540 Chemie
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Der Replikationszyklus der Herpesviren ist sehr komplex und im Detail unzureichend verstanden. Die Funktionen und Eigenschaften einiger viraler Proteine sind bisher kaum charakterisiert. Folglich gibt es wenige Strukturmodelle dieser Proteine, wodurch beispielsweise eine rationale Medikamentenentwicklung kaum möglich war. Die Zielstellung dieser Arbeit war, neun dieser Proteine (pUL4, -7, -11, -16, -21, -26, -26.5, -32 und -33) aus dem pseudorabies virus (PrV) zu charakterisieren und nach Möglichkeit deren Struktur aufzuklären. Hierzu wurden die zur Verfügung gestellten Gensequenzen in geeignete bakterielle Expressionsvektoren umkloniert und in E. coli exprimiert. Lösliche Proteine wurden gereinigt und anschließend Kristallisationsexperimenten unterzogen, während unlösliche Proteine zum Teil auf ihre Renaturierbarkeit getestet wurden. Die Strukturen des kristallisierten N-terminalen Teils von pUL26 (Assemblin) wurden mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt. Außerdem wurden alle Proteine in silico auf Signalsequenzen, Phosphorylierungen und Sequenzmuster untersucht. Von der N-terminalen Serinproteasedomäne (Assemblin) von pUL26 wurden drei Strukturen durch Röntgenkristallographie bestimmt: eine native dimere, eine inhibierte dimere, sowie eine native monomere Struktur. Letztere ist das erste bekannte Strukturmodell der monomeren Form eines Assemblins. In Verbindung mit den dimeren Strukturen konnte experimentell bestätigt werden, dass die Aktivierung der Assembline über die Verschiebung eines loop bei der Dimerisierung erfolgt. Die Umlagerung dieses loop basiert darauf, dass sich der in der monomeren Form teilweise flexible Dimerisierungsbereich durch die Dimerisierung etwas verändert und eine weitestgehend starre Konformation einnimmt. Die Helix α8 wird etwas verkürzt und die Helix α7 etwas verlängert und begradigt, wodurch sich der Oxyanionenloch-Loop vom Dimerisierungsbereich entfernt und ein ausgedehntes Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk aufbaut. In dieser Konformation stabilisiert der loop das Oxyanionenloch, wodurch die Protease aktiviert wird. Weiterhin wurde durch small-angle X-ray scattering bestätigt, dass der Dimerisierungsgrad von der Assemblin- und Mg²+;-Ionenkonzentration abhängig ist. Diese Informationen zur Dimerisierung des PrV-Assemblins können dazu beitragen, rationale Medikamentenentwicklung zu betreiben. Daraus resultierende Wirkstoffe können die Dimerisierung und somit die Aktivierung dieses Schlüsselproteins verhindern. Durch die hohe Ähnlichkeit der Assembline in anderen Herpesviren, kann die nun bekannte monomere Struktur des PrV-Assemblins als Modell für die monomere Struktur anderer, zum Teil humanpathogener Herpesviren genutzt werden. Demzufolge könnte dieses Modell auch die Entwicklung von Medikamenten beispielsweise gegen das Epstein-Barr virus oder das herpes simplex virus 1 ermöglichen. Es stellte sich zudem heraus, dass die bisher für das PrV-pUL26 bzw. -pUL26.5 vorhergesagte zweite Assemblinschnittstelle (M-site) vermutlich nicht korrekt ist. Es wurde eine andere M-site vorgeschlagen, welche ebenfalls infrage kommt. Eine Charakterisierung in vitro war bei fünf der neun zu untersuchenden Proteine möglich. Die anderen vier Proteine (pUL7, -16, -21 und -32) konnten aus verschiedenen Gründen nicht erfolgreich exprimiert werden. Die Proteine pUL4, pUL26.5 und pUL33 wurden unlöslich exprimiert, wobei pUL33 renaturiert werden konnte. Der Membrananker pUL11 und die N-terminale Serinproteasedomäne von pUL26 konnten löslich exprimiert werden. Untersuchungen in silico ergaben, dass der Membrananker pUL11 aus dem pseudorabies virus wahrscheinlich ein nukleäres Exportsignal trägt, was bisher nicht bekannt war. Es ist zudem wahrscheinlich, dass pUL11 selbst keine definierte Struktur hat, da es mit 63 Aminosäuren ein sehr kleines Protein ist und über Sequenzmuster mit anderen Proteinen interagiert.
Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe
(2017)
Der Einsatz von Tierversuchen in Forschung und Entwicklung nimmt trotz fortschreitender Optimierung von Testmethoden und –verfahren weiter zu. Zeitgleich werden fortwährend neue Substanzen isoliert oder synthetisiert, deren Wirkungen auf den humanen Organismus und speziell das Immunsystem nicht bekannt sind. In vitro Methoden stellen deshalb sowohl eine günstige und schnelle als auch eine ethisch unbedenkliche Alternative zu Tierversuchen dar. In der vorliegenden Arbeit sollten proteom- und transkriptombasierte Methoden dazu dienen, immuntoxische Eigenschaften von Naturstoffen zu identifizieren und diese Verfahren als Alternative zu Tierversuchen zu etablieren. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien mit Naturstoffen behandelt und das intrazelluläre Proteom sowie das Transkriptom spezifischer Biomarker-Gene analysiert. Zusätzlich dienten weitere Methoden wie Metaboliten-, Zellzyklus- und Apoptoseanalysen sowie die Identifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies dazu, Ergebnisse zu verifizieren oder zusätzliche Informationen zu erhalten. Wie zu erwarten war, zeigten die Proteomanalysen, dass sowohl immuntoxische als auch nicht-immuntoxische Substanzen eine breite Wirkung auf das intrazelluläre Proteom haben. Vor allem Proteine, die in den allgemeinen Metabolismus, zelluläre Prozesse und Prozesse der Informationsverarbeitung involviert sind, wurden durch die Behandlung mit den Substanzen in ihrer relativen Menge auf den 2D-Gelen verändert. Allein durch die Zuordnung von Proteinen zu Stoffwechselwegen war eine Abgrenzung immuntoxischer und nicht immuntoxischer Substanzen nicht möglich. Dennoch gibt die Methode einen Einblick in die Wirkungsweise der Substanzen, wodurch Wirkmechanismen entschlüsselt und Reaktionen auf das Immunsystem abgeleitet werden können. Dies wird vor allem nach der Behandlung der Zellen mit Tulipalin A und Helenalin deutlich, da auch allgemeine Stoffwechselwege wie die Purinsynthese und die anaerobe Glykolyse einen Einfluss auf das Immunsystem haben. Zusätzlich zu den allgemeinen Stoffwechselwegen wurden einzelne Proteine in ihrer Abundanz verändert, die in Reaktionen des Immunsystems wie der Zytokinbildung oder der Bildung von MHC-Molekülen involviert sind. Außerdem konnten Biomarker für Immuntoxizität auf Proteomebene entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Daten war eine Klassifizierung der Substanzen nach ihrer Immuntoxizität möglich. Anhand dieser Analysen wurden die Testsubstanzen Tulipalin A, Helenalin, Vincristin und Cannabidiol als immuntoxisch klassifiziert. Die Klassifizierung der Substanzen als immuntoxisch aufgrund der Biomarker-Proteine und Stoffwechselwege konnte durch die Anwendung von Transkriptom-Biomarkern bestätigt werden. Neben den über 2D-Gelelektrophorese-basierten Proteomanalysen getesteten Substanzen wurden auch Bisphenol A und Ergosterolperoxid aufgrund der Transkriptombiomarker als immuntoxisch klassifiziert. Agaritin und p-Tolylhydrazin sowie der Bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether haben keine immuntoxische Wirkung. Neben den Proteom-basierten Methoden dient der entwickelte Entscheidungsbaum basierend auf verschiedenen Methoden als Grundlage für die Immuntoxiztätsklassifizierung. Mit dem erstellten Entscheidungsbaum konnten beispielsweise Cyclosporin A, Helenalin und Tulipalin A durch die Anwendung gezielter Tests als immuntoxisch eingestuft werden, während Mannitol als nicht-immuntoxisch bestätigt wurde. Zusammenfassend war es mittels in vitro Methoden möglich, die Immuntoxizität verschiedener Naturstoffe zu identifizieren. Neben Proteom-basierten Methoden wurden auch Transkriptom- sowie funktionelle und Metabolomanalysen genutzt. Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Alternative zu Tierversuchen für eine erstes Screening Testung neuer Substanzen ermöglichen und so sowohl Zeit und Kosten sparen als auch ethische Bedenken minimieren.
Ribozymes for Aminoacylation
(2012)
Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) are at the heart of modern translation, catalyzing the accurate biosynthesis of aminoacyl-tRNAs. According to the RNA world hypothesis, the early translation system should have aminoacylation ribozymes for RNA aminoacylation. For this, an aaRS ribozyme system, consisting of the KK13 ribozyme and the C3a ribozyme was successfully designed, which can perform both amino acid activation and aminoacyl transfer reaction. Generation of such aminoacylation ribozyme system would fill up the gap between the RNA world and the modern biological world. In addition, two types of diversified aminoacylation ribozymes, symmetrical ribozymes and self-assembling ribozymes were successfully developed, which may have great meaning in the origin of life.
The focus of the first two articles was the engineering and application of enzymes for the conversion of the bio-based resources glycerol and its oxidation product glyceraldehyde for the production of the value added product glyceric acid. Article III focuses on the cloning, exploration and engineering of a polyol dehydrogenase, which later on was used as cofactor recycling system in order to produce ε-caprolactone from cyclohexanol as presented in arti-cle IV. The following paragraphs will give a short outline of each article. ARTICLE I: ASYMMETRIC SYNTHESIS OF D-GLYCERIC ACID BY AN ALDITOL OXIDASE AND DIRECTED EVOLUTION FOR ENHANCED OXIDATIVE ACTIVITY TOWARDS GLYCEROL. GERSTENBRUCH, S., WULF, H., MUßMANN, N., O’CONNELL, T., MAURER, K.-H. & BORNSCHEUER, U. T. (2012). Appl. Microbiol. Biotechnol. 96, 1243-1252. The alditol oxidase of Streptomyces coelicolor A3(2) (AldO) was used to catalyze the oxida-tion of glycerol to glyceraldehyde and glyceric acid. The enantioselectivity for the FAD-de-pendent glycerol oxidation was elucidated and different strategies were used to enhance the substrate specificity towards glycerol. Directed evolution by error-prone PCR led to an AldO double mutant with 1.5-fold improved activity for glycerol. Further improvement of activity was achieved by combination of mutations, leading to a quadruple mutant with 2.4-fold higher specific activity towards glycerol compared to the wild-type enzyme. In small-scale biotransformation concentrations up to 2.0 g•l-1 D-glyceric acid could be reached using whole cells. Investi¬gation of the effects of the introduced mutations led to a further identification of es¬sential amino acids with respect to enzyme functionality and structural stability. ARTICLE II: KINETIC RESOLUTION OF GLYCERALDEHYDE USING AN ALDEHYDE DEHYDROGENASE FROM DEINOCOCCUS GEOTHERMALIS DSM 11300 COMBINED WITH ELECTROCHEMICAL COFACTOR RECYCLING. WULF, H., PERZBORN, M., SIEVERS, G., SCHOLZ, F. & BORNSCHEUER, U. T. (2012). J. Mol. Catal. B Enzym. 74, 144-150. Two aldehyde dehydrogenases (ALDH) from Escherichia coli BL21 and Deinococcus geother-malis were cloned, characterized and evaluated according to their applicability for a bio-catalysis setup with electrolytic cofactor recycling. Both ALDHs turned out to have a sim¬ilar substrate scope and favor short to medium chain aldehydes and both oxidize glyceralde¬hyde to D-glyceric acid. The ALDH variant of D. geothermalis shows higher specific activity towards glyceraldehyde and has an elevated optimum temperature compared to the BL21 enzyme. Due to the higher specific activity of the ALDH of D. geothermalis, this enzyme was used to conduct a kinetic resolution of glyceraldehyde with electrolytic NAD+ recycling at a glassy carbon foam electrode with ABTS as redox mediator yielding in 1.8 g•l-1 glyceric acid. ARTICLE III: PROTEIN ENGINEERING OF A THERMOSTABLE POLYOL DEHYDROGENASE. WULF, H.*, MALLIN, H.*, BORNSCHEUER U.T. (2012). Enzyme Microb. Technol. 51, 217-224 (*equally contributed). The new enzyme polyol dehydrogenase PDH-11300 from D. geothermalis was extensively characterized regarding its temperature optimum and thermostability. A peptide stretch responsible for substrate recognition from the PDH-11300 was substituted by this particular stretch of a homolog enzyme, the galactitol dehydrogenase from Rhodobacter sphaeroides (PDH-158), resulting in a chimeric enzyme (PDH-loop). The substrate scopes were deter-mined and basically the chimeric enzyme represented the average of both wild-type en-zymes. A rather unexpected finding was the notably increased T5060, by 7°C to 55.3°C, and an increased specific activity against cyclohexanol. Finally, the cofactor specificity was suc¬cess-fully altered from NADH to NADPH by an Asp55Asn mutation, which is located at the NAD+ binding cleft, without influencing the catalytic properties of the dehydrogenase. ARTICLE IV: A SELF-SUFFICIENT BAEYER-VILLIGER BIOCATALYSIS SYSTEM FOR THE SYNTHESIS OF Ɛ-CAPROLACTONE FROM CYCLOHEXANOL. MALLIN, H. *, WULF, H. *, BORNSCHEUER U.T. (2013). Enzyme Microb. Technol., online, DOI: 10.1016/j.enzmictec.2013.01.007 (*equally contributed). The application of the engineered PDH-loopN mutant [1] (Article III) for the production of ε-caprolactone from cyclohexanol was investigated in a co-immobilization approach with the cyclohexanone monooxygenase from Acinetobacter calcoaceticus. Biotransformation with solubilized enzymes led to an isolated yield of 55% pure ε-caprolactone with no residual cy-clohexanol to be detected. During the immobilization experiments a higher enzyme ratio in favor of the CHMO led to higher reaction velocities. Similarly, the addition of soluble fresh CHMO during reuse of co-immobilization batches significantly increased the activity identi-fying the CHMO as the bottleneck in this reaction setup.
Biorelevante In-vitro-Freisetzungsmodelle werden u. a. für das Screening neuartiger Formulierungen, zur Etablierung von In-vitro-/In-vivo-Korrelationen und zur Vorhersage des In-vivo-Verhaltens einer applizierten Darreichungsform angewendet. Die Entwicklung von In-vitro-Freisetzungsmodellen für peroral verabreichte Arzneiformen fokussierte bisher vorwiegend auf die Abbildung der gastrointestinalen Physiologie eines gesunden, „durchschnittlichen“ Erwachsenen. Patientenspezifische Faktoren, wie z. B. das Alter, Erkrankungen oder Geschlecht sowie individuelle Unterschiede, die die gastrointestinalen Verhältnisse und folglich auch das Freisetzungsverhalten einer peroral applizierten Arzneiform beeinflussen können, wurden bisher kaum berücksichtigt. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Entwicklung und Etablierung von patientenspezifischen, bioprädiktiven In-vitro-Freisetzungsmodellen für perorale Darreichungs-formen unter Berücksichtigung der gastrointestinalen Gegebenheiten zweier unterschiedlicher Patientenpopulationen: pädiatrische Patienten und Parkinson-Patienten.
Eine wichtige Voraussetzung für eine sichere und wirksame perorale Arzneimitteltherapie bei pädiatrischen Patienten sind altersgerechte Darreichungsformen sowie eine geeignete Einnahmepraxis. Peroral applizierte Arzneimittel werden pädiatrischen Patienten häufig zusammen mit Applikationsvehikeln verabreicht, um die Einnahme der Arzneimittel zu erleichtern. Es muss jedoch bei einer solchen Anwendungspraxis sichergestellt werden, dass die eingenommene Arzneiform mit dem jeweiligen Applikationsvehikel kompatibel ist. Die Beurteilung der Kompatibilität ist anhand klinischer In-vivo-Studien an gesunden Kindern jedoch aufgrund ethischer Bedenken kaum möglich. Zur Evaluierung der Kompatibilität könnten In-vitro-Freisetzungsmethoden als eine mögliche Alternative eingesetzt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden pädiatrische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt, um zu evaluieren, ob die Stabilität und das In-vivo-Freisetzungsverhalten der neuartigen Alkindi®-Formulierung durch Co-Verabreichung mit alterstypischen Applikationsvehikeln beeinträchtigt werden. Zur Beantwortung dieser Fragestellung wurden im Anschluss an eine intensive Literaturrecherche Physiologie-basierte In-vitro-Modelle auf Basis der Mini-Paddle-Apparatur entwickelt. In der ersten Studie wurde die In-vitro-Wirkstofffreisetzung nach simulierter Applikation der Alkindi®-Formulierung mit typischen Applikationsvehikeln für Kinder unter 6 Jahren, d. h. Muttermilch, Formulamilch und Vollmilch, untersucht. In der zweiten In-vitro-Studie wurde der Altersbereich der adressierten Patientenpopulation auf 2 - 16 Jahre verändert und eine Reihe weiterer flüssiger sowie halbfester Applikationsvehikel, wie z. B. Orangensaft und Joghurt, verwendet. In beiden Studien konnte deutlich gezeigt werden, dass die Alkindi®-Formulierung ein robustes Freisetzungsverhalten aufwies und kompatibel mit den untersuchten Matrices war. Auf Grundlage der Ergebnisse der In-vitro-Untersuchungen wurde geschlussfolgert, dass die In-vivo-Freisetzung und die Bioverfügbarkeit der untersuchten Arzneiform nicht durch die untersuchten Applikationsvehikel beeinflusst werden und folglich diese Vehikel zur gemeinsamen Einnahme mit der Alkindi®-Formulierung geeignet sind. Diese Beobachtungen wurden darüber hinaus durch publizierte Ergebnisse einer korrespondierenden In-vivo-Studie in Erwachsenen bestätigt.
Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Entwicklung eines neuartigen, Parkinson-spezifischen und Physiologie-basierten In-vitro-Freisetzungsmodells. Für die Entwicklung von biorelevanten In-vitro-Modellen zur Simulation der luminalen Bedingungen im Gastrointestinal-trakt einer spezifischen Patientenpopulation sind umfangreiche Kenntnisse über die jeweiligen gastrointestinalen In-vivo-Bedingungen und deren Variabilität unerlässlich. Im Rahmen einer Literaturrecherche wurde der aktuelle Wissensstand zu den gastrointestinalen Gegebenheiten in Parkinson-Patienten recherchiert, ausgewertet und zusammengefasst. Die Ergebnisse der Literaturstudie machen deutlich, dass sich die gastrointestinalen Bedingungen von Parkinson-Patienten teilweise erheblich von gesunden Erwachsenen unterscheiden. Das bedeutendste gastrointestinale Merkmal von Parkinson-Patienten ist die beeinträchtigte Motilität des Gastrointestinaltrakts, was sich u. a. in einer Verlangsamung der Magenentleerung sowie der intestinalen Passage äußert. Demgegenüber steht jedoch ein großer Mangel an Daten für eine Reihe von gastrointestinalen Parametern. Dies betrifft z. B. die Zusammensetzung und physiko-chemischen Eigenschaften der luminalen Flüssigkeiten des Gastrointestinaltrakts.
Als geeignete In-vitro-Testplattform wurde die USP-3-Apparatur – auch als Eintauchender Zylinder (Europäisches Arzneibuch, Ph. Eur.) und Reciprocating cylinder (Ph. Eur. und US-amerikanisches Arzneibuch, USP) bezeichnet – ausgewählt, da sich diese Testplattform insbesondere zur Untersuchung von Darreichungsformen mit modifizierter Wirkstofffreisetzung eignet und bereits in einer Vielzahl von analytischen Laboren etabliert ist. Die Nutzung der kompendialen USP-3-Apparatur ließ aufgrund der geringen Variationsmöglichkeiten keine Simulation typischer Motilitätsmuster im humanen Gastrointestinaltrakt zu und eignete sich noch weniger für die Entwicklung und Etablierung von individuellen, patientenspezifischen Motilitätsprofilen. Um diese technischen Limitationen zu überwinden, wurde für die Weiterentwicklung des arzneibuchkonformen Modells ein Lastenheft erstellt, welches detaillierte Anforderungen für die Entwicklung der neuen Testapparatur enthielt. Auf Grundlage des beschriebenen Übersichtsartikels und unter Anwendung einer auf Basis des Lastenheftes modifizierten USP-3-Apparatur wurden unter besonderer Berücksichtigung von Motilität, Passagezeiten und Flüssigkeitsvolumina Parkinson-spezifische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt. Für ausgewählte modifiziert freisetzende Levodopa-Fertigarzneimittel wurde anschließend eine vergleichende Serie von In-vitro-Freisetzungsuntersuchungen unter Anwendung von Parkinson-spezifischen- oder „standardmäßigen“ Testmodellen durchgeführt, wobei letztere die gastrointestinalen Gegebenheiten eines „durchschnittlichen“, gesunden Erwachsenen simulierten. Für eine Beurteilung der Aussagekraft der entwickelten Parkinson-spezifischen Testmodelle wurden die generierten In-vitro-Freisetzungsdaten aus den Parkinson-spezifischen- und den „standardmäßigen“ Freisetzungsuntersuchungen in ein In-silico-PBPK-Modell implementiert und die jeweiligen simulierten Plasmakonzentrations-Zeit-Profile von Levodopa anschließend mit klinischen, durchschnittlichen In-vivo-Daten korreliert. Für PBPK-Modelle mit integrierten Parkinson-spezifischen In-vitro-Freisetzungsdaten wurde eine höhere Prädiktivität des In-vivo-Verhaltens der untersuchten Levodopa-Darreichungsformen beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Parkinson-spezifischen In-vitro-Modelle ein vielversprechendes und prädiktives Instrument zur Vorhersage der In-vivo-Wirkstofffreisetzung von modifiziert freisetzenden Levodopa-Darreichungsformen darstellen. Der diskutierte methodische Ansatz der vorliegenden Studie könnte zukünftig das Screening neuartiger Formulierungen deutlich optimieren und somit zu einer verbesserten Arzneimitteltherapie für Parkinson-Patienten, aber auch für andere spezifische Patientengruppen beitragen
Diese Arbeit beschreibt den Aufbau eines Assays zur Selektion eines Ribozyms, welches die Desaminierung von Adenosin zu Inosin katalysiert. Diese Reaktion spielt im Organismus, wo sie proteinkatalysiert abläuft, eine wichtige Rolle (Nukleotidmetabolismus, RNA-Editing). Zusätzlich besitzt ein solches Ribozym das Potenzial zur gezielten Veränderung von RNA-Sequenzen. Das Projekt hat somit evolutionstheoretische (RNA-Welt-Hypothese) als auch gentherapeutische Relevanz. Zentraler Punkt des vorgestellten Assays ist die Markierung einer Mischung verschiedener RNA-Sequenzen (= Bibliothek) mit dem Substrat Adenosin. Dieses trägt an der exozyklischen Aminogruppe eine Biotinfunktion. Wird diese Bibliothek auf einer festen Phase über die Biotin/Streptavidin-Wechselwirkung immobilisiert und den Selektionsbedingungen unterworfen, werden Spezies mit der gewünschten Aktivität in Lösung entlassen. Diese können eluiert und über RT-PCR angereichert werden. Die Funktionalisierung der RNA-Bibliothek geschieht am 5’-Ende jeder Sequenz durch Transkriptionspriming aus einer chemisch synthetisierten DNA-Bibliothek in Gegenwart der vier NTPs und eines Guanosin-5’-monophosphatderivats, dem „Initiator“. Letzteres ist über die 5’-Phosphatfunktion mit dem biotinylierten Substrat Adenosin verknüpft. Das Initiatormolekül wurde in zwei Strategien synthetisiert. Die erste Strategie fand an der festen Phase unter Verwendung des Phosphoramiditverfahrens statt und lieferte Initiator in nanomolarem Maßstab. Die zweite Strategie bestand aus einer 17-stufigen Synthese in Lösung und ergab fast identisches Initiatormolekül in µmolarem Maßstab. Beide Initiatormoleküle wurden erfolgreich zur Funktionalisierung einer RNA eingesetzt. Zur qualitativen Dokumentation des Einbaus des Initiators wurde eine auf Chemilumineszenzdetektion basierende Methode entwickelt. Dabei wurden die Transkriptionsprodukte auf eine Nylonmembran immobilisiert und mit einem Fusionsprotein aus Alkalischer Phosphatase und Streptavidin inkubiert, welches spezifisch den Biotinrest bindet. Durch Zugabe eines möglichen Substrats der Alkalischen Phosphatase wird ein Chemilumineszenzsignal erzeugt, was über einen Röntgenfilm dokumentiert wurde. Dieser qualitative Nachweis wurde erweitert, um die Einbaueffizienz zu quantifizieren. Dazu wurde eine RNA, welche zu 100% mit dem Initiatormolekül markiert war, mit Hilfe des Phosphoramiditverfahrens hergestellt. Diese als Standard fungierende RNA wurde in definierter Menge zusammen mit definierten Mengen an statistisch funktionalisierten Primingprodukt geblottet. Die Quantifizierung der Chemilumineszenz der Proben erfolgte mit Hilfe eines Photosystems und durch Integration der Signalintensitäten. Dadurch konnte der Anteil der in den durchgeführten Primingreaktionen mit Initiator markierten RNA zu maximal 3 % bestimmt werden. Obwohl eine Erhöhung dieses Wertes z.B. durch Optimierung der Initiatorstruktur wünschenswert ist, ist damit die Funktionalisierung einer RNA-Bibliothek in einer für die Selektion ausreichenden Menge durchaus möglich. Zur Evaluation des Assays wurde der Selektionsschritt simuliert, in welchem ein über das Initiatormolekül festphasengebundenes Ribozym spezifisch zur Selbstspaltung aktiviert wird. Zu diesem Zweck wurden ein Hammerheadriboyzm, ein Hairpinribozym sowie ein DNAzym untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die Spaltaktivität aller drei Systeme durch Funktionalisierung mit dem Initiator in Lösung fast vollständig inhibiert wird, unmarkierte Spezies unter identischen Bedingungen jedoch uneingeschränkte Spaltaktivität zeigen. Die beobachtete Inhibierung beruht auf einem intramolekularen Effekt, der möglicherweise zu einer Verschiebung des Konformerengleichgewichts der Testsysteme hin zu spaltinaktiven Konformeren führt. Zusätzlich wurde die Spaltaktivität des mit Initiator markierten und an einer Festphase immobilisierten Hairpinribozyms untersucht. Auch hier war eine stark verringerte Spaltaktivität zu beobachten, welche jedoch in unspezifischen Wechselwirkungen zwischen Festphase und Ribozym begründet liegen könnten. Die verwendeten Systeme eignen sich offenbar nicht zur Evaluierung des Assays, was jedoch die Möglichkeit offen lässt, dass im geplanten Assay selektierte RNA-Sequenzen die Funktionalisierung mit Initiator tolerieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben den Schluss, dass die gewählte Strategie zur Selektion der Adenosindesaminase einige Punkte beinhaltet, welche nach Möglichkeit optimiert werden müssen, um eine effizientere Selektion durchführen zu können. Prinzipiell ist die Vorraussetzung für die Selektion der Adenosindesaminase durch die beschriebene Methode jedoch geschaffen und kann basierend auf den vorgestellten Ergebnissen in zukünftigen Studien durchgeführt werden.
Das aus antarktischem Meereis stammende und auch bei geringen Temperaturen schnell wachsende γ Proteobakterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PhTAC125) ist ein Modellorganismus für kälteangepasste Bakterien und Enzyme. Zusätzlich ist es ein alternativer Expressionswirt für die lösliche Überproduktion von heterologen Proteinen, die in etablierten Expressionswirten zur Bildung von inclusion bodies neigen. Bisher sind bei PhTAC125 im Rahmen der Erforschung von Kälteanpassungsmechanismen bzw. der Optimierung des kälteangepassten Expressionssystems nur Teilaspekte der Physiologie, des Stoffwechsels und der Bioprozessoptimierung untersucht worden. Bis zum Beginn dieser Dissertation gab es kaum Experimente, die sich mit der dynamischen und nahezu ganzheitlichen Betrachtung der Veränderung zellulärer Zustände und des Stoffwechsels von PhTAC125 beschäftigt haben. Darüber hinaus sind trotz der Fortschritte bei der Etablierung von PhTAC125 als alternativer Expressionswirt die bisher erzielten Biomassekonzentrationen gering. Aus diesem Grund wurden in dieser Dissertation zur Untersuchung des Stoffwechsels die exponentielle Wachstumsphase sowie vergleichende Untersuchungen verschiedener Wachstumsphasen und zellulärer Kompartimente auf Basis der Proteomanalytik durchgeführt. Zusätzlich konnte mit Hilfe der Fed-Batch-Kultivierungstechnik die Biomassekonzentration im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden deutlich gesteigert werden. Zur Untersuchung der Physiologie und des Stoffwechsels von PhTAC125 während des exponentiellen Wachstums wurde das Proteom analysiert. Neben den typischen stark exprimierten Kategorien der exponentiellen Wachstumsphase wie Protein- u. Nukleotidbiosynthese, Aminosäure- u. Kohlenstoffmetabolismus, stellten sich vor allem die Proteine des TonB abhängigen Transportsystems (TBDT), sowie der Kategorien Entgiftung und Coenzyme für PhTAC125 als wichtig heraus. Das TBDT ist wegen seiner hohen Abundanz im Proteom und seiner potentiellen Beteiligung am Transport von Proteinabbauprodukten für PhTAC125 ähnlich bedeutend wie die anderen Kategorien mit einer hohen Anzahl stark exprimierter Proteine. Auch die Proteine zum Schutz vor ROS (reactive oxygen species) und die der Biosynthesewege der Coenzyme sind besondere und bedeutende Merkmale von PhTAC125. Der ROS Schutz ist bei kälteangepassten Bakterien während des Wachstums bei geringen Temperaturen (≤ 20°C) mit erhöhter Sauerstofflöslichkeit und der damit verbundenen verstärkten ROS-Bildung essentiell. Die Verfügbarkeit der meisten Biosynthesewege der Coenzyme im Proteom von PhTAC125 ist ein besonderes Charakteristikum gegenüber vielen anderen Wasser- und Bodenmikroorganismen und kennzeichnet einen potentiellen Wachstumsvorteil. Zur vergleichenden Untersuchung der unterschiedlichen zellulären Kompartimente von PhTAC125 wurden 2D-Gelbilder des Cyto- und Periplasmas erstellt und gegenübergestellt. Das periplasmatische Kompartiment war wesentlich durch Signalpeptid-haltige Proteine des TBDT, Porine und periplasmatische Peptidasen und Chaperone charakterisiert. Die Untersuchung der Proteomsignaturen unter Nährstofflimitationsbedingungen basierte auf dem Vergleich der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase mit der exponentiellen Wachstumsphase. Beide Wachstumsphasen waren durch Kategorien mit hoher Anzahl an gering exprimierten Proteinen dominiert. Dabei handelte es sich vor allem um die Kategorien der Nukleotid-, Protein- und RNS-Biosynthese. Diese potentiell reprimierten Kategorien der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase waren in Verbindung mit der Limitation der meisten Aminosäuren ein deutlicher Hinweis auf die stringent response. In diesem Zusammenhang schienen die stärker exprimierten Proteine (TBDT, Porine, Peptidasen/Protease und PilQ) positiv durch die stringent response eguliert zu sein, um das Überleben unter Nährstofflimitationbedingungen zu garantieren. Bei der Bioprozessoptimierung zur Steigerung der Biomassekonzentration von PhTAC125 wurden zwei verschiedene FB-Strategien durchgeführt. Bei der ersten Strategie wurde eine komplexe Aminosäurequelle (Casamino Acids) als Substrat eingesetzt und über konstante oder exponentielle Substratzufütterungsprofile eine optische Dichte (OD) von 30 erreicht. Im Vergleich zu den bisherigen in der Literatur beschriebenen Bioprozessen von PhTAC125 wurde die finale Biomassekonzentration 3 fach erhöht. Bei der zweiten FB-Strategie wurde ein „definierteres“ Substrat bestehend aus Glycerol und Glutamat für die Fütterungslösung eingesetzt. Mit einer anfänglichen exponentiellen gefolgt von einer konstanten Fütterungsrate konnte die Biomassekonzentration (OD = 86) gegenüber den veröffentlichen Ergebnissen 8 fach gesteigert werden. Zusammenfassend konnten erste proteombasierte Aussagen zur Physiologie und zum Stoffwechsel von PhTAC125 getroffen und erste Bioprozessstrategien zur gezielten Biomassesteigerung entwickelt werden.
Durch die vorliegende Arbeit wurde die Relevanz moderner Ansätze in der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung für den Erfolg und die Sicherheit in der Arzneistoffentwicklung aufgezeigt. Neben den theoretischen Grundlagen konnte die praktische Anwendung molekularer Vielfalt mit Hilfe komplementärer Substanzbibliotheken vielfach direkt den resultierenden Nutzen aufzeigen. Dabei galt das Interesse speziell antiproliferativen Zielstrukturen, mit besonderem Schwerpunkt auf der Hemmung der Glutathionperoxidase. Des Weiteren unterstützten in silico-Methoden eine zielgerichtete Arbeitsweise. Durch die Optimierung des GPx 1-Testsystems konnte eine zuverlässige in vitro-Analytik etabliert werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mit Hilfe der angestellten Untersuchungen die erfolgreiche Entwicklung, Optimierung und Evaluierung mehrerer Leitstrukturen für diverse Zielproteine der Tumortherapie aufgezeigt werden konnte. Es wurden zunächst die Fortschritte auf dem Gebiet der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung über multifunktionale Screeningbibliotheken zusammengefasst und bewertet (Publikation 1). Die vorgestellten Ansätze, wie Halogenbindungen und sp3-Reichtum, fanden in den folgenden Publikationen zu einem Großteil praktische Anwendung. Die Synthese einer umfangreichen Acylhydrazonbibliothek führte zum Ausbau der inhibitorischen Aktiviät gegenüber der bovinen GPx 1 (Publikation 2). Der kombinatorische Syntheseansatz erbrachte eine Vielzahl eng verwandter Analoga, die entgegen der Erwartungen leider kaum Erkenntnisse über SAR erbrachten. Zudem erwiesen sich die angewandten Docking-Studien als irreführend, da keinerlei Korrelation zu den in vitro-Ergebnissen erkennbar war. Dennoch konnte mit den angestellten Untersuchungen ein stabiler Enzymassay etabliert werden, der eine zuverlässige Analyse zukünftiger Produkte unterstützt. Langfristig wäre für Aussagen über quantitative SAR die gezielte Optimierung anhand einer Kristallstrukturanalyse erforderlich. Alternativ wurden bereits erste NMR-Versuche mit Sättigungstransfer-Differenz (STD)-Spektroskopie angestellt, die sich jedoch aufgrund der schlechten Löslichkeit der Acylhydrazone als schwierig erwiesen. Weiterhin wurde Misonidazol als Inhibitor der GPx 1 einer Neubewertung unterzogen (Publikation 3). Während racemisches Misonidazol nach früheren Berichten die Aktivität muriner GPx 1 bei 500 µM signifikant reduzierte, zeigte die in vitro-Testung der reinen Enantiomere gleicher Konzentration an boviner GPx 1 keine inhibitorische Wirkung. Von wissenschaftlichem Nutzen war zudem die Erkenntnis über einen schwachen, aber nachweisbar signifikanten Synergismuseffekt des Racemats verglichen mit den isolierten Enantiomeren. Die ergänzende Beschreibung dieser noch wenig untersuchten Wirkungspotenzierung liefert einen Beitrag zum gesamtheitlichen Verständnis dieses Phänomens. Alle synthetisierten Endstufen sowie ausgewählte Zwischenstufen wurden in einer öffentlich zugänglichen Screeningplattform, dem FMP in Berlin, hinterlegt (Publikation 4). Sie haben als Gemeinsamkeit eine ausgeprägte Reaktionsbereitschaft, wodurch in zukünftigen biologischen Screenings eine gezielte oder auch zufällige Entdeckung neuartiger Interaktionen nicht abwegig ist. Die nukleophilen Verbindungen 1, 2, 4 und 5 könnten mit basischen Aminosäuren, wie dem Histidin der Serinproteasen, oder mit Metalloenzymen wechselwirken, während durch die gezielte Elektrophilie von 3 kovalente reversible Bindungen mit Cysteinresten und deren Selen-Analoga zu erwarten sind. Der Beitrag fragmentbasierter Substanzbibliotheken zur Leitstrukturentwicklung konnte am Beispiel der 4-Amidocyclopentan-1,3-diole gezeigt werden (Publikation 5). Ausgehend von acht trisubstituierten Cyclopentan-Templaten konnte die Synthese von achtzig Produkten mit zum Teil potenter Wirkung gegen mehrere Tumor-Zelllinien beschrieben werden. Die Substanzbibliothek dieser Studie demonstriert den Einsatz moderner Methoden zur Bereitstellung von Werkzeug für offene Fragen der Molekularbiologie aus einem bisher zu wenig bearbeiteten Bereich des chemischen Strukturraums. Mit Hilfe von in silico-Untersuchungen gelang eine gezielte Synthese neuartiger Inhibitoren NAD+-abhängiger Histondeacetylasen (Publikation 6). Die resultierende Klasse N1-substituierter Benzimidazolthione zeichnete sich durch erhöhte physiologische Stabilität gegenüber der Leitstruktur Splitomicin aus. Obgleich eine vollständig selektive Inhibition zwischen den Sirtuinen 1–3 nicht erreicht wurde, gelang durch die Anwendung computergestützter Methoden die Synthese eines potenten Inhibitors mit selektiver Wirkung gegen Sirtuin 1 und 2, dessen Grundgerüst als Leitstruktur weiterer Untersuchungen dienen kann.
Interactions between bacteria and the human body are manifold and happen constantly. Most parts of the skin and gastrointestinal tract, the saliva, the oral mucosa, the conjunctiva and the vaginal mucosa are colonized with a multitude of bacterial species forming the human microbiota. Strikingly, the estimated amount of bacterial cells outnumbers the human body by 10 to 1. However, most of these bacteria colonize the human body without positive or negative effects and are regarded as commensals. Staphylococcus aureus a Gram positive bacterium is such a commensal bacterium of 25 % to 30 % of the world population. It is also an opportunistic pathogen and is able to cause infections in the lung, skin and heart and to induce sepsis. Its pathogenicity is mainly facilitated by the secretion of a broad spectrum of virulence factors which interact with the host. Some are distracting the immune system, others are targeting the host cell membrane or degrade macromolecular structures of the host in order to provide nutrients. Furthermore S. aureus is able to invade the host cell and to survive and replicate in the host cell cytosol or other compartments. The Gram negative proteobacterium Burkholderia pseudomallei is an environmental bacterium but still has the ability to enter the human body via body orifices or skin wounds. In a very efficient way it penetrates the host cell, replicates intracellular and the uses host structures to spread from cell to cell thereby causing the disease melioidosis often with fatal outcomes. Since the natural habitats of B. pseudomallei are wet soils, the change to the environment in the human body is drastic and requires a high degree of flexibility of the bacterium. Environmental stress conditions such as temperature, pH, nutrient limitation or presence of antibiotics induce a switch of colony morphology which is a special characteristic of this bacterium. Since it is assumed, that changes in colony morphology are connected to adaptive processes to the environmental changes, these morphology switches might also be important during infection. The host organism and the host cell on the other side try to kill and remove the bacterial threat by activating the immune system and cellular defence mechanisms. This includes generation of reactive oxygen and nitrogen species, production of antimicrobial peptides and cellular processes such as phagocytosis, autophagy, apoptosis and activation of the immune response. The actions and reactions on both, the pathogen side and the host side, are summarized as host-pathogen interactions. In the field of functional genomics, methods were developed to understand various levels of host-pathogen interactions. The holistic analysis of the mRNA (the transcriptome) or translated proteins (the proteome) were already very useful tools to describe important cellular processes on the host and the pathogen site. The level of metabolites with regard to host-pathogen interactions however, has been neglected so far. In this dissertation the metabolic composition in the intracellular and extracellular space of the host and the pathogen was analyzed. For this matter biochemical analytical tools were used such as 1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy and chromatographic methods (GC and HPLC) coupled to mass spectrometry. The combination of these methods allows a broad coverage of physicochemical diverse metabolites. In accordance to the above mentioned biological levels like mRNA and proteins, the sum of all metabolites is referred as the metabolome. Consequently to transcriptomics and proteomics the analysis of the metabolome is referred as metabolomics. To gain insights into the infection relevant metabolome of the host-pathogen relationship between S. aureus and human lung cells several approaches were developed. First the distribution of the recently identified bacillithiol in different S. aureus strains was investigated with regard to its role during the infection. For that matter a HPLC-methodology was used with fluorescence based detection of labelled low molecular weight thiols (article I: Distribution and infection-related functions of bacillithiol in Staphylococcus aureus). After that the next aim was to reveal the effect of S. aureus on the host cell metabolism. To reduce the complexity of effects on the host cells an artificial model was chosen in a first approach. The lung cells were treated with the staphylococcal virulence factor alpha-hemolysin, a pore forming toxin and a holistic metabolomics approach was performed (article II: Staphylococcus aureus Alpha-Toxin Mediates General and Cell Type-Specific Changes in Metabolite Concentrations of Immortalized Human Airway Epithelial Cells). Using this approach, a protocol for cell culture metabolomics was established and first changes in the host cell metabolome that could be caused by S. aureus were described. However, this only describes specific changes caused by one single virulence factor and does not necessarily describes the reality during a S. aureus infection. Therefore in a next approach, an infection model using a human lung epithelial cell line and the S. aureus strain USA300 was established and used for metabolome analysis. Furthermore a combination of inhibitor treatment and metabolic labelling was used to clarify the metabolic activity in the host cell after exposure to S. aureus (article III: Metabolic features of a human airway epithelial cell line infected with Staphylococcus aureus revealed by a metabolomics approach). Finally this thesis deals with the host-pathogen interaction of B. pseudomallei and its host with a focus on the role of the switch in colony morphology in basic metabolism. Various morphotypes of two strains were generated by nutrient limitation and their uptake of nutrients was monitored. Furthermore the morphotypes were used in in vitro and in vivo infections and subsequently isolated out of the cell line and mice respectively. After isolation, the colony morphology was determined and again the nutrient uptake profile was monitored (article IV: Burkholderia pseudomallei morphotypes show a synchronized metabolic pattern after acute infection). The information provided by this thesis adds a new complexity to the knowledge about the host-pathogen interactions of S. aureus and B. pseudomallei and their hosts. It furthermore lays the groundwork for future studies, which will deal with these and other bacterial host-pathogen interactions in order to understand the interdependencies of infection and metabolism.
In der Arbeit wird die Synthese und Charakterisierung von trans-Platin(IV)-Diaziden beschrieben. Es wird gezeigt, dass sie durch die Verwendung von UV- und Weißlicht photoaktiviert werden können, wobei Photoreduktionen, Photosubstitutionen oder Photoisomerisierungen auftreten können. Ähnlich wie der bekannte Antitumorwirkstoff Cisplatin, sind die Verbindungen in der Lage irreversiblel an DNA zu binden. In Zellversuchen konnte zusätzlich eine antiproliferierende Aktivität festgestellt werden, wenn mit Licht bestrahlt wurde. Im Dunkeln zeigten die Verbindungen keine Wirkung. Durch Zellzyklusanalysen und der Beobachtung von morphologischen Veränderung nach der Behandlung mit Platin(IV)-Diaziden kann jedoch auf einen zu Cisplatin unterschiedlichen Wirkmechanismus geschlossen werden.
Koronare Drug-eluting Stents sind röhrenförmige, netzartig aufgebaute, medizinische Implantate aus meist metallischen Grundkörpern, die zur Vermeidung eines erneuten Gefäßverschlusses mit Wirkstoff beschichtet sind. Derzeit finden die Beschichtungen der Stents typischerweise über speziell entwickelte Einzelbeschichtungsverfahren statt, die es ermöglichen, die feingliedrige und fragile Struktur der Implantate zu beschichten. Wesentliche Nachteile dieser Verfahren liegen allerdings in hohen Materialverlusten und geringer Fertigungs¬menge, die zu hohen Produktionskosten führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, inwieweit die Wirbelschichttechnologie zur Beschichtung von Stents eingesetzt werden kann. Die Wirbelschichttechnologie stellt ein etabliertes Verfahren zur Beschichtung von Partikeln im Großmaßstab mit geringen Verlusten dar. Obwohl in der Literatur das Verhalten verschiedener Partikel (Größe, Form, Dichte) in der Wirbelschicht beschrieben ist, wurde das Verhalten von netzartig aufgebauten Hohlkörpern noch nicht untersucht. Inwiefern sich die Wirbelschichttechnologie zur Beschichtung der fragilen Stents eignet, ist daher nicht vorhersagbar. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine Beurteilung hinsichtlich der Anwendbarkeit des Wirbelschichtverfahrens zur Beschichtung von Stents erfolgen. Dazu wurde das Fluidisierungs-verhalten der Körper unter Verwendung verschiedener Anströmböden untersucht. Darüber hinaus wurde der Einfluss der Prozessparameter, verschiedener Beschichtungsrezepturen und Stenttypen auf die Qualität der Beschichtung untersucht. Dazu wurden die beschichteten Körper hinsichtlich Homogenität und Defekte der Oberfläche, ihrer Robustheit gegenüber mechanischen Einflüssen, der Schichtverteilung und Gehaltsgleichförmigkeit und des Wirkstofffreisetzungsverhaltens untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Stents den Partikel der Geldart- Klasse D zugeordnet werden und die Beschichtungen der Stents erfolgte unter Verwendung eines speziell angefertigten konisch ausgeformten Anströmbodens. In Versuchen mit verschiedenen Beschichtungsmaterialien war es möglich typischer Weise auftretende Beschichtungsdefekte und präventive Gegenmaßnahmen zu identifizieren. So zeigte sich, dass es unter Verwendung von wässrig dispergierten Beschichtungsmaterialien die Bildung von Brücken oder Schwimmhäuten ausblieb, während diese typischer Weise unter Verwendung von organisch gelösten Beschichtungsrezepturen auftraten. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass es durch Anpassung der Prozessparameter möglich war Beschichtungen mit hoher Qualität zu erzeugen. Dabei wurden unabhängig von der Lackrezeptur leichter Abrieb, Risse oder Deformationen der Stentgrundkörper vor allem an den Stentenden beobachtet, da die Stents während des Beschichtungsprozesses einer starken mechanischen Belastung ausgesetzt waren. In Versuchen mit unterschiedlichen Auftragsmengen beziehungsweise Prozesszeiten und unterschiedlich langen Stents konnte gezeigt werden, dass die Defekte unter gleichbleibenden Bedingungen mit zunehmender Prozesszeit und abnehmender Stentlänge zunehmen. Zudem zeigte sich, dass auch die Prozessparameter und Flexibilität der Beschichtung Einfluss auf den Anteil defekter Stents nimmt. Durch Adaptierung des Beschichtungsprozesses ist es entsprechend möglich die Defekte zu reduzieren. In der Regel wurde ein etwas höherer abluminaler Schichtauftrag erzielt, wobei die Schicht homogen über die gesamte Stentlänge verteilt war. Es resultierten üblicherweise Abscheideraten des Beschichtungslackes von 40 - 50 % und darüber hinaus konnten durch die gleichzeitige Beschichtung einer hohen Stückzahl von Grundkörpern Fertigungsmengen von umgerechnet bis zu 25 Stents pro Minute erreicht werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Wirbelschichttechnologie ein vielversprechendes Verfahren zur Beschichtung von Stents im Großmaßstab darstellt, das in Bezug auf Ausbeute und Fertigungsmenge den derzeit herkömmlich verwendeten Beschichtungstechnologien überlegen ist, wobei die Qualität der erzeugten Beschichtungen vergleichbar mit der Beschichtungsqualität herkömmlich beschichteter Stents ist.
The relevance of cold atmospheric plasmas (CAPs) in biomedicine has recently grown. The potential of CAPs has been discussed in multiple scientific works, highlighting its effectiveness in promoting wound healing, limiting cancer progression, and for sterilization of surfaces. Main bioactive molecules, such as reactive oxygen and nitrogen species (RONS), are proposed as key candidates in these processes. Indeed, the generation of cold plasma induces noble gas ionization which, reacting with atmospheric air molecules, generates species such as singlet oxygen, atomic oxygen radicals, nitric oxide radicals. Although molecular simulations have been conducted, the mechanism of action on biological molecules, as well as the possibility to tune plasmas to produce specific species cocktails (e.g., with different degree of oxidation power) has been not fully unleashed. In this dissertation, presented in form of 5 published scientific articles, focus has been placed on the interaction of plasmas with peptides and proteins, which are main biological effectors in cellular compartments. Precisely, through the development of liquid chromatography coupled mass spectrometry (LC-MS) methods, the effects of plasmas on peptides and proteins in form of oxidative post-translational modifications (oxPTMs) has been investigated. The characterization of these oxPTMs has been performed by treating peptide or protein aqueous solutions and on porcine skin tissues. It has been found that, introducing small amounts of different gases (oxygen, nitrogen, or both) or even water molecules, can made CAPs tunable tools to produce oxygen-species dominating effects versus nitrogen-species dominating effects. In addition to this, it was found that the amino acid position in a peptide or protein influences the quality and quantity of the resulting oxPTMs. Besides this, other important parameters like driven gases, admixture gases or treatment duration were identified as relevant factors for the modification of amino acids in the peptide structure. By comparing the effects between peptide solutions and complex matrices such as porcine skin, water has been identified as a valid vehicle to transport and amplify the plasma chemistry. In an experimental study, the inactivation of a protein (PLA2) was observed after CAP treatment and together with simulation studies, the specific dioxidation of tryptophane W128 was detected as a potential explanation for this inactivation, indicating the strong impact of plasma on biological targets. In summary, oxidative modifications found in peptide solutions were observed also in complex protein structures and sample matrices. In conclusion, this work provides a starting point for future studies of oxidative modifications in complex models and may thus be helpful for further investigations in the fields of plasma medicine and redox chemistry.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein auf dem Promotor Pdes basierendes Kälte-induzierbares Expressionssystem für B. subtilis konstruiert und sukzessive optimiert. Dazu wurden verschiedene Kälte-regulatorische DNA-Sequenzen aus B. subtilis an das entsprechende Zielgen fusioniert, was neben der Kälte-Induzierbarkeit in einem positiven Einfluss auf die Expressionsstärke durch eine effizientere Translation bzw. Stabilisierung der mRNA resultierte. Vorausgehend wurde in vergleichenden Versuchen die Eignung unterschiedlicher Galaktosidasen zur Verwendung als Reporterenzyme für B. subtilis untersucht. Hierbei wurde erstmals die heterologe Expression einer Kälte-angepassten β-Galaktosidase aus P. haloplanktis TAE79 in B. subtilis durchgeführt und diese durch die Integration der DB-Sequenz sowie einer stem-loop-Struktur aus der 5‘-UTR des B. subtilis cspB-Gens gesteigert. Somit konnte nachgewiesen werden dass sowohl die additiven Sequenzen der cspB-DB und der cspB-sl-UTR als auch des bkdB-Terminators zu einer deutlich erhöhten Synthese der entsprechenden Zielproteine führt. Anhand der Überexpression einer Xylanase aus B. subtilis sowie einer α-Glucosidase aus S. cerevisiae wurde abschließend die Eignung des konstruierten Systems für die sekretorische und intrazelluläre Proteinsynthese in B. subtilis demonstriert. Diese Ergebnisse bestätigen die Eignung von B. subtilis als Wirtsorganismus auch für die Überproduktion kritischer, schwer zu faltender Proteine.
Chiral amines represent high-value fine chemicals serving as key intermediate products in pharmaceutical, chemical and agrochemical industries. In the past decades, application of amine transaminases (ATAs) for stereoselective amination of prochiral ketones emerged to an environmentally benign and economically attractive alternative to transition metal-catalyzed asymmetric synthesis to afford optically pure amines at industrial scale. However, the restricted substrate scope of wild-type transaminases prohibited the conversion of particularly sterically demanding substrates, making protein engineering indispensable. The following thesis covers elaboration of a novel assay for transaminases (Article I) and identification and development of transaminase variants in order to achieve biocatalytic preparation of a set of pharmaceutically relevant model amines, ideally in optically pure form for both stereoisomers, preferentially using asymmetric synthesis and most preferably using isopropylamine as cost-efficient amine donor co-substrate (Article II-IV). The aforementioned target amines and the corresponding precursor ketones (see Scheme 4.1) were conceived and provided by the company F. Hoffmann-La Roche to attain suitable biocatalysts for a variety of potential intermediates for active pharmaceutical ingredients. Protein engineering of the transaminase scaffolds investigated in this thesis comprised: Initial screening for suitable starting enzyme scaffolds, structure-guided rational design of these scaffolds to enable bulky planar substrate acceptance, elaboration of a sequence motif, verification of the motif and preparative-scale asymmetric synthesis reactions (Article II). For non-planar and structurally different target substrates, namely spatially bulky or bi-cyclic bridged substrates, the transaminase variants were specifically refined and a different evolutionary route had to be pursued (Article III and Article IV). These results (Article II) represent not only the first successful endeavor to engineer a PLP-fold type I amine transaminase (commonly denoted as (S)-selective) for the conversion of highly sterically demanding substrates, but also generally expanded the scope of available fold type I amine transaminases by enzymes having a novel and exceptionally broad substrate spectrum. Aside from structure-guided rational protein engineering, as well non-rational methods, such as site-specific saturation mutagenesis or directed evolution, were applied for protein-engineering. In order to do so for all of the target compounds, a novel high-throughput solid phase activity assay for transaminases that was actually developed during the master thesis, was refined and published (Article I). In the context of this thesis, the same assay principle was as well adapted for quantification of specific activities in liquid phase (Article III). A comparison of different methodologies for developing agar plate assays and a detailed step by step protocol of our transaminase assay are illustrated in a book chapter.
Rekombinante Expression und Design der Aminoacylase 1 für die Synthese von N-Acyl-Aminosäuren
(2009)
Im Rahmen der Dissertation wurde die Möglichkeit der enzymatischen N Acylierung von Aminosäuren über eine thermodynamisch kontrollierte Reaktion im wässrigen Medium untersucht. Eine Auswahl von Biokatalysatoren wurde auf ihre Eignung hin untersucht und die Aminoacylase 1 aus der Schweineniere (pAcy1) als Wildtyp-Enzym ausgewählt. Es konnte gezeigt werden, dass das primäre Problem bei der pAcy1-katalysierten Synthese der Modellkomponente N-Lauroyl-L-Glutamat (NLLG) in einem sehr ungünstigen thermodynamischen Gleichgewicht liegt. Dieses konnte zwar durch den pH-Wert zugunsten der Synthese verschoben werden, lieferte aber auch unter optimierten Bedingungen nur unzureichende Umsätze. Als primäre Probleme auf Seiten des Biokatalysators wurde ein niedriges Verhältnis zwischen der Synthese und Hydrolyse des Produktes (S/H-Verhältnis) neben einer vergleichsweise schlechten Akzeptanz langkettiger Acyldonoren identifiziert. Um für eine Optimierung des Enzyms die Methoden des rationalen Protein Designs und der gerichteten Evolution zu nutzen, wurde ein rekombinantes Expressionssystem über ein synthetisches Gen der pAcy1 auf dem Vektor pET52(b) realisiert. Durch die Anpassung des Expressionsmediums, der Temperatur sowie der Co-Expression molekularer Chaperone konnten etwa 80 mg aufgereinigtes Enzym pro Liter Fermentationslösung erhalten werden. Das rekombinante Protein wurde biochemisch charakterisiert und die Aktivität gegenüber dem bevorzugten Substrat der pAcy1 N-Acetyl-L-Methionin (NAM) mit 94 U/mg quantifiziert. Die Optimierung des S/H-Verhältnisses der pAcy1 fokussierte sich auf das Potential der katalytischen Base (E146) zur Protonenaufnahme. Als Basis für ein rationales Design wurde ein Strukturmodell erstellt und ein Aspartat an der Position 346 identifiziert, welches den pKa-Wert von E146 maßgeblich beeinflusst. Durch Modellierungen der Elektrostatik im aktiven Zentrum wurde die Substitution von D346 zu Alanin, Asparaginsäure, Glutamat und Glutamin vorgeschlagen und weiterhin die Mutation der katalytischen Base selbst untersucht. Versuche zur Beschreibung des S/H-Verhältnisses von erstellten Varianten der pAcy1 wurden anschließend mit NAM als Modellkomponente durchgeführt. Bei allen Mutanten war ein starker Rückgang der Gesamtaktivität zu verzeichnen, wobei die Restaktivitäten der 146X-Varianten maximal 0,5% und die der 346X-Varianten maximal 9% bei der Hydrolyse betrugen. Durch die parallele Quantifizierung der Synthesereaktion konnte gezeigt werden, dass sich das S/H-Verhältnis durch die Substitution des Asp346 in beide Richtungen verschieben lässt, wobei die gewünschte Erhöhung des Verhältnisses mit einer stark verminderten Gesamtaktivität einhergeht. Die Mutante D346A wies z.B. eine Erhöhung des S/H-Verhältnisses von 0.02 auf 0.18 auf, wobei allerdings die Restaktivität im Vergleich zum Wildtyp-Enzym bei der Synthese 0.2% und die in der Hydrolyse 0.05% betrug. Zur Erklärung dieser Beobachtungen wurde die pH-Abhängigkeit der pAcy1-Varianten für die Hydrolyse des artifiziellen Substrats Furyl-Acyl-M ethionin (FAM) bestimmt. Eine Verschiebung des pH-Optimums ins Saure bzw. ins Basische korrelierte bei D346A bzw. D346E mit der zuvor bestimmten Verschiebung des S/H-Verhältnisses. Weiterhin sollte die Affinität der pAcy1 gegenüber langkettiger Acyldonoren durch gerichtete Evolution erhöht werden. Da aus der Literatur bekannt ist, dass die Reste I177, T345, L370 die Acylbindetasche des Enzyms definieren, wurden diese über iterative Sättigungsmutagenese randomisiert und so etwa 32.000 Varianten der pAcy1 erzeugt. Zur Charakterisierung einer Mutantenbibliothek wurde ein hochdurchsatzfähiges Expressions- und Screeningsystem etabliert, wofür das bereits realisierte Expressionssystem auf den Mikrolitermaßstab übertragen und auf die besonderen Ansprüche hin optimiert wurde. Zur Charakterisierung der Enzyme wurde eine modifizierte Form eines bereits beschriebenen Proteaseassays verwendet, welcher eine kontinuierliche Messung der entstehenden Aminosäure als Produkt der Hydrolysereaktion erlaubte. Eine vorhergehende Selektion aktiver Varianten auf Minimalmedium erlaubt ein effizientes Screening der Mutantenbibliothek. Das Screening- und Selektionssystem wurde bisher mit der Wildtyp-pAcy1 und einer inaktiven Mutante erfolgreich getestet und zeigte Schwankungen von lediglich ±10%. Das noch ausstehende Screening der Mutantenbibliothek wird in laufenden Arbeiten durchgeführt.
Diese Arbeit widmet sich der funktionellen und strukturellen Untersuchung von SCO3201, einem Protein aus der Klasse der TetR-Repressoren, dessen Struktur bisher unbekannt war und das eine geringe sequenzielle Ähnlichkeit zu anderen Mitgliedern seiner Familie besitzt. SCO3201 wurde als Repressorprotein identifiziert, das durch Überexpression sowohl die Antibiotikaproduktion, als auch die morphologische Differenzierung von Streptomyces coelicolor unterdrückt. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass SCO3201 an mindestens 16 verschiedene Promotor-Sequenzen binden kann. Das Protein konnte in E. coli exprimiert und anschließend isoliert werden. Wegen des Fehlens geeigneter Strukturmodelle gelang eine Strukturlösung mittels Molekularem Ersatz nach erfolgreicher Kristallisation zunächst nicht. Mittels Single-Wavelength-Anomalous-Dispersion-Methode konnte die Struktur des teilweise induzierten Proteins jedoch aufgeklärt werden. Zudem wurde eine Apo-Form des Proteins kristallisiert und ebenfalls strukturell aufgeklärt. Dies erlaubte die Lokalisation der Ligandenbindungstasche und ließ Rückschlüsse auf die Domänenbewegungen zu, die durch den Prozess der Induktion ausgelöst werden. Daneben wurde mittels Röntgenkleinwinkelstreuung die Struktur von SCO3201 in Lösung untersucht, um eventuelle Kristallisationsartefakte auszuschließen. Durch den Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) wurde außerdem die Interaktion zwischen dem Regulator SCO3201 zu seinen Operatoren untersucht.
In 2010, the identification of 17 novel (R)-ATAs represented a breakthrough for the biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines, because only one (R)-ATA was described before. These novel ATAs were identified in a bioinformatic approach by studying the substrate acceptance of BCATs and DATAs to deduce the unknown substrate coordination of (R)-ATAs. Article I describes an alternative approach for the identification of (R)-ATA activity by reengineering the substrate- recognition site of α-AATs. While the engineering of the eBCAT led to the formation of an initial (R)-amine acceptance only, the (R)-ATA activity was successfully introduced in the DATA scaffold. These results demonstrate the transformation of an α-AAT in a moderately active (R)-ATA for the first time and highlight the evolutionary relationship between α-AATs and ATAs. Despite the availability of different ATAs nowadays, their substrate spectrum is limited due to the natural composition of their active sites. Several protein-engineering studies showed the widening of the substrate spectrum and the acceptance of bulky substrates by screening large mutant libraries to identify beneficial variants. In Article II, we developed an in silico engineering approach for amine transaminases to improve the conversion of bulky substrates and to reduce the number of variants to be tested in the laboratory. The resulting double-mutants of the (S)-ATA from C. violaceum displayed a >200-fold improved activity towards the bulky benchmark substrate. These variants expand the available biocatalytic toolbox for the synthesis of bulky amines, and the developed framework paves the way for rational protein-engineering protocols.
By studying unconventional transaminase substrates, we explored the potential of the available in- house transaminase toolbox in Articles III, IV, V, and VI. In Article III, we showed the transamination of a β-keto ester, leading to the synthesis of β-phenylalanine. The described cascade in Article IV enables the synthesis of amino carbohydrates. In addition, Article V describes an enzymatic cascade for the synthesis of amino fatty acids, which was extended in Article VI to obtain fatty amines.
The findings of this thesis clearly contribute to the understanding of the substrate scope and specificity of amine transaminases and expand the application of this versatile biocatalyst beyond classical ketone substrates.
This work investigated the enzymatic degradation of polyethylene terephthalate (PET) (ArticlesI and II) and polyvinyl alcohol (PVA) (Article III). Physical or chemical degradation of plastic polymers is often performed under extreme conditions like high temperatures or pressure. In comparison to that, recycling of plastics with enzymes can be carried out at ambient temperatures and neutral pH. Enzymes themselves are non- toxic, environmentally friendly, and have been used successfully in a variety of industrial processes.
Enzymatic degradation of polyesters is well studied. Their heteroatomic backbone, which is connecting monomers via ester bonds offers a target for an enzymatic attack. Especially PET, one of the most common polyesters, has been in the focus of research. The first enzyme capable of degrading the polymer was found in 2005. Since then, researchers discovered several enzymes with similar functions and subjected them to enzyme engineering. Improving the enzyme's substrate affinity, activity, and stability aims at making PET recycling more efficient. Article I provides an overview of limitations that enzymatic PET recycling is still facing and the research carried out to overcome them. More precisely, enzyme−substrate interactions, thermostability, catalytic efficiency, and inhibition caused by oligomeric degradation intermediates are summarized and discussed in detail.
Article II further addresses one of the above-mentioned limitations, namely product inhibition of PET hydrolyzing enzymes. We elucidated the crystal structure of TfCa, a carboxylesterase from Thermobifida fusca (T. fusca), and applied semi-rational enzyme engineering. The article discusses the structure-function relationship of TfCa based on the apo-structure as well as ligand-soaked structures. Furthermore, it compares the structures of TfCa and MHETase, another PET hydrolase helper enzyme. Lastly, we determined the substrate profile of the carboxylesterase based on terephthalate-based oligo-esters of various lengths and one ortho-phthalate ester. In a dual enzyme system, TfCa degraded intermediate products derived from the PET hydrolysis of a variant of PETase hydrolase from Ideonella sakaiensis (I. sakaiensis). The dual enzyme system utilized PET more efficiently in comparison to solely PETase due to relieved product inhibition. Since TfCa successfully degraded oligomeric intermediates, the reaction not only released terephthalic acid as the sole product but also increased the overall product yield.
While PET contains an ester bond that can be attacked and hydrolyzed by esterases or lipases, PVA consists of a homoatomic C-C-backbone with repeating 1,3-diol units. The polymer is water soluble with remarkable physical properties such as thermostability and viscosity. PVA is often described as biodegradable, but microbial degradation is slow and frequently involves cost-intensive cofactors. In this study, we present an improved PVA polymer with derivatized side chains and an enzyme cascade that can degrade not only modified but also unmodified PVA in a one-pot reaction. The enzyme cascade consists of a lipase, an alcohol dehydrogenase (ADH), and a Baeyer-Villiger monooxygenase (BVMO). In comparison to the scarcely published research on PVA degradation with free enzyme, this cascade is not only independent from the frequently required cofactor pyrroloquinoline quinone (PQQ) but, in principle, contains an in vitro cofactor recycling mechanism.
Die Monooxygenase TetX wurde zuerst in Bacteroides sp. identifiziert, später auch in Sphingobacterium sp. Tetracycline werden von TetX zu 11a-Hydroxy-Tetracyclinen hydroxyliert, welche nicht-enzymatisch weiterdegradieren und keine zweiwertigen Kationen chelatieren können. Dies führt zur Resistenz von aeroben Bakterien gegen Tetracycline. Die Verbreitung von TetX könnte zu einem späteren Zeitpunkt zu klinischer Relevanz gelangen. Die Kristallstruktur von TetX wurde durch Multiple Anomale Dispersion an einem Selenomethionin-Derivat gelöst. Die native Kristallstruktur von TetX konnte mit den erhaltenen Phasen des TetX-SeMet Experiments gelöst werden. Die Kristallstrukturen von TetX im Komplex mit 7-Iodtetracyclin, 7-Chlortetracyclin, Minocyclin und Tigecyclin wurden gelöst, wobei der Minocyclin-Komplex mit 2.18 Å der am höchsten aufgelöste Komplex ist und so zu den detailliertesten Einblicken der Tetracyclin-Erkennung durch TetX verhilft. Durch Derivatisierung von TetX-Einkristallen mit Xenon, welches ähnliche hydrophobe Eigenschaften wie molekularer Sauerstoff besitzt, wurden zwei besonders hydrophobe Taschen in der Substrat-bindenden Domäne von TetX identifiziert, die dem Sauerstofftransport dienen können. Neben der enzymatischen Inaktivierung von Tetracyclinen durch TetX sind nicht-enzymatische Abbauprozesse von Tetracyclinen allgegenwärtig. Dazu gehört die Umwandlung von Tetracyclinen zu Iso-Tetracyclinen im neutralen bis alkalischen Milieu, was zu einem Bruch der C11-C11a-Bindung und somit zu einer veränderten Anordnung der neuen Ringe A, B, C* und D führt. Die Bindung von Iso-Tetracyclinen zum Tetracyclin-Repressor, der durch die [Mg-Tetracyclin]-Bindung induziert wird, von der Operator-DNA tetO dissoziiert und so die Expression von TetR und dem Effluxprotein TetA reguliert, wurde untersucht. Die Affinität von Iso-Chlortetracyclin für TetR(D) wurde durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz bestimmt. Die Kristallstrukturen von TetR(D) im Komplex mit Iso-Chlortetracyclin bzw. Iso-Cyanotetracyclin wurden durch Co-Kristallisationsexperimente gelöst.
This dissertation explores and tries to unravel the fundamental basis of G-quadruplex end-folding as well as G-quadruplex interactions with small molecules by thermodynamic and structural approaches. Selective targeting of G-quadruplexes with ligands remains elusive, either because the ligand has
considerable binding affinity for other DNA structures or because it fails to discriminate between different G-quadruplex topologies. Unique structural motifs on the G-quadruplex may enhance or inhibit ligand binding to the G-quadruplex. For such aspects, it is necessary to understand the effect of G-quadruplex motifs or elements on the end-folding in order to better tune certain G-quadruplex topologies as model systems. Importantly for targeting G-quadruplex with ligands, motifs called Quadruplex-duplex (QD) junctions and interfaces are shown to be a binding hotspot
for various G-quadruplex ligands containing an intercalator motif. Binding affinity and selectivity of the ligands are discussed with the support of the NMR structures.
Verschiedene Strategien sind heute in der Entwicklung, um mit Hilfe von RNA Molekülen die genetische Information auf Transkriptebene zu korrigieren. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Twinribozyme durch den Austausch kleiner RNA Fragmente das Potential zur RNA Reparatur und ortsspezifischen RNA Funktionalisierung besitzen. Das Hairpinribozym katalysiert je nach Stabilität des Ribozym-Substrat-Komplexes die Spaltung bzw. die Ligation seines Substrats. Twinribozyme wurden durch Verknüpfung von zwei Hairpinribozymeinheiten entwickelt. Die Spaltung eines RNA Substrates an den zwei katalytischen Stellen produziert drei Fragmente: beide äußeren binden fest an das Twinribozym, während die Bindung des mittleren Fragments durch einen Vier-Nukleotid-Loop im Ribozymstrang destabilisiert wird. Dies fördert dessen Dissoziation gegenüber dessen Rückligation. Die Zugabe eines so genannten Reparaturoligonukleotids, das stabil an das Twinribozym anstelle des mittleren Fragments bindet, begünstigt dessen Assoziation zum Ribozym und dessen Ligation zu den übrigen Substratfragmenten. Das Ergebnis ist ein um vier Nukleotide verlängertes Reparaturprodukt. Dies stellt ein Modell für die Reparatur einer Vier-Nukleotid-Deletion auf mRNA Ebene dar. Erstes Ziel dieser Arbeit war es, die bestehende Reaktion kinetisch und thermodynamisch zu charakterisieren. Weiter wurde das Potential von Twinribozymen für die Reparatur anderer RNA Defekte und die ortsspezifische RNA Funktionalisierung untersucht. Schließlich wurde die Twinribozym vermittelte Reparaturreaktion in Zellkulturen getestet. Beim ursprünglichen Vier-Nukleotid-Deletionsmodell wurden unter äquimolaren Konzentrationen aller Fragmente und bei 10 mM Magnesiumchlorid und 37 °C 35 % Reparaturprodukt erhalten. Kinetische Untersuchungen jeder Einzelreaktion konnten zeigen, dass die Tamdemkonfiguration des Twinribozyms die Spalt- und Ligationseigenschaften nicht beeinträchtigt. In thermodynamischen und kinetischen Bindungsuntersuchungen von Modellduplexen, die der Austauschregion ähneln, wurde gezeigt, dass die Struktur des Ribozym-Substrat-Komplexes den Austausch der mittleren Fragmente stark fördert. Eine Voraussetzung zur biophysikalischen und biochemischen Untersuchungen von RNA Molekülen ist ihre ortsspezifische Markierung. Dies wird für bis zu 80 Nukleotide lange RNA Stränge durch chemische Synthese erreicht. Längere modifizierte RNA Moleküle werden mühsam durch Ligation mehrerer Stränge synthetisiert. Eine andere Möglichkeit besteht darin, native RNAs durch in situ Hybridisierung zu markieren. Keine Methode steht somit zur Verfügung, um in vitro Transkripte oder native RNAs intern und kovalent zu modifizieren. Ein synthetisches Substrat konnte ohne Ausbeuteverluste mit verschiedenen Fluoreszenzmolekülen, die chemisch in das Reparaturoligonukleotid eingebaut wurden, mit dem Twinribozym markiert werden. Verschiedene Transkripte wurden ebenfalls erfolgreich mit dem Twinribozym funktionalisiert. Drei verschiedene Modelle wurden untersucht: die Markierung der Transkripte resultierte entweder in einer Verlängerung um vier Nukleotide, in der Einführung von drei Einzelbasenmutationen oder in gar keinem Sequenzunterschied. Um die Ribozymzugänglichkeit der Zielsequenzen zu verbessern wurden erhöhte Temperaturen sowie DNA Oligonukleotide verwendet, die an das Transkript im Bereich der Flanken zur Ribozymbindungssequenz binden. Markierungsausbeuten von jeweils 53, 47 und 11 % wurden erzielt. Die potentielle Anwendung von Twinribozymen für die therapeutische RNA Reparatur erfordert eine effektive Zellaktivität. In vitro Versuche konnten zeigen, dass Twinribozyme unter zellähnlichen Bedingungen aktiv sind. Ein Versuch, die bestehende in vitro Reaktion in menschlichen Zellkulturen durchzuführen und das Reparaturprodukt nach Zelllyse nachzuweisen, scheiterte, da das Ribozym während der Analyse nicht deaktiviert werden konnte. Weiter wurde ein Luciferasereportergen durch die Einführung verschiedener Mutationen so deaktiviert, dass ein neues entwickeltes Twinribozym die Fehler auf mRNA Ebene reparieren sollte. In vitro Versuche mit kurzen synthetischen Substraten zeigten, dass das Ribozym die Fehler effizient prozessiert. Reparaturansätze mit den mutierten Transkripten lieferten aber Reparaturausbeuten unter 1 %, möglicherweise wegen der schlechten Ribozymzugänglichkeit der langen Transkripten. Durch Lumineszenzzellversuche konnte leider keine RNA Reparatur nachgewiesen werden. Twinribozyme erlauben den Austausch kurzer RNA Fragmente innerhalb synthetischer RNAs und Transkripte und akzeptieren dabei modifizierte Sequenzen. Dies öffnet Twinribozymen den Weg als molekulares Werkzeug für die RNA Reparatur und die ortsspezifische RNA Funktionalisierung. Die Erarbeitung von Möglichkeiten, die schlechte Zugänglichkeit der Zielsequenzen zu umgehen, sowie der Erhalt positiver Zellversuche werden über die Verwendung dieses potentialreichen RNA Werkzeugs entscheiden.
Surface and electrode modifications allow the alteration of surface and electrode properties required for certain applications. In the first part of this thesis, a pH sensitive graphite/quinhydrone composite electrode for Flow-Injection-Analysis (FIA) systems was optimized by using polysiloxane as binder material. This allows an easier handling of the electrode. Furthermore, new applications of the FIA system in conjunction with the pH sensitive detection system were developed. The electrode used here in conjunction with a common reference electrode proved to be a very useful potentiometric detector for FIA acid-base titrations of aqueous solutions. Even acid-base titrations in buffered solutions were performed successfully with the FIA system allowing the determination of activities of enzymes, which catalyse reactions with increasing or decreasing proton concentrations. A FIA system was applied to measure calcium and magnesium ions in different water samples by measuring the hydronium ion release during the complexometric reaction between EDTA and calcium or magnesium ions. A method was established to determine sequentially the titratable acidity and the pH of different wine samples. The new FIA method fulfils the official requirements of the "Organisation Internationale de la Vigne et du Vin" with respect to reproducibility and repeatability and can be easily adjusted to the legal requirements in USA and Europe. In summary, the first part of this thesis shows that the FIA system in conjunction with the graphite/quinhydrone/polysiloxane composite electrode is very well suited for simple, rapid and automatic determinations of small sample volumes in the areas of water analysis, food analysis or even biochemical analysis, provided that hydronium ions are involved. For all applications, one and the same measuring device without changing the detection system is used. Only different carrier solutions are necessary, which can be provided by a proper stream selector. The second part of this thesis is focused on the modification of gold surfaces of medical devices by treatment with OH radicals. These investigations are based on previous studies of the impact of OH radicals on mechanically polished gold surfaces resulting in a smoothing of the surface by dissolution of highly reactive gold atoms. In this thesis, the effect of OH radicals, generated either ex vivo by Fenton solutions or in vivo by immune reactions, on gold implants was analysed using atomic force microscopy. It was found that there is an analogy between the exposure of gold to Fenton solutions and the exposure of gold to immune reactions. The pre-treatment of gold implants with OH radicals of Fenton solution prevents surface alterations of the gold implants in vivo. This indicates that the in vivo release of gold from implants can be reduced by exposing the gold implants to Fenton solution before implantation. Finally, the modification of gold surfaces by OH radicals was applied to a medical nanodetector, which is coated with a gold layer and functionalized with antibodies, for isolating circulating tumour cells (CTCs) from the blood stream of cancer patients. By treating the gold layer of the nanodetector with OH radicals generated by Fenton solution or by UV-photolysis of hydrogen peroxide, the cytotoxicity of the gold layer after gamma irradiation was reduced to almost zero. This modification of the gold surface with OH radicals allows applying the nanodetector for in vivo applications.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zu zellulären Abwehrmechanismen der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) während einer Infektion mit dem wirtschaftlich bedeutsamen Virus der Viralen Hämorrhagischen Septikämie (VHSV) durchgeführt. Unter Verwendung eines in vitro-Testsystems zur Erfassung der zellvermittelten Zytotoxizität wurde festgestellt, dass Forellen ab dem 10. Tag nach Infektion antivirale zytotoxische Abwehrzellen generieren. Anfangs lysierten diese zytotoxischen Leukozyten ausschließlich virusinfizierte Targetzellen mit identischem MHC-Klasse-I und erst später nach Zweitinfektion MHC-Klasse-I-inkompatible Zellen. Ein mit dem Anstieg des Zytotoxizitätsvermögens einhergehender Anstieg der CD8α-mRNA-Expression im Verlauf der Infektion deutet auf die Beteiligung spezifischer zytotoxischer Zellen bei der antiviralen Abwehr hin. Eine erneute Infektion bereits infizierter Forellen mit homologem Virus führte bei erhöhter CD8α-mRNA-Expression zu einer gesteigerten zellvermittelten Zytotoxizität. Das deutet darauf hin, dass Forellen, ähnlich wie höhere Vertebraten, über spezifische zytotoxische T-Zellen sowie über ein immunologisches Gedächtnis verfügen. Im Unterschied zu Säugern konnte eine zytotoxische Aktivität gegen MHC-Klasse-I-inkompatible Targetzellen und damit eine Beteiligung von NK-ähnlichen Zellen zeitlich erst nach der T-Zell-ähnlichen Zytotoxizität gemessen werden, wobei ein Anstieg der mRNA-Expression des indirekten NK-Zellmarkers NKEF durch die Effektorzellen bereits zu einem früheren Zeitpunkt erfolgte. NKEF wird bei Säugern von hämatopoetischen Zellen gebildet. Deshalb ist die erhöhte Expression von NKEF als Folge einer kompensatorischen Reaktion bei der hämorrhagischen Erkrankung VHS zu werten. Zum Zeitpunkt der NK-ähnlichen Aktivität hatte das Niveau VHSV-spezifischer Antikörper ein Maximum erreicht, weshalb die Bewaffnung von NK-ähnlichen Zellen mit Antikörpern denkbar ist, die ihrerseits natives VHSV-Protein auf infizierten Targetzellen erkannt und letztere lysiert haben könnten. Gegenstand dieser Arbeit war es ferner, den Einfluss des Glyko(G)- beziehungsweise Nukleo(N)-proteins des VHSV auf das zelluläre Abwehrsystem der Forelle zu untersuchen. Dazu wurde die DNA-Immunisierungstechnologie eingesetzt. Nach Applikation von VHSV-Protein-kodierenden Plasmid-DNAs konnte als Voraussetzung für eine erfolgreiche Antigenpräsentation am Applikationsort die Expression viraler Proteine in den Forellenmuskelzellen gezeigt werden. Ebenso generierten Forellen nach Immunisierung antivirale zytotoxische Zellen gegen beide Proteine. Das Glykoprotein, welches nach der Virusreplikation auf der Virushülle und auch auf der Membran infizierter Wirtszellen exprimiert wird, regte die Bildung von virusspezifischen CTL-ähnlichen, aber auch NK-ähnlichen zytotoxischen Effektorzellen an, da zytotoxische Zellen aus DNA-immunisierten Forellen sowohl infizierte MHC-Klasse-I-identische als auch Zellen mit einem anderen MHC-Klasse-I lysierten. Das Nukleoprotein dagegen bewirkte lediglich die Bildung CTL-ähnlicher Zellen, da ausschließlich MHC-Klasse-I-kompatible Zellen lysiert wurden. Diese Aktivität erreichte nur in den Sommermonaten ein signifikantes Niveau. Solche, bei poikilothermen Vertebraten zu erwartenden saisonbedingten Schwankungen im Niveau und in der Qualität antiviraler zellvermittelter Zytotoxizität, sind bei Fischen bisher nicht beschrieben worden. Diese Unterschiede sind umso bemerkenswerter, als dass die Forellen ganzjährig einem konstanten Temperatur- und Lichtregime ausgesetzt waren. Die Kombination eines Testsystems für zellvermittelte Zytotoxizität mit Untersuchungen zur mRNA-Expression, zum Antikörperstatus und zur Expression von Leukozyten-Oberflächenmarkern lassen bei paralleler Analyse bereits veröffentlichter Daten wichtige Schlussfolgerungen zum allgemeinen Verständnis der Immunreaktionen bei Fischen zu. Es sind Parallelen aber auch Unterschiede (verspätete NK-zellähnliche Aktivität, Saisonabhängigkeit) zum Immunsystem höherer Vertebraten feststellbar. Ferner leisten diese Ergebnisse einen Beitrag zum Verständnis der Pathogenese der VHS und geben Anhaltspunkte für Vakzinationsstrategien insbesondere von DNA-Vakzinen.
1,1-Bis(trimethylsilyloxy)ketene acetals represent useful synthetic building blocks which can be regarded as masked carboxylic acid dianions. In recent years, a number of cyclization reactions of 1,1-bis(trimethylsilyloxy)ketene acetals have been reported. Functionalized maleic anhydrides represent important synthetic building blocks, which have been employed, for example, in the synthesis of γ-alkylidenebutenolides, maleimides, 5-alkylidene-5H-pyrrol-2-ones. Substituted maleic anhydrides are available by Michael reaction of nucleophiles with parent maleic anhydride and subsequent halogenation and elimination. Oxalyl chloride is an important synthetic tool for the synthesis of O-heterocycles. 3-hydroxymaleic (1-3) anhydrides were synthesised by one-pot cyclization of 1,1-bis(trimethylsilyloxy)ketene acetals with oxalyl chloride using TMSOTf as a catalyst. The Me3SiOTf mediated reaction of 1,1-bis(trimethylsilyloxy)ketene acetals with 3-silyloxyalk-2-en-1-ones, such as (4), afforded 5-ketoacids, such as (5). Treatment of the latter with TFA in CH2Cl2 afforded pyran-2-ones, such as (6-8). It has been found that 1,1-bis(trimethylsilyloxy)ketene acetals can behave as dinucleophile. Functionalized benzo-azoxabicyclo[3.3.1]nonanones (9-12), were prepared by regio- and diastereoselective condensation of 1,1-bis(silyloxy)ketene acetals with isoquinolinium and quinolinium salts and subsequent regioselective and stereospecific iodolactonization. Our next target was the reaction of silyl ketene acetals with pyrazine and quinoxaline. These reactions provide a facile access to a variety of 2,3-benzo-1,4-diaza-7-oxabicyclo[4.3.0]non-2-en-6-ones and 1,4-diaza-7-oxabicyclo[4.3.0]non-2-en-6-ones (13-14). The second part of my research work was concentrated on bis(silyl enol ethers). The TiCl4-mediated [3+3] cyclization of 2,4-bis(trimethylsilyloxy)penta-1,3-diene with 3-silyloxyalk-2-en-1-ones afforded 2-acetylphenols (15), which were transformed into functionalized chromones (16). The Me3SiOTf-mediated condensation of the latter with 1,3-bis(silyl enol ethers) and subsequent domino ′retro-Michael–aldol–lactonization′ reaction afforded 7-hydroxy-6H-benzo[c]chromen-6-ones (17-18). With regard to our on going investigation with bis(silyl enol ethers), we significantly extended the preparative scope of the methodology. We have successfully developed regioselective cyclizations of unsymmetrical 1,1-diacylcyclopentanes, such as 1-acetyl-1-formylcyclopentane, and also studied cyclizations of 2,2-diacetylindane, 1,1-diacetylcyclopent-3-ene and 3,3-dimethylpentane-2,4-dione. In addition, the mechanism of the domino process was studied. We have synthesised spiro[5.4]decenones (19) and that were transfored into bicyclo[4.4.0]deca-1,4-dien-3-ones (20-21), by domino ′Elimination–Double-Wagner-Meerwein-Rearrangement′ reactions. The Lewis acid mediated domino ′[3+3]-cyclization-homo-Michael′ reaction of 1,3-bis-silyl enol ethers with unsymmetrical 1,1-diacylcyclopentanes, such as 1-acetyl-1-formylcyclopentane, allows an efficient one-pot synthesis of functionalized salicylates containing a halogenated side-chain (22-23). A great variety of substitution patterns have been realized by variation of the starting materials and of the Lewis acid. The mechanism of the domino process was studied.
The synthesis of pterin-dithiolene ligands was achieved by employing the radical nucleophilic substitution, i.e. the so-called “Minisci- Reaction”1. This protocol was used for the first time by Professor W. Pfleiderer on pterin substrates2 and proved a powerful method for the preparation of 6 acyl-pterins in course of this work. Subsequent construction of the dithiolene ring facilitates the synthesis of pterin-dithiolene ligands with completely unprotected pterin moieti.
The molybdenum cofactor is probably one of the most relevant discoveries in the recent history of pterin chemistry and biochemistry. Many efforts have been made for the preparation of compounds able to mimic the features of the Moco ligand system called "Molybdopterin". In fact, the study of MPT models enables a deeper understanding of the “mechanism of function” of this cofactor and most importantly, lays the foundation for a potential treatment for the Moco related diseases MoCOD and iSOD.
Die Entwicklung von Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus verschiedenen Arzneiformen hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Einerseits werden diese Methoden im Rahmen der routinemäßigen Qualitätskontrolle genutzt, andererseits können diese Methoden auch in einer frühen Phase der Entwicklung einer neuartigen Darreichungsform hilfreich sein. Weiterhin werden heutzutage auch biorelevante Aspekte in Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung eingebracht, um aus den Ergebnissen der In-vitro-Wirkstofffreisetzung mögliche In-vivo-Profile vorherzusagen. Aufgrund der steigenden Anzahl an langwirksamen Arzneimitteln auf dem Markt wird die Nachfrage nach beschleunigten Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung auch von Seiten der Behörden steigen.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von diskriminierenden und beschleunigten Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus LNGB-haltigen Injektionssuspensionen unterschiedlicher Partikelgrößen. Auf Grundlage der zu entwickelnden Methode sollte es demnach möglich sein, trotz Beschleunigung der Methode zwischen den verschiedenen Partikelgrößen, welche in einem Bereich von 8-41 μm lagen, zu unterscheiden. Zunächst wurde die Sättigungslöslichkeit von LNGB in verschiedenen Medien, welche später in den Freisetzungsuntersuchungen eingesetzt werden sollten, bestimmt. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von LNGB in den Freisetzungsmedien wurde diesen eine variierende Menge an SDS zugesetzt, um die Löslichkeit zu steigern. Für die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung wurden Methoden sowohl für die Blattrührer-Apparatur als auch für die Durchflusszelle entwickelt.
In einer ersten Versuchsreihe in der Blattrührer-Apparatur wurde der Einfluss der zugesetzten Tensid-Menge auf die Wirkstofffreisetzung untersucht. Um in den Versuchen mindestens dreifache Sink-Bedingungen einzuhalten, wurden alle nachfolgenden Versuche mit einem Zusatz von 0,75 % SDS zu dem entsprechenden Freisetzungsmedium durchgeführt. In einem systematischen Screening wurde der Einfluss der Umdrehungsgeschwindigkeit, des Freisetzungsmediums und der Temperatur in der Blattrührer-Apparatur untersucht. In allen durchgeführten Versuchen konnten signifikante Unterschiede in den MDTs zwischen der Gruppe der kleineren Partikel (Suspensionen mit sehr kleinen und kleinen LNGB-Partikeln) und der Gruppe der größeren Partikel (Suspensionen mit mittleren und großen LNGB-Partikeln) beobachtet werden. Den größten Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen zeigte die Erhöhung der Temperatur von 37,0 °C auf 50,0 °C.
Für die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung in der Durchflusszelle wurde sowohl eine Methode unter Verwendung eines offenen Systems als auch eine Methode für die Verwendung der Durchflusszelle im geschlossenen System entwickelt. Für beide Modi wurde der Einfluss der Flussrate (10 mL/min vs. 20 mL/min) untersucht. Die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen im offenen System brachte einige Nachteile mit sich. So wurden innerhalb der ersten Minuten trotz entsprechender Filterpackung die LNGB-Partikel aus der Zelle herausgespült. Darüber hinaus wurde durch die relativ hohe Flussrate eine große Menge an Freisetzungsmedium benötigt. Aus diesem Grund wurde der Einfluss der Temperaturerhöhung auf die Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen unter Verwendung der Durchflusszellen-Methoden nur im geschlossenen System untersucht. Ähnlich wie bei den Ergebnissen der Wirkstofffreisetzung in der Blattrührer-Apparatur zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den Ergebnissen der Wirkstofffreisetzung aus den Suspensionen bei 37,0 °C und 50,0 °C. Eine Unterscheidung zwischen der Gruppe der kleineren LNGB-Partikel und den größeren LNGB-Partikeln war bei den verschiedenen Flussraten und auch unter den Testbedingungen der erhöhten Temperaturen möglich.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines neuen bioprädiktiven Freisetzungsmodells für Vaginalringe. Dieses neue Modell sollte in der Lage sein, den sogenannten burst release, welcher für Vaginalringe des Reservoir-Typs beobachtet werden kann, in vitro zu erfassen. Als burst release wird eine im Vergleich mit der täglichen Freisetzungsrate initial höhere Freisetzungsrate bezeichnet, welche zu unerwünschten Nebenwirkungen führen kann. Die untersuchten Formulierungen, der NuvaRing® und der Cyclelle®-Ring, sind Vertreter der Vaginalringe vom Reservoir-Typ. Vaginalringe vom Reservoir-Typ bestehen aus einem Kernpolymer, welches die beiden Steroidhormone EE und ENG enthält. Das Kernpolymer wird wiederum von einer wirkstofffreien Membran umgeben, welche die Wirkstofffreisetzung der Steroidhormone aus dem Kernpolymer maßgeblich steuert. Während der Lagerung solcher Vaginalringe vom Reservoir-Typ diffundieren EE und ENG in die Membran, bis in dieser die beiden Wirkstoffe in einem gesättigten Zustand vorliegen. Aufgrund der Sättigung der Membran kommt es nach Einsetzen des Vaginalrings zum Auftreten des burst release. In bisherigen Versuchen zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus Vaginalringen mit einfachen Shake-flask-Methoden wurde der burst release nicht erfasst, da häufig nur alle
24 h eine Probennahme und anschließend ein kompletter Tausch des Freisetzungsmediums erfolgte.
Das neu entwickelte Freisetzungsmodell sollte biorelevanter gestaltet werden als die bisherigen Shake-flask-Methoden. Daher wurden in dem neuen Modell zwei weitere Kompartimente integriert, welche die Absorption der Steroidhormone ähnlich der In-vivo-Situation, berücksichtigen sollten. Da die Daten, welche mit dem neu entwickelten Freisetzungsmodell erhoben wurden, später mit In-vivo-Plasmaspiegeln aus klinischen Studien mit dem NuvaRing® und dem Cyclelle®-Ring korreliert werden sollten, wurden die Probennahmezeitpunkte für die In-vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus den klinischen Studien adaptiert. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von EE und ENG und der geringen Volumina, welche im neuen Freisetzungsmodell eingesetzt wurden, wurde den Freisetzungsmedien 0,5 % SDS zugesetzt, um zehnfache Sink-Bedingungen zu gewährleisten. Die Wirkstofffreisetzung aus dem NuvaRing® und dem Cyclelle®-Ring wurde sowohl mit der modifizierten Shake-flask-Methode als auch mit dem neu entwickelten Freisetzungsmodell bestimmt. Der burst release wurde mit dem neuen Freisetzungsmodell besser als mit der modifizierten Shake-flask-Methode erfasst. Auch die deklarierten täglichen Freisetzungsraten von 120 μg ENG und 15 μg EE aus den untersuchten Vaginalringformulierungen wurden in dem neu entwickelten Freisetzungsmodell erreicht. Nach dem sogenannten burst release setzten beide untersuchte Formulierungen EE und ENG nach einer Kinetik 0. Ordnung frei. Die In-vitro-Freisetzungsdaten, welche einer Kinetik 0. Ordnung folgten, wurden mit den dekonvulierten In-vivo-Plasmaspiegeln korreliert. Für beide In-vitro-Methoden konnte für EE ein linearer Zusammenhang gefunden werden.
Das neu entwickelte Freisetzungsmodell stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Prüfung der Wirkstofffreisetzung aus Vaginalringen dar. Mit Hilfe des neuen Modells konnte der burst release aus Vaginalringen vom Reservoir-Typ besser erfasst werden als mit den bisher verwendeten Shake-flask-Methoden. Trotz der geringen Volumina, welche im neu entwickelten Freisetzungsmodell eingesetzt wurden, konnten durch den Zusatz von 0,5 % SDS zehnfache Sink-Bedingungen in beiden Kompartimenten erreicht und während der Versuche eingehalten werden. Erste Korrelationen mit den aus In-vivo-Plasmaspiegeln berechneten absorbierten EE-Fraktionen und den kumulativ freigesetzten EE-Mengen zeigten einen linearen Zusammenhang zwischen der in vivo absorbierten Fraktion und der in vitro kumulativ freigesetzten Wirkstoffmenge.
Die in dieser Arbeit durchgeführten Kristallstrukturanalysen der ersten bakteriellen Chalconisomerase (CHI) bilden die Grundlage für das strukturelle Verständnis der Flavonoiddegradation von Eubacterium ramulus. Das Enzym zeigt eine offene und eine geschlossene Lid-Konformation, die das aktive Zentrum vollständig vom Solvens abgrenzt. Durch SAXS-Messungen konnte gezeigt werden, dass sich diese beiden Konformationen im Solvens in einem dynamischen Gleichgewicht befinden und nur eine geringe Energiebarriere zur Schließung überwunden werden muss. Die Lokalisation des aktiven Zentrums konnte durch Cokristallisation mit dem Substrat (2S)-Naringenin bewiesen werden. Der Reaktionsmechanismus konnte durch Mutagenese-Studien und spezifischen 1H/2H-Austausch durch NMR bewiesen werden. Trotz jeglicher fehlender funktionaler Verwandtschaft zeigt die Tertiärstruktur der bakteriellen CHI große Ähnlichkeiten zu der ferredoxin-like Faltung der Chloritdismutase aus Dechloromonas aromatica und dem mit Stress verbundenen Protein SP1 aus Populus tremula. Ein Vergleich der bakteriellen CHI mit der pflanzlichen CHI von Medicago sativa zeigt, dass deren 3D-Struktur in keinem verwandtschaftlichen Verhältnis steht. Dies suggeriert eine konvergente Evolution der beiden Chalconisomerasen ausgehend von unterschiedlichen Vorläuferproteinen. Anhand von Strukturaufklärungen der (R)-selektiven Amin-Transaminase aus Aspergillus fumigatus konnten erste Informationen über die strukturellen Voraussetzungen zur (R)-Selektivität dieser neuen Enzymklasse gewonnen werden. Die in silico Experimente zeigen, dass ähnlich zu den BCATs und D-ATAs das aktive Zentrum der (R)-ATA in eine große und eine kleine Bindetasche unterteilt ist. Dies konnte strukturell über den Inhibitorkomplex verifiziert werden. Die De-/Protonierung des Substrates durch das katalytische aktive Lys179 kann ausschließlich von der si-Seite erfolgen, sodass es zur Bildung des (R)-Enantiomers kommt. Der Mechanismus zur Bindung polarer Substrate (dual substrate recognition) wurde durch einen kovalenten Inhibitorkomplex und Mutagenese-Studien belegt und ist auf ein konserviertes Arginin im active site loop zurückzuführen.
Bacillus licheniformis is one of the most important hosts used in the biotechnological industry for the production of technical enzymes, antibiotics and a number of biochemicals. Although this bacterium has been used for a long time as an expression host, only little information on expression systems of this host is available. An expression system could be controlled by a cell density signal, a specific chemical inducer or a thermal shift. A limiting substrate such as glucose or phosphate limitation is suggested to use as the signal for the induction of an expression system. When B. licheniformis cells are subjected to nutrient limitation conditions, numerous genes involved in the metabolism of alternative nutrient sources are induced in order to keep cell survival. Therefore, the main topic of this study was to identify and investigate the regulation of genes or operons which are strongly induced in B. licheniformis cells grown under nutrient limitation conditions in order to apply for the construction of potential new expression systems. The research includes studies on the regulation of genes which are responsible for the acetoin and 2,3-butanediol utilization in B. licheniformis cells grown under glucose limitation conditions. Furthermore, we also analyzed the regulation of phytase gene expression as well as investigated the function of a putative ribonuclease expressed in B. licheniformis under phosphate limitation conditions. From this study, it was shown that in B. licheniformis, the utilization of acetoin and 2,3-butanediol was mainly mediated by enzymes encoded by the acoABCL operon. The transcription of this operon was regulated by sigma L transcription factor and was induced by acetoin. The acuABC operon was suggested to play as an indirect regulatory role for the acetoin utilization in B. licheniformis. This operon was controlled by a typical sigma A dependent promoter, however, acetoin was not an inducer for its expression. Furthermore, the regulation of phytase gene expression was suggested to be controlled by PhoPR-two component systems. The results showed that phytate, which is the substrate of phytase enzyme, was not an inducer for the expression of phy gene. However, growth experiments revealed that phytate served as a good alternative phosphate source for the growth of B. licheniformis cells under these conditions. Finally, the inactivation of BLi03719 gene, coding for a putative ribonuclease, resulted in an increase of the total RNA concentration of B. licheniformis cells grown in phosphate limited medium. However, the mutation did not affect the expression of the heterologous reporter gene. Therefore, it could be speculated that the putative ribonuclease BLi03719 plays a role in ribosomal RNA degradation under these conditions.
In an aerobic environment the occurrence of reactive oxygen species (ROS) is a common phenomenon. The diverse roles of ROS in cellular function and in diseases make them a target of interest in many research areas. Substances capable of directly or indirectly reducing the (harmful) effects of ROS are referred to as “antioxidants”. However, the term is applied miscellaneously in the chemical and the biological context to describe different attributes of a substance. In this work the potential of an electrochemical assay to detect different ROS in-vitro was explored. The method was optimized to investigate the radical scavenging activities (antioxidant potential) of trolox and different plant compounds (ascorbic acid, caffeic acid, epigallocatechin gallate, ferulic acid, kaempferol, quercetin, rutin, and Gynostemma pentaphyllum extract) in-vitro. The obtained data was compared to established antioxidant in-vitro assays. Further, the impact of the plant substances on cellular parameters was evaluated with the electrochemical assay and established cell assays.
The optimization of the electrochemical assay allowed the reproducible detection of ROS. The sensor electrode proved differently sensitive towards individual ROS species. The highest sensitivity was recorded for hydroxyl radicals while superoxide and hydrogen peroxide had little impact on the sensor. Extracellular ROS concentrations could be detected from cell lines releasing elevated ROS into the extracellular space. The antioxidant activity of the investigated plant substances could be demonstrated with all in-vitro assays applied. However, the absolute as well as the relative activity of the individual substances varied depending on the experimental parameters of the assays (pH, radical species, phase, detection method).
The plant compounds modified redox related intracellular parameters in different cell lines. However, a direct correlation between intracellular and extracellular effects of the plant compounds could not be established.
The work demonstrates the feasibility to use the electrochemical assay to sense ROS as well as to evaluate the radical scavenging activity of molecules. The in-vitro antioxidant activities demonstrated for the individual plant substances are not reliable to predict the cellular effects of the molecules.
In the search for bioactive compounds, 32 fungal strains were isolated from Indonesian marine habitats. Ethyl acetate extracts of their culture broth were tested for cytotoxic activity against a urinary bladder carcinoma cell line and for antifungal and antibacterial activities against fish and human pathogenic bacteria as well as against plant and human pathogenic fungi. Bioassay-guided fractionation led to the isolation of bioactive compounds. Altogether 14 compounds were isolated and further elucidated. The compounds were obtained from the ethyl acetate and dichloromethane extracts of six fungal strains. They included 9 polyketides, 2 terpenes, 1 alkaloid and 2 till now undefined structures.
S-adenosyl-L-methionine- (SAM) dependent methyltransferases (MTs) catalyse methylation of halide ions and the C, O, N, S, Se, and As atoms of biomolecules ranging from biopolymers to small molecules. They display different chemo-, regio- and stereoselectivity according to their specific functions. This thesis focuses on the engineering of O-methyltransferases (OMTs) and halide methyltransferases (HMTs) through rational design and directed evolution to study their structure-function relationship and to explore their catalytic promiscuity. The influence of substrate binding residues on the substrate scope and regioselectivity of a plant OMT against various phenolic substrates (Article I) and flavonoids (Article II) has been investigated. Article III describes the directed evolution of an HMT for the biocatalytic synthesis of diverse SAM analogues. With the evolved HMT, regioselective alkylation of phenolic compounds and flavonoids, as well as the SAM analogue regeneration, were achieved through an HMT-MT cascade reaction.
Article I Specific residues expand the substrate scope and enhance the regioselectivity of a plant O-methyltransferase.
It was reported in literature that an isoeugenol 4-OMT (IeOMT) can be engineered to a caffeic acid 3-OMT (CaOMT) by replacing three consecutive residues. In this article, we investigated the effect of these residues on substrate preference and regioselectivity of IeOMT. The triple mutant T133M/A134N/T135Q and the respective single mutants were constructed and tested against a series of phenolic compounds. The variant T133M had a universal effect to improve enzymatic activities against all tested substrates while the mutant A134N had enhanced regioselectivity. The triple mutant T133M/A134N/T135Q benefits from these two mutations, which not only expanded the substrate scope, but also enhanced the regioselectivity of IeOMT. On the basis of this work, regiospecific methylated phenolics can be produced in high purity by different IeOMT variants.
Article II Influence of substrate binding residues on the substrate scope and regioselectivity of a plant O-methyltransferase against flavonoids
Flavonoid OMTs (FOMTs), isoflavonoid OMTs (IOMTs) and phenylpropanoid OMTs (POMTs) display different substrate preferences. Sequence comparison showed that the substrate binding residues at positions 322 and 326 are different between these OMT groups and might be critical for the substrate discrimination. Residues at positions 322 and 326 in IeOMT (a POMT) were mutated to the commonly presented residues in FOMT and IOMT. The introduced mutants, in cooperation with the variant T133M, have improved or brought novel activities and regioselectivity against the tested flavonoids eriodictyol, naringenin, luteolin, quercetin, and also the isoflavonoid genistein compared to the wild-type IeOMT. On the basis of this work, methylated flavonoids that are rare in nature were produced in high purity.
Article III Directed evolution of a halide methyltransferase enables biocatalytic synthesis of diverse SAM analogs
Biocatalytic alkylations to obtain chemo‐, regio‐ and stereoselectively alkylated compounds can be achieved by MTs with the supply of SAM analogues. It was recently discovered that SAM can be directly synthesized from S adenosyl-L homocysteine (SAH) and methyl iodide, catalysed by an HMT. To explore the promiscuity of HMT in the synthesis of SAM analogues, we performed directed evolution of the Arabidopsis thaliana HMT based on a sensitive, colorimetric iodide assay. The identified variant V140T displayed activities against ethyl‐, propyl‐, and allyl iodides to produce the corresponding SAM analogues. With this HMT variant, regioselective ethylation of luteolin and allylation of 3,4‐dihydroxybenzaldehyde, as well as the SAM analogue regeneration, were achieved through this HMT-MT one-pot cascade reaction.
Unter Verwendung von rekombinanten Schweineleberesterasen wurden zwei Chemoenzymatische Prozesse sukkzessive etabliert, optmiert und im Maßstab vergößert. Es wurden zwei chirale Synthesebausteine beispielhaft hergestellt und charakterisiert.
Die Arbeit gibt einen Einblick in die Prozessoptimierung von chemoenzymatischen Syntheserouten unter ökonomischen Aspekten.
Chemistry and biology of Phenolics isolated from Myricaria germanica (L.) Desv. (Tamaricaceae)
(2014)
In accordance with the recent worldwide interest in plant phenolics, which emerges from their broad range of biological activities, particular emphasis has been focused, in the present thesis, on the constitutive phenolics of the extract of Myricaria germanica (L.) Desv. (Tamaricaceae). During the current thesis twenty phenolics (1 – 20) were isolated and identified from the aqueous/ethanol extract of the whole Myricaria germanica plant. The isolates include four hitherto unknown natural phenolics (2, 10, 12 and 20). Also, the cytotoxic activities of M. germanica extract, column fractions, and one new natural isolate against three different solid tumor cell lines, namely, breast cancer (MCF-7), prostate (PC-3), and liver (Huh-7) cancer cell using SRB viability assay have been investigated and first insights into mode of action have been obtained.
The goal of this thesis was to characterize the properties of tetramyristoyl cardiolipin (TMCL) and several environmental influences on it. This included investigating the pH and temperature dependency of TMCL as well as the influences of ROS on TMCL and exam-ining the lipid-protein interactions between TMCL and cytc. Furthermore, I extended the research to the analysis of binary mixtures composed of TMCL and dimyristoyl phosphati-dylcholine (DMPC). To this end, I investigated the samples with the aid of the Langmuir monolayer technique. This method allowed me to mimic interactions occurring at the membrane surface as it represents one membrane layer. The recording of π-A isotherms was also coupled with further other techniques like Brewster angle microscopy (BAM), Infrared Reflection-Absorption Spectroscopy (IRRAS), Grazing Incidence X-Ray Diffraction (GIXD) and Total Reflection X-Ray Fluorescence (TRXF) to enable a more comprehensive monolayer study. In addition, some systems were analyzed using Thin-layer Chromatography (TLC) and/or Differential Scanning Calorimetry (DSC) to be able to draw conclusions about sample composition or characteristic temperatures, respectively.
Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Strukturen, die unter anderem in viralen Satelliten-RNAs entdeckt wurden, wo sie durch reversible Spaltung des Phosphatrückgrates die virale Replikation unterstützen. Durch gezielte strukturelle Manipulation von Ribozymen entstehen wertvolle Werkzeuge, die in vielen bioanalytischen, biotechnologischen und gentherapeutischen Bereichen Anwendung finden. Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem funktionalen Design von verschiedenen Ribozymmotiven, deren kinetische und strukturelle Charakterisierung sowie deren potentielle Anwendung. In einem ersten Projekt sollten durch rationales Design RNA-Schalter, sogenannte Riboswitches, entwickelt werden. Die Aktivität dieser schaltbaren Ribozyme hängt von einem externen Kofaktor ab. Solche Konstrukte können durch gezielte Kombination einer natürlichen Ribozymdomäne mit einer Aptamerdomäne, die spezifisch einen Kofaktor (darunter Nukleinsäuren, Peptide, organische Moleküle und Metallionen) binden kann, gewonnen werden. Durch Bindung dieses Kofaktors wird eine konformelle Änderung innerhalb der Ribozymstruktur erzwungen die einen Anstieg- oder Abfall der katalytischen Aktivität zur Folge hat. Derartige Systeme besitzen biosensorisches Potential. Betrachtet man den Kofaktor als Analyten, kann das Bindungsereignis, also die Detektion, über ein Spaltereignis beobachtet werden. Die Reversibilität solcher Detektionssysteme konnte bisher nicht demonstriert werden, würde aber deren Attraktivität und Anwendungspotential erhöhen. In dieser Arbeit wurden Ribozyme auf Basis des Hairpin-Motivs entwickelt, die in Abhängigkeit von Flavinmononukleotid (FMN) aktiv sind. Um die Reversibilität des Prozesses zu gestatten, müsste FMN beliebig aus der Aptamerdomäne entfernt und in diese wieder eingelagert werden können. Dies sollte über die Kontrolle der Molekülgeometrie des Kofaktors erfolgen. Durch chemische Reduktion von FMN werden strukturelle und elektronische Veränderungen innerhalb des Moleküls hervorgerufen, die die Bindungsaffinität verringern sollten. Versuche mit Reduktionsmitteln konnten die Reversibilität des Schaltvorganges in einem ersten Ansatz demonstrieren. Um ein mehrmaliges, kontrolliertes Schalten zu gestatten, wurde zur gezielten Manipulation des Oxidationszustandes von FMN eine elektrochemische Zelle entwickelt. Dazu musste das klassische Drei-Elektroden-System dem hier vorliegenden System angepasst werden. Zum einen muss die quantitative Reduktion/Oxidation von FMN in einem kleinen Probenvolumen von einigen Mikrolitern gewährleistet werden, zum anderen sollte unter Sauerstoffausschluss gearbeitet werden, um unerwünschte Reoxidationsprozesse zu verhindern. Mit der entwickelten Zelle konnte in einem Spaltexperiment ansatzweise die Verringerung der Ribozymaktivität durch elektrochemische Reduktion des Kofaktors demonstriert werden. Schnelles und präzises Schalten des Systems wurde durch Diffusionsprozesse der reagierenden Spezies zur Elektrodenoberfläche limitiert und konnte mit dieser Anordnung nicht demonstriert werden. Neben kinetischen Studien sollten strukturelle Untersuchungen die Charakterisierung des RNA-Schalters vervollständigen. Hierbei wurden die konformellen Änderungen innerhalb des Ribozyms bei Bindung des Kofaktors ESR-spektroskopisch studiert. Allgemein müssen dazu Nukleinsäuren mit paramagnetischen Spinsonden markiert werden. In diesem Zusammenhang wurden Synthese- und Markierungsmethoden zum Erhalt spinmarkierter Oligonukleotide etabliert. Ein zweites Projekt beschäftigte sich mit der Entwicklung von Reparatursystemen auf Basis kleiner katalytischer RNA-Motive. Die in diesem Zusammenhang entwickelten Twinribozyme besitzen großes Potential zur Reparatur von Gendefekten auf RNA-Ebene. Hierbei wird ein kurzer Sequenzabschnitt innerhalb eines RNA-Stranges gegen eine alternative Sequenz durch doppelte Spaltung und Ligation ausgetauscht. Diese Methode sollte es ermöglichen, mutierte Sequenzbereiche auf mRNA-Ebene gegen die entsprechend korrekte Sequenz zu ersetzen und Gendefekte zu beheben. Twinribozyme entstehen durch Duplikation zweier katalytischer Motive und wurden als erstes unter Verwendung des Hairpinribozymmotivs entwickelt. Da nicht alle Substratsequenzen vom Hairpinribozym toleriert werden, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Eignung eines Hammerheadribozyms zur Entwicklung eines Twinribozyms überprüft, um die Palette derartiger Werkzeuge zu erweitern. Gezeigt werden konnte, dass der Austausch einer Sequenz zwar katalysiert wird, die geringe Produktausbeute von nur 3% eine gentherapeutische Anwendung zunächst noch in Frage stellt. Hier sollten strukturelle Optimierungen des Systems zu einem besseren Ergebnis führen. Insgesamt konnte demonstriert werden, dass die Aktivität von RNA-Enzymen gezielt durch die Einführung von charakteristischen Strukturelementen manipuliert und kontrolliert werden kann und somit Systeme mit hohem Anwendungspotential geschaffen wurden.
Die Bedeutung der endothelialen Mechanotransduktion für vaskuläre Implantate: Das Apelin/APJ-System.
(2014)
Bei der Behandlung atherosklerotischer Gefäße mit vaskulären Implantaten spielt nicht nur die endotheliale Dysfunktion eine wichtige Rolle. Auch die Fähigkeit des Implantatmaterials, sich an die Gefäßwand anzupassen und dessen Biokompatibilität, sind von großer Bedeutung. Die Entwicklung von wirkstofffreisetzenden Stents (DES) konnte die Risiken nach Stentimplantation signifikant reduzieren. Jedoch gibt es Hinweise darauf, dass diese polymerbeschichteten DES Ursache für die Entstehung von Stent Thrombosen (ST) sein können - eine potentiell tödliche Komplikation. Die mechanischen Eigenschaften eines Materials, das in ein Gefäß eingebracht wird, können einen großen Einfluss auf die umliegenden Zellen haben. Die Bedeutung einer solchen Veränderung in der Umgebung einer Zelle und der Einfluss auf deren mechanische Eigenschaften und biologische Funktionen wird immer häufiger als Ursache für die Entstehung von In-Stent-Restenose (ISR) und ST diskutiert. Das Endothel dient als einzigartige Barriere zwischen dem fließenden Blut und der Gefäßwand, wodurch es permanent mechanischen Reizen ausgesetzt ist. Mechanosensitive Strukturen auf der Zelloberfläche übersetzen diese Stimuli in biochemische Signale. Die anschließende Translation in downstream Effekte moduliert die Zellfunktion. Zu dem mechanosensorischen Komplex um PECAM-1 gehören auch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), welche an der flussabhängigen Regulation der NO-Freisetzung beteiligt sind. Im kardiovaskulären System werden der GPCR APJ und sein spezifischer Ligand Apelin vor allem von Endothelzellen und endokardialen Zellen exprimiert. Die Apelin-Isoformen Apelin-12 und Apelin-13 wurden in diesem Zusammenhang bisher als bioaktiv beschrieben. Obwohl das apelinerge System in vielen vaskulären Endothelzellen exprimiert wird, wurde es bisher nicht als Überträger mechanischer Reize in Betracht gezogen. In diesem Kontext ist das Ziel der vorliegenden Arbeit, zunächst die physiologische Rolle des Apelin/APJ-Systems als Mechanotransducer in humanen Endothelzellen in einem in vitro Zellperfusionsystem zu charakterisieren. Weiterhin soll der Einfluss von Stentpolymeren auf die Zellfunktion und die endotheliale Mechanotransduktion untersucht werden.
Im Fokus dieser Arbeit standen die Wechselwirkungen zwischen nicht-thermischem Atmosphärendruck-Plasma und in-vitro kultivierten Keratinozyten (HaCaT-Keratinozyten) und Melanomzellen (MV3). Für die Untersuchungen wurden drei Plasmaquellen unterschiedlicher Bauart genutzt; ein Plasmajet (kINPen 09) und zwei Quellen, die das Plasma mittels der dielektrisch behinderten Entladung (Oberflächen-DBE, Volumen-DBE) generieren. Um grundlegende Effekte von Plasma auf Zellen analysieren zu können, wurde zunächst der Einfluss von physikalischem Plasma auf die Vitalität; die DNA und die Induktion von ROS untersucht. Folgende Methoden wurden verwendet: - Vitalität: - Neutralrotassay, Zellzählung (Zellzahl, Zellintegrität) - BrdU-Assay (Proliferation) - Annexin V und Propidiumiodid- Färbung, Durchflusszytometrie (Induktion von Apoptose) - DNA: - Alkalischer Comet Assay (Detektion von DNA-Schäden) - DNA-Färbung mit Propidiumiodid, Durchflusszytometrie (Zellzyklusanalyse) - ROS: - H2DCFDA-Assay, Durchflusszytometrie (Bestimmung der ROS-positiven Zellen) Neben den Folgen die die Plasmaquellen induzieren wurde weiterhin untersucht, welchen Einfluss das Behandlungsregime (direkt, indirekt, direkt mit Mediumwechsel), das Prozessgas (Argon, Luft) und die zellumgebenden Flüssigkeiten (Zellkulturmedien: IMDM, RPMI; Pufferlösungen: HBSS, PBS) auf das Ausmaß der Plasma-Zell-Effekte hatten. Die Verwendung aller Plasmaquellen führte in HaCaT-Keratinozyten und Melanomzellen (MV3) zu Behandlungszeit-abhängigen Effekten: - Verlust an vitalen Zellen und verminderte Proliferationsfähigkeit - Induktion von Apoptose nur nach den längsten Plasmabehandlungszeiten - DNA-Schäden 1 h nach Plasmabehandlung, nach 24 h deutlich weniger bzw. nicht mehr nachweisbar, Hinweise für DNA-Reparatur vorhanden - Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase zulasten der G1-Phase 24 h nach Plasmabehandlung - Anstieg der ROS-positiven Zellen 1 h und 24 h nach Plasmabehandlung Es wurde gezeigt, dass in RPMI-Medium kultivierte Zellen sensitiver, in Form von verminderter Vitalität und vermehrten DNA-Schäden, reagierten als in IMDM-Medium gehaltene Zellen. Aber auch während der Plasmabehandlung in Pufferlösungen (HBSS, PBS) gehaltene HaCaT-Zellen wiesen DNA-Schäden auf. Die direkte und indirekte Plasmabehandlung führte zu nahezu gleichen Ergebnissen. Ein Wechsel des Zellkulturmediums direkt nach der Plasmabehandlung schwächte alle gemessenen Effekte ab. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass neben der Art der Flüssigkeit und Behandlungszeit auch der Inkubationszeitraum der Zellen mit der in Plasma in Kontakt gekommenen Flüssigkeit von essentieller Bedeutung ist. Die durch Plasma induzierten reaktiven Spezies gelangen in die Flüssigkeit und interagieren mit den Wassermolekülen und den organischen Molekülen der Zellkulturmedien, welche langlebige Radikale (z.B. H2O2) bilden, die dann ihrerseits mit zellulären Molekülen reagieren. Die anderen Plasmakomponenten wie UV-Licht und elektrische bzw. magnetische Feldern scheinen nur eine untergeordnete Rolle in der Plasma-Zell-Interaktion zu spielen, da diese nur bei der direkten Behandlung mit den Zellen in Berührung kommen und die starken Auswirkungen nach der indirekten Behandlung nicht verursachen können. Die in diesen Untersuchungen verwendete Oberflächen-DBE konnte mit Luft oder mit Argon als Prozessgas betrieben werden. Wurde Argon als Prozessgas genutzt, kam es zu milderen Auswirkungen im Vergleich zur Plasmabehandlung im Luftmodus. Mit Luft generiertes Plasma weist neben ROS auch RNS in der Gasphase auf, letztere lassen sich im Argon-Plasma nicht nachweisen und stehen für Plasma-Zell-Interaktionen nicht zur Verfügung. Zusätzlich zu den humanen Keratinozyten wurden auch humane Melanomzellen mit Plasma (Oberflächen-DBE/Luft) behandelt. Im Vergleich zu den HaCaT-Zellen sind bei den MV3-Zellen geringere Behandlungszeiten nötig, um biologisch gleichwertige Effekte zu bewirken. Die hier verwendeten Testmethoden eignen sich für die biologische Charakterisierung von neuen Plasmaquellen bzw. für die Analyse von Plasma-Zell-Wechselwirkungen weiterer Zelllinien. Tiefergehende Untersuchungen, z.B. bezüglich der genaueren Spezifizierung der durch Plasma hervorgerufenen oxidativen DNA-Schäden und den daraus resultierenden Reparaturmechanismen, sollten folgen.
Bis heute ist die Haupterblindungsursache in den westlichen Industrienationen, die altersbedingte Makuladegeneration, nicht heilbar und aufgrund der zunehmenden Lebenserwartung der Bevölkerung wird die Anzahl an Neuerkrankungen zukünftig weiter steigen. Die intravitreale operative Medikamentengabe gilt als aktuelle Standardtherapie um das Fortschreiten eines Visusverlusts zu verzögern und kann in manchen Fällen eine deutliche Sehverbesserung bewirken. Überwiegend werden antiinflammatorische und antineovaskuläre Wirkstoffe in Form von intravitrealen Injektionen verabreicht, deren Nachteil jedoch ein verhältnismäßig kurzer Therapieeffekt in Hinblick auf die chronische Erkrankung des hinteren Augenabschnitts ist. Für längerfristig erfolgreiche Therapien sind zahlreiche Innovationen im Bereich der periokularen und intravitrealen Arzneistofffreigabesysteme in unterschiedlichen Phasen der Forschung und Entwicklung, deren Wirksamkeit und Sicherheit jedoch erst belegt werden muss. Für möglichst prädiktive Ergebnisse über das Verhalten von Arzneiformen in vivo sollten ausgewählte physiologische Parameter in Modellen und Testmethoden simuliert und nach aktuellem Wissensstand berücksichtigt werden können. Da die reale Situation des Glaskörpers älterer Patienten in Tiermodellen nur unzureichend widergespiegelt wird und die Nutzung von Simulationsmodellen zur Abschätzung des pharmakokinetischen Profils von Arzneistoffen oder Darreichungsformen aufgrund der lückenhaften Datenlage über den Glaskörper als Applikationsort oft limitiert ist, sollen zuverlässige In vitro-Testsysteme dazu beitragen, die unvollständige Datenlage mit In vitro Ergebnissen zu ergänzen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, humane Glaskörper aus der postmortalen Spende zu gewinnen und zu charakterisieren. Somit konnten die lückenhaften Literaturdaten zum humanen Glaskörper durch ausgewählte physikochemische Eigenschaften (pH Wert, Brechungsindex, Osmolalität, Gesamtproteingehalt, Wassergehalt) ergänzt werden. Zudem wurden Untersuchungen zur Glaskörperverflüssigung durchgeführt und erstmals eine altersbedingt zunehmende Inhomogenität des humanen Glaskörpers im Gegensatz zum Jungtiermodell (Schwein) gezeigt.
Weiterhin wurden die von Loch et al. beschriebenen Prototypen des Glaskörper- (GK-) Modells und des Eye Movement Systems (EyeMoS) in weiterer Anlehnung an die Situation in vivo modifiziert und ausgewählte Darreichungsformen hinsichtlich ihres Freisetzungs- und Verteilungsverhaltens im simulierten Glaskörper charakterisiert. In Ergänzung zu den Modellen von Loch et. al wurde neben einem standardisierten Injektionsverfahren zudem die Körpertemperatur, vielfältige Augenbewegungsmuster und der Zustand nach einer Vitrektomie in den modifizierten In vitro Modellen berücksichtigt. Für Langzeituntersuchungen bis über Monate bietet die neuartige und kostengünstige Testapparatur die Möglichkeit, 6 GK-Modelle gleichzeitig bei simulierten Augenbewegungen zu integrieren. Am Beispiel von intravitrealen Modellimplantaten mit dem klinisch häufig eingesetzten Wirkstoff Dexamethason wurde der Einfluss ausgewählter In vitro-Testmethoden und -Parameter im Hinblick auf die Wirkstofffreisetzung aus Implantaten untersucht. Je nach verwendeter Testapparatur, Testmedium und einer Probenahme- oder Transfermethode wurden erhebliche Unterschiede in den Freisetzungsprofilen von Dexamethason oder Fluorescein-Natrium aus PCL- oder PLGA-Modellimplantaten beobachtet, wodurch die Notwendigkeit zum Verständnis der zugrundeliegenden und freisetzungsbestimmenden In vivo-Parameter sowie deren Transfer in zuverlässige In vitro-Testsysteme hervorgehoben wurde.
Weiterhin wurde gezeigt, dass die simulierte Glaskörperverflüssigung, wie sie für ältere Patienten beschrieben ist, im Vergleich zum homogen aufgebauten Glaskörper eine schnellere Verteilung der Injektionslösungen im GK-Modell zur Folge hat. Suspensionszubereitungen zeigten anstatt einer homogenen Verteilung im GK-Modell eine ausgeprägte Neigung zur Sedimentation, was am Beispiel des klinisch relevanten Triamcinolonacetonids verdeutlicht wurde. Der simulierte Zustand nach einer Vitrektomie mit anschließender Injektion der wirkstoffhaltigen Suspension resultierte ebenfalls in einer Sedimentation der Triamcinolonacetonid-Partikel, deren potentiell netzhautschädigende Effekte in klinischen Langzeitstudien untersucht werden sollte.
Zusammenfassend verdeutlichen die Ergebnisse dieser Arbeit kritische In vitro- und In vivo-Parameter, die die Wirkstofffreisetzung und -Verteilung aus intravitrealen Darreichungsformen beeinflussen und die von großer Bedeutung für die Abschätzung des pharmakokinetischen Profils einer Arzneiform sein können.
Structure– and sequence–function relationships in (S)-amine transaminases and related enzymes
(2015)
Chiral primary amines are valuable building blocks for many biologically active compounds. Environmentally friendlier alternatives to the classical methods for α-chiral primary amine synthesis are highly desired. A biocatalytic alternative that recently proved beneficial for industrial applications is asymmetric synthesis utilising (S)-selective amine transaminases (S-ATAs). These enzymes can be utilized to transaminate a prochiral ketone with an amino donor (e.g. isopropylamine), to achieve a chiral amine and a carbonyl product (e.g. acetone). However, for several potential applications protein engineering is required to fit (S)-ATAS to the demands of an industrial process. Since no (S)-ATA crystal structure required for understanding the substrate recognition and thus protein engineering was available, we first aimed at obtaining structural data. Instead of solving crystal structures ourselves, we took advantage of structural genomics projects and discovered, that the protein data bank (PDB) already contained crystal structures of four enzymes with unknown function that we hypothesised to possess (S)-ATA activity. After developing a screening method, the four enzymes could be characterized as ω-amino acid:pyruvate transaminases (ωAA:pyr TAs). (S)-amine conversion was suggested to be a ‘substrate-promiscuous’ activity of these enzymes, as it is pronounced differently in the four investigated ones. By comparing the active sites of the highly and poorly active (S)-ATAs, the residues that determine the ability of amine conversion in these enzymes were discovered. Furthermore, the mechanism for dual substrate recognition, the binding of both, carboxyl and bulky hydrophobic substrates in the same active site, could be elucidated with the crystal structures. A flexible arginine side chain is able to adopt various positions thus enabling carboxylate binding and by ‘flipping’ out of the active site, to create space for amine binding. Then, a limitation of these enzymes, the restricted substrate scope caused by a small binding pocket was addressed. First, a rational protein engineering approach was set up to create more space. The tested mutations, however, destroyed most of the activity for both regular and more bulky substrates. We thus learned that the structural requirements for (S)-ATA activity are more complex than initially anticipated and a semi-rational approach was applied to broaden the substrate scope. By systematic saturation of active site positions, substantially improved mutants for bulkier amine synthesis could be obtained. As this study highlighted a lack of understanding of (S)-ATA, the functional important residues in the enzymes belonging to the class III TA family were surveyed. This family is defined by common sequence and structure features and besides (S)-ATAs mainly comprises TAs of various substrate scopes but also a few phospholyases, racemases and decarboxylases. To enable the comparison of active site residues among them, a commercial bioinformatics tool was used to create a family wide structure-based alignment of around 13,000 sequences. Based on statistical analyses of this alignment, structural inspections and literature evaluation, active site residues crucial for certain specificities within this family have been identified. By investigating the ingenious active site designs that enable such a plethora of reactions, and by identifying sets of functional important residues termed ‘active site fingerprints’, the understanding of catalysis in this enzyme family could be broadened. Furthermore, these functional important residues can on the one hand be applied to predict the specificity of uncharacterised enzymes, if a fingerprint is matched. On the other hand, if no fingerprint is matched, they can help to discover yet unknown activities or mechanisms to achieve a known specificity. We exemplified the latter case by functionally characterising a Bacillus anthracis enzyme with the crystal structure 3N5M, whose substrate specificity was unknown and could not be predicted. The 3N5M enzyme was found to possess ωAA:pyr TA and (S)-ATA activity even though it lacks the above-mentioned ‘flipping’ arginine. Based on molecular dynamics simulations we were able to propose an alternative mechanism for dual substrate recognition in the B. anthracis ωAA:pyr TA. By these findings the understanding of the requirements for (S)-ATA activity could be further broadened and a functional knowledge gap within the class III TA family was closed. The active site residue composition in 3N5M is now connected to enzymatic function and may be applied for future specificity predictions.
Investigation on the primary and secondary metabolism of marine and terrestrial endosymbionts
(2017)
Ph.D. thesis describes the metabolism of marine fungus and isolation of natural product for human use in part I and also describes earthworm endosymbiosis mechanism in part II. From the marine fungus project, three new producers have been identified for the previously reported bioactive secondary metabolites. And, from the Earthworm endosymbiosis project, the role of primary metabolites in the host fitness has been partially studied. the results outcome will be a partial contribution to microbial symbiosis.
Synthesen modifizierter Nukleoside zur Aufklärung der Struktur und Funktion von RNA-Molekülen
(2019)
Im Fokus dieser Arbeit lagen die Synthesen verschiedener Nukleosidderivate zur Aufklärung der Struktur und Funktion von RNA-Molekülen. Es wurden erfolgreich zwei Adenosinderivate synthetisiert und die für die post-synthetische Markierung benötigte Aminofunktion entweder mit Hilfe der Sonogashira-Kupplung an der Position C2 oder der Heck-Reaktion an der Position C8 eingebaut. Um auch Zugang zu modifizierten Cytidinen zu erhalten, wurde eine Synthesestrategie für ein aktiviertes Uridinderivat entworfen, um dieses nach der chemischen Synthese mittels Phosphoramiditverfahren, während der Reinigung, in das dazugehörige Cytidinderivat umzuwandeln. Hierzu wurden die funktionellen Gruppen erfolgreich für die chemische Oligonukleotidsynthese geschützt, die Modifikation an der Position C5 mit Hilfe der Sonogashira-Kupplung eingebaut und die Position C4 mit Hilfe von TIPS-Cl (2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonylchlorid) aktiviert. In Vorversuchen konnte die erfolgreiche Umwandlung in das Cytidinderivat experimentell bestätigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss ausgewählter basenmodifizierter Nukleoside auf den Charakter einer doppelsträngigen RNA untersucht. Dazu wurden die Schmelzkurven und Schmelzpunkte modifizierter und unmodifizierter Oligonukleotide gemessen und ausgewertet. Die erhaltenen Daten lassen darauf schließen, dass der Einbau von basenmodifizierten Nukleosiden zur Senkung des Schmelzpunktes führt, jedoch nicht zur Veränderung des doppelsträngigen Charakters. Eine anschließende Markierung eines modifizierten Oligonukleotids mit dem Farbstoff ATTO 680 scheint nur einen marginalen Einfluss auf den Schmelzpunkt, im Vergleich zu den Schmelzpunkten der modifizierten Oligonukleotide, zu haben. Für die Untersuchung der Funktion und Struktur von größeren RNA-Molekülen, wie zum Beispiel ROSE-Elementen, wurde eine Strategie zu deren Herstellung mit Hilfe der T4 RNA Ligase I entwickelt und ex-perimentell bestätigt. Dazu wurde das ROSE-Element in drei Segmente geteilt, diese chemisch synthetisiert, gereinigt und mit Hilfe der T4 RNA Ligase I zum vollständigen Element ligiert. Dabei konnte das ROSE-Element erfolgreich vom 5´-Terminus aufgebaut werden. Es steht nun eine Methode zur Verfügung, um auch modifizierte Oligonukleotide zu einem ROSE-Element zu ligieren und dieses auf seine Funktion und Struktur hin zu untersuchen. Eine RNA 4-way-junction wurde durch Hybridisierung generiert und für strukturelle Untersuchungen verfügbar gemacht.
Das Interesse an Amin-Transaminasen stieg in den letzten Jahren stark an. Hierbei wurde der Fokus vor allem auf die Aufklärung der Strukturen der Amin-Transaminasen, aber auch auf ihre Anwendung in der Synthese von immer komplexeren Aminen gelegt. In dieser Arbeit befasste ich mich mit der Strukturaufklärung der (R)-selektiven Amin-Transaminase aus Aspergillus fumigatus und mit der Synthese von diastereomerenreinen 1 Amino-3-Methylcyclohexan. Es gelang die (R)-selektive Amin-Transaminase aus Aspergillus fumigatus zu kristallisieren und ihre Struktur mit einer Auflösung von 1,27 Å zu lösen. Der bis dato postulierte Aufbau des aktiven Zentrums von (R)-selektiven ATAs wurde bestätigt. Weiterhin wurde die duale Substraterkennung dieser (R)-ATA untersucht. Dieses erfolgte durch das Soaken mit dem Inhibitor Gabaculin und durch Mutagenesestudien. Hierbei wurde das Arginin 126 identifiziert, welches zusammen mit einem Histidin und einem Tyrosin, für die Koordinierung der Carboxylgruppe von Alanin bzw. Pyruvat in der großen Bindungstasche des aktiven Zentrums verantwortlich ist. Durch diese Erkenntnisse konnte das Verständnis über (R)-selektive Amin-Transaminasen erweitert werden und bietet nun eine gute Grundlage für zukünftige Optimierungen und Anwendungen dieser Enzyme in der Herstellung von Aminen. Zur Synthese von diastereomerenreinem 1-Amino-3-Methylcyclohexan wurde die (S)-selektive Amin-Transaminase aus Vibrio fluvialis (VibFlu) verwendet. Während hohe Enantioselektivitäten für andere Substrate bekannt waren, musste die Amin-Transaminase zunächst mit Hilfe der 3DM-Datenbank für die selektive Transaminierung von 3-Methylcyclohexanon optimiert werden. Eine Kopplung der generierten Mutanten VibFlu Leu56Ile und VibFlu Leu56Val mit verschiedenen Enoatreduktasen führte zur erfolgreichen Synthese von drei der möglichen vier Diastereomeren mit hohen Reinheiten von bis zu 97 %de und guten Umsätzen bis zu 99 %. Somit konnte die erfolgreiche selektive Synthese eines zyklischen Amins mit mehr als einem Stereozentrum durch eine Enzymkaskade gezeigt werden. Dies demonstriert die Möglichkeiten von Kaskadenreaktionen mit Amin-Transaminasen und Enoatreduktasen zur Synthese von komplexen diastereomerenreinen Aminen.
Einige Oberflächenstrukturen, die sogenannten aktiven Zentren, sind Katalysatoren für heterogene Reaktionen. Ihre Beständigkeit ist von Art und Zusammensetzung der Phasengrenze abhängig. Eine Wechselwirkung mit reaktiven Molekülen ändert die Oberfläche durch Auflösung, Adsorption oder Oberflächendiffusion. In dieser Arbeit werden die Änderungen der Oberflächenaktivität und –struktur von Gold und Platin nach der Behandlung mit den Hydroxyl-Radikalen aufgezeigt.
Die elektrochemische Aktivität von Platin gegenüber Hydrochinon, K3Fe(CN)6 und [Ru(NH3)6]Cl2 wurde durch die Behandlung mit Hydroxyl-Radikalen nicht beeinflusst. Die Oberfläche wurde allerdings, durch die Bildung einer Oxidschicht, rauer. Die Oxidschichtbildung konnte zyklovoltammetrisch und potentiometrisch nachgewiesen werden. Im Verlauf der Wechselwirkung von H2O2 mit Platin ging Platin in Lösung (ICP-AES).
Bei Gold wurden im letzten Jahrzehnt Oberflächenstrukturen mit vielfach erhöhter Aktivität nachgewiesen. Die Experimente zeigten, dass Hydroxyl-Radikale die reaktiven Goldstrukturen (aktiven Zentren) selektiv beeinflussen. Die elektrokatalytische Sauerstoffreduktionsreaktion und die defektorientierte Platinabscheidung wurden durch die vorherige Behandlung mit Hydroxyl-Radikalen inaktiver. Der Keimbildungsmechanismus blieb hingegen unverändert (instantaneous). Dies wurde mit Hilfe der Zyklovoltammetrie und der Chronoamperometrie nachgewiesen. Topographische Experimente mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM) zeigten ein Platinwachstum auf den oberen Teilen der polykristallinen polierten Goldelektrode. Verschiedene Politurmethoden (fein und grob) wiesen zudem eine komplett unterschiedliche Aktivität und Reproduzierbarkeit auf. Mit einer groben Politur konnte eine deutlich bessere Reproduzierbarkeit erreicht werden.
Die Identifizierung chemisch aktiver Zentren ist sehr reizvoll. Mit Hilfe von AFM Experimenten konnte die Auflösung von Gold direkt verfolgt werden und damit die aktiven Zentren charakterisiert werden. Morphologische Untersuchungen mit dem Rasterkraftmikroskop belegen eine selektive Änderung der Kristallite und Korngrenzen nach der Wechselwirkung einer ausgeheilten Goldoberfläche mit Hydroxyl-Radikalen (in- und ex-situ). Es kann angenommen werden, dass die selektive Oberflächenänderung bei Gold durch die inhomogene Verteilung der Elektronendichte und verschiedene Bindungszustände der Oberflächengoldatome beeinflusst ist. Herausstehende Kristallstrukturen sind nach der Wechselwirkung mit den Hydroxyl-Radikalen kleiner und die Korngrenzen zwischen den Goldkristallen tiefer. Die nach der einmaligen elektrochemischen Zyklisierung auftretenden Oberflächenänderungen sind den Änderungen nach Behandlung mit Hydroxyl-Radikalen ähnlich. Ein mehrmaliges Zyklisieren führt hingegen zu ein er deutlich veränderten Oberflächenstruktur.
Das In vitro-Testsystem der Gefäß-simulierenden Durchflusszelle (vessel-simulating flow-through cell, vFTC) ermöglicht die Untersuchung der Wirkstofffreisetzung und -verteilung aus Arzneistoff-freisetzenden Stents (drug-eluting stents, DES) zwischen dem Perfusionsmedium, dem Hydrogelkompartiment und dem in der Stentbeschichtung verbliebenden Wirkstoffanteil. Die vorliegende Forschungsarbeit hatte zum Ziel, die physikochemischen Eigenschaften des Gefäß-simulierenden Gelkörpers (ein 3 %iges Alginat-Gel) unter Erhaltung definierter Materialeigenschaften wie Elastizität, Festigkeit und Formstabilität der Hydrogelkompartimente unter Perfusionsbedingungen zu verändern und den Einfluss der Einbettungsbedingungen auf die Wirkstofffreisetzung und -verteilung von mit Modellwirkstoffen-beschichteten Stents in der vFTC zu untersuchen. Die Modifizierung der physikochemischen Eigenschaften des Alginat-basierten Hydrogelkompartimentes konnte durch Integration des hydrophoben Adsorbens LiChroprep® RP-18 sowie durch den Austausch der wässrigen Phase durch die o/w-Emulsion Lipofundin erfolgreich abgeschlossen werden. Dabei zeigte die 5 %ige LiChroprep-Formulierung eine schnelle Gelierung, ergab formstabile Gelkörper und beobachte Auswaschungseffekte des inkorporierten Adsorbens (bei einem Masseanteil im Gel von ≤ 10 %) unter Perfusion in der vFTC blieben aus. Eine maximale Änderungen der Verteilungseigenschaften ergab sich für die Kombination der hydrophoben Modellsubstanz Triamteren mit dem LiChroprep-Gel (Verteilungskoeffizient von ~ 5). Im Rahmen der Freisetzungs- und Verteilungsuntersuchungen in der vFTC konnte eine Anreicherung im LiChroprep-Gel (gegenüber dem Alginat-Gel) beziehungsweise eine Änderung der Wirkstoffverteilung zwischen den Kompartimenten Freisetzungsmedium, Hydrogel und Stentbeschichtung jedoch nicht bestätigt werden. Die numerische Modellierung der experimentellen Freisetzung mittels Finite-Elemente zeigte jedoch, dass im Fall von Triamteren der Einfluss einer Gelhydrophobisierung auf die Freisetzung und Verteilung mit steigender Entleerungsgeschwindigkeit des Modellwirkstoffes aus der Stentbeschichtung zunimmt. Für die In vitro-Testung von DES in der vFTC über einen verlängerten Versuchszeitraum von 28 Tagen konnten geeignete, Langzeit-stabile Gelformulierungen aus Agar, Agarose, Polyacrylamid und Polyvinylalkohol gefunden werden. Diese unterschieden sich hinsichtlich ihrer Herstellungstechnik, ihren Quellungseigenschaften, ihrer makroporösen Gelstruktur, ihren Verteilungs- und Diffusionseigenschaften sowie den Materialeigenschaften, Gelfestigkeit und Elastizität. Der Vergleich der mit Hilfe des Texture Analyser ermittelten Kraft-Deformations-Profile der Gelkörper vor und nach 28-tägiger Perfusion in der vFTC zeigte, dass die untersuchten Materialeigenschaften, Festigkeit und Elastizität, im Fall der Agarose-, Polyacrylamid- und Polyvinylalkohol-Gelkörper trotz kontinuierlicher Scherbeanspruchung durch Perfusion des Gellumens nahezu unverändert waren. Aufgrund der schnellen und simplen Herstellungstechnik, der milden Gelierungsbedingungen, der elastischen Eigenschaften und der nahezu unveränderten mechanischen Stabilität unter Flussbedingungen in der vFTC erscheint das Agarose-Gel der vielversprechendste Kandidat der für die vFTC neu entwickelten Gelformulierung zu sein. Die Untersuchung der Diffusions- und Verteilungseigenschaften in den Langzeit-stabilen Hydrogelkompartimenten ergab eine Gleichverteilung der hydrophoben Modellsubstanz Triamteren zwischen dem Agar-, dem Agarose- beziehungsweise dem Polyacrylamid-Gel und dem flüssigem Kompartiment, während für die Polyvinylalkohol-Formulierung eine minimale Anreicherung (Verteilungskoeffizient von ~ 2) im Hydrogel gezeigt werden konnte. Die Wirkstoffdiffusion im Gel variierte von 2 x 10-4 mm2/s für Polyvinylalkohol, 5 x 10-4 mm2/s für Alginat und Polyacrylamid bis 8 x 10-4 mm2/s für Agarose. Die theoretische Modellierung der experimentellen Freisetzung mittels Finite-Elemente-Methode ergab in Abhängigkeit unterschiedlicher Entleerungsgeschwindigkeiten aus dem Wirkstoffreservoir und unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Verteilungs- und Diffusionseigenschaften von Triamteren in den Langzeit-stabilen Hydrogelkompartimenten die schnellste Wirkstofffreisetzung in das Gel und die höchste Wirkstoffanreicherung im Gel im Fall des Polyvinylalkohol-Gelkörpers. In Abhängigkeit unterschiedlicher Diffusionsgeschwindigkeiten in einem Modellgel (bei konstantem Verteilungskoeffizienten- und gleichbleibenden Entleerungsgeschwindigkeiten aus der Polymerbeschichtung) konnte gezeigt werden, dass die Geschwindigkeit der Wirkstofffreigabe ins Freisetzungsmedium mit steigender Wirkstoffdiffusion im Hydrogel reduziert ist. Gleichzeitig ist die Entleerungsgeschwindigkeit aus dem Wirkstoffreservoir gesenkt, während der absolut ins Hydrogel eluierte Wirkstoffanteil steigt sowie terminal anschließend langsamer ins Medium rückverteilt wird. So scheinen die physikochemischen Eigenschaften des Hydrogelkompartimentes im Rahmen der experimentell durchgeführten Gelmodifikationen/Gelbildnersubstitution eine untergeordnete Rolle auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten der Modellwirkstoffe aus DES in der vFTC zu spielen. Die numerischen Modellierungen der experimentellen Wirkstofffreisetzung zeigen jedoch, dass eine Änderung der Verteilungs- und Diffusionskoeffizienten im Hydrogel und in der Stentbeschichtung zu Konzentrationsunterschieden in den Verteilungskompartimenten führen kann. So nimmt mit zunehmender Hydrophobisierung des Hydrogelkompartimentes, mit steigender Entleerungsgeschwindigkeit aus dem Wirkstoffreservoir und einer verlangsamten Diffusion im Hydrogel der Einfluss des Hydrogelkompartimentes auf die Wirkstofffreisetzung und verteilung in der vFTC zunimmt.
Die Applikation von Arzneistoffen erfolgt sehr häufig über die orale Gabe. Die Kenntnis der Arzneistoffkonzentration im humanen Darm ist somit essentiell für das Verständnis der oralen Arzneimitteltherapie. Die intestinale Absorption wird von verschiedenen Faktoren bestimmt. Dazu gehören die anatomischen und physiologischen Gegebenheiten des Gastrointestinaltraktes sowie die Eigenschaften des Arzneistoffes und der Arzneiform. Das komplexe Zusammenspiel dieser Faktoren kann die intestinale Konzentration des Arzneistoffes und folglich dessen Absorption und daraus abgeleitet Wirkung und Nebenwirkung beeinflussen. Zur Bestimmung der intraluminalen Arzneistoffkonzentration und zur Charakterisierung des zugehörigen Absorptionsprozesses werden bisher Systeme und Methoden verwendet, welche die Physiologie des Darmes beeinflussen können oder die im Rahmen einer chirurgischen Intervention angewendet werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung eines Mikrodialysesystems zur Bestimmung intraluminaler Arzneistoffkonzentrationen im humanen Dünndarm. Dabei sollte das System die positiven Eigenschaften der bisher verwendeten Methoden und Systeme kombinieren. Die verwendeten Materialien wurden so ausgewählt, dass ein flexibles aber dennoch robustes System aus biokompatiblen Bestandteilen erhalten wurde. Das entwickelte System kann zudem mit bildgebenden Verfahren, wie der MRT, kombiniert werden. Das neu entwickelte Mikrodialysesystem besteht letztendlich aus einer Mikrodialyseeinheit sowie einem Zufluss- und Ablaufschlauch. Die finale Mikrodialyseeinheit ist aus 30 semipermeablen Kapillaren mit einer Austauschlänge von 10 cm zusammengesetzt, über die der Stoffaustausch zwischen dem Perfusat als Akzeptor-Kompartiment und dem Medium als Donor-Kompartiment erfolgt. Das System kann hierbei kontinuierlich oder diskontinuierlich perfundiert werden. Für den diskontinuierlichen Perfusatfluss war es hierbei nötig, einen zusätzlichen Schlauch in das System zu integrieren, der ein Abtrennen der gewonnenen Proben im Ablaufschlauch mittels Luftblasen ermöglicht. Die vorgesehene Anwendung des Mikrodialysesystems in klinischen Studien am Menschen wurde bei dessen Entwicklung stets berücksichtigt. Die Einbettung der Mikrodialyseeinheit in ein Schlauchsystem ermöglicht die orale Applikation und vereinfacht damit die Anwendung des Mikrodialysesystems im Menschen. Mit der Kombination von zwei Mikrodialysesystemen in einem Set kann weiterhin die gleichzeitige Erfassung von intraluminalen Arzneistoffkonzentrationen in unterschiedlichen Abschnitten des humanen Darmes erfolgen. Nach der erfolgreichen Entwicklung des Mikrodialysesystems erfolgte zunächst die Charakterisierung der Funktionalität des Systems anhand der relativen Wiederfindung des Arzneistoffes in den Dialysatproben. Die Untersuchungen wurden mit den Arzneistoffen Paracetamol, Amoxicillin-Trihydrat und Valsartan, die aufgrund ihres spezifischen Absorptionsverhaltens im Gastrointestinaltrakt ausgewählt wurden, und verschiedenen biorelevanten Donor-Medien sowie Perfusaten durchgeführt. Das Mikrodialysesystem wurde dabei kontinuierlich oder diskontinuierlich vom Perfusat durchströmt. Bei Verwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses wurden jedoch vergleichsweise geringere Werte für die relative Wiederfindung bestimmt. Die Verwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses resultierte dagegen in einer Equilibrierzeit von 1 bis 60 min, welches einen verlängerten Stoffaustausch zwischen dem Donor-Kompartiment und dem Perfusat ermöglichte und somit zu deutlich höheren relativen Wiederfindungen führte. Außerdem wurden die Proben im Ablaufschlauch unverzüglich durch die Zufuhr von Luft, die über den zusätzlich enthaltenen Schlauch zugeführt wurde, separiert. Ein Anstieg der Equilibrierzeit von 1 auf 5 oder 60 min resultierte hierbei allerdings nicht in einer deutlichen Erhöhung der relativen Wiederfindung. Für Amoxicillin und Valsartan wurden ähnliche Werte für die relative Wiederfindung bestimmt, während für Paracetamol höhere Werte ermittelt wurden, die mit dem geringeren Molekulargewicht und der damit verbundenen erhöhten Diffusionsgeschwindigkeit erklärt werden können. Nachdem ein deutlicher Einfluss der Temperatur auf die relative Wiederfindung nachgewiesen wurde, erfolgte die Durchführung der In vitro-Untersuchungen ausschließlich bei Körpertemperatur. Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde untersucht, um dessen Eignung für In vivo-Untersuchungen zu bestimmen. Dabei sollte geprüft werden, ob und wie schnell Änderungen der Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment in den Dialysatproben nachweisbar sind. Bei Anwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses erfolgte die Detektion der Erhöhung und Verringerung der Stoffkonzentration im Donor-Kompartiment verzögert. Im Gegensatz dazu konnte bei Nutzung des diskontinuierlichen Perfusatflusses mit einer Equilibrierzeit von 1 min eine Konzentrationsänderung im Donor-Kompartiment sofort in der nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe nachgewiesen werden. Dies wurde für alle verwendeten Arzneistoffe bestätigt, sodass alle nachfolgenden Untersuchungen mit dem diskontinuierlichen Perfusatfluss und einer Equilibrierzeit von 1 min durchgeführt wurden. In den folgenden Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass das Mikrodialysesystem mehrmalig für In vitro-Untersuchungen genutzt werden konnte. Anhand von acht untersuchten Mikrodialysesystemen für Paracetamol und jeweils vier Mikrodialysesystemen für Amoxicillin und Valsartan konnte die reproduzierbare Herstellung der Mikrodialyse¬systeme nachgewiesen werden. Die Verwendung unterschiedlicher Donor-Medien und Perfusate führte zu ähnlichen Ergebnissen. Die anatomischen Gegebenheiten des Dünndarms wurden durch Untersuchungen in einem Röhrenmodell simuliert. Erhöhungen oder Verringerungen der Konzentration im Donor-Kompartiment wurden auch bei dieser Versuchsanordnung ohne zeitliche Verzögerung in der darauffolgenden Dialysatprobe nachgewiesen. In Zusammenarbeit mit dem Medizinproduktehersteller RoweMed erfolgte anschließend die Adaption des Mikrodialysesystems an die humane Anwendung. Dabei wurden modifizierte Bestandteile, wie zum Beispiel Schläuche mit verringerten Durchmessern verbaut, um die Anwendung für den Probanden möglichst angenehm zu gestalten. Die Möglichkeit, die Lokalisation der Mikrodialyseeinheit im Gastrointestinaltrakt über die pH-metrische Analyse der Dialysatproben zu bestimmen, wurde anschließend untersucht. Bis zu einem pH-Wert von pH 3 kann über den erniedrigten pH-Wert in den Dialysatproben der Rückschluss auf die Lage im Magen gezogen werden. Dies entspricht dem üblicherweise ermittelten pH-Wert im Magen von pH 2,7 bei nüchternen jungen, gesunden Probanden. Abschließend wurde die Eignung der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen, die zur humanen Anwendung zugelassen sind, für die Nutzung in Kombination mit dem Mikrodialysesystem überprüft, um in einer Studie am Menschen CE-zertifizierte Geräte einsetzten zu können. Die beschränkte Programmierbarkeit beider Pumpen bei der Anwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses erforderte eine erneute Modifikation des Versuchsablaufes. Durch die Reduktion der Pump- und Equilibrierzeiten konnte ein Versuchsablauf ermittelt werden, der ähnliche Ergebnisse wie mit den bisher verwendeten Pumpen lieferte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Mikrodialysesystem zur Bestimmung intestinaler Arzneistoffkonzentrationen entwickelt und in vitro charakterisiert. Die mit dem Mikrodialysesystem gewonnenen Daten könnten genutzt werden, um zukünftig das komplexe Zusammenspiel verschiedener Faktoren während der Arzneistoffabsorption besser zu verstehen. Mit diesem Wissen könnten Nebenwirkungen und Wechselwirkungen oral applizierter Arzneistoffe verringert und deren Bioverfügbarkeit erhöht werden.
In this thesis, two novel assay systems had been developed, which allow a fast and easy screening for amine transaminase activity as well as the characterization of the amino donor and acceptor specificity of a given amine transaminase. The assays overcome some limitations of previously described assays but of course have some limitations themselves. The relatively low wavelength of 245 nm, at which the production of acetophenone is detected with the spectrophotometric assay, limits the amount of protein/crude extract that can be applied, which eventually results in a decreased sensitivity at higher enzyme loads due to an increased initial absorbance. Otherwise, this assay can be used very easily for the investigation of the amino acceptor specificity and both pH and temperature dependencies of amine transaminases. The conductometric assay is – by its very nature – limited to low-conducting buffers, a neutral pH and constant temperatures. In summary, the assays complement one another very well and the complete characterization of the most important enzyme properties can be accomplished quickly. Furthermore, we developed and applied a novel in silico search strategy for the identification of (R)-selective amine transaminases in sequence databases. Structural information of probably related proteins was used for rational protein design to predict key amino acid substitutions that indicate the desired activity. We subsequently searched protein databases for proteins already carrying these mutations instead of constructing the corresponding mutants in the laboratory. This methodology exploits the fact that naturally evolved proteins have undergone selection over millions of years, which has resulted in highly optimized catalysts. Using this in silico approach, we have discovered 17 (R)-selective amine transaminases. In theory, this strategy can be applied to other enzyme classes and fold types as well and for this reason constitutes a new concept for the identification of desired enzymes. Finally, we applied the seven most promising candidates of the identified proteins to asymmetric synthesis of various optical pure amines with (R)-configuration starting from the corresponding ketones. We used a lactate dehydrogenase/glucose dehydrogenase system for the necessary shift of the thermodynamic equilibrium. For all ketones at least one enzyme was found that allowed complete conversion to the corresponding chiral amine with excellent optical purities >99% ee. Bearing in mind that until last year there was only one (R)-selective amine transaminase commercially available and two microorganisms with the corresponding activity described, the identification of numerous enzymes is a breakthrough in asymmetric synthesis of chiral amines.
Untersuchungen zum Einfluss des Endothelinsystemes auf die Doxorubicin-induzierte Kardiomyopathie
(2012)
Das Zytostatikum Doxorubicin besitzt nach wie vor einen hohen Stellenwert in der Therapie maligner Erkrankungen. Die schwerste und gleichzeitig dosislimitierende Nebenwirkung, die bei der Therapie mit Doxorubicin auftreten kann, ist eine Kardiomyopathie. Die Prävention dieser Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie könnte eine effektivere Gestaltung der zytostatischen Therapie ermöglichen, allerdings sind dafür detaillierte Kenntnisse über den Pathomechanismus der Entstehung dieser Herzschädigung unabdingbar. Basierend auf der kardioprotektiven Wirkung des dualen Endothelinrezeptorantagonisten (ETA) Bosentan gegenüber einer Doxorubicin-Kardiotoxizität im Mausmodell, war das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit, die Wirkung von Bosentan vergleichend zu einer selektiven Endothelinrezeptor-A- bzw. -B-Blockade mittels Sitaxentan bzw. BQ-788 zu analysieren und zugrunde liegende Mechanismen der Kardioprotektion aufzuklären. Dazu wurde das Konduktanzkatheter-System zur Messung und Auswertung hämodynamischer Parameter von C57/BL6-Mäusen am Institut für Pharmakologie etabliert, mit Literaturdaten verglichen und mittels Magnetresonanztomographie verifiziert. Nach Herausarbeitung der zur Induktion einer Herzschädigung geeigneten Doxorubicin-Dosis von 20 mg/kg KG, wurde im folgenden Tierversuch der Einfluss einer Endothelinrezeptor-Blockade durch die ETAs Bosentan, Sitaxentan und BQ-788 auf hämodynamische Parameter vergleichend analysiert. Dabei konnte bei allen ETAs ein kardioprotektiver Effekt gegenüber der Doxorubicin-Kardiotoxizität nachgewiesen werden. Sitaxentan als hochselektiver Endothelinrezeptors-A-Blocker zeigte eine nur geringfügig schlechtere Wirkung auf die Hämodynamik der Versuchstiere. Interessanterweise konnte auch der Endothelinrezeptors-B-Antagonist BQ-788 die Herzfunktion der Doxorubicin-behandelten Mäuse in ähnlichem Ausmaß wie Bosentan und Sitaxentan verbessern, was auf der zusätzlichen Endothelin-A1-Rezeptorblockade beruhen könnte. In einem weiteren Schritt konnte der Doxorubicin- und Doxorubicinolgehalt verschiedener Organe der Maus mittels HPLC bestimmt werden. Dabei zeigte sich, dass der kardioprotektive Effekt der ETAs nicht auf einer verringerten Akkumulation von Doxorubicin oder Doxorubicinol im Myokard beruht, da deren kardiale Spiegel unter ETA-Co-Medikation keine signifikanten unterschiede zeigten. Lediglich BQ-788 beeinflusste den Doxorubicin- und Doxorubicinol-Gehalt in manchen Organen etwas stärker, was die geringfügig schlechtere Hämodynamik erklären könnte. Um der kardioprotektiven Wirkung der ETAs zugrunde liegende molekulare Prozesse aufzuklären, wurden ausgewählte Gene und Proteine hinsichtlich ihrer Expression und Lokalisation im Myokard bzw. in Kardiomyozyten untersucht. Für das mitochondriale Protein ANT1, welches sowohl physiologische als auch pathophysiologische Effekte vermittelt, konnte auf Proteinebene eine verringerte Expression nach Doxorubicingabe ermittelt werden, während die ETAs die ANT-Expression wieder normalisierten bzw. erhöhten, was in der Literatur als kardioprotektiv beschrieben wird. Die ebenfalls kardioprotektiv wirksamen Kinasen Pim-1 und AKT1 zeigten eine gegensätzliche Regulation unter Doxorubicin. Der kardiale Gehalt an phosphorylierten AKT1 (pAKT1) wurde durch Doxorubicin signifikant vermindert und durch Bosentan sowie BQ-788 wieder auf das Kontrollniveau angehoben, was bei Sitaxentan nicht zu verzeichnen war. Demnach könnte AKT1 in die kardioprotektive Wirkung von Bosentan und BQ-788 involviert sein. Pim-1 L (44 kDa-Isoform) wurde durch Doxorubicin im murinen Myokard signifikant hoch reguliert, was durch Co-Medikation mit ETAs nahezu vollständig revertiert wurde und durch den Transkriptionsfaktor STAT3 vermittelt sein könnte. Auch die Lokalisation von Pim-1 unterlag in einem in vitro Kardiomyozyten-Modell (H9c2) einer Regulation durch Doxorubicin mit nukleärer Akkumulation der Kinase, was durch die ETAs in unterschiedlichem Ausmaß moduliert wurde. Die Pim-1-Regulation unter Doxorubicin-Gabe könnte dabei einen Schutzmechanismus der Zellen gegen die kardiotoxische Wirkung des Zytostatikums darstellen, welcher unter Co-Medikation mit ETAs nicht mehr nötig war, da diese die kardiale Pumpfunktion wieder herstellten. Zusätzliche in vitro Untersuchungen zur Viabilität von H9c2-Kardiomyozyten unter Doxorubicin, ETAs und Hemmung von AKT1 und Pim-1 bestätigten die in vivo Ergebnisse im Mausmodell jedoch nicht. Die vorliegende Arbeit bietet interessante Ansätze zur pharmakologischen Prävention der Doxorubicin-induzierten Kardiotoxizität. In einem in vivo murinen Kardiomyopathie-Modell konnte der therapeutische Nutzen von ETAs zur Prophylaxe einer Herzschädigung unter Doxorubicin deutlich herausgestellt sowie mögliche zugrunde liegende Mechanismen aufgeklärt werden. Damit bietet diese Arbeit vielversprechende Ansätze für weiterführende Untersuchungen zum Einsatz von ETAs als Kardioprotektiva.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Herstellungsverfahren der wässrig-fermentativen Frischpflanzenextraktion nach HAB, Vs. 33 und 34 sowie die dabei ablaufenden biochemischen und mikrobiologischen Reaktionen zu betrachten. Neben der Extraktion findet begleitend eine Fermentation statt und die daraus entstehende Urtinktur wird bis zur Weiterverarbeitung mindestens 6 Monate gelagert. Diese drei Prozessschritte -Extraktion, Fermentation, Lagerung- können Einfluss auf die Qualität der Urtinktur nehmen. Es sollte daher geklärt werden, welche bio- und phytochemischen Reaktionen bei der Herstellung und anschließenden Lagerung einer wässrig-fermentierten Urtinktur ablaufen und welche Mikroorganismen daran maßgeblich beteiligt sind.
In diesem Zusammenhang wurden Extrakte aus Atropa belladonna, blühendes Kraut hergestellt und durch Variation bestimmter Herstellungsparameter die Robustheit des Verfahrens überprüft.
Folgende Parameter wurden variiert:
Rezepturbestandteile:
· Honig und Lactose-Monohydrat
· Molke
· Starterkultur
· Asche
Herstellungsschritte:
· Erntezeitpunkt
· Waschen der Pflanze
· Mazerationstemperatur
· Zeitpunkt des Abpressens
· Sauerstoffzutritt
· Dauer der Reifezeit
Weiterhin erfolgte ein Vergleich zwischen diesem Extraktionsverfahren mit der verbreiteten ethanolischen Frischpflanzenextraktion. In den Jahren 2006-2009 wurden insgesamt 106 wässrig-fermentierte Urtinkturen und 4 ethanolische Auszüge hergestellt.
Da im Verlauf der Lagerung in einigen wässrig-fermentierten Urtinkturen Abnahmen des Atropingehaltes beobachtet wurden, wurde zur Klärung das Verhalten von Milchsäurebakterien in atropinhaltigen Lösungen untersucht.
Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigten, dass an der Fermentation in erster Linie Milchsäurebakterien beteiligt sind, die durch Zuckerabbau Milchsäure, daneben auch Acetat und Ethanol, bilden. Als verantwortliche Milchsäurebakterien konnten vor allem der homofermentative Lactobacillus plantarum und der heterofermentative Lactobacillus brevis isoliert und identifiziert werden. Hierbei war in der Hauptfermentationsphase eine Dominanz von Lactobacillus plantarum erkennbar. Die Kultivierung von Milchsäurebakterien in atropinhaltigen Lösungen zeigte, dass das Wachstums- und Fermentationsverhalten der gewünschten Milchsäurebakterien durch Atropin nicht negativ beeinflusst wird.
Bei dem betrachteten Herstellungsverfahren kann ein Verlust des Wirkstoffs Atropin unter Einhaltung einer ausreichenden Säuerung ausgeschlossen werden. Damit ist die wässrig-fermentative Urtinkturherstellung hinsichtlich der Atropinextraktion unter Einhaltung bestimmter Herstellungsregeln als ebenso effektiv und robust anzusehen wie die ethanolische Frischpflanzenextraktion. Unterschiedliche Gehalte zwischen ethanolischen und wässrig-fermentierten Extrakten ließen sich bei Scopoletin, Flavonoiden und einer im Rahmen der Arbeit nachgewiesenen Substanz X feststellen.
Das untersuchte Herstellungsverfahren führte in den meisten Fällen zu einem stabilen Extrakt, wobei sich Mikroflora und Fermentationsverläufe trotz Variation der Herstellungsparameter ähnelten. Auf Grund der Variabilität der mikrobiologischen Flora des Pflanzenmaterials unterliegt die Fermentation unter den Bedingungen des Homöopathischen Arzneibuchs allerdings natürlichen Schwankungen. Dies führte in einigen Fällen zu einer nicht spezifikationskonformen Urtinktur. Deswegen wurden für eine optimierte Herstellung die Zugabe einer Starterkultur, der Zusatz von Molke, eine durchgängige Mazeration bei 37 °C, eine flexible Anpassung des Kohlenhydratbedarfs, Sauerstoffausschluss während der Mazerationswoche, eine kürzere, für den Fermentationsverlauf individuelle Lagerungszeit und die Berücksichtigung des Wassergehaltes des Pflanzenmaterials empfohlen. Da die Ergebnisse der Arbeit mit den Untersuchungen anderer pflanzlicher Materialien Sauerkraut, Sauerteig, Silage) in Einklang stehen, ist davon auszugehen, dass diese Empfehlungen auch bei anderen Pflanzen die Herstellsicherheit erhöhen und zu einer reproduzierbaren Extraktqualität führen.
Eukaryotische Mikroalgen werden seit einigen Jahrzehnten hinsichtlich ihrer Eignung als Wirkstoffproduzenten intensiv untersucht, wobei bisher nur wenige potentiell nutzbare Verbindungen identifiziert wurden. Trotzdem lässt alleine die riesige Artenvielfalt die Vermutung zu, dass es Produzenten interessanter Sekundärstoffe geben muss. In den letzten Jahren zeigte sich außerdem, dass Mikroalgen Lieferanten von Wertstoffen, beispielsweise im Bereich der regenerativen Energien, sein können. Hier sind vor allem die hohen Kultivierungskosten und die geringe Produktausbeute noch zu überwindende Hürden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden 70 eukaryotische Mikroalgenstämme auf ihre Eignung als Produzenten neuartiger Wirk- und Wertstoffe untersucht. Außerdem wurde durch Variation der Kultivierungsbedingungen ermittelt, ob die Kultivierungskosten gesenkt und die Ausbeuten an relevanten Produkten aus Mikroalgen gesteigert werden können. Die untersuchten Mikroalgen stammten aus der Stammsammlung der Pharmazeutischen Biologie der Universität Greifswald, aus kommerziellen Stammsammlungen oder wurden aus Gewässerproben der Greifswalder Umgebung isoliert. Neue Isolate wurden mit molekulargenetischen Methoden identifiziert. Alle Mikroalgen wurden zunächst unter Standardbedingungen kultiviert, die Biomasse-Raum-Zeit-Ausbeute bestimmt und bewertet. Anschließend wurde die biochemische Zusammensetzung der Biomasse analysiert. Dazu wurden im Rahmen der Arbeit sechs Methoden zur Gesamtlipid-, Gesamtkohlenhydrat- und Gesamtproteingehaltsbestimmung sowie zur Analytik der Lipid- und Kohlenhydratzusammensetzung etabliert.
Die Algen zeigten bei Kultivierung unter Standardbedingungen Biomasseausbeuten bis 90 mg L-1 d-1. Die höchsten Wachstumsraten erreichten verschiedene Scenedesmus spp. Die biochemische Zusammensetzung der Algenbiomasse war sehr variabel. Häufig war jedoch der Proteinanteil mit ca. 50 % am höchsten, gefolgt von Kohlenhydraten mit etwa 30 % und einem Lipidanteil von ca. 10 %. Anhand der Modellalge Scenedesmus obtusiusculus konnte gezeigt werden, dass die Biomassezusammensetzung durch Variation der Kultivierungsbedingungen beeinflusst werden kann. So führten erhöhte Beleuchtung sowie Nitrat- und Eisenmangel zu vermehrter Lipid- und Kohlenhydratakkumulation. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde ein neues Kulturmedium entwickelt, in dem die Modellalge lipid- und kohlenhydratreiche Biomasse ohne Wachstumseinbußen im Vergleich zum Standardmedium produziert. Durch Verwendung natürlicher Wasserquellen als Basis für das Kulturmedium konnten darüber hinaus die Kultivierungskosten deutlich reduziert werden. Durch die gleichzeitige Steigerung der Produktausbeute und Senkung der Kultivierungskosten konnte gezeigt werden, dass auch eine großtechnische Produktion von Wertstoffen aus Mikroalgen wirtschaftlich sein kann.
Zur Bewertung des Potenzials der Mikroalgen als Produzenten von interessanten Sekundärstoffen wurde beispielhaft die antimikrobielle Aktivität von Extrakten der Algenbiomasse untersucht. Es zeigte sich, dass vor allem lipophile Extrakte gegen grampositive Bakterien wirksam waren, wofür wahrscheinlich die in den Extrakten nachgewiesenen mehrfach ungesättigten FS verantwortlich sind. Einige Mikroalgenarten wiesen zudem einen hohen Betaglucangehalt auf. Diesen Polysacchariden werden, wenn bestimmte Strukturvoraussetzungen erfüllt sind, diverse gesundheitsfördernde Effekte zugeschrieben. Durch Optimierung der Kultivierungsbedingungen konnten bei einigen Algenarten mit einem Gehalt von bis zu 35 % deutlich höhere Werte im Vergleich mit anderen betaglucanreichen Lebensmitteln wie Getreide (bis 10 %) oder Pilzen (bis 25 %) erreicht werden. Damit konnte gezeigt werden, dass Mikroalgen neben ihrer Eignung als Wertstoffproduzenten auch interessante Wirkstoffe liefern können.
Massebilanzdefizite
(2013)
Kapitel 1 beschreibt Untersuchungen zu der Fragestellung, ob Matrixalterung eine Ursache für Massebilanzdefizite sein kann. Diese Vermutung blieb bislang in der Literatur unberücksichtigt und wurde nun anhand einer breit angelegten Studie überprüft. Verschiedene Fertigarzneimittel und für die Studie entwickelte Formulierungen mit PCA und E2 wurden in Klimakammern und Trockenschränken gelagert, um unterschiedliche Alterungszustände der Formulierungsmatrices zu simulieren. In definierten Zeitabständen wurden Proben hinsichtlich der PCA- und E2-Wiederfindung analysiert. Ausgewählt wurden Formulierungen mit geringen Konzentrationen der Modellsubstanzen, da dies als worst-case angesehen wurde und auch die Anforderungen für die Aufklärung von Massebilanzdefiziten bei sehr gering dosierten Arzneimitteln stetig steigen. Im vorliegenden Fall konnte bei 67 % aller untersuchten Proben eine signifikante Änderung der Wiederfindung und somit eine potentielle Ursache für Massebilanzdefizite festgestellt werden. Tritt in der Praxis ein Massebilanzdefizit auf, das mithilfe der etablierten Lösungsansätze nicht aufzuklären ist, so ist die Überprüfung der Wiederfindung der betreffenden Substanz aus der gealterten Matrixstruktur sinnvoll und kann unter Umständen eine Optimierung und ggf. Revalidierung der analytischen Methode erforderlich machen. Ausgangsgedanke für Kapitel 2 war die Tatsache, dass die chromatographische Trennung eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte für die Aufstellung einer lückenlosen Massebilanz entscheidend ist. Die E2-Abbauprodukte delta6- und delta9,11-E2 konnten bislang im Rahmen von Stabilitätsstudien mit E2-Formulierungen nicht separat quantifiziert werden. Zum Teil wird in der Literatur delta6-E2 als Abbauprodukt, delta9,11-E2 jedoch mit dem Verweis auf sehr ähnliche Retentionszeiten lediglich als Syntheseverunreinigung angesehen, was im Gegensatz zu praktischen Erfahrungen und Untersuchungen von Vertretern der pharmazeutischen Industrie steht. Das Kapitel 2 beschreibt die Entwicklung einer chromatographischen Trennmethode für E2 und die Abbauprodukte 6alpha-E2, 6beta-E2, 6-Keto-E2, delta6-E2, beta-Equilenol und delta9,11-E2. Die Trennung aller Komponenten wurde mittels einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter der Verwendung einer pentafluorphenylierten Kieselgelphase realisiert. Praktische Anwendung konnte anhand des Marktproduktes Vagifem® gezeigt werden, für welches aufgrund der niedrigen Arzneistoffkonzentration und sehr komplexen Tablettenmatrix zunächst die Entwicklung einer geeigneten Probenvorbereitung durchgeführt wurde. Abschließend wurde die Methode hinsichtlich Selektivität, Sensitivität, Linearität, Präzision und Richtigkeit validiert. Kapitel 3 nimmt Bezug auf die Arzneimittelsicherheit von Fertigarzneimitteln unter analytischen Gesichtspunkten. Die Identität und der Verbleib eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte sind bei der Lagerung von Arzneimitteln nicht nur unter dem Aspekt der Massebilanz von Bedeutung. Entstehen während der Lagerung genotoxische Abbauprodukte, müssen diese in engen Grenzen überwacht werden. Diese Aspekte wurden anhand des Fertigarzneimittels Paludrine® (Arzneistoff Proguanil) verdeutlicht. Zunächst wurde der Übergang des genotoxischen Abbauproduktes PCA in die Gasphase während der Lagerung bei erhöhten Temperaturen überprüft. Simultan wurde der Anstieg von PCA sowie der Proguanilgehalt in den Tabletten bestimmt, um Rückschlüsse auf die Massebilanz zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass PCA unter den gewählten Bedingungen in der Gasphase über den Tabletten nachweisbar war. Der entsprechende Gehalt war jedoch in Relation zum PCA-Gehalt und Proguanilgehalt in den Tabletten vernachlässigbar gering. Ein Einfluss auf die Massebilanz konnte folglich ausgeschlossen werden. Für eine Massebilanz entscheidend sind weiterhin Kenntnisse über alle Abbauprodukte. Im Fall von Proguanil lieferte die Literatur Hinweise auf bislang unidentifizierte Abbauprodukte, für welche Strukturvorschläge erarbeitet wurden. Im Hinblick auf die Genotoxizität des Hauptabbauproduktes PCA, wurden auch für die neu vorgeschlagenen Strukturen erste toxikologische Bewertungen mittels DEREK, MCASE und Vitic erstellt. Abschließend wurde die Anwesenheit von allen Abbauprodukten in künstlich gealterten Tabletten überprüft.
Analysis of bioactive lipids from different infection models during bacterial and viral infections
(2021)
Bioactive lipids or lipid mediators influence numerous processes like the reproduction, the bone turnover, the pain perception, the cardiovascular function and the immune system. Eicosanoids and oxylipins are parts of the immunomodulatory lipid mediators, which can be synthesized from polyunsaturated fatty acids (PUFAs) by enzymatic and non-enzymatic reactions. Typical members of eicosanoids are prostaglandins and leukotrienes. The properties of bioactive lipids include the activation of inflammatory reactions as well as the support of resolution. Like hormones, they act locally restricted and in low concentrations. Further bioactive lipids exist i.e. intermediates of the sphingolipid class. The biosynthesis of some of these compounds like the prostaglandins can be influenced by different drugs whereas for other groups of lipid selective inhibitors are still missing. Their impact on inflammatory processes and against chronic diseases has already been analyzed, while studies in context with infection are largely limited. Infection of the upper respiratory tract caused by viral and bacterial pathogens constitute a huge burden for the human healthcare. The main pathogens are the Influenza A virus (IAV), Staphylococcus aureus (S. aureus), Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) and Streptococcus pyogenes (S. pyogenes). Besides mono-infection with one of these pathogens, frequently occurring bacto-viral co-infections exist, which negatively influence the etiopathology. The main task of the immune system is the detection and the elimination of pathogens, which can essentially be affected by lipid mediators. Their instability due to oxidizability, the existence of regioisomers and the low abundance of eicosanoids and other oxylipins are the main problems for their analytical measurement.
The mayor objective of this dissertation was the establishment of a suitable analytical method for selected lipid mediators and the detection of infection-related changes. The separation and detection was performed by using high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with triple quad mass spectrometry. This combination is called tandem mass spectrometry (MS/MS). The MS parameters were optimized for approximately 30 lipid mediators by use of chemical standards and the detection was achieved by dynamic multiple reaction monitoring (MRM). Furthermore, the spatial resolution of selected sphingolipids was analyzed in tissue samples using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging (MALDI-MS-Imaging). Concerning the HPLC-MS/MS detection, an MS method was established and optimized with standard compounds. Another crucial part of the establishment was the extraction of bioactive lipids from the different sampling materials. Whereas well tested protocols exist for the extraction and detection of lipid mediators, such protocols for MALDI-MS-Imaging are still limited due to the novelty of this measurement. Ultimately, robust and reproducible protocols for both techniques that were used for the analysis of a broad array of samples from infection experiments were established for both techniques. The analyses of infected cell culture, mice and pigs revealed infection-related perturbations of host lipid mediator levels. Depending on the scientific issue, the sample types cell pellets, lungs, spleens, livers, blood plasmas, pawns including bones or bronchoalveolar lavages were analyzed. For MALDI-MS-Imaging, the spatial distribution of sphingolipids in lung and spleen was detected.
The present dissertation includes four coherent research scopes, in which the pathogen impact on host-derived lipid mediators was detected with the above mentioned analytical methods. The infection models epithelial cells (article II), mouse (article III and IV) and pig (article I) – the latter as the most human like model - showed different aspects of the host-pathogen interaction. The analysis of samples from IAV infection for all three hosts revealed a couple of similarities for some oxylipins that were also described in human infections. Additionally, cell culture and mouse samples from mono-infections as well as co-infections with the pathogens S. aureus and S. pneumoniae were measured. In particular for the bacterial mono- and co-infections, these are the first published results with aspects of infection related changes of lipid mediators. The additional spatial resolution of the sphingolipid intermediates sphingosine 1-phosphate and ceramide 1-phosphate revealed important new insights into their tissue distribution and changes during co-infection.
Article I describes the IAV-specific oxylipin changes in the pig (german landrace) as infection model. Therefore, the sample types lung, spleen, blood plasma, and bronchoalveolar lavage from infected animals at different time points after infection were analyzed and compared with samples from uninfected pigs. Mainly in the lung and the spleen, increased amounts of certain lipid mediators were observed. These changes coincide well with already described alterations in humans and mice. Furthermore, the analysis of different sample material provided an overview about appropriate sample types. Surprisingly, many perturbations were detected in the spleen, which itself was uninfected. Based on the local reaction of lipid mediators, most studies concentrate on sample material with close contact to side of infection. Therefore, this dissertation reveals new insights into a form of systemic immune response. Besides the use of animals with a complex immune system for infection experiments, human bronchial epithelial cells (16HBE) were mono- and co-infected with the pathogens S. aureus, S. pneumoniae and IAV as described in article II. Such cells are the initial barrier for and first contact site with pathogens and thus the comprehension of this host-pathogen interaction is of essential importance. Most changes were detected during pneumococcal infection. Furthermore, the analyzed infections with bacterial pathogens differed from IAV infection by an increased synthesis of 5-hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE). For further infections with the above mentioned pathogens, the mouse was used as an infection model. Besides infections affecting the respiratory tract, also the impact of an S. pyogenes infection in different mice strains was analyzed and described in article III. Infection-related changes in prostaglandins, which are involved in bone turnover in swollen pawns as well as enhanced amounts of sepsis- and arthritis-associated lipid mediators were detected, in case arthritis had been induced prior to infection. Furthermore, increased amounts of 20-HETE could be observed for such severe infections. An enhanced biosynthesis of 20-HETE was further confirmed in a high-pathogenic S. aureus LUG2012 infection in article IV for all examined sample types. In this last article of this dissertation, bacterial and viral infections in mice were analyzed similar to those described in article II. Mainly IAV-specific lipid mediator alterations were detected, which are in accordance with the findings of the infected pigs. The additional MALDI-MS-Imaging measurements revealed so far unknown accumulation of ceramide 1-phosphate in lung and spleen as well as enrichment in the red pulp of the spleen.
In summary, this dissertation provides substantial lipid mediator profiles for infections in three different model systems with selected bacterial and viral pathogens. The obtained data constitute a suitable basis for continuative research projects, in which the influence of single bioactive lipids on the course of infection could be examined in more detail.
The investigation of complex molecular systems by molecular dynamics simulations has been successfully established and proven as a standard method during the last decades. The use of highly optimized algorithms and steadily increasing, generally available computing resources enables even larger and longer simulations. However, the dynamics of the system itself is not accelerated, and it can be trapped in low energy minima that can only be overcome slowly. A number of methods have therefore been developed to address this problem.
Within the context of this dissertation, a novel algorithm based on replica exchange was developed to solve problems with existing methods, which can now be used for large molecular systems with a low resource consumption. Parameter dependence was systematically evaluated and optimized to define guidelines for correct application. This algorithm was successfully applied to various pharmaceutical and biochemical problems, such as protein folding or protein-protein interactions.
Enzymes are well-known for being remarkably selective catalysts. They are often able to catalyse reactions for certain molecules while leaving other similar molecules completely unchanged. Nevertheless, many enzymes are capable of catalysing other reactions and/or transforming other substrates than their physiologically relevant activities. This phenomenon is referred to as enzyme promiscuity and it is thought to play an important role in the emergence of novel functions by providing a starting point for divergent evolution towards different enzymatic activities. It is important for enzymes to be selective to avoid harmful side-products and increase reaction efficiency, but often catalysts are not optimised beyond what is required for their function. Life profits from the cross-reactivity and enzyme promiscuity through accidental discovery of new helpful molecules and pathways, while using regulation to quickly adapt to changing circumstances.
Enzymes are grouped together with other similar proteins into structural families and superfamilies. Members of a structural family share significant structural elements and often have similar catalytic mechanisms. However, they often catalyse very different chemical reactions and accept a variety of different substrates. Promiscuous activities are common within superfamilies, where the primary function of one family member is often found as promiscuous activity in other family members. Together with the structural similarities, this prevalent cross-reactivity suggests a common evolutionary origin. One of the largest structural superfamilies is the α/β-hydrolase-fold family. Despite sharing a highly conserved core structure, this superfamily is catalytically diverse and spans several distinct enzyme classes including hydrolases, acyltransferases, oxidoreductases, lyases, and isomerases. Epoxide hydrolases and dehalogenases of the α/β-hydrolase-fold family even share the same Asp/Glu-His-Asp catalytic triad and form similar covalent alkyl-enzyme reaction intermediates, yet they are known for attacking either epoxides or C-X bonds with perfect chemoselectivity. Although promiscuity is often observed within the α/β-hydrolase fold family and despite their mechanistic similarities, no α/β-hydrolases were known that exhibit both epoxide hydrolase and dehalogenase activity simultaneously.
The versatility of the catalytic triads used by α/β-hydrolases makes these enzymes attractive targets for the conversion of catalytic activity through protein engineering. Several attempts were made to introduce dehalogenase activity in an epoxide hydrolase, and after several rounds of designing and screening different variants of the epoxide hydrolase PaeCIF from Pseudomonas aeruginosa, minor dehalogenase activity was detected for some of the variants. However, despite promising first results it proved extremely difficult to reliably reproduce the results, primarily due to expression problems and low sensitivity of the halide detection assays that were available at the time. Since the conversion proved to be more difficult than expected (unpublished data), it was decided to investigate other potential protein scaffolds.
Considering the prevalence of catalytic promiscuity among members of the α/β-hydrolase-fold superfamily, and the close relationship and catalytic similarities between epoxide hydrolases and dehalogenases, it seemed odd that no enzyme is known to have both epoxide hydrolase and dehalogenase activity. We argued that it is highly probable that a promiscuous epoxide hydrolase-dehalogenase enzyme exists, but it simply has not been found yet due to the absence of sensitive high-throughput halide assays and not screening the right set of enzymes. Although several established assays were available for the determination of dehalogenase activity, these assays suffer major drawbacks. For example, one of the most popular assays, the Iwasaki assay, is not very sensitive and uses extremely toxic chemicals, while pH assays like the phenol red assay are inherently unreliable and insensitive due to the low buffer concentrations employed107,114. Thus, a new assay for the screening of dehalogenase activity through the selective detection of halides was developed115. The halide oxidation assay provides a safer, more reliable, and most importantly, much more sensitive method to detect dehalogenase activity.
Using molecular phylogenetics, we studied the evolutionary relationship between epoxide hydrolases and dehalogenases to identify interesting extant epoxide hydrolases. Molecular phylogenetics uses a multiple sequence alignment of the amino acid or nucleotide sequences of extant enzymes to construct a phylogenetic tree. At first, we tried using a large dataset with almost 3,500 putative epoxide hydrolase and dehalogenase sequences, but we quickly realised the resulting phylogenetic tree was impractical. Most of the sequences in this large dataset were not characterised experimentally but annotated automatically based on their sequence similarity to a rather limited number of characterised sequences. Although automated annotations can be used as predictions for catalytic activity, they are often wrong. As we were particularly interested in the interface of both epoxide hydrolase and dehalogenase activities, we needed more certainty and a change in direction was necessary.
Instead of trying to filter the α/β-hydrolase fold database, experimentally characterised sequences were collected through literature research. This smaller dataset consisting of characterised sequences resulted in a phylogenetic tree containing 45 epoxide hydrolases, 30 haloalkane dehalogenases and 7 haloacetate dehalogenases from a variety of different organisms. Ancestral sequence reconstruction was attempted for several interesting nodes in this phylogenetic tree. By combining the multiple sequence alignment, the evolutionary relationships from the phylogenetic tree, and evolutionary models, a hypothetical sequence of the theoretical ancestor can be determined. Unfortunately, it was difficult to get good soluble protein expression with the ancestral sequences and despite our best efforts it was not possible to obtain reliable and reproducible screening results. Instead of trying to improve protein expression and purification protocols for the ancestral sequences, we decided to focus on screening extant sequences with the newly developed halide oxidation assay to find a promiscuous epoxide hydrolase-dehalogenase.
In addition to reconstructing ancestral sequences, eight extant epoxide hydrolases could be selected for screening towards dehalogenase activity and as promising potential engineering scaffolds from this phylogenetic tree. The eight selected epoxide hydrolases were screened for dehalogenase activity with several haloalkane substrates and the epoxide hydrolase CorEH from Corynebacterium sp. C12 was found to exhibit promiscuous dehalogenase activity. Interestingly, the measured concentrations of bromide for the initial hit with CorEH were only 150-250 nM, well below the lowest detection limit of 20 µM achievable in microtiter plate format with the Iwasaki assay. This means that the dehalogenase activity of CorEH would probably not have been detected were it not for the development of the sensitive halide oxidation assay.
CorEH is an epoxide hydrolase that can also catalyse the dehalogenation of haloalkanes, particularly bromoalkanes such as 1-bromobutane and 1-bromohexane. The dehalogenase activity of wild-type CorEH with 1-bromobutane (0.25 nmol·min-1·mg-1) is about 4,000-fold lower than the average activity of several natural dehalogenases with two halide-stabilising residues (1 μmol·min-1·mg-1) and approximately 400-fold lower compared to the dehalogenases with a single halide-stabilising residue. The crystal structure of CorEH was determined to 2.2 Å. Our structure-function studies suggest that the dehalogenase activity of CorEH probably stems from the presence of at least one halide-stabilising residue. Unfortunately, this could not be confirmed experimentally via mutagenesis as the W100A variant lost both the dehalogenase and epoxide hydrolase activity in equal measure, making it difficult to demonstrate that W100 is involved in halide stabilisation. The loss of both activities for variant W100A can possibly be explained by the secondary function of the tryptophan; removal of W100 might lead to the incorrect positioning of the catalytic nucleophile for the nucleophilic attack involved in both epoxide hydrolysis and dehalogenation. Nevertheless, computational modelling of Michaelis-Menten complexes, utilising the crystal structure of CorEH, supports the hypothesis that the tryptophan W100 is involved in halide stabilisation in CorEH. Based on docking studies, the epoxide ring-opening tyrosine is also close enough to form hydrogen bonds to stabilise the substrate. However, it is also possible that like several characterised haloalkane dehalogenases, CorEH only uses a single residue to stabilise the halide. Removal of the tryptophan at the primary halide-stabilising position resulted in the loss of both activities, likely due to the loss of its secondary function to properly position the catalytic nucleophile. Substitution of the uncommon tryptophan in the HGxP-motif with phenylalanine does not completely remove the dehalogenase activity. Nevertheless, it causes a significant drop in both haloalkane dehalogenase and epoxide hydrolase activities, indicating that this residue is important for catalysis or the structural integrity of CorEH.
Enzyme promiscuity plays an important role in enzyme evolution and the diversification of enzymes. Several researchers have attempted to interconvert epoxide hydrolase and dehalogenase activity, or to find an enzyme with both activities, without success. It would be hard to maintain the view that promiscuity is a fundamental property crucial to enzyme evolution if we could not observe promiscuity between two enzyme classes with such similar reaction mechanisms. Our findings show that dual epoxide hydrolase and dehalogenase activity can occur in one natural protein scaffold. We believe that we succeeded because we used a phylogenetic analysis of characterised sequences to select the right subset of epoxide hydrolases to investigate and due to the much more sensitive halide assays not available to those before us. The versatility of the catalytic triad in α/β-hydrolases combined with the variety of possible supporting residues found in both epoxide hydrolases and dehalogenases shows that catalytic mechanisms can be flexible. This flexibility allows space for diversification of catalytic residues without loss of function, giving rise to novel (promiscuous) functions and new cross-reactivities.
Die Verlängerung des Magenaufenthalts von oralen Arzneiformen steht seit mehr als 30 Jahren im Fokus internationaler Forschungsgruppen. Trotz der Vermarktung diverser Systeme gelang es bislang nicht, eine sichere und reproduzierbare Gastroretention von Arzneiformen zu realisieren. Dies würde jedoch enorme Möglichkeiten für die Therapie mit oral applizierten Arzneimitteln mit sich bringen. Die Reduktion der Einnahmefrequenz, das Vermeiden von Plasmaspiegelspitzen sowie die gesteigerte Patientenadhärenz sind nur einige der denkbaren Vorteile. Die größte Hürde gastroretentiver Systeme ist dabei die Motilität des menschlichen Magens. Starke Kontraktionswellen sind für eine rasche Entleerung insbesondere unter Nüchternbedingungen verantwortlich. Daneben kommt es zu höchsten Belastungen auf Arzneiformen, was wiederum die Wirkstofffreisetzung beschleunigen kann, mit drastischen Folgen für den Patienten. In der präklinischen Testung neu entwickelter Systeme fehlt häufig der Bezug zur Physiologie des Magens und die Vorhersagekraft von Freisetzungstests ist dementsprechend gering. Ziel der Arbeit war daher die Charakterisierung der relevanten Parameter im Magen im Rahmen einer Humanstudie. Die aus dieser Humanstudie gewonnenen Daten zu pH-Werten, Temperaturen und insbesondere Drücken im Magen sollten anschließend genutzt werden, um die im Arbeitskreis verfügbaren, biorelevanten Freisetzungsmodelle weiterzuentwickeln. Abschließend sollten verschiedene, kommerziell erhältliche gastroretentive Arzneiformen unter Berücksichtigung der Magenphysiologie auf ihr Freisetzungsverhalten getestet werden. Die Ergebnisse der Humanstudie zeigten die enorme Abhängigkeit der Magenaufenthaltszeit einer telemetrischen Kapsel vom prandialen Status der Probanden. Nach Einnahme der Standardmahlzeit, wie sie in klinischen Studien zu Nahrungsmitteleffekten Verwendung findet, kam es zu Magentransitzeiten von über 20 h. Dagegen wurde die Kapsel unter Nüchternbedingungen spätestens nach 2,7 h aus dem Magen entleert. Die intragastralen Drücke nach postprandialer Einnahme der Kapsel betrugen mindestens 240 mbar und waren aufgrund des verlängerten Magenaufenthalts deutlich zahlreicher im Vergleich zur Nüchterneinnahme. Die Ergebnisse der In vitro-Untersuchungen zeigten, dass die herkömmlich verwendeten Freisetzungstestgeräte nicht in der Lage sind, biorelevante Belastungen auf eine telemetrische Kapsel auszuüben. Maximale Drücke von 14 mbar waren im eintauchenden Zylinder zu beobachten, welche wir jedoch auf den hydrostatischen Druck beim Eintauchen zurückführen konnten. Im Gegensatz dazu waren wir mit Hilfe unserer neuartigen In vitro-Freisetzungsmodelle in der Lage, vollständige Druckprofile nachzustellen, wie sie auch in vivo beobachtbar waren. Die Freisetzungsuntersuchungen der gastroretentiven Präparate Glumetza® 1000 und Madopar® Depot unter biorelevanten Bedingungen offenbarten die extreme Drucksensitivität dieser Systeme. Hierfür definierten wir auf Basis der In vivo-Daten drei realistische Druckprofile und stellten diese in vitro nach. Früh auftretende, leichte Belastungen während der Freisetzungstests führten bei der flotierenden Arzneiform Madopar® Depot bereits zur vollständigen Wirkstofffreisetzung. Glumetza® 1000 schien abhängig vom Quellungszustand auf die Belastungen zu reagieren, wobei spätestens stärkere Belastungen nach 6 h zur vollständigen Freisetzung des Wirkstoffs führten. Auf Basis dieser Ergebnisse ist anzuzweifeln, dass die bislang erhältlichen gastroretentiven Systeme über einen längeren Zeitraum im Magen intakt bleiben und kontrolliert ihren Wirkstoff freisetzen. Daneben können die entwickelten Testmethoden dazu genutzt werden, um die Entwicklung neuartiger gastroretentiver Systeme voranzutreiben.
In dieser Arbeit wurden systematisch mehrdimensionale chromatographische Systeme unter Verwendung von Alkyl-, Calixaren- und Resorcinarenphasen untersucht. Deren Analyse bildet einen grundlegenden Schritt on-line gekoppelte Trennungen in der HPLC schneller und effektiver planen und optimieren zu können. Neue Ergebnisse über den Einfluss der Säulenschaltsysteme auf die Retention der Analyten wurden dargestellt. Sowohl Erkenntnisse über die Retentionsmechanismen während der Schaltung als auch mathematische Modelle zur Beschreibung der Retention auf der sekundären stationären Phase wurden ermittelt. Um eine umfassende Betrachtung zu gewährleisten, wurden 43 Analyten verschiedener Struktur (unpolare, polare, ionische Analyten chemischer Leitstruktur sowie pharmazeutisch genutzte Stoffe) verwendet. Mit diesen Analyten erfolgten zunächst eindimensionale Analysen, um anschließend den exakten Einfluss der Säulenschaltungen zu ermitteln. Die Ergebnisse wurden unter Berücksichtigung bestehender Retentionsmodelle interpretiert. Dabei zeigten sich Unterschiede zwischen konventionellen alkylgebundenen und neuartigen calixarengebundenen stationären Phasen. Erweiterungen und Präzisierungen der bestehenden Modelle wurden vorgeschlagen. Diese vertiefen das Verständnis der Retentionsmechanismen in der RPLC.
In this thesis an artificial enzyme cascade consisting of an ADH from Lactobacillus kefir, a CHMO from Acinetobacter sp. NCIMB 9871 and lipase A from Candida antarctica has been investigated for the biocatalytic synthesis of the bulk chemical ε-caprolactone as well as several derivatives for their direct utilization as polymer building blocks. Due to major limitations, which hamper such a biocatalytic route, the first addressed demand in this work was the improvement of the stability of the CHMO. By structure-guided engineering, distinctively improved variants concerning the resistance against oxidation as well as temperature stability without compromising the catalytic activity were successfully created. Due to the incomplete knowledge of the mechanisms that lead to thermal and/or oxidative inactivation of enzymes, this study illustrates that the selection of mutations for increased protein stability is still hard to predict. Thus, these results can serve as a basis for further stability studies on this enzyme class to give better insights into the underlying mechanisms, which determine the stability of an enzyme. Such a highly stabilized biocatalyst will pave the way for the successful use of flavin-dependent enzymes for industrial applications. A further aim of this thesis was dedicated to the second major hurdle en route to polyester precursors represented by the product inhibition and enzyme deactivation caused by ε-caprolactone, particularly at higher concentrations. To overcome this limitation, we developed an elegant solution in which the ε-caprolactone produced by the one-pot two-step enzymatic method is directly subjected to ring-opening polymerization using the unique lipase A from Candida antarctica. Applying this enzyme cascade in a whole cell biocatalysis in combination with an improved cofactor regeneration approach, the problem of product inhibition problem was efficiently solved leading to the formation of oligo-ε-caprolactone at more than 20 g/L when starting from 200 mM cyclohexanol. By a process development approach through solvent engineering it was found that biotransformations proceed much faster in an isooctane-containing biphasic solvent system when using free enzymes. Finally, the improved enzyme cascade was applied for the synthesis of chiral substrates and provided access to functionalized chiral compounds in high yields (up to >99%) and optical purities (up to >99%ee). By subsequent enzymatic enantioselective ring-opening of the enantiopure monomers, oligomeric lactones were successfully synthesized, which can be directly serve as building blocks for the polymer industry.
Kardioprotektive Wirkung von Antagonisten am Mineralokortikoidrezeptor nach akutem Myokardinfarkt
(2013)
Der akute Myokardinfarkt ist eine der häufigsten Todesursachen in den Industrienationen. Dieser entsteht überwiegend durch artherosklerotische oder entzündliche Veränderungen der Herzkranzgefäße, welche zu einem thrombotischen Verschluss einer oder mehrerer Koronararterien und damit zu plötzlicher Unterbrechung der Blutversorgung, der sogenannten Ischämie, führen. Um die entstehende Herzmuskelschädigung möglichst klein zu halten, ist die schnelle Wiedereröffnung des Koronargefäßes notwendig. Heute ist bekannt, dass diese gewünschte Reperfusion aber auch irreversible Herzschäden verursachen kann. Mit dem Verfahren der ischämischen Postkonditionierung durch kurze Intervalle der Ischämie und Reperfusion nach Wiederöffnung des Koronargefäßes kann die Infarktgröße deutlich gesenkt werden. Für den klinischen Einsatz ist dieses Verfahren jedoch technisch zu aufwändig, sodass der Wunsch nach pharmakologischen Interventionen, die ein hohes Potenzial zur Reduktion der Myokardschädigung nach einem Infarkt bieten, steigt. Aus diesem Grund besteht ein großes Interesse daran, neue Therapien zu entwickeln, ihre kardioprotektiven Signalwege zu erforschen und in den klinischen Alltag einzubringen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich daher mit der Untersuchung der kardioprotektiven Wirkung der Mineralokortikoidrezeptor-Antagonisten (MR-Antagonisten) Eplerenon und Canrenoat sowie der Charakterisierung wichtiger Elemente der Signalkaskade. Hierfür wurde in dem Modell der isolierten Rattenherzen die kardioprotektive Wirkung dieser MR-Antagonisten während der Reperfusion und die mögliche Beteiligung bekannter Elemente der Signalkaskade für Prä- und Postkonditionierung untersucht. Des Weiteren wurde ein in situ Mausmodell etabliert, um die Infarktgrößen im Gesamtorganismus zu bestimmen. Zur Charakterisierung der Rolle der Adenosinrezeptoren wurden CD73-/-- und A2bAR-/--Mäuse verwendet. Die CD73-/--Mäuse können durch die fehlende 5-Ektonukleotidase (CD73) kein endogenes Adenosin bilden, welches ein wichtiger Mediator für den Myokardschutz ist. Dagegen wurde bei den A2bAR-/--Mäusen der Adenosin-A2b-Rezeptor deletiert, welcher bei der Reperfusion eine Schlüsselrolle spielt. In einem in situ Kaninchenmodell haben weitere Untersuchungen des Canrenoats stattgefunden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Eplerenon während der Reperfusion die Infarktgröße nach einem Myokardinfarkt signifikant reduziert und dass dieser Schutzmechanismus von PKC, PI3-Kinase und den weiteren Kinasen Akt und ERK 1/2 abhängig ist. Weiterhin konnte sowohl bei der Infarktgrößenbestimmung in isolierten Rattenherzen als auch im in situ Mausmodell, in den CD73-/--Mäusen, die Beteiligung des Adenosins bei dem durch Eplerenon vermittelten Myokardschutz nachgewiesen werden. Mit Hilfe des in situ Mausmodells konnte gezeigt werden, dass Canrenoat ebenfalls eine Myokard schützende Wirkung zeigt. Dabei wurde die maximale Reduktion der Infarktgröße mit einer Konzentration von 1 mg/kg erreicht, wenn das Canrenoat 5 min vor Beginn der Reperfusion injiziert wurde. Anhand der Untersuchungen an den CD73-/-- und A2bAR-/--Mäusen konnte gezeigt werden, dass das extrazelluläre Adenosin und der Adenosin-A2b-Rezeptor für den durch Canrenoat vermittelten Myokardschutz essenziell sind. Canrenoat hat sich im in situ Kaninchenmodell ebenfalls als kardioprotektiv erwiesen und zeigte keine Veränderungen der hämodynamischen Parameter. In dem Modell der isolierten Rattenherzen konnte die kardioprotektive Wirkung des Canreonats erneut bestätigt werden und der Schutzmechanismus war von den Kinasen Akt und ERK 1/2 abhängig. Die beiden MR-Antagonisten haben die Fähigkeit, die negative Wirkung von Aldosteron zu unterbinden und damit die Infarktgröße nach einem akuten Myokardinfarkt zu senken. Die Untersuchungen zeigten, dass erst mit einer höheren Aldosteron-Konzentration die kardioprotektive Wirkung dieser MR-Antagonisten aufgehoben und die Phosphorylierung der Akt- und ERK 1/2-Kinase reduziert werden konnte. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse liefern neue Ansätze für pharmakologische Interventionen zur Behandlung des akuten Myokardinfarktes.
The aim of this thesis was to validate a method called OSCARR for One-pot, Simple Cassette Randomization and Recombination for focused directed evolution, which had been developed by Dr. Hidalgo. It is based upon the megaprimer PCR method using outer primers differing in TM and including asymmetric cycles before the addition of the forward primer to generate more mutated megaprimer. As mutation-carrying primers, spiked oligonucleotides are employed. These spiked oligonucleotides are designed using an algorithm and have strictly defined composition of nucleotides at each position. An OSCARR library of the Pseudomonas fluorescens esterase I (PFE I) of approximately 8000 clones was generated and screened for altered chain-length selectivity. Two mutants with higher activity towards medium chain length p-nitrophenyl esters were identified, both carried the mutation F126I, which causes the substrate entrance tunnel to be widened, thus facilitating access of bulkier substrates to the active site. One mutant carried the additional mutation G120S which completes a catalytic tetrad which is observed mainly in proteases. F126I had a stronger influence on chain-length specificity, so the further amino acids which form the “bottleneck” to the active site were mutated to further widen the entrance, and mutants with improved activity were found. The bottleneck mutants which consist of single, double, triple and quadruple mutants which are mostly combinations of F126L, F144L, F159L and I225L were then assayed for altered enantioselectivity against chiral acids and secondary alcohols. For substrates 1-phenyl-1-propyl acetate (2), 1-phenyl-2-propyl acetate (3) and 1-phenyl ethyl acetate (4), mutants with increased enantioselectivity were found. I225L plays a crucial role, as it is vital for enantioselectivity against 3, but destroys selectivity against 2, both facts obvious from the comparison of the triple mutant without I225L (mutant T3) and the corresponding quadruple mutant including I225L (mutant Q). However, the single mutant I225L alone does not possess high selectivity against 3, so synergistic effects play an important role. The PFE I wild type already possesses a good enantioselectivity in the hydrolysis of 4, but all mutants which were analyzed in detail surpass the wild type. The program YASARA was then used to calculate docking solutions for both enantiomers of 2 and 3 into the wild type and the best mutant. The results revealed that the mutants’ widened bottleneck allows the phenyl moiety of the substrates to point towards the access tunnel, while only (R)-2 does so in the wild type. Residues 126 and 144 do not come very close to the substrate and are more likely to influence substrate diffusion. Another goal was to find a way to confer promiscuous amidase activity upon the PFE I. In the search for structural homologues, a close structural neighbour with amidase activity was found. The --lactamase from Aureobacterium sp. was named after its activity toward the Vince lactam 2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-one. Biocatalysis experiments with the PFE I and its mutants revealed an excellent enantioselectivity against the ( )-lactam. Specific activities were determined for purified proteins, and the activity of some mutants was within the same order of magnitude as lactamase’s activity.
Das MRP4 ist ein Mitglied der ABCC-Subfamilie der ATP-binding cassette transporters. Es transportiert eine große Vielfalt an endogenen und xenobiotischen Verbindungen aus der Zelle. Des Weiteren vermittelt MRP4 den Transport von Signalmolekülen wie z.B. zyklische Nukleotide. Das einzigartige Substratspektrum, die Regulation und die zelluläre Lokalisation des MRP4 stehen in Verbindung mit seiner möglichen Funktion beim Zell-Schutz und dem zellulären Signaling. MRP4 ist abhängig vom Zelltyp entweder in der basolateralen (Prostata, Leber) oder apikalen (Nieren, Kapillaren des Gehirns) Membran von polarisierten Zellen lokalisiert. Des Weiteren wird MRP4 auch in Thrombozyten und Erythrozyten exprimiert. Protein-Protein-Interaktionen können die Funktion, Lokalisation und Expression von Transportern in der Plasmamembran beeinflussen. Viele Interaktionen beinhalten die stabile Assoziation von Proteinen innerhalb von Multi-Untereinheitskomplexen sowie die vorübergehende Assoziation von regulatorischen Proteinen. MRP4 weist u.a. ein sogenanntes PDZ-Bindemotiv auf, welches durch die Aminosäuren ETAL charakterisiert wird und die Interaktion mit PDZ-Adaptorproteinen vermitteln kann. Speziell in Thrombozyten ist MRP4 neben der Plasmamembran auch in den δ-Granula lokalisiert. Hier könnten interagierende Proteine eine wichtige Rolle spielen. Änderungen in diesen Proteinen könnten eine Ursache für Störungen der Thrombozytenfunktion mit einer Fehllokalisation von MRP4 sein. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung möglicher Interaktionspartner von MRP4, insbesondere in Thrombozyten. Dafür wurde ein Fusionsprotein aus einem c-terminalen Fragment (117 Aminosäuren) des MRP4 mit der Glutathion-S-Transferase (GST) generiert. Nach Aufreinigung des Fusionsproteins (GST-MRP4) mittels Glutathion-Sepharose wurden pull-down-Experimente mit Thrombozytenlysat durchgeführt. Mittels Western Blot und LC-MS/MS-Analyse konnten als mögliche Interaktionspartner das EBP50/NHERF1, das PSD95, SNX27, die β-Untereinheit des AP3B1 und das HSP90 identifiziert werden. Durch indirekte Immunfluoreszenz konnte außerdem eine partielle Ko-Lokalisation der genannten möglichen Interaktionspartner und MRP4 in den Thrombozyten dargestellt werden. Ein weiterer Ansatz zur Untersuchung der Protein-Interaktion war die Ko-Präzipitation des MRP4 und der daran gebundenen Proteine mittels eines anti-MRP4-Antikörpers, der an magnetische beads gebunden war. Mithilfe der Ko-Immunpräzipitation konnten SNX27, HSP90, AP3B1, EBP50 und PSD95 unterschiedlich stark ko-präzipitiert werden. Es wurde untersucht, inwiefern das PDZ-Bindemotiv des MRP4 für die Interaktion der detektierten Interaktionsproteine essentiell ist. Dafür wurde ein GST-MRP4-Konstrukt ohne das C-terminale PDZ-Motiv generiert. Damit konnte gezeigt werden, dass das PDZ-Bindemotiv nur für die Interaktion mit SNX27, EBP50 und PSD95 notwendig ist, während die Bindung von AP3B1 und HSP90 unabhängig davon erfolgte. Nachdem auf Proteinebene mit verschiedenen Versuchen dargestellt werden konnte, welche Adaptorproteine mit dem MRP4 interagieren, sollte im letzten Abschnitt auf funktioneller Ebene gezeigt werden, inwiefern sich die Lokalisation des MRP4 verändert, sofern das Bindemotiv des MRP4 nicht mehr vorhanden ist bzw. die Adaptorproteine herunterreguliert werden. In Bezug auf das Herunterregulieren der Adaptorproteine wurde die megakaryoblastische Leukämie-Zelllinie M07e als Modell für Thrombozyten-Vorläuferzellen verwendet. Des Weiteren lag das Interesse bei den Interaktionsproteinen AP3, PSD95 und SNX27. Nach Transfektion der M07e-Zellen mit der entsprechenden siRNA und der sich anschließenden Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass die Ko-Lokalisation des MRP4 mit den Adaptorproteinen nach knock-down verringert und die Plasmamembran-Lokalisation von MRP4 signifikant gesteigert war. Umgekehrt sollte die Überexpression dieser Adaptorproteine die Plasmamembran-Lokalisation verringern. Dies wurde exemplarisch für SNX27 in MDCK-Zellen untersucht. Dabei sollte auch nochmals die Rolle des PDZ-Bindungsmotivs für die MRP4-Lokalisation gezeigt werden. Dafür wurden die Fluoreszenz-markierten Fusionsproteine CFP-MRP4, SNX27-YFP und das CFP-MRP4(-PDZ) synthetisiert, in MDCK-Zellen transfiziert und ihre Lokalisation mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Es zeigte sich, dass nach Ko-Transfektion des CFP-MRP4 mit SNX27-YFP das MRP4 hauptsächlich im Zell-Inneren lokalisiert war. Außerdem wurde verdeutlicht, dass das PDZ-Bindemotiv für die Internalisierung des MRP4 in das Innere der Zelle durch das Interaktionsprotein SNX27 essentiell ist. Zusammenfassend liefert diese Arbeit wichtige grundlegende Erkenntnisse zu möglichen Protein-Interaktionen von MRP4 und deren Einfluss auf die Lokalisation des Transporters. Deren mögliche physiologische und pathophysiologische Rolle für die MRP4-Funktion in Thrombozyten sollte in weiterführenden Studien näher untersucht werden.
Es wurden vier Nukleosid-Analoga hergestellt, deren Anwendungsbereiche gänzlich unterschiedlicher Natur sind. Sie stellen wichtige Hilfsmittel zur Erweiterung der Eigenschaften und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Voraussetzungen für die Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms geschaffen. Es wurde ein Assay für die in-vitro-Selektion vorgestellt und das zu diesem Zweck notwendige Schlüsselmolekül, ein Cytidin-Derivat, designt und mit einer Gesamtausbeute von 8 % synthetisiert. Das Nukleosid wurde in einer 16-stufigen Synthese mit zwei unterschiedlichen Linkereinheiten funktionalisiert und stellt ein effektives Werkzeug zur Selektion von Cytidindesaminase-Ribozymen dar. Das bifunktionalisierte Cytidin-Substrat wurde über seine 5’-OH Gruppe mit einem Hexaethylenglykol-Linker versehen, der eine primäre Aminogruppe aufwies. Über eine kurze Linkereinheit an der C4-Position der Nukleobase wurde ein Biotinrest angefügt. Die angestrebte Selektionsstrategie sieht die Oxidation des 3’-Endes einer RNA-Bibliothek mittels Natriumperiodat vor. Das resultierende Dialdehyd soll anschließend mit der primären Aminogruppe des Cytidin-Derivats umgesetzt werden. Ein Protokoll zur Anbindung des synthetisierten Cytidins an eine an ihrem 3’-Terminus oxidierte RNA wurde entwickelt und steht für die zukünftige Selektion zur Verfügung. Der Nachweis des Konjugats aus RNA und dem Cytidin-Derivat erfolgte mittels HPLC, sowie massenspektrometrisch. Die RNA-Bibliothek zur Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms wurde ausgehend von zwei Klenow-Primern hergestellt und steht ebenfalls bereit. Parallel zu den Arbeiten der Synthese des Cytidins, wurden im Rahmen zweier Kooperationen drei weitere Nukleosid-Analoga dargestellt. Das erste Kooperationsprojekt sah die Herstellung einer kurzen RNA vor. Es handelte sich dabei um die hochmodifizierte Anticodonschleife der tRNA(Lys) aus E. coli. Zur chemischen Festphasensynthese dieser 17mer RNA waren die Phosphoramiditbausteine von N6-Threonylcarbamoyladenosin (t6A) und 2-Thiouridin (s2U) erforderlich. Die Synthesen der Nukleosid-Analoga t6A und s2U, sowie deren Umwandlungen in die jeweiligen Phosphoramidite wurden vorgestellt. Die Darstellung von s2U erfolgte nach Protokollen von Vorbrüggen und Strehlke mit einer Gesamtausbeute von 78 %.Während des Schutzes der 2’-OH Gruppe mit TBDMS, bildete sich hauptsächlich das 3’-O-TBDMS-Isomer, das sich nur sehr schwer vom 2’-O-TBDMS-Isomer separieren ließ. Durch Verwendung der Schutzgruppe Di-tert-butylsilandiylditriflat zur Synthese des s2U-Phosphoramidits konnte das Problem der Bildung des 3’-O-TBDMS-Isomers behoben werden. Die erste Synthese eines t6A-Derivats orientierte sich an Vorschriften von Davis et al. und lieferte das Produkt mit einer Gesamtausbeute von 25 % über 7 Schritte. Darüber hinaus wurde eine zweite Synthesestrategie entworfen, die auf der Verwendung eines Isocyanats von L-Threonin basierte. Die Aminosäure Threonin wurde mit zwei verschiedenen Silylschutzgruppen versehen, die beide kompatibel mit der Phosphoramiditchemie während der chemischen RNA-Synthese waren. Das Isocyanat wurde mit guten Ausbeuten dargestellt und anschließend sowohl mit ungeschütztem, als auch mit geschütztem Adenosin zur Reaktion gebracht. In beiden Fällen wurde ein t6A-Derivat erhalten. Die Umsetzung mit einem geschützten Adenosin lieferte das t6A-Derivat mit einer Gesamtausbeute von 20% über 8 Stufen. Es wurde somit eine – in Bezug auf Ausbeute und Arbeitsaufwand – gleichwertige Alternativsynthese zur Darstellung von t6A-Derivaten entwickelt. Aus den beiden modifizierten Nukleosiden s2U und t6A wurden die Phosphoramidit-Bausteine generiert. Durch den erfolgreichen Einbau beider Nukleoside in eine 17mer RNA konnte die Anticodon-Schleife der tRNALys hergestellt werden. Die Bearbeitung des zweiten Kooperationsthemas erforderte die Herstellung eines isotopenmarkierten Pseudouridins. Es wurde eine vergleichende Synthese von 15N- markiertem Pseudouridin durch Adaption zweier unterschiedlicher Protokolle durchgeführt. Die erste Strategie, eine 7-stufige Synthese, lieferte die Zielverbindung mit einer Ausbeute von 2% über alle Schritte ausgehend von D-Ribose. Bezogen auf den 15N-Harnstoff betrug die Gesamtausbeute 14 %. Grund für die geringe Gesamtausbeute war eine unvermeidliche Isomerisierung der beta-Form der D-Ribose zum nicht reagierenden alpha-Anomer während der Lacton-Bildung, sowie der geringe Umsatz während der Reaktion mit dem 15N-angereicherten Harnstoff. Die zweite Strategie gab das 15N-markierte Pseudouridin mit einer Gesamtausbeute von 9 % über 9 Schritte. Für die Synthese von Uracil wurde eine alternative Vorschrift verwendet, bei der Propinsäure mit Harnstoff umgesetzt wurde. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass auf karzinogene Lösungsmittel, sowie anderer Reagenzien ohne Ausbeuteverluste verzichtet werden konnte.
Indoloquinoline derivatives are very interesting compounds for pharmaceutical applications because of their broad spectrum of biological activity. However, phenyl-substituted indoloquinolines suffer from solubility problems in aqueous solution and require the synthesis of better soluble derivatives for their effective application. Therefore, the indoloquinoline derivatives were covalently attached to two different types of cationic aminoalkyl linkers. After having successfully established the synthesis and subsequent purification of the novel derivatives that could be isolated in excellent yields, these ligands were characterized in this thesis with regard to their spectral properties in different environments and their sequence specific binding to different types of nucleic acids with a variety of spectroscopic methods.
Pyrrolobenzodiazepines (PBDs) are a group of antitumor antibiotics that exert their biological activity by alkylation of guanine bases within the minor groove of double-stranded DNA through nucleophilic attack of the guanine amino group on the PBD imine functionality. In trying to increase both the binding strength and sequence selectivity for further enhancing their biological activity, PBDs were linked to additional DNA binding moieties. Preliminary DNA melting experiments partly also performed in our lab with a series of closely related PBD-naphthalimide and benzimidazole conjugates revealed extraordinary DNA-binding capability of hybrids PBD-NIM and PBD-BIMZ. These studies also indicated the favorable contribution of the piperazine structure on drug binding to the DNA duplex. Previously, in vitro cytotoxicity studies also showed promising antitumor activity of both compounds with PBD-BIMZ having the largest cytotoxic potential among various examined conjugates. In the present work, the kinetics, thermodynamics and structural details of the drug-DNA interactions have been determined employing a variety of spectroscopic, calorimetric and computational methods. Thus, a high thermal duplex stabilization upon DNA binding could be ascertained for both drugs and attributed to their covalent attachment to the DNA guanine bases. The 1:1 binding stoichiometry as well as the exclusive minor groove binding for the benzimidazole and the mixed minor grove - intercalative type of binding for the naphthalimide hybrid could be verified by several spectroscopic methods including NMR spectroscopy. Furthermore, by using a combination of solution NMR and some of the most recent molecular modeling techniques, the first high-resolution structures of DNA-drug complexes with PBD hybrid drugs could be obtained giving detailed insight into the specific drug-DNA interactions. Thus, details on van der Waals and hydrogen bond contacts within the complex and the tight fit of the benzimidazole hybrid into the DNA minor groove could be revealed. By using recent data analysis techniques like clustering algorithms, the high flexibility of the piperazine moiety within the PBD-BIMZ-DNA complex could be nicely captured and visualized. Additionally, a thermodynamic analysis for the non-covalent drug binding by UV and fluorescence spectroscopy as well as by direct calorimetric methods revealed a 1:1 binding mode driven by enthalpy changes and counteracted by unfavorable entropic contributions to result in moderately strong association constants. Analysis of the solvent-accessible surface area confirmed the importance of hydrophobic effects on drug binding and the combination of these data with ITC measurements allowed for an extensive thermodynamic characterization of the drug binding process. With respect to the influence of the individual drug moieties on DNA binding, the importance of the piperazine ring for drug-DNA interactions and the basis for its capability to enhance drug binding were addressed. Furthermore, it could be shown that the naphthalimide and benzimidazole moieties also impart additional sequence selectivity to the alkylating PBD structural unit and these distinct differences in the sequence selectivity could be linked to the three-dimensional structures of the DNA-drug complexes. Clearly, the combination of detailed structural and thermodynamic data of complex formation allows for a better understanding of the binding mechanism and structure-activity relationship when it comes to drug-DNA interactions. Therefore, the information gathered can assist in the design of more efficient derivatives of this type of alkylating DNA binding drugs in particular and of DNA recognition by ligands composed of several motifs in general.
Discovery of novel Baeyer-Villiger monooxygenases and their application in organic synthesis.
(2009)
The application of BVMOs in kinetic resolution is a versatile alternative for the synthesis of optically pure esters. Within this thesis BVMOs proved to be highly active against a broad range of linear and aryl aliphatic ketones yielding a variety of enantiopure products. Among the beta-hydroxy ketones several CHMOs and BVMOPsfl showed the best results (E > 100), whereas the application of the latter enzyme also allowed access to the abnormal esters (regioisomeric excess > 40%). Interestingly, some enzymes showed a reduced activity and selectivity with a growing chain length of the ketone, suggesting that middle-chain ketones (C8-C10) might be preferred. Moreover, the production of optically pure 1,2-diols was observed (yields 8-50%), resulting from an in vivo hydrolysis of the 2-hydroxy alkyl acetates. Regarding the N-protected beta-amino ketones, results were different. While the majority of CHMOs catalyzed linear substrates showing high enantioselectivities (for CHMOBrevi1 and CHMOBrachy E > 100, c = 40-50%), BVMOPsfl did not convert nitrogen bearing linear ketones, although this might also be justified with the methylcarbamate protecting group. Interestingly, the number of BVMOs catalyzing oxidation of spatially more demanding linear branched beta-amino ketones was greatly reduced, indicating steric hindrance that was also combined with a decrease in selectivity. Similar to the observation for beta-hydroxy ketones, also the 2 amino alkyl acetates hydrolyzed furnishing 2-amino alcohols (yields 9-52%). Moreover, hydrolysis of the “abnormal“ esters allowed an alternative access to valuable native and non-native β-amino acids. In a two step process, using CDMO from R. ruber and CAL-B, it was possible to generate N-protected (+)-beta-leucine. During kinetic resolutions of aryl aliphatic ketones it was observed that the highest enantio¬selectivities could be achieved utilizing HAPMOJD1, HAPMOACB and PAMO, enzymes typically preferring aromatic substrates. Biotransformation with 3-phenyl-2-butanone revealed an E-value > 100 for HAPMOJD1 (S-selective). Nevertheless, also BVMOPsfl converted this sub¬strate (E = 43), and also CHMOAcineto and CPMO oxidized it, although selectivity was rather low (E < 5). Interestingly, BVMOKT2440 was the only examined enzyme showing R selectivity (E = 13). Additionally, increasing the scale and performing biotransformation in a baffled flask could increase enantioselectivity of BVMOPsfl from E = 43 to 82. The discovery of novel enzymes with diverse properties is still a main goal of the biotechnological industry. Within these studies, two BVMOs (BVMOKT2440 and HAPMOJD1) could be successfully amplified from genomic DNA using different PCR-methods. Then, expression in E. coli was optimized, revealing that the reduction of expression temperature, implementation of E. coli JM109 or RosettaTM (DE3), possessing the pRARE plasmid to facilitate translation of rare codons in the latter case, and/or co-expression of chaperones (pGro7: GroEL/ES-familiy) could increase the amount of soluble and active protein. Both enzymes were subjected to biocatalysis and it was found that BVMOKT2440 preferentially oxidized linear ketones, while HAPMOJD1 dominantly converted aryl aliphatic ketones. The latter enzyme could be purified by anion exchange and affinity chromatography allowing examination of kinetic parameters. Thereby, HAPMOJD1 displayed lowest KM-values for acetophenone derivatives bearing their substituent in para-position (KM < 320 µM). Moreover, also aldehydes and heteroaromatic compounds were oxidized and also sulfoxidation was observed. Interestingly it was found, that both BVMO genes are located in the direct neighborhood of a dehydrogenase and a hydrolase. This led to the suggestion that these enzymes may be metabolically connected in the degradation of their natural substrate.
In der Arzneimitteltherapie nehmen parenteral zu applizierende Arzneimittel einen immer größer werdenden Stellenwert ein. Diese Entwicklung beruht vor allem auf der steigenden Anzahl von Peptiden und Proteinen als Wirkstoffe, deren perorale Applikation aufgrund unzureichender Resorptionsraten aus dem Gastrointestinaltrakt unmöglich ist, aber auch auf der Möglichkeit Depotformulierungen anzuwenden, die Wirkstoffe nach subkutaner oder intramuskulärer Injektion über einen langen Zeitraum freisetzen können. Dennoch sind Arzneimitteltransportwege nach subkutaner oder intramuskulärer Applikation im Detail weitestgehend unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus auf die intramuskuläre Applikation gelegt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine tierexperimentelle Studie an Ratten durchgeführt, die es zum Ziel hatte, ausgewählte physiologische Einflussparameter auf die Wirkstoffresorption nach intramuskulärer Injektion zu untersuchen. Die Tiere erhielten sowohl wässrige Lösungen als auch ölige Suspensionen von Paracetamol, Prednisolon und Diclofenac-Natrium in die rechte Oberschenkelmuskulatur und das jeweilige Placebo in den Muskel des linken Oberschenkels. Anschließend wurde das intramuskuläre Arzneistoffdepot erstmals mittels Magnetresonanztomographie (MRT) als bildgebendes Verfahren zeitabhängig untersucht und parallel die Anflutungskinetik der Wirkstoffe ins Blut bestimmt. Die Volumina und Oberflächen der Depots sowie die Zeit bis zu deren Abtransport aus dem Muskelgewebe wurden mit den Blutspiegelkurven verglichen. Allen Formulierungen war gemein, dass der Wirkstoff deutlich schneller resorbiert wurde als das Depot. Daraus lässt sich schließen, dass die Wirkstoffaufnahme nicht über die Resorption des Depots erfolgte. Ein schnelleres Verschwinden der Depots führte nicht zu höheren Blutspiegelmaxima oder zu einer beschleunigten systemischen Wirkstoffresorption. Es wurde keine Korrelation zwischen dem Volumen und der Oberfläche der Depots und den Blutspiegelkurven gefunden. Ein weiterer Aspekt, der während der durchgeführten Studie näher untersucht wurde, ist die Möglichkeit, mit Hilfe der MRT lokale Reaktionen in Folge der Injektion zu detektieren. Bei Diclofenac-Natrium wurde in allen Fällen eine Ansammlung interstitieller Flüssigkeit am Ort der Injektion beobachtet. Histopathologische Untersuchungen des Muskelgewebes konnten einen Zusammenhang zwischen der Größe des visualisierten Ödems und dem Ausmaß der Entzündung belegen. Im zweiten Teil dieser Arbeit galt es, mit den gewonnenen In vivo-Daten möglichst biorelevante Methoden für Freisetzungstests intramuskulärer Arzneiformen zu entwickeln. Dabei sollte sowohl die Simulation der Durchblutung des Muskelgewebes Berücksichtigung finden als auch die Simulation des Muskelgewebes oder der Depots im Muskelgewebe. Es wurden verschiedene Versuchsaufbauten entwickelt, adaptiert und modifiziert. Darunter zählen Gel-Schaum-Blöcke in der Durchflusszelle, die Keramikmembran und der Membranadapter in der Durchflusszelle. Während die Simulation der Durchblutung und der injizierten Depots in allen Testmethoden möglich war, konnte das Muskelgewebe nicht befriedigend nachgebildet werden. Die Anwendung verschiedener Freisetzungstest-Methoden hatte auf die Verteilung der Wirkstoffe aus den wässrigen Lösungen keinen nennenswerten Einfluss. Der größte Einfluss auf die Verteilungsgeschwindigkeit wurde bei der öligen Suspension von Prednisolon beobachtet. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte nicht abschließend geklärt werden, welche Parameter der Situation in vivo entscheidend für das Anflutungsverhalten der Wirkstoffe nach intramuskulärer Injektion sind. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Kombination aus pharmakokinetischen Untersuchungen mit MRT-Bildgebung eine vielversprechende Möglichkeit darstellt, Einblicke in die Biopharmazie intramuskulärer Depots zu erhalten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung der MRT zur Feststellung der lokalen Verträglichkeit, vor allem neu entwickelter Arzneiformen, eine sehr gut geeignete nicht-invasive Methode darstellt. Die Ergebnisse der In vitro-Untersuchungen verdeutlichen, dass die Freisetzungstestmethode vor allem bei langsam freisetzenden Arzneiformen einen erheblichen Einfluss ausüben kann. Eine universelle Testmethode, mit der zuverlässig das In vivo-Freisetzungsverhalten nach intramuskulärer Injektion vorhergesagt werden kann, ist derzeit nicht verfügbar. Die entwickelten Modelle stellen einen ersten Schritt zur Entwicklung biorelevanter Freisetzungstestmethoden für intramuskulär applizierte Darreichungsformen dar. Zur Verbesserung dieser Modelle sind ein umfassenderes Verständnis der Arzneimittelverteilungs- und -Transportmechanismen notwendig und weitere Studien, die bildgebende Verfahren mit der pharmakokinetischen Analyse kombinieren, wünschenswert.
Cyanobakterien sind eine vielversprechende Quelle an strukturell diversen und biologisch hochaktiven Naturstoffen für die Entwicklung neuer Wirkstoffe. Bislang konnte die Strukturklasse der [7.7]Paracyclophane nur in fädigen Cyanobakterien der Gattungen Nostoc und Cylindrospermum nachgewiesen werden. Vorangegangene Arbeiten zeigten, dass gerade die Carbamidocyclophane chemisch und biologisch interessante Verbindungen darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vor allem die Carbamidocyclophane produzierenden Cyanobakterien Nostoc sp. CAVN2 und Nostoc sp. CAVN10 unter besonderer Berücksichtigung der strukturellen Vielfalt an biosynthetisierten Metaboliten sowie deren antimikrobieller Aktivität umfassend charakterisiert. Um das biosynthetische Potenzial auf der metabolischen Ebene zu untersuchen, wurde im Vorfeld eine spezifische [7.7]Paracyclophan-Analytik etabliert, die skalierbare Methoden für alle Aufarbeitungsschritte beinhaltet. Die Optimierung endete in einem validierten sowie arbeits- und zeitsparenden einstufigen Extraktions- und Aufreinigungsverfahren mittels eines Zweiphasensystems und anschließender LC-UV-Analyse, um biologische Proben reproduzierbar zu analysieren und enthaltene Carbamidocyclophane zu quantifizieren. Kultivierungsstudien zum Einfluss der Temperatur an metabolisch aktiven und defizienten Nostoc-sp.-CAVN10-Kulturen ergaben einen direkten Zusammenhang zwischen der Biomassezunahme und der Temperaturerhöhung. Im Gegensatz dazu zeigten die einzelnen Carbamidocyclophan-Gehalte ein eher differenzierteres Bild über die verschiedenen Wachstumsphasen und Temperaturen hinweg. Da nur eine geringe Korrelation zwischen der spezifischen Wachstumsrate und der spezifischen Carbamidocyclophan-Produktionsrate ermittelt werden konnte, ist eine Relevanz dieser Verbindungen für den primären Zellstoffwechsel nicht ersichtlich. Bei Kultivierungsexperimenten an Nostoc sp. CAVN2 hatte der Zusatz von Chlorid- oder Bromid-Ionen eine drastische Erhöhung der Basalrate und Strukturdiversität der [7.7]Paracyclophane zur Folge. Das gleichzeitige Vorhandensein beider Halogenide im Medium zeigte kompetitive Effekte, wobei Chlorid als Substrat für den Halogenierungsprozess favorisiert wurde. Mit Hilfe eigens entwickelter Kultivierungsprozedere und Separierungsstrategien konnten insgesamt 25 Verbindungen aus Stamm CAVN2 isoliert und strukturell aufgeklärt werden. Dabei bilden die Carbamidocyclophane H–U neue chlorierte, bromierte und nicht halogenierte Naturstoffe. Zusätzlich konnten aus Stamm Cylindrospermum stagnale PCC 7417 neben den bekannten Cylindrocyclophanen A, B und D die drei neuen Cylindrofridine A–C erhalten werden. Diese stellen den Cylindrocyclophanen strukturell eng verwandte lineare Mono- und Dialkylresorcinole dar. Die vergleichende Evaluierung der Bioaktivität von 30 Reinsubstanzen ergab, dass viele Verbindungen sehr starke antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien zeigen – besonders gegen Antibiotika-resistente Kokken mit minimalen Hemmkonzentrationen von oftmals deutlich unter 1 µM. Dabei bedingten die verschiedenen Substituenten (Carbamoyl- und Acetoxy-Reste sowie Hydroxygruppen oder Halogene) z.T. signifikante Aktivitätsunterschiede. Die Zytotoxizität der [7.7]Paracyclophane ist vor allem an das Vorhandensein des Makrozyklus gebunden, da lineare Derivate (Cylindrofridine B/C) kaum biologisch aktiv waren. Eine Ausnahme stellt dabei das nicht zytotoxische, aber antimikrobiell aktive Cylindrocyclophan-D-Monomer Cylindrofridin A dar. Die phylogenetische Analyse der 16S-rDNA-Daten bestätigte die morphologisch-taxonomische Identifizierung der Stämme CAVN2 und CAVN10 als Cyanobakterien der Gattung Nostoc und ergab weiterhin, dass alle Carbamido- und Cylindrocyclophane produzierenden Nostoc-Stämme Bestandteil einer monophyletischen Gruppe sind, die phylogenetisch distinkt zu anderen [7.7]Paracyclophan-Produzenten ist. Des Weiteren konnten keine Nukleotidunterschiede zwischen Stamm CAVN2 und CAVN10 auf den untersuchten Markergen-Sequenzen festgestellt werden, was beide auf der phylogenetischen Ebene als identisch erscheinen lässt und sie somit nur metabolisch aufgrund der strukturellen Diversität und Quantität an [7.7]Paracyclophanen differenzierbar sind. Mit Hilfe von molekulargenetischen Analyseverfahren und bioinformatorischer Auswertung konnte in Stamm CAVN2 das Carbamidocyclophan-Biosynthesegencluster mit einer Gesamtgröße von ca. 26,9 kbp identifiziert werden. Dieses beinhaltet 13 offene Leserahmen (cabA-cabM), wobei das Gen cabL für eine putative Carbamoyltransferase codiert. Ein neuer Halogenase-Typ in Verbindung mit einer Tandem-ACP-Domänen-Struktur in der Typ I Polyketidsynthase CabD könnte für die Ausbildung halogenierter Derivate verantwortlich sein. Der Nachweis eines codierenden Bereichs mit Rieske-Domäne (cabM) lässt eine direkte oxidative intermolekulare Makrozyklisierung bei der Assemblierung vermuten.
Um zukünftige Untersuchungen des im bekannten chemical space unterrepräsentierten Strukturmotivs 3,4-disubstituierter bzw. 3,4-verbrückter 1H-Indol-Derivate zu ermöglichen sollte im Zuge der praktischen Arbeiten, welche dieser Dissertation zugrunde liegen, eine Reihe bisher nicht literaturbekannter Verbindungen dieser Substanzklasse, auch unter Verwendung von Multikomponentenreaktionen, dargestellt und charakterisiert werden. Weitere Untersuchungen zur Derivatisierung und Modifikation des Strukturmotivs sollten durchgeführt werden und im Idealfall zu einem weiteren Ringschluss an den tricyclischen Substraten führen. Relevante Verbindungen sollten anschließend in einer Reihe von (internationalen) Screening-Kampagnen und bei Kooperationspartnern hinterlegt werden, um langfristig eine nähere Charakterisierung ihrer physikochemischen und pharmakologischen Eigenschaften zu erreichen, welche gegebenenfalls zur weiteren Optimierung des Strukturmotivs für spezifischere Anwendungen führen kann.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen drei Substanzbibliotheken verschiedener Grundkörper darzustellen und zu charakterisieren. Dabei handelt es sich um 13 Derivate der cyclischen Bisamide vom 5-Oxo-1,3,4,5-tetrahydropyrrolo[4,3,2-gh]isochinolin-3-carboxamid-Typ, welche sich durch Ugi-MCR aus einem geeigneten bifunktionellen Reagenz, sowie verschiedenen primären Aminen und Isocyaniden in Anlehnung an die Arbeiten von Mironov et al. synthetisieren ließen. Weiterhin konnten, ausgehend von den tricyclischen Verbindungen vom 2-Methyl-5-oxo-1,3,4,5-tetrahydrobenzo[cd]indol-3-carbonsäure- und 2-Methyl-1,3,4,5-tetrahydrobenzo[cd]indol-3-carbonsäure-Typ, welche nach einer modifizierten Vorschrift nach Böshagen et al. erhalten werden konnten, zwei weitere Substanzbibliotheken mit 33 bzw. 24 individuellen Amid-Derivaten hergestellt werden. Dabei konnte durch Verwendung geeigneter Substrate nach der Amidkupplung die Freilegung eine basischen funktionellen Gruppe in einigen Verbindungen erreicht werden, welche die Bildung eines Hydrochlorid-Salzes ermöglichte und dadurch die Wasserlöslichkeit der neuen Verbindungen deutlich zu erhöhen vermag.
Auch gelang durch Einsatz des ökologisch äußerst vorteilhaften Lösungsmittels Dihydrolevoglucosenon die Entwicklung einer „grüneren“ Vorschrift zur Synthese dieser Substanzen, welche auf den Einsatz des, aus ökologischen und gesundheitlichen Gründen kritisch zu hinterfragenden, Lösungsmittels N,N-Dimethylformamid verzichtet.
Die Untersuchungen zur weiteren strukturellen Modifikation der erhaltenen 3,4-verbrückten 1HIndol- Derivate verlief nicht mit dem erhofften Erfolg, da viele Untersuchungen zu dieser Thematik unter anderem mittels Diels-Alder-Reaktion und Olefin-Metathese nicht zu isolierbaren Produkten führten. Allerdings konnte durch Diamin-vermittelte Ringschlussreaktion von 3-Formyl-1H-indol- 4-carbonsäuremethylester letztlich eine Synthesevorschrift zur Darstellung tetracyclischer Derivate erhalten werden. Die aus diesen Versuchen hervorgegangene Verbindung konnte ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit zur Kristallisation gebracht und am Institut für Biochemie der Universität Greifswald im Arbeitskreis für Synthetische und Strukturelle Biochemie röntgendiffraktometrisch untersucht werden, was zur Bestätigung der angenommenen Konstitution führte.
Erste Evaluationen der biologischen Aktivität der dargestellten Verbindungen konnten bereits im Arbeitskreis Pharmazeutische Bioanalytik der Universität Greifswald vorgenommen werden: Dabei wurden die relevanten Verbindungen mittels MTT-Assay auf eventuelle Zytotoxizität hin untersucht. Die Ergebnisse legen nahe, dass von den meisten untersuchten Verbindungen keine Zytotoxizität ausgeht, wobei dies allerdings, aufgrund der Limitationen des MTT-Assay im Bezug auf diese Aussage, in weiteren Untersuchungen abschließend geklärt werden sollte. Weiterhin konnte für einige der synthetisierten Verbindungen eine Inhibition der Arachidonat-5-Lipoxygenase (5-LOX) mit IC50-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich in vitro nachgewiesen werden. Der genaue Mechanismus der Inhibition, ebenso wie eine eventuell vorhandene Selektivität gegenüber anderen Arachidonat-Lipoxygenasen soll Gegenstand zukünftiger Untersuchungen, unter anderem am isolierten Enzym 5-LOX und in Homogenaten, sein. Darüber hinaus konnte ein großer Teil der synthetisierten Verbindungen im Molekülarchiv „Compound Platform“ (ComPlat) des Karlsruhe Institut für Technologie (KIT) hinterlegt werden, wo sie einer Vielzahl von potentiellen Kooperationspartnern zur Verfügung stehen. Erste Ergebnisse einer solchen Kooperation mit der Arbeitsgruppe Prof. Dr. Fahrer der Technischen Universität Kaiserslautern sollen zeitnah in einer gemeinsamen Publikation veröffentlicht werden. DesWeiteren konnten 40 Verbindungen in der „Testing4Ag“-Kampagne des Unternehmens Bayer Crop Science untergebracht werden, wo ihre Wirkung auf ein breites Spektrum von Schädlingen, Pilzen und Unkräutern evaluiert werden soll. Die Ergebnisse dieser Testungen stehen zum Zeitpunkt der Niederschrift dieser Arbeit noch aus. Eine Hinterlegung von 40 Substanzen in der EU-OPENSCREEN-Plattform, einer non-profit-Abteilung des European Research Infrastructure Consortium (ERIC) wird vorbereitet.
Die at-line Expressionsanalyse von Bioprozess-relevanten Markergenen auf der Grundlage von elektrischen Biochip-Verfahren ist eine viel versprechende Strategie für eine prozessbegleitende Beurteilung der Zellphysiologie des Produktionswirtes. Eine derartige direkte Methode für die Bestimmung des physiologischen Status würde zu einer umfassenderen Überwachung und Kontrolle von industriellen Fermentationsprozessen beitragen. Die Expressionsanalyse der Markergene mit den verwendeten elektrischen Biochips beruht auf dem Nachweis der entsprechenden mRNA über eine Sandwich-Hybridisierung und der elektrochemischen Detektion der Hybride. Hierbei sind sowohl Bead-basierte als auch Array-basierte Formate möglich. Der Bead-basierte mRNA-Nachweis nutzt paramagnetische Partikel (Beads) für die Immobilisierung von Gen-spezifischen Fängersonden. Während der Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den Beads gebunden. Gleichzeitig hybridisiert eine Detektionssonde in einem anderen Bereich der mRNA und ermöglicht so die Markierung mit einem Enzym. Dieses setzt para-Aminophenol (pAP) frei, das an den Elektroden des Biochips über zyklische Oxidations- und Reduktionsprozesse (Redox-Recycling) amperometrisch detektiert wird. Der resultierende elektrische Strom dient als Maß für die mRNA-Menge in der Probe. Die Array-basierte mRNA-Detektion nutzt elektrische Biochips mit 16 individuell auslesbaren Elektrodenpositionen. In diesem Format werden die Fängersonden direkt auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Durch die Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den jeweiligen Elektrodenpositionen gebunden. Die Detektion erfolgt positionsspezifisch über das Enzym-kontrollierte Redox-Recycling von pAP. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag vor allem auf der Verkürzung, Optimierung und Automation der Bead-basierten mRNA-Detektion. Durch erste Optimierungen einzelner Protokollschritte der Bead-basierten Sandwich-Hybridisierung konnte eine Verkürzung des Protokolls von ursprünglich 4 h auf unter 3 h erzielt werden. Der Übergang zu einer Sandwich-Hybridisierung in Lösung führte vor allem zu einer verbesserten Handhabbarkeit und Reproduzierbarkeit des Protokolls. Die Neuanordnung der Sondenbindestellen auf der Ziel-mRNA und die Einführung einer zweiten Detektionssonde resultierten in signifikanten Steigerungen der Hybridisierungssignale. Dies ermöglichte eine Verkürzung der Detektionszeit auf ca. 75 min. Durch weitere Optimierungen einzelner Aspekte des Protokolls konnte schließlich eine mRNA-Detektionszeit von ca. 45 min realisiert werden. Somit wurde das Protokoll für die Bead-basierte mRNA-Detektion mit dem elektrischen Biochip, ausgehend von isolierter Gesamt-RNA, von ursprünglich 4 h auf 45 min verkürzt. Gleichzeitig konnte die Sensitivität des Protokolls um das etwa Fünffache gesteigert werden. Die Automatisierung mithilfe eines Pipettierroboters erlaubte eine parallele Bearbeitung und die automatische, sequentielle Detektion von 8 Proben innerhalb von ca. 1 h. Weiterhin wurde die Array-basierte mRNA-Detektion etabliert und teilweise optimiert. Dies ermöglichte eine parallele, elektrochemische Detektion von derzeit 4 verschiedenen mRNAs in einer Probe isolierter Gesamt-RNA innerhalb von 20 min. Allerdings sind vor der automatischen Messung noch zusätzliche Schritte für die manuelle Bearbeitung der RNA-Proben (ca. 25 min) erforderlich. Die Anwendbarkeit der entwickelten Protokolle wurde jeweils am Beispiel von ausgewählten Markergenen des industriell bedeutsamen Wirtes Bacillus licheniformis getestet. Die mithilfe der elektrischen Biochip gemessenen Expressionsprofile der Markergene korrelierten mit den mittels real-time RT-PCR bestimmten mRNA-Mengen. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Grundlage für eine Bioprozess-begleitende mRNA-Analytik, basierend auf elektrischen Biochips, geschaffen werden.
The widespread use of natural and synthetic estrogens or chemicals with estrogenic activities is causing an increasing accumulation of estrogenic compounds in the environment. Already at very low concentrations these estrogenics can severely affect the wildlife, particularly in an aquatic environment. For these reasons measuring devices for detecting estrogen contaminations are in great demand. The majority of the analytical methods and bioassays on the market so far, lack semi-online adaptability, and usually cannot be used for automatic and continuous determination. Therefore, we have embarked on the development of new systems, which are able to fulfil those demands. The EstraMonitor combines recombinant A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK yeast cells as the microbial component with an amperometric detection method to analyze estrogenic contaminations. A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK was constructed by Kaiser et al. (2010). These cells were engineered to co-express the human estrogen receptor (hERa) gene and the inducible phytase (phyK, derived from Klebsiella sp. ASR1) reporter gene under control of a promoter with estrogen response elements (EREs). In the presence of estrogenic substances, such as 17ß -estradiol (E2), the phyK gene is expressed and recombinant phytase is secreted into the media. The level of phytase is quantified by amperometric detection using substrate p-aminophenyl phosphate (p-APP). Phytase dephosphorylates p-aminophenyl phosphate (p-APP) into an intermediate product p-aminophenol (p-AP). p-AP is electroactive and oxidized at the electrode. This generates electrons and produces a current which is proportional to the level of phytase activity. Since phytase activity is directly correlated to the E2 concentration, the estrogenic activity can thus be calculated from the current measured. The microbial component of the EstraMonitor, the non-immobilized A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK, works well with the amperometric method in a quantitative manner. The optimal applied potential determined for amperometric measurements was 150 mV and provided a low background signal for the amperometric detection. The half maximal effective concentration (EC50) and limit of detection (LoD) values for E2 obtained from amperometric measurements with the EstraMonitor were 69.9 ng L-1 and 44.5 ng L-1, respectively. The measuring procedure of the EstraMonitor system including incubation of A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK cells with E2, subsequently incubation with electrochemical substrate (p-APP), and signal recordation is completed within only 4 h and 10 min. Out of this total time, amperometric detection including substrate incubation and signals recordation takes only 10 min out of total time. The use of immobilized cells for a microbial biosensor is an essential advantage of the EstraMonitor system because it allows easy-handiness next to long-term stability and reusability. Immobilized A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK cells revealed excellent properties which make them very suitable for semi-online, automatic and continuous monitoring. They were stable up to 30 days when stored at 4 °C. Furthermore, they could be reused up to 15 times. The EC50 and LoD values achieved for E2 using immobilized cells in combination with amperometric detection were 20.9 and 8.3 ng L-1, respectively. Furthermore, this application also removes the need to separate cells by centrifugation, to sterilize the samples as well as to cultivate repeatly. Additionally, both immobilized and non-immobilized A. adeninivorans G1212/YRC102-hERa-phyK cells remain fully functional in a wide range of untreated wastewater samples and in environments containing up to 5% NaCl. To enhance the sensitivity and reduce the time for estrogenic determination, an alternative A. adeninivorans G1214/YRC103-hERa-phyK strain was developed. This strain can produce a detectable amount of phytase within 2 h after induction with E2. It offers an improved microbial component in terms of sensitivity and time-effectiveness. In addition, to reduce the cost for estrogenic detection an alternative substrate, ascorbic acid 2-phosphate (AA2P), was tested. AA2P, which is both cheap and widely available, performed better than p-APP. The EC50 and LoD values for E2 obtained with AA2P were 15.69 and 0.92 ng L-1 versus 20.09 and 8.3 ng L-1 when examined with p-APP, respectively. Taken together, the EstraMonitor is an automated system with respect to sample cycling, sample measuring and calibration supplemented with an alarm function. This system makes it possible to control estrogenic activity semi-online, automatically and continuously. These are advantages of the EstraMonitor compared to other estrogenic detection systems. It can thus be concluded that, the EstraMonitor is a powerful and feasible semi-online device for monitoring estrogenic activity especially adapted for the use in sewage treatment plants.
Das Hairpin-Ribozym-basierte System CRZ-2 wurde verwendet, um Selbst-Prozessierungsprodukte nach Ribozym-Reaktion zu untersuchen. Inter- und intramolekulare Ribozym-Reaktionen sollten mit CRZ-2 und dem entsprechenden linearen 83mer (l-83mer) durchgeführt und Oligomere und zyklisierte RNAs nachgewiesen werden. Über die Bildung der intermediären Spaltprodukte und des finalen Spaltproduktes konnte der Ablauf der Spalt-Kaskade komplett gezeigt werden. Dies war insbesondere durch vergleichende Verwendung von Test-Systemen im denaturierenden Polyacrylamid-Gel möglich, da eines der Systeme eine eindeutige Separation der Produkte im Gel zulässt. Weiter konnten die zwei erwarteten Spalt-Produkte (83mer und 92mer) über Sequenzierung ihrer komplementären DNAs nachgewiesen werden. Um zwischen zyklischen und linearen Reaktionsprodukten unterscheiden zu können, wurden folgende Methoden herangezogen: i) 2D-PAGE ii) exonukleolytischer Abbau von RNA in Lösung und im Gel, iii) Vergleich des Laufverhaltens eines inaktiven RNA-Monomers mit dem Reaktionsgemisch des l-83mer nach Ligationsreaktion, iv) AFM und v) Ferguson-Plot. Es zeigte sich, dass das CRZ-2 nach Ribozym-Reaktion ausschließlich lineare Produkte und Oligomere bis zum Trimer hervorbringt, während das l-83mer nach Ligationsreaktion auch einen Ring, das zyklische 83mer, hervorbringt. Das Wissen um die Art der Reaktionsprodukte von CRZ-2 und dem l-83mer ermöglichten es, diese beiden RNAs als Referenz-Systeme zu benutzen, um Hairpin-Ribozym-basierte Varianten zu untersuchen. Die bioinformatische Entwicklung neuer Varianten erfolgte in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Ivo Hofacker (Universität Wien). Dabei wurde ein wahrscheinlichkeitsbasierter Entwurf (probability based design, kurz: PBD) für RNA-Sekundärstrukturen mittels Programm Switch.pl aus dem Vienna RNA package 2.0 verwendet. Die für die katalytische Aktivität der Hairpin-Ribozym-Varianten essentiellen Basenfolgen in den Loops wurden beibehalten. Alle Test-Systeme waren bistabil, denn sie zeigten indirekt, das die für CRZ-2 übliche Spalt-Kaskade durchlaufen wurde, indem das jeweilige zyklische 83mer über 2D-PAGE nachgewiesen wurde. Wie erwartet, waren die Varianten insgesamt aktiver als das Referenzsystem CRZ-2 und sie unterschieden sich, wie bioinformatisch charakterisiert, in ihrem Zirkularisationsverhalten bezüglich der Monomere. Bioinformatisch unerwartet war das Zyklisierungsverhalten der Dimere. Ausschließlich bei Test-System 4 könnten gemäß 2D-PAGE und AFM Analyse unter anderem auch dimere RNA-Ring entstanden sein. PBD4 ist das System, bei welchem die geringste Dimer-Zyklisierungstendenz angenommen wurde. Eine erste Evaluierung der PBD-Methode ergibt somit, dass die Erwartungen für die bioinformatische Charakterisierung des Ablaufs der Spalt-Kaskade bis zur Monomerzyklisierung erfüllt wurden. Für die bioinformatisch nicht vorausgesagten experimentellen Ergebnisse, z.B. bei der Dimerzyklisierung, könnten verstärkt tertiäre Interaktionen relevant sein, die mit der PBD-Methode zur Sekundärstrukturvorhersage nicht berücksichtigt werden. Sequenz-Alignments der Test-Systeme zu CRZ-2 ließen Rückschlüsse auf die Funktionen einzelner Basen zu. Vier Basen traten zusätzlich zu den vorgegebenen Sequenzen auf. Diese befinden sich in einer Helix und könnten kritisch für das Zustandekommen dieser Helix als wichtiges Strukturelement im bistabilen Ribozym sein. Dieser Aspekt könnte in weiterführenden Arbeiten mit rationalem Design z.B. über Einfach- oder Doppelmutation weiter untersucht und die Auswirkungen auf die Selbst-Prozessierungsereignisse analysiert werden. Interessant sind auch die eingeführten Mutationen im superstabilen Tetraloop der Hairpin-Ribozym-Varianten. Im Sequenz-Alignment zeigte sich, dass sich PBD3 und 4 nur um zwei sich im Tetraloop befindlichen Basen unterscheiden (Positionen 1 und 3). Da sich die beiden Systeme bezüglich ihrer Oligomerisierungs- und Zyklisierungstendenz unterscheiden, sind diese beiden Positionen für die Funktionen essentiell.
Der gesamte Zellmetabolismus besteht aus einem effektiven System an Enzymkaskaden, um das Leben zu ermöglichen. Hier werden Stoffe ohne Abtrennung oder Aufarbeitung über verschiedene Intermediate selektiv zum Produkt umgesetzt. Die Ersparnis an Zeit, Kosten und Abfall durch den Wegfall von Reinigungen der Zwischenprodukte und der direkte Umsatz von toxischen oder instabilen Intermediaten zum Produkt machen Kaskadenreaktionen zu einem aktuellen und interessanten Anwendungsbereich der Biotechnologie. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte erfolgreich eine in vivo Enzymkaskade aus drei Oxidoreduktasen etabliert, untersucht und mit Fusionsproteinen verbessert werden. Zur Etablierung der in vivo Enzymkaskade aus Alkoholdehydrogenase, Enoatreduktase und Baeyer-Villiger-Monooxygenase im Rahmen eines DFG-Projekts (Bo1862/6-1) in Zusammenarbeit mit der Technischen Universität Wien wurde zunächst nach den geeigneten Enzyme gesucht. Mit einer Alkoholdehydrogenase aus Laktobacillus kefir und einer Alkoholdehydrogenase aus Rhodococcus ruber konnte eine Oxidation von chiralen Cyclohexenol-Derivaten und Carveolen zu den entsprechenden prochiralen Ketonen erfolgen. Im Rahmen der Suche nach geeigneten Enzymen für die Kaskade wurde von drei neuen Enoatreduktasen aus Pseudomonas putida ATCC 17453 das Substratspektrum untersucht. Die xenobiotische Reduktase A (XenA), die xenobiotische Reduktase B (XenB) und die N-Ethylmaleimid-Reduktase (NemA) akzeptierten sowohl aliphatische als auch cyclische Ketone und Aldehyde. Sehr gute Umsätze konnten mit Imiden und Carvonen nachgewiesen werden. Besonders die XenA und XenB zeigten mit über 99 % Enantiomerenüberschuss in der Bildung von Dihydrocarvonen exzellente Stereoselektivitäten. In der Enzymkaskade setzten dann die XenB oder das Old yellow enzyme (OYEI) die α,β-ungesättigen Ketone selektiv zu den chiralen Ketonen um. Diese wurde dann von der Cyclohexanon-monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter species in die gewünschten chirale Laktone umgesetzt. Nach erfolgreichen Klonierungen konnten alle vier Enzymkombinationen der Enzymkaskade löslich und aktiv in einem E. coli-Stamm kultiviert werden. Mit der Kombination verschiedener nicht-natürlich verbundener Biokatalysatoren konnten in vivo Cyclohexenol und einfach Methyl-substituierte Cyclohexenol-Derivate selektiv zu chiralen Laktonen umgesetzt werden. Wir konnten durch Auswahlmöglichkeiten zwischen verschiedenen Alkoholdehydrogenasen und Enoat-reduktasen modular agieren und so zum Beispiel innerhalb von 20 Stunden die Reaktion von 4 Methyl-2-cyclohexenol zu 100 % in das optisch reine Lakton in E. coli katalysieren. Auch die für die Polymerindustrie interessanten Dihydrochalconlaktone konnten mit sehr guten Umsätzen und mit über 99 %ee hergestellt werden. Nach der erfolgreichen Etablierung der Enzymkaskade wurde die Umsatzgeschwindigkeit mit Hilfe von Fusionsproteinen noch einmal gesteigert. Dafür wurde die Auswirkung von verschiedenen Linkern und die Abfolge der Enzymdomänen im Fusionsprotein aus XenB-Domäne und CHMO-Domäne untersucht. Mit dem Fusionsproteine CHMO_G_XenB konnte nach einer Stabilisierung der CHMO-Domäne ein sehr guter Biokatalysator hergestellt werden. Anwendungen in der in vivo Enzymkaskade zeigten schnellere Umsätze für Cyclohexenol und Carveol. Ein aktives Fusionsprotein aus Alkoholdehydrogenase, XenB und CHMO konnte nicht etabliert werden, da beide Alkoholdehydrogenasen aus der Enzymkaskade bei der Fusionierung inaktiviert wurden. Auch wenn kein aktives Fusionsprotein aus drei verschiedenen Enzymdomänen hergestellt werden konnte, ist mit der erstmaligen Fusion einer Enoatreduktase und einer Baeyer-Villiger-Monooxygenase die neue in vivo Enzymkaskade verbessert worden. Somit konnte in dieser Doktorarbeit die erfolgreiche Anwendung von einer modularen in vivo Enzymkaskaden für die Herstellung chiraler Laktone für die Polymerchemie gezeigt werden.
Trotz aller Erfolge in der Chemotherapie mit platinhaltigen Antitumormitteln bestehen dennoch viele Nachteile. Ein Fortschritt brachte die Entwicklung von lichtempfindlichen Pt(IV)-Verbindungen, die sich selektiv in Tumorzellen aktivieren lassen. Durch die geringe Eindringtiefe von kurzwelligem Licht wäre das Anwendungsgebiet auf oberflächige Tumore limitiert. Durch die Kopplung von Pt(IV)-Prodrugs mit upconversion-lumineszierende Nanopartikel (UCNPs) könnte die aktivierte Pt(II)-Spezies durch Bestrahlung mit NIR-Licht, welches durch UCNPs aufwärtskonvertiert wird, freigesetzt werden. Daher wurden sechs Bistetrazolatoplatin(II)-Komplexverbindungen sowie zwölf Bistetrazolato-Pt(IV) Komplexe synthetisiert und charakterisiert. Die Bistetrazolato-Pt(II) Komplexe stellen die ersten Beispiele für mononukleare Diamminbistetrazolato-Pt(II) Komplexe dar. Untersuchungen der Synthese ließen vermuten, dass es während der Synthese zur cis/trans-Isomerie kommt. Durch die Röntgenkristallstruktur konnte eine N2-Koordination des Tetrazolatliganden nachgewiesen werden. Entgegen der Erwartung, konnte keine eine lichtinduzierte Aktivierung der hergestellten Bistetrazolato-Pt(IV) Komplexe nachgewiesen werden. Trotzdem wurden die Eigenschaften der synthetisierten Verbindungen im Hinblick auf eine potenzielle Anwendung als Pt-basierte Zytostatika weiter untersucht wurde. Es zeigte sich, dass cis/trans-[Pt(OH)2(5-phenyltetrazolato)2(NH3)2] durch Ascorbinsäure in eine Spezies, die irreversibel an DNA bindet, umgewandelt werden kann. Die Bistetrazolato-Pt(II) Komplexe waren gegen adhärente Zelllinien nicht sonderlich aktiv, wohingegen nahezu alle der getesteten Bistetrazolato-Pt(IV) diammine antiproliferierende Aktivität gegen humane adhärente Krebszelllinien zeigten und dabei (IC50-Werte < 20 µM) gefunden wurden. Auch wenn einige der vorgestellten Syntheserouten eine Optimierung bedürfen und die gefundene Zytotoxizität durch die Einführung anderer Tetrazolderivate in Pt(II)-Komplexverbindung sicherlich weiter gesteigert werden kann, konnten die Befunde einen relevanten Beitrag zum Verständnis der Komplexierung von Tetrazolatanionen an ein Pt-Zentrum leisten. Aufgrund dessen, dass die Lichtempfindlichkeit von Diiodido-Pt(IV) Komplexen bekannt war, wurden fünf neuartige Diiodido-Pt(IV) diamine (25, 26, 27, 28 und 29) synthetisiert. Daraufhin wurde sich mit der Herstellung von seltenerd-dotierten NaYF4/NaGdF4-UCNPs sowie mit der Kopplung dieser mit Diiodido-Pt(IV) Komplexen beschäftigt. Zunächst wurde überprüft, ob die Bestrahlung mit einem NIR-Laser (λ = 980 nm) in Gegenwart von UCNPs tatsächlich zu einem Abbau der Diiodido-Pt(IV) Komplexe sowie zu einer erhöhten DNA-Platinierung führt. Nachdem dies bestätigt war, wurden drei verschiedene Kopplungsmethoden angewandt. Für die kovalente Kopplung (Konjugatherstellung) wurden Diiodido-Pt(IV) Komplexe mit freier Carboxygruppe über eine Amidbindung mit amino-modifizierten NaGdF4:Yb,Er/Tm-UCNPs verknüpft. Der zweite Kopplungsansatz beinhaltet den Austausch der an der Nanopartikeloberfläche koordinierten Oleatliganden mit Diiodido-Pt(IV) Komplexen (Herstellung von Konstrukten). Durch die XPS-Analyse der Kopplungsprodukte kann gefolgert werden, dass beide Strategien eine Kopplung zwischen Pt Komplex und UCNPs ermöglichen, da Platin auf der Nanopartikeloberfläche nachgewiesen werden konnte. Allerdings liegt, unabhängig von der angewandten Kopplungsmethode, Pt zu 70–80 % im Oxidationszustand II vor. Die Verbindungen wiesen ohnehin eine gewisse Instabilität in Lösung auf. Die dritte Methode umfasst den Einschub des hydrophoben Pt(IV) Komplexes 29 in die Oleathülle. Der Nachweis von Pt auf diesem Konstrukt ist noch nicht gelungen, in vitro-Testungen ließen jedoch das Vorhandensein einer aktiven Pt-Spezies auf der Oberfläche vermuten. Für die Evaluierung der Zytotoxizität der NIR-Licht-vermittelten Antitumor-Aktivierungssysteme (Konjugate/Konstrukte) wurden diverse Methoden mit Variation im Bestrahlungsablauf vorgestellt. Hierbei stellte sich heraus, dass die Viabilität bei Bestrahlung der Konjugate/Konstrukte in Anwesenheit von Zellen im Vergleich zu Dunkelkontrollen signifikant herabgesenkt werden konnte. Allerdings besaß der NIR-Laser selbst einen toxischen Effekt gegenüber HL-60-Zellen. Die zunehmende Pt-Freisetzung der Konjugate mit der Bestrahlungsdauer und die geringe Pt-Freisetzung von Konstrukten, macht die Konjugate, insbesondere NaGdF4:Yb,Er-OA-SiO2-NH-28, zu besseren Kandidaten für die PACT. Dies wird bekräftigt durch die leicht höhere gefundene Toxizität der Konjugate im Vergleich zu den entsprechenden Konstrukten. Die dargestellten Konjugate/Konstrukte sind die ersten Beispiele für eine Kopplung von Diiodido-Pt(IV) Komplexen mit NaGdF4-UCNPs. Damit sich allerdings das vorgestellte Konzept der NIR-Aktivierung von lichtempfindlichen Diiodido-Pt(IV) Komplexen durchzusetzen kann, bedarf es noch Optimierungen hinsichtlich der Kopplungsstrategien.
In their idealized forms, enzymes can facilitate complex reactions with extreme specificity and selectivity. Additionally, in this imaginative form, they only require mild reaction conditions, resulting in low energy consumption, and they are biodegradable, efficient, reusable, and sustainable. Unfortunately, this idealized form often deviates significantly from reality, where enzymes are more likely to be associated with marginal stability and low reaction rates, leaving them less than desirable for many industrial applications. As such, if we could master the process of engineering the configuration of a protein towards a given task, the implications could be staggering.
This thesis aims to contribute to the process of protein engineering, mainly how computational tools can be used to make the protein engineering process more efficient and accessible.
Article I explores the current state of the art in machine learning-guided directed evolution and serves as a foundation for Article II, which is a concrete application of these techniques to an engineering campaign. Despite successfully improving overall activity and selectivity, we also observe limitations and constraints within the methodology. Article III then delves into these drawbacks and attempts to lay the foundation for a more generalizable and, more importantly, efficient engineering workflow, balancing the strengths and weaknesses of computational techniques with advances in gene synthesis. We then validated this novel pipeline in Article IV, where we show the potential of this methodology. Article V describes a more standard protein engineering campaign on squalene-hopene cyclases for potentially interesting products in the flavor and fragrance industry. Lastly, Article VI outlines a PyMol plugin for molecular docking.
The aim of this work is to further analyze the nature of the TiO2 passivation layer regarding structure, hydrophilicity and adsorption behavior, starting with the question how far metal and oxide properties are affected by the contact, regarding structural relaxation, atomic charges and work function. This determines how far the influence of metal has to be considered in simulations of TiO2 passivation layers. Mimicking the initial phases of implant contact with the biological environment, the adsorption of the inorganic ions on titanium oxides is to be investigated next, especially the influence of Ca2+ and HnPO4n-3 on the surface properties. Finally, biomolecule adsorption on TiO2 surfaces is investigated for understanding and improving their bioactivity.
Titanium and Titanium Dioxide
The properties of sharp interfaces formed between metallic titanium and a titanium dioxide layer with rutile or anatase structure and four different surface terminations were investigated. In all cases the work of separation is higher than the sum of surface energies, indicating the formation of an energetically very favorable interface region that glues the two phases together. The interface energy is negative, which means that for Ti and TiO2 bulk phases, mixing is energetically favorable.
The influence of the metal on the atomic and electronic structure of the oxide is limited to a few atomic layers. Depending on its modification, a passivation layer may give rise to up- (rutile) or downshift (anatase) of the work function of the underlying titanium metal.
Calcium and Phosphate
First principles molecular dynamics simulations in vacuum revealed stable bonds between Ca2+ and HnPO4n-3 ions and the investigated TiO2 surfaces. Ca2+ ions bind to 2–4 surface oxygen atoms, preferring peripheral positions as found on both rutile surfaces where adsorption energies reach 9 eV per ion. In solution the hydration energy drastically reduces these values.
Phosphate adsorbs to the TiO2 surface, but the adsorption energy is much lower than that of Ca2+ ions. The approach of phosphate is highly orientation dependent and hampered by the terminal oxygen atoms.
Both ab initio and force field simulations indicate enrichment of Ca2+ ions close to the surface, most of them directly bound to it, which results in a net positive charge. As the adsorption of phosphate takes longer and is strongly reinforced by adsorbed Ca2+ ions, it has become obvious that Ca2+ ions initiate the adsorption of calcium phosphate clusters to titania surfaces. However, the TiO2 surface does not necessarily act as a nucleation site for calcium phosphate crystallization, as adsorbed Ca2+ ions show reduced affinity towards phosphate compared to free ions in solution.
Collagen and Mechanical Stress
Coinciding force distance relations have been obtained for a variety of restraint force constants, expansion rates and environments. The resulting Young’s moduli are in the range of experimental values both at low and high strain ranges. For low strains the calculated Young’s modulus of about 2 GPa is comparable to experimental values between 3 and 5 GPa. For high strains it reaches 10 GPa. The Young’s moduli can be assigned to three different mechanisms of stretching, affecting the macroscopic linearity, the torsional angles and the bond lengths.
Chondroitin Sulfate (CS) and Hyaluronic Acid (HA)
A force field model for CS and HA could be established that reproduced experimental torsion angles and showed the same free energy surface (FES) as an ab initio model. Hydration affects the overall FES, but does not alter the position of the energetic minima. Stabilization of the conformation via bridging water molecules as suggested by other works is not necessary.
Both glycosaminoglycans adsorb to a hydroxylated rutile (100) surfaces despite the negative net charge both on surface and adsorbate. The presence of Na + ions is enough to compensate for the negative surface charge and to allow for adsorption. Ca2+ ions form additional bridges between negative groups on the surface and in the adsorbate.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig systematische Untersuchungen zum Thema „Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen“ dargestellt. Es gelang mit Hilfe einer geeigneten kalten Atmosphärendruckplasmaquelle in Form einer dielektrisch behinderten Oberflächenentladung (DBE) ein Plasma in verschiedenen Arbeitsgasen zu zünden und Flüssigkeiten ohne direkten Plasmakontakt zu behandeln. Um einen Einblick in die komplexen Mechanismen zu bekommen, wurde im analytischen Teil dieser Arbeit das Plasma mittels OES untersucht, die angrenzende Gas-Phase mittels FT-IR-Spektroskopie und MS, und anschließend die Flüssigkeit unter Nutzung photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen. Auf der Basis dieser Untersuchungen folgten theoretische Ausführungen zu möglichen Wechselwirkungen der detektierten Komponenten mit der Flüssigkeit. Theoretisch entstehen bei der Luftplasmabehandlung von Wasser, über Zwischenprodukte (ROS und RNS) wie z. B. HO•, HOO•, NO•, NO2•, schlussendlich H+, NO3-, NO2- und H2O2. Bei der Argon- und Argon-Sauerstoff-Plasmabehandlung von Wasser dürften aufgrund des Stickstoffmangels nur ROS entstehen, die in der Entstehung von H+ und H2O2 enden. Diese Hypothesen zur Bildung der Spezies NO3-, NO2- und H2O2, sowie die Ansäuerung der Flüssigkeit wurden mittels photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen überprüft und bestätigt. Im anschließenden biologischen Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Plasmabehandlungen in den verschiedenen Arbeitsgasen auf in physiologischer NaCl-Lösung und PBS suspendierte Mikroorganismen (E. coli, S. aureus und B. atrophaeus Sporen) untersucht. In ungepuffertem Medium wurden die vegetativen Mikroorganismen innerhalb weniger Minuten Plasmabehandlung inaktiviert. In PBS hingegen wurden längere Behandlungszeiten benötigt. Das Plasma hatte auf die suspendierten Sporen wie erwartet kaum eine inaktivierende Wirkung. Die zwei vermutlichen Hauptwege laufen einerseits über reaktive Stickstoffspezies (RNS) und andererseits über reaktive Sauerstoffspezies (ROS). RNS können in Wechselwirkung mit Wasser über diverse zelltoxische Zwischenprodukte wie z. B. NO•, NO2•, N2O3, ONOOH, ONOO- zu NO3- und NO2- umgesetzt werden. ROS in Interaktion mit Wasser resultieren in Bildung von H+ und H2O2. Auch hier wird angenommen, dass eine Vielzahl an antimikrobiellen Komponenten entsteht, z. B. HO•, HOO•, O2•-. Es gibt folglich sehr viele Reaktionen und Interaktionen zwischen plasmagenerierten reaktiven Spezies und Wasser, welche in zelltoxischen Komponenten enden und die inaktivierende Wirkung des Plasmas auf suspendierte Mikroorganismen erklären. Um die Interaktionen zwischen den Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit besser zu verstehen und Hypothesen zu prüfen, wurden einerseits die Mikroorganismen-Suspensionen und destilliertes Wasser nur mit plasmabehandeltem Gas behandelt und andererseits die Mikroorganismen plasmabehandelter Flüssigkeit ausgesetzt. Die Untersuchungen zeigten deutlich, dass die plasmainitiierte Chemie und damit die biologischen Effekte des Plasmas auf das Gas bzw. in Flüssigkeit übertragen werden. Folglich werden biologische Effekte des Plasmas über die Gas- und Flüssigkeits-Phase vermittelt und Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen müssen immer im zusammenhängenden chemischen System Plasma-Gas-Flüssigkeit(-Zelle) betrachtet werden. Weiterhin wurden chemische und mikrobiologische Effekte durch den Einfluss von gasförmigem NO• und O3 auf Wasser bzw. suspendierte Mikroorganismen untersucht und mit der Luftplasmabehandlung verglichen. Hierbei zeigten beide Begasung deutlich geringere inaktivierende Effekte als die Luftplasmabehandlung. Die Begasung von Mikroorganismen mit NO• und O3 und die Analytik von begastem Wasser geben einen detaillierten Einblick in die Chemie und Mechanismen der RNS und ROS. Die Behandlung mit der dielektrisch behinderten Oberflächenentladung in Luft vereint diese zwei Hauptwege über RNS und ROS und resultierte somit in effektiveren antimikrobiellen Wirkungen. Durch die Experimente der vorliegenden Arbeit wurde ein geeignetes biologisches Modell gefunden und validiert, um den Einfluss von Plasma auf lebende Zellen zu untersuchen und Mechanismen von Plasmabehandlungen aufzudecken. Anhand des Modells „Mikroorganismen-Suspension“ konnte gezeigt werden, dass die Gas-Phase (Behandlungen mit DBE-Abgas) und die extrazelluläre Flüssigkeit (Behandlungen mit plasmabehandelter Flüssigkeit) eine bedeutende Rolle bei der Vermittlung der Plasmaeffekte spielen. Die Spezies aus dem Plasma gelangten über die Gas-Phase durch Diffusion/Penetration/ Interaktion in die Flüssigkeits-Phase, reagierten teilweise zu anderen reaktiven Spezies weiter und erreichten so die Zellen. Die verschiedenen analytischen Methoden und anschließende theoretische Betrachtungen der Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit gaben einen detaillierten Einblick in die chemischen Mechanismen von Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen und zeigten biologisch wirksame Komponenten auf.
Trotz multimodaler Behandlungschemata bestehend aus Resektion, Chemotherapie und Radiatio stellt das Glioblastoma multiforme nach wie vor eine große Herausforderung auf onkologischem Gebiet dar. Dieser hochmaligne Hirntumor ist durch eine hohe zelluläre Proliferationsrate, diffuse Infiltration, Anwesenheit von Nekrosen, Angiogenese, mikrovaskuläre Hyperplasie, Apoptoseresistenz und genomische Instabilität charakterisiert. Aufgrund der Invasivität und Rezidivierung beträgt das mediane Gesamtüberleben der Patienten mit einem Glioblastom nur 15 Monate, so dass eine intensive Erforschung neuer Therapiestrategien zwingend erforderlich ist. Eine onkogene Funktion des Transkriptionsfaktors MEF (Myeloid ELF-1-like Factor) ist bereits für andere Tumorentitäten wie Ovarialkarzinome und akute myeloische Leukämie beschrieben. Seine Wirkung vermittelt MEF in diesen Tumoren sowohl über eine Inhibition des p53-Signalwegs als auch p53-unabhängig. In Gehirntumoren ist bislang die Bedeutung der Expression und Funktion von MEF vollkommen unerforscht. In der vorliegenden Arbeit kann erstmals eine signifikante Überexpression von MEF in humanen Glioblastomen verglichen mit gesundem Gehirngewebe nachgewiesen werden. Die Analyse der unterschiedlichen, molekularbiologisch definierten Subtypen des Glioblastoma multiforme zeigte, dass Patienten mit proneuralen Glioblastomen bei niedriger MEF-Expression signifikant länger überleben als Patienten desselben Subtyps mit hoher MEF-Expression. Eine signifikante Häufung der für den proneuralen Subtyp charakteristischen IDH1-Mutation unter den Patienten mit niedriger MEF-Expression und längerem Gesamtüberleben unterstreicht den Einfluss von MEF auf die Progression des proneuralen Glioblastomsubtyps. Äquivalent zu den humanen Daten überleben in einem speziell für den proneuralen Glioblastomsubtyp etablierten Mausmodell Gliom-tragende Mef-/--Mäuse signifikant länger als die entsprechenden Mef-exprimierenden Mäuse. Mef-/--Mäuse weisen zudem signifikant benignere Gliome als die Mef-exprimierenden Mäuse auf. Die Mef-abhängige Entstehung der Gliome wird zum einen über eine stärkere, p53-unabhängige Zellproliferation hervorgerufen, die mit einer erniedrigten p21-Expression in den Mef-exprimierenden Zellen verglichen mit den Mef-/--Zellen assoziiert ist. Zum anderen bewirkt MEF eine signifikante, p53-unabhängige Zunahme von tumorinitiierenden Glioblastomstammzellen sowie ihrer Selbsterneuerung, was anhand einer gesteigerten Neurosphärenbildung, einer Zunahme der die Stammzellen enthaltenden Side Population und einer verstärkten Expression des neuronalen Stammzellmarkers Nestin verdeutlicht wird. Zusätzliche Expressionsanalysen weisen darauf hin, dass MEF direkt über eine Regulation des Transkriptionsfaktors Sox2 als wichtige Komponente im Netzwerk der Stammzell-Signaltransduktion wirkt, während die Transkriptionsfaktoren Oct4 und Nanog möglicherweise indirekt durch MEF beeinflusst werden. Eine für die Radiotherapie von Glioblastompatienten relevante Funktion könnte MEF ebenfalls besitzen, da sich humane Glioblastomzellen gemäß Analysen der subG1-Phase des Zellzyklusses unter Radiotherapie signifikant apoptoseresistenter verhalten, wenn sie MEF exprimieren als bei dessen Verlust. Zusammenfassend geben die Daten dieser Arbeit Anlass zur Hoffnung, in MEF ein für die Tumorentität des Glioblastoma multiforme bedeutsames Onkogen identifiziert zu haben, welches neben seiner wissenschaftlichen Novität zukünftig im klinischen Alltag eine Bedeutung als prognostischer Marker haben könnte. Gemäß den Daten dieser Arbeit könnten insbesondere Patienten, die die molekularen Besonderheiten des proneuralen Subtyps, wie eine IDH1-Mutation, aufweisen, von einer individualisierten Therapie mit MEF-Inhibitoren profitieren, denn Patienten mit einem Glioblastom des proneuralen Subtyps sowie einer niedrigen MEF-Expression zeigen einen signifikanten Überlebensvorteil. Durch eine Behandlung mit einem MEF-Inhibitor könnte bei Glioblastompatienten des proneuralen Subtyps mit hoher MEF-Expression die Wirkung des Onkogens MEF gehemmt und damit das Überleben der Patienten verlängert werden.
The overarching goal of this work was to develop a biosensor based on functional nucleic acids. The biosensor should be modular, such that by exchange of the recognition unit, tailored biosensors could be created, allowing detecting a variety of analytes on demand. In the context of the cooperation with a company, initially, TNFalpha was chosen as an analyte. In a previous work, it was tried to build a modular aptazyme for TNFalpha that was based on four aptamers that were developed by SELEX. Here, these aptamers were investigated more closely by different methods (SPR, QCM). In the present work, it was proven beyond doubt that this attempt was not feasible. The aptamers were not able to bind the biologically active form of TNFalpha. An even more interesting finding was that a common tool to immobilize molecules to investigate their interactions with a binding partner, namely the streptavidin-biotin interaction, can strongly influence the result of the assay and causing false-positive results. Afterwards, it was decided to continue the work with a DNAzyme and modular approach was strictly refrained. It was tried to build aptazymes for TNFa or creatinine by in vitro selection, which failed. Most likely, the crucial factors were the ligands itself and the high demand on in vitro selection to select two functionalities (aptamer and catalytic activity) in parallel. This was the reason, to develop a new and a different method with streptavidin as a model analyte. The new strategy was to combine in vitro selection and rational design. The 17E-DNAzyme was chosen as catalytically active module. In preparation of the in vitro selection work, its properties were analyzed. An oligo-based inhibitor of the 17E-DNAzyme was rationally designed and its functionality was experimentally evaluated. Then, a library was designed which contained the 17E-DNAzyme, a randomized domain, and the inhibitor and its functionality was experimentally proven. The in vitro selection for the aptamer and the catalytic function were separated in two steps where the substrate strand was introduced in the second step. The knowledge about in vitro selection procedures, which was gained in the first trials with TNFalpha and creatinine was applied and could be substantially broadened. The crucial factors for the success of this process were identified. Most important steps are the amplification steps between the rounds and the in vitro selection pressure. The template concentration in the PCR has to be very low; the selection pressure has to be high. However, in fact, the exact quantity of "low" and "high" is difficult to determine exactly, it has to be individually evaluated for every amplification step, and this makes in vitro selection a method that requires a lot of experimental skills, optimization procedures, and experience. An EMSA was established and performed to qualitatively prove the affinity of the library for streptavidin in the first step of the in vitro selection method. For the second step, the in vitro selection of the catalytic function, considerable effort was done, but the in vitro selection did not succeed. Using the Biacore, the dissociation constant of the pool, which was applied in the second step of in vitro selection, was determined to be KD = 38 nM. This is very low, and by sequencing the pool it was found that the sequence variability was too low. The sequences share a cramp-like stem-loop structure, which hold the DNAzyme in an inactive conformation. This work presents valuable results for the development of biosensors based on nucleic acids, applying in vitro selection and rational design. Aptamers for streptavidin were selected. The library, which was used for this in vitro selection was structurally constrained. This obviously, represented an exceptionally good starting point for the in vitro selection. In this work, a lot of information about the development of in vitro selection systems was gained. Important work was done on establishing a click chemistry-based immobilization strategy. This work is going to fundamentally facilitate a new in vitro selection approach based on this immobilization strategy.
The synthesis of valuable chemicals via traditional chemical methods can be often outperformed by the use of enzymes because of their excellent chemo-, regio- and stereoselectivity in aqueous solvents at ambient temperatures. On the other hand, enzymes often suffer from several limitations that hamper their industrial application. Protein engineering is commonly applied to overcome these limitations although the generation and the validation of mutants is often a laborious process that may not lead to the desired results within reasonable time frames. This thesis focuses on engineering the enantioselectivity and the substrate scope of industrially relevant enzymes, such as esterases and transaminases. Semi-rational protein engineering was employed to identify improved variants for the synthesis of valuable chemicals ensuring a reduced screening effort. Compared to previous works, 3DM’s applicability was extended to the study of correlated mutations and proved effective in the acceleration of the comprehension and in the mutation of these enzymatic scaffolds. Semi-rational approaches require an extensive amount of information such as protein structures, reaction mechanisms, previous mutational experiments reported in literature and a considerable amount of amino acid sequences from similar proteins to analyze amino acid distributions and correlated mutations. Here, we have exploited 3DM as a tool that can combine all this wealth of information: 3DM is a convenient solution to retrieve and integrate information simplifying decision making in the planning of a semi-rational mutant library since in 3DM’s multiple sequence alignments (MSA) is summarized Nature’s screening process for alternative variants. Furthermore, naturally evolving enzymes often require mutations at more than one position for the acquisition of a new property. Such mutations generate patterns that are recognized by the 3DM algorithm, which creates networks that can be investigated to design strategies that aim to improve the property of interest. Finally, these correlated mutations are connected to the mutations described in publications covered in the PubMed database, thus helping to investigate the role certain positions might play in the network. Article I shows that it is possible to improve the enantioselectivity of an esterase towards a highly symmetrical substrate while drastically reducing the screening effort. This was achieved through the creation of libraries that limit the variants to those identified in the 3DM alignment. Article II shows that networks of correlated mutations are composed of positions that may cluster around a function. These functions can be investigated because 3DM connects the positions in the network to their related publications. In this article, a mutant of the esterase PFE-I from Pseudomonas fluorescens was generated having increased enantioselectivity in the hydrolysis of important target compounds. Article III suggests that the in silico modelling software YASARA, combined with the use of the 3DM database, can further reduce the screening effort: it was possible to identify a hot-spot because both the 3DM database and YASARA docking studies, indicated its importance. This led to a further improved enantioselectivity of the enzyme variant identified in Article II. Article IV shows how MSA may be used to get structural insights into the catalytic properties of enzymes with documented activity. The study of the patterns observed in a large subfamily alignment allowed the definition of the structural determinants important for the substrate recognition in amine transaminases. Article V and VI apply the knowledge acquired for the improvement of the substrate scope in the amine transaminase from Vibrio fluvialis.
The present work is a cumulative dissertation that covers the research work of the author at the Department of Analytical and Physical Chemistry of Chelyabinsk State University. It contains a short description of the study and a set of attached publications in peer-reviewed journals and conference proceedings.
The phase and chemical equilibria in binary systems Me – Si
(where Me is the 4th-period transition metal) as well as Mo – Si, Mn – Ge and Fe – Ge at low temperatures were considered. The solid solubility of silicon in vanadium, chromium, manganese, iron, nickel, cobalt and copper and that of germanium in manganese and iron was estimated.
The phase equilibria in Me – Si – O, Mo – Si – O, Mn – Ge – O and Fe – Ge – O ternary systems at standard conditions were considered from a thermodynamic viewpoint. The atmospheric corrosion of transition metals silicides and manganese and iron germanides was discussed.
The chemical and electrochemical equilibria in Me – Si – H2O, Mo – Si – H2O, Mn – Ge – H2O and Fe – Ge – H2O systems were considered from a thermodynamic viewpoint. Pourbaix diagrams for some 4th-period transition metals and molybdenum, as well as for silicon, were revised. The potential – pH diagrams for Me – Si – H2O, Mo – Si – H2O, Mn – Ge – H2O and Fe – Ge – H2O systems were plotted in the first time. The corrosion-electrochemical behaviour of transition metals silicides and manganese and iron germanides in aqueous media was discussed.
The potential – pH diagrams for some siliceous brasses and bronzes (which are multicomponent alloys containing both transition metals and silicon) were plotted, and the corrosion of these alloys in aqueous media was discussed.
Method of estimation of corrosion-electrochemical behaviour of multicomponent alloys, which takes into account both thermodynamic and kinetic data and is based on mutual construction of equilibrium and polarisation potential – pH diagrams, was described. Its usage was illustrated in the example of the structural steel 20KT.
Phosphines are highly versatile ligands for transition metal catalysts because of wide tuning abilites of their stereoelectronic properties. Bulky and basic phosphines, to a smaller extend also π-acidic phosphites were intensively studied whereas dicoordinated trivalent phosphorus compounds were comparatively little investigated in this respect. In part this may go back to the limited stability of many P=C compounds, in the case of the stable benzazaphosphole to low stabilityof complexes with non-zero-valent transition metals. With the availability of suitable chelate complexes this problems may be overcome. Because biaryl phosphines proved particularly useful as chelate ligands this work is focused on the development of convenient syntheses of new biaryl-type N-heterocyclic or functionally aryl substituted 1,3-benzazaphosphole P,N- P,P- and P,O-chelate ligands and the characterization of their structures. The pivotal point was to find an applicable synthetic route to the title ligands. Because currently transition metal catalyzed cross-coupling reactions are a hot field in catalytic research, the initial target of my work was the investigation of the applicability of suitable biaryl coupling reactions on 1,3-benzazaphospholes. There are several types of transition metal catalyzed biaryl couplings. One reaction, which is currently in the main focus by use of non-toxic and air stable coupling partners, often allowing water as environmental friendly solvent, is the Pd-catalyzed Suzuki-Miyaura coupling of an aryl halide with an arylboronic acid. To apply the Suzuki coupling to the synthesis of biaryl-type benzazaphospholes, the synthesis of either benzazaphosphol-2-boronic acids or reactive 2-halogen-benzazaphospholes have to be performed. Because of the successful introduction of functional groups in position 2 of benzazaphospholes via lithiation and reaction with electrophiles, the 2-lithiation of suitably available N-substituted benzazaphospholes and introduction of boryl groups or halogen by reaction with boronic acid esters or with a halogenating reagent like dibromoethane appeared as a realistic route and was chosen for closer study. N-Neopentyl-benzazaphosphole was selected by its relatively easy access and N-mesityl-benzazaphosphole as a N-aryl representative. From the two principal methods developed to synthesize 1,3-benzazaphospholes, only the synthesis and reduction of o-aniline phosphonic acid esters to o-phosphinoanilines and subsequent [4+1] cyclocondensation is promising to access N-substituted 2-CH benzazaphospholes. My first investigations targeted to improve the synthesis of the benzazaphosphole precursors. The invention of a Cu- instead of the earlier used Pd-catalyzed P-C coupling allows a more economical access to anilinophosphonates which were then transformed to 2H-1,3-benzazaphospholes by the established orthoformamide cyclocondensation. Several attempts of the coupling with careful control of dryness of all reagents and solvents were made in order to obtain pure 1,3-benzazaphosphole-2-boronic acid ester and, after mild hydrolysis, to isolate 1,3-benzazaphosphole-2-boronic acid. The coupling worked with N-mesityl-1,3-benzazaphosphole 13e, but the benzazaphosphol-2-boronic acid could not be obtained in pure form because of easy B-C bond cleavage during crystallization, certainly by the two ‘OH groups. For attempts with a reverted methodology, the synthesis of a 2-bromo-substituted benzazaphosphole was studied, which should be coupled with (hetero)arylboronic acids via Suzuki-Mijaura reaction. However, the 2-bromo-benzazaphosphole also could not be obtained in pure form, and a coupling experiment with phenyl boronic acid and catalysis with ligand free Pd/C failed. Therefore, other routes to biaryl-type benzazaphospholes were envisaged. Direct C-H functionalization has emerged over the past few years as an attractive strategy to enhance molecular complexity. This holds also for π-excess-type heterocycles like indoles, benzoxazoles or purines which allow direct CH-arylation in 2-position. These reactions generally involve palladium based catalysts and in some cases rhodium catalysts. In a series of experiments the catalytic arylation, heteroarylation and later also alkylation were studied with 1,3-benzazaphospholes 13a-e as precursors. The initial studies were carried out with iodobenzene, keeping similar reaction conditions as for 2-CH arylation of indoles. Then transition metal catalysts, bases and conditions were varied. The necessity and influence of a catalyst was established by blind experiments without transition metal catalyst which led to strong decrease of the reactivity. However, the transitional metal catalyzed reactions of N-substituted-1,3-benzazaphosphole with aryl- and heteroaryl halides did not give the desired 2-aryl-substituted 1,3-benzazaphosphole biaryl ligands but revealed a novel oxidative addition at the P=C double bond. In the presence of moisture benzazaphospholine-P-oxides are formed. Further exploration of the scope of this reaction showed that it is applicable to several functionally substituted aryl halides and heteroaryl halides. As besides PdX2 (X = Cl, OAc) also Pd(0)(PPh3)4 was found active as catalyst, it can be assumed, that the reaction occurs via a Pd(0) species and oxidative addition of the aryl halide at Pd(0). Because Pd(0) will coordinate stronger to the π-acidic benzazaphosphole than Pd(II) it is assumed that in the first step small equilibrium amounts of a Pd(0)benzazaphosphole complex will be formed which undergo the oxidative addition and then react to benzazaphospholium salt and furnish back a Pd(0) complex with 1,3-benzazaphosphole ligand. The benzazaphospholium salts are highly sensitive to moisture and react with traces of water to form benzazaphospholine-P-oxides 20 and acid, neutralized by the base. A cyclic species RR’P(OH)=CHR”, where the halogen is replaced by OH, may be assumed as intermediate which undergoes a rearrangement to the more stable RR’P(=O)-CH2R” tautomer, driven by the high P=O bond energy. After various investigations of the optimum conditions for the reaction, a number of new functionally substituted P-aryl or P-heteroaryl benzazaphospholine P-oxides and 1,3-dineopentyl-benzazaphospholine-3-oxide were isolated and characterized by 1H, 31P, 13C and HRMS data and two by crystallography. The biaryl-type 2-phenyl-1,3-benzazaphosphole is known since the earliest reports of these heterocycles, synthesized by cyclocondensation of 2-phosphinoaniline with benziminoester hydrochloride or in low yield with benzaldehyde. The latter method was further developed because of the compatibility of the aldehyde group with various donor functions. 2-Phosphinoaniline (12a) and 2-phosphino-4-methylaniline (12b) were heated with pyridine-2-carboxaldehyde under varied conditions, and a crucial role of acid catalyst was observed in the investigation. The results showed that the dehydrogenating cyclocondensation, if catalyzed by a suitable type and amount of acid catalyst, works well for primary phosphinoanilines 12a,b and a variety of reactive aldehydes, including N-heterocyclic and o- or m-functionally substituted arylaldehydes. In an equimolar ratio, on heating usually hydrogen is eliminated, at least formally, to furnish the aromatically stabilized 1H-1,3-benzazaphosphