Institut für Pharmazie
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Abstract
Saliva is an attractive sampling matrix for measuring various endogenous and exogeneous substances but requires sample treatment prior to chromatographic analysis. Exploiting supercritical CO2 for both extraction and chromatography simplifies sample preparation, reduces organic solvent consumption, and minimizes exposure to potentially infectious samples, but has not yet been applied to oral fluid. Here, we demonstrate the feasibility and benefits of online supercritical fluid extraction coupled to supercritical fluid chromatography and single‐quadrupole mass spectrometry for monitoring the model salivary tracer caffeine. A comparison of 13C‐ and 32S‐labeled internal standards with external standard calibration confirmed the superiority of stable isotope‐labeled caffeine over nonanalogous internal standards. As proof of concept, the validated method was applied to saliva from a magnetic resonance imaging study of gastric emptying. After administration of 35 mg caffeine via ice capsule, salivary levels correlated with magnetic resonance imaging data, corroborating caffeine's usefulness as tracer of gastric emptying (R2 = 0.945). In contrast to off‐line methods, online quantification required only minute amounts of organic solvents and a single manual operation prior to online bioanalysis of saliva, thus demonstrating the usefulness of CO2‐based extraction and separation techniques for potentially infective biomatrices.
Abstract
Neutrophils are the most abundant leukocytes in circulation playing a key role in acute inflammation during microbial infections. Phagocytosis, one of the crucial defence mechanisms of neutrophils against pathogens, is amplified by chemotactic leukotriene (LT)B4, which is biosynthesized via 5‐lipoxygenase (5‐LOX). However, extensive liberation of LTB4 can be destructive by over‐intensifying the inflammatory process. While enzymatic biosynthesis of LTB4 is well characterized, less is known about molecular mechanisms that activate 5‐LOX and lead to LTB4 formation during host–pathogen interactions. Here, we investigated the ability of the common opportunistic fungal pathogen Candida albicans to induce LTB4 formation in neutrophils, and elucidated pathogen‐mediated drivers and cellular processes that activate this pathway. We revealed that C. albicans‐induced LTB4 biosynthesis requires both the morphological transition from yeast cells to hyphae and the expression of hyphae‐associated genes, as exclusively viable hyphae or yeast‐locked mutant cells expressing hyphae‐associated genes stimulated 5‐LOX by [Ca2+]i mobilization and p38 MAPK activation. LTB4 biosynthesis was orchestrated by synergistic activation of dectin‐1 and Toll‐like receptor 2, and corresponding signaling via SYK and MYD88, respectively. Conclusively, we report hyphae‐specific induction of LTB4 biosynthesis in human neutrophils. This highlights an expanding role of neutrophils during inflammatory processes in the response to C. albicans infections.
Within the last decades cancer treatment improved by the availability of more specifically
acting drugs that address molecular target structures in cancer cells. However, those target-sensitive
drugs suffer from ongoing resistances resulting from mutations and moreover they are affected
by the cancer phenomenon of multidrug resistance. A multidrug resistant cancer can hardly be
treated with the common drugs, so that there have been long efforts to develop drugs to combat
that resistance. Transmembrane efflux pumps are the main cause of the multidrug resistance in
cancer. Early inhibitors disappointed in cancer treatment without a proof of expression of a respective
efflux pump. Recent studies in efflux pump expressing cancer show convincing effects of those
inhibitors. Based on the molecular symmetry of the efflux pump multidrug resistant protein (MRP) 4
we synthesized symmetric inhibitors with varied substitution patterns. They were evaluated in a
MRP4-overexpressing cancer cell line model to prove structure-dependent effects on the inhibition
of the efflux pump activity in an uptake assay of a fluorescent MRP4 substrate. The most active
compound was tested to resentisize the MRP4-overexpressing cell line towards a clinically relevant
anticancer drug as proof-of-principle to encourage for further preclinical studie
Unveiling the N-Terminal Homodimerization of BCL11B by Hybrid Solvent Replica-Exchange Simulations
(2021)
Transcription factors play a crucial role in regulating biological processes such as cell
growth, differentiation, organ development and cellular signaling. Within this group, proteins
equipped with zinc finger motifs (ZFs) represent the largest family of sequence-specific DNA-binding
transcription regulators. Numerous studies have proven the fundamental role of BCL11B for a
variety of tissues and organs such as central nervous system, T cells, skin, teeth, and mammary
glands. In a previous work we identified a novel atypical zinc finger domain (CCHC-ZF) which
serves as a dimerization interface of BCL11B. This domain and formation of the dimer were shown
to be critically important for efficient regulation of the BCL11B target genes and could therefore
represent a promising target for novel drug therapies. Here, we report the structural basis for
BCL11B–BCL11B interaction mediated by the N-terminal ZF domain. By combining structure
prediction algorithms, enhanced sampling molecular dynamics and fluorescence resonance energy
transfer (FRET) approaches, we identified amino acid residues indispensable for the formation of
the single ZF domain and directly involved in forming the dimer interface. These findings not only
provide deep insight into how BCL11B acquires its active structure but also represent an important
step towards rational design or selection of potential inhibitors.
