PR619 was associated with the acquisition of a strong type I IFN gene signature which relied on key components of the unfolded protein and integrated stress responses including inositol-requiring enzyme 1 (IRE1), protein kinase R (PKR) and general control nonderepressible 2 (GCN2). The immunological relevance of blocking de-ubiquitination in MM was further reflected by the ability of PR619-induced apoptotic cells to facilitate dendritic cell (DC) maturation via type I IFN-dependent mechanisms. Conclusion Altogether, our findings identify de-ubiquitination inhibition as a promising strategy for inducing ICD of MM to expand current available treatments.