Controlling the time point and site of the release of active ingredients within the gastrointestinal tract after administration of oral delivery systems is still a challenge. In this study, the effect of the combination of small capsules (size 3) and large capsules (size 00) on the disintegration site and time was investigated using magnetic resonance imaging (MRI) in combination with a salivary tracer technique. As capsule shells, Vcaps® HPMC capsules, Vcaps® Plus HPMC capsules, gelatin and DRcaps® designed release capsules were used. The three HPMC-based capsules (Vcaps®, Vcaps® Plus and DRcaps® capsules) were tested as single capsules; furthermore, seven DUOCAP® capsule-in-capsule combinations were tested in a 10-way crossover open-label study in six healthy volunteers. The capsules contained iron oxide and hibiscus tea powder as tracers for visualization in MRI, and two different caffeine species (natural caffeine and 13C3) to follow caffeine release and absorption as measured by salivary levels. Results showed that the timing and location of disintegration in the gastrointestinal tract can be measured and differed when using different combinations of capsule shells. Increased variability among the six subjects was observed in most of the capsule combinations. The lowest variability in gastrointestinal localization of disintegration was observed for the DUOCAP® capsule-in-capsule configuration using a DRcaps® designed release capsule within a DRcaps® designed release outer capsule. In this combination, the inner DRcaps® designed release capsule always opened reliably after reaching the ileum. Thus, this combination enables targeted delivery to the distal small intestine. Among the single capsules tested, Vcaps® Plus HPMC capsules showed the fastest and most consistent disintegration.
The investigation of complex molecular systems by molecular dynamics simulations has been successfully established and proven as a standard method during the last decades. The use of highly optimized algorithms and steadily increasing, generally available computing resources enables even larger and longer simulations. However, the dynamics of the system itself is not accelerated, and it can be trapped in low energy minima that can only be overcome slowly. A number of methods have therefore been developed to address this problem.
Within the context of this dissertation, a novel algorithm based on replica exchange was developed to solve problems with existing methods, which can now be used for large molecular systems with a low resource consumption. Parameter dependence was systematically evaluated and optimized to define guidelines for correct application. This algorithm was successfully applied to various pharmaceutical and biochemical problems, such as protein folding or protein-protein interactions.
Revaskularisierende Maßnahmen wie die perkutane transluminale Angioplastie sowie die Stentimplantation zählen heutzutage zu den Standardtherapieverfahren der koronaren Herzkrankheit. Insbesondere die Einführung der mit proliferationshemmenden Wirkstoffen wie Paclitaxel oder Sirolimus beschichteten drug-eluting stents (DES) konnte die Restenoserate der behandelten Gefäße auf unter 10 % senken. Der Erfolg der kardiovaskulären Intervention ist dabei insbesondere auch von der Freisetzungskinetik der Wirkstoffe aus der Polymerbeschichtung der Stents abhängig. Methoden zur Untersuchung des In vitro-Freisetzungsverhaltens sind jedoch weder im Europäischen noch im US-Amerikanischen Arzneibuch monographiert, meist werden aber offizinelle Methoden wie der Eintauchende Halter oder die Durchflusszelle sowie nicht offizinelle, einfache Shake-Flask-Methoden zur Bestimmung der In vitro-Freisetzung verwendet. Dabei bleiben allerdings Besonderheiten von DES wie die Einbettungsbedingungen in das Gewebe der Gefäßwand oder die Flussbedingungen unberücksichtigt. Mit der Einführung der Gefäßsimulierenden Durchflusszelle (vFTC) mit einem Gewebemodell in Form eines Hydrogels als zweitem Akzeptorkompartiment konnten dagegen Parameter wie der Blutfluss, die Verteilung des Wirkstoffes in die Gefäßwand sowie reine Diffusionsprozesse auf der abluminalen Seite der Stents in vitro simuliert werden. Durch Modifikation des Hydrogels mittels hydrophober Zusätze konnte auch bereits ein Einfluss auf die Freisetzung von Modellarzneistoffen aus schnellfreisetzenden Stents gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, auch für die tatsächlich in DES eingesetzten Arzneistoffe Sirolimus und Paclitaxel Gewebemodelle auf Basis von Hydrogelen zu entwickeln und den Einfluss dieser Gewebemodelle auf die In vitro-Wirkstofffreisetzung in der vFTC zu untersuchen.
Dazu wurden zunächst analytische Methoden zur Quantifizierung der beiden Wirkstoffe entwickelt und validiert. Zur Identifizierung eines geeigneten Freisetzungsmediums wurde anschließend die Stabilität der Wirkstoffe in verschiedenen pufferbasierten und ungepufferten Medien sowie unter Zusatz von stabilisierenden Additiva untersucht. Eine mit Butylhydroxytoluol und Brij® L23 stabilisierte 0,9 %-ige Kochsalzlösung wurde dabei als geeignet identifiziert, die Stabilität der beiden Wirkstoffe über einen Freisetzungszeitraum von fünf Tagen zu gewährleisten.
Auf Basis vorhergehender Arbeiten wurde für die Entwicklung der Gewebemodelle auf ein 2 %-iges Agarosegel als Grundlage zurückgegriffen. Um die Verteilung der Wirkstoffe in das Gewebemodell zu erhöhen, wurden verschiedene Zusätze wie Lecithin, LiChroprep® RP-18, Lipofundin® MCT/LCT 20 %, mittelkettige Triglyceride und Cholesterol zur Hydrophobisierung beigemischt. Außerdem wurden Elastin und bovines Serumalbumin als Zusätze gewählt, um spezifische Bindungen der Wirkstoffe im Gewebe zu simulieren. Zur Untersuchung der Eignung der entwickelten Hydrogele als Gewebemodell wurde der Verteilungskoeffizient zwischen Hydrogel und Wirkstofflösung ermittelt und mit ex vivo ermittelten Literaturwerten zwischen humanem Aortengewebe und einer Wirkstofflösung verglichen. Zusätze von 10 % Lipofundin®, 0,1 % LiChroprep® + 0,02 % Lecithin sowie 0,1 % Lecithin wurden als geeignet befunden, um die Verteilung von Sirolimus in das Gewebe humaner Aorta mit unterschiedlichem Status zu simulieren und wiesen zudem eine ausreichende Stabilität für Freisetzungsuntersuchungen in der vFTC über einen Zeitraum von fünf Tagen auf.
Die Untersuchung des Einflusses dieser drei Gewebemodelle als Hydrogelkompartiment auf die Wirkstofffreisetzung aus DES in der vFTC wurde mit Sirolimus-beschichteten Stents mit Poly-L-Milchsäure als Beschichtungspolymer über 120 h durchgeführt. Zum Vergleich wurde zusätzlich die Wirkstofffreisetzung in einer einfachen Shake-Flask-Methode sowie in der Durchflusszelle ohne Hydrogelkompartiment beziehungsweise mit einem Agarosegel ohne Zusätze bestimmt. Es konnte ein triphasisches Freisetzungsverhalten mit biphasischem, jeweils nach einer Kinetik 1. Ordnung ablaufenden burst release von 30 - 40 % des Wirkstoffes innerhalb der ersten 12 h sowie nachfolgender langsamer Diffusionsphase beobachtet werden. Ein Vergleich der unterschiedlichen Freisetzungs-methoden zeigte eine langsamere Freisetzung unter Verwendung der Durchflusszelle sowie eine weitere Verringerung des in das Medium freigesetzten Wirkstoffanteils durch die Einführung eines zweiten Akzeptorkompartiments in der vFTC. Statistisch signifikante Unterschiede wurden aber vorrangig in der Verteilung des Wirkstoffes zwischen den Kompartimenten gesehen. So führte die Verwendung von 10 % Lipofundin als Zusatz zu einer Erhöhung des Anteils an Sirolimus im Gewebemodell von etwa 1 % auf fast 14 % der Gesamtfreisetzung nach fünf Tagen (p < 0,05). Im Gegensatz zu vorherigen Untersuchungen mit Modellarzneistoffen ist es für den tatsächlich in DES eingesetzten Wirkstoff Sirolimus also gelungen, ein Gewebemodell mit ausreichend hohem Verteilungskoeffizienten zu entwickeln, mit dem signifikante Unterschiede in der Verteilung zwischen den verschiedenen Kompartimenten der vFTC ermittelt werden konnten. In vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus DES mittels der vFTC können somit durch die Verwendung von Gewebemodellen mit einem den In vivo-Bedingungen angepassten Verteilungskoeffizienten für die betreffenden Wirkstoffe eine noch bessere Abschätzung der In vivo-Verteilung eines aus DES freigesetzten Wirkstoffes in die Arterienwand leisten. Auch für biorelevante In vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus anderen Implantaten können die in dieser Arbeit entwickelten Gewebemodelle möglicherweise einen wertvollen Beitrag leisten.
Erkrankungen der Speiseröhre waren in der Vergangenheit ein wenig beachteter Themenkomplex in der Forschung und Entwicklung neuartiger Therapieoptionen. Die Behandlung von Erkrankungen wurde in der Regel systemisch oder chirurgisch durchgeführt. Trotz eines geringeren Risikos für unerwünschte Arzneimittelwirkungen im Vergleich zur systemischen Therapie wurde der Ösophagus bisher kaum als Target zur Medikamentenapplikation in Betracht gezogen. Durch die besonders kurze Transitzeit stellt die Speiseröhre einen sehr anspruchsvollen Applikationsort für die Entwicklung lokal wirksamer Darreichungsformen dar. Zur effektiven Therapie von Tumorerkrankungen, Pilzinfektionen, Motilitätsstörungen oder durch Reflux verursachte Schädigungen im Bereich der Speiseröhre wäre beispielsweise eine lokale Arzneimitteltherapie mit niedrig dosierten Wirkstoffen in mukoadhäsiven Darreichungsformen wünschenswert.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiges System zur gezielten lokalen und langanhaltenden Applikation von mukoadhäsiven Filmen in der Speiseröhre entwickelt und charakterisiert. Das dabei entstandene EsoCap-System besteht aus einem aufgerollten Film, der an einem Faden befestigt und in einer geschlitzten Kapsel positioniert ist. Bei der Einnahme der EsoCap mit einem eigens entwickelten Applikationssystem wird der Mechanismus zum Entrollen des Filmes ausgelöst. Durch den Schluckvorgang wird der Film in der Speiseröhre entrollt und haftet aufgrund der mukoadhäsiven Eigenschaften an der Mukosa des Patienten.
Die Funktionalität des Systems konnte in einer Studie mit zwölf gesunden Probanden gezeigt werden. Bei insgesamt 72 durchgeführten Applikationen konnte in 71 Fällen eine erfolgreiche Platzierung des mukoadhäsiven Filmes in der Speiseröhre nachgewiesen werden. Die korrekte Platzierung des Filmes wurde anhand eines neu entwickelten und kontrastierenden Filmes mittels MRT nachgewiesen. Zur standardisierten Evaluation der Akzeptanz wurde ein spezifisch auf die Eigenschaften und Besonderheiten des EsoCap-Systems angepasster Fragebogen entwickelt. Auch die prinzipielle Funktionalität des Systems konnten durch die Studie mit gesunden Probanden, nachgewiesen werden. Das modifizierte EsoCap-System, welches zusätzlich mit einem Sinker zur Erhöhung der Dichte versehen wurde, zeigte in der Befragung eine subjektiv bessere Schluckbarkeit. Zudem konnte ein bereits in der Literatur beschriebener Lern- und Trainingseffekt bei der Einnahme von oralen Darreichungsformen auch beim EsoCap-System beobachtet werden.
Neben der vorteilhaften Erhöhung der Dichte des Systems könnte die Verwendung kleinerer Kapseln (z. B. Größe 0) und die Verwendung eines schnell wasserlöslichen Retainers zum Auslösen des Systems mit einer Steigerung der Akzeptanz korreliert sein. Die Verwendung von kleineren Kapseln sollte durch die Verwendung von, im Vergleich zur MRT-Kontrastierung, dünneren, für die lokale Wirkstoffapplikation genügenden Filme möglich sein. Die Akzeptanz und die Überlegenheit des neuartigen Systems im Patienten sind in klinischen Studien zu beweisen. Zudem ist ein Verfahren zur automatisierten Herstellung des sehr komplexen und bisher vollständig manuell gefertigten Systems zu etablieren.
Neben der Filmdicke haben sowohl die verwendeten Polymere als auch die Wirkstoffbeladung einen Einfluss auf die Charakteristik der verwendeten Filme. Eine Möglichkeit die Funktionalität von Filmen In vivo besser vorherzusagen, besteht in der Verwendung biorelevanter In vitro-Testsysteme. Aus diesem Grunde wurde der EsoPeriDiss, ein neuartiges und biorelevantes In vitro-Testsystem zur Charakterisierung ösophageal applizierter Darreichungsformen entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass mittels des EsoPeriDiss erste Erkenntnisse hinsichtlich des Freisetzungsverhaltens und der Verweildauer von Filmen in der Speiseröhre bei simulierter Speichelflussrate, simulierter Peristaltik sowie bei verschiedenen simulierten Ausrichtungen des Patienten gewonnen werden können.
Durch Variation der Pumpleistung war die Speichelflussrate flexibel steuerbar und ermöglichte, wie auch das modulare Walzensystem, die Simulation verschiedener Einnahmebedingungen. So können Konfigurationen mit niedriger Intensität zur Simulation der nächtlichen Einnahme, aber auch hochintensive Konfigurationen zur Simulation der Einnahme mit Nahrung am Tage zusammengestellt werden. Durch die Ergänzung einer Positionsanpassung war es möglich, sowohl eine waagerechte als auch senkrechte Speiseröhre zu simulieren. Die Simulation von ausgewählten physiologischen Parametern und die In vitro-Charakterisierung verschiedener Darreichungsformen ermöglichten ein besseres Verständnis über die Verhältnisse und Beschaffenheiten von esophageal applizierten Darreichungsformen. Die Zusammenstellung von physiologischen Konfigurationen oder die Übertragung von In vivo-Daten von Patienten auf das System, ergeben für die neuartige modulare Testplattform eine Vielzahl interessanter Möglichkeiten zur Charakterisierung von ösophageal applizierbaren Darreichungsformen. Somit konnte gezeigt werden, dass das modular aufgebaute neue System zahlreiche Möglichkeiten für biorelevante Freisetzungsuntersuchungen bietet.
Das EsoCap-System stellt eine neuartige, innovative und hochvariable Plattformtechnologie dar, die die Applikation von mukoadhäsiven Polymerfilmen in der Speiseröhre ermöglicht. Durch Anpassung der Plattform, beispielsweise durch Verwendung verschiedener wirkstoffbeladener Filme könnte das System neue Möglichkeiten in der Therapie von bisher nur unzureichend therapierbaren Krankheiten der Speiseröhre eröffnen. Die Erkenntnisse aus der In vivo-Studie und den In vitro-Untersuchungen geben Anlass zur Hoffnung hinsichtlich einer In vivo verlängerten lokalen Verweildauer von Filmen in der Speiseröhre, die besondere Bedeutung für die Effektivität einer Therapie hat. Das EsoCap-System hat aus vielerlei Hinsicht das Potenzial eine Durchbruchsinnovation im Bereich der Therapie von Erkrankungen der Speiseröhre darzustellen. Durch diese innovative Applikationsmöglichkeit begünstigt, könnte insbesondere das Screening nach hochaktiven und spezifisch in der Speiseröhre wirkenden Wirkstoffen zusätzlich vorangetrieben werden.
Hypoxia is common in marine environments and a major stressor for marine organisms inhabiting benthic and intertidal zones. Several studies have explored the responses of these organisms to hypoxic stress at the whole organism level with a focus on energy metabolism and mitochondrial response, but the instrinsic mitochondrial responses that support the organelle’s function under hypoxia and reoxygenation (H/R) stress are not well understood. We studied the effects of acute H/R stress (10 min anoxia followed by 15 min reoxygenation) on mitochondrial respiration, production of reactive oxygen species (ROS) and posttranslational modifications (PTM) of the proteome in a marine facultative anaerobe, the blue mussel Mytilus edulis. The mussels’ mitochondria showed increased OXPHOS respiration and suppressed proton leak resulting in a higher coupling efficiency after H/R stress. ROS production decreased in both the resting (LEAK) and phosphorylating (OXPHOS) state indicating that M. edulis was able to prevent oxidative stress and mitochondrial damage during reoxygenation. Hypoxia did not lead to rearrangement of the mitochondrial supercomplexes but impacted the mitochondrial phosphoproteome including the proteins involved in OXPHOS, amino acid- and fatty acid catabolism, and protein quality control. This study indicates that mussels’ mitochondria possess intrinsic mechanisms (including regulation via reversible protein phosphorylation) that ensure high respiratory flux and mitigate oxidative damage during H/R stress and contribute to the hypoxia-tolerant mitochondrial phenotype of this metabolically plastic species.
Der Sepsis sowie einer Reihe von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose und Diabetes mellitus Typ 1 ist, ebenso wie zahlreichen weiteren Krankheitsbildern, gemein, dass für diese eine Beteiligung der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) an deren Pathogenese durch exzessive Freisetzung von Stickstoffmonoxid bewiesen ist bzw. diskutiert wird. Die Auffindung von effektiven und selektiven Inhibitoren der iNOS stellt einen möglichen, erfolgversprechenden Ansatz dar, zumindest die Symptomatik dieser Erkrankungen positiv zu beeinflussen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten neue Wirkstoffe als potentielle Inhibitoren der iNOS zugänglich gemacht und auf ihre Aktivität getestet werden. Ein wesentlicher Ansatzpunkt für das Wirkstoff-Design ist die strukturelle Modifikation des natürlichen Substrats der iNOS, der Aminosäure Arginin. Ein bekannter Arginin analoge Hemmstoff der iNOS ist Aminoguanidin. Das Konzept der vorliegenden Arbeit zur strukturellen Abwandlung dieses Moleküls beinhaltete dessen Integration in ein heterobicyclisches System, mit dem Ziel, die Flexibilität der Aminoguanidin-Struktur herabzusetzen, um somit die Hemmwirkung und die iNOS-Spezifität zu verbessern. Die bisher wenig erschlossene Verbindungsklasse der [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazine erschien sehr gut geeignet, dieses Konzept zu realisieren. So wurden verschieden substituierte Vertreter dieses Grundkörpers als Analoga zu Aminoguanidin dargestellt. Als Hauptsyntheseroute wurde die Darstellung von Hexahydro[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazinen über Ringschluss von Hexadyro-1-carbothioamid mit Aldehyden / Ketonen verfolgt. Anschließend wurden diese durch S-Methylierung mit Iodmethan zu 1-Methylsulfanyl-5,6,7,8-tetrahydro-3H-[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazinen umgesetzt und schließlich mittels S-N-Austausch Tetrahydro-3H-[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazin-1-amine dargestellt. Die erhaltenen Vertreter der Zielverbindungen aller Synthesestufen wurden auf ihre Aktivität gegenüber der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase und mögliche zytotoxische Effekte mittels eines Zellkultur-Modells getestet. Im Ergebnis der chemisch-synthetischen und strukturanalytischen Arbeiten wurde eine Vielzahl von Verbindungen mit [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazin-Struktur einschließlich entsprechender Vorstufen neu- bzw. resynthetisiert. Alle Verbindungen wurden umfassend strukturanalytisch charakterisiert. So war es möglich eine umfangreiche Substanzbibliothek mit diversen Substitutionsmustern zu generieren, welche für die Überprüfung der generellen Eignung von Abkömmlingen des [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazins als Inhibitoren der induzierbaren NO-Synthase genutzt werden konnte. Für diese biologischen Untersuchungen zur Inhibition der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) durch die synthetisierten Titelverbindungen wurde ein optimiertes Zellkultur-Testverfahren unter Verwendung der Ratten-Insulinom Zelllinie RINm5F für den Arbeitskreis etabliert. Diese wurden mit den proinflammatorischen Zytokinen Interleukin-1β und Interferon-γ zur Expression von induzierbarer NO-Synthase stimuliert. Nach der Inkubation mit den potentiellen Hemmstoffen wurde die verbleibende NO-Produktion der Zellen durch Ermittlung der Nitritkonzentration im Überstand bestimmt. Anschließend wurde an den bereits behandelten Zellen auf mögliche Zytotoxizität der Substanzen durch einen MTT-Assay getestet. Mit diesem Verfahren wurden eine Reihe der Titelverbindungen bezüglich ihrer iNOS-hemmenden und zytotoxischen Eigenschaften untersucht. Davon inhibierten etliche in Position 3 unterschiedlich substituierte [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazin-1-thione dem Aminoguanidin vergleichbar oder stärker die NO-Produktion der iNOS bei nur geringem, zytotoxischem Effekt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die Verbindungsklasse der [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazine mit einer breiter Palette von Derivaten synthetisch zu erschließen und eine iNOS-inhibierende Wirkung für eine Anzahl von Vertretern zu belegen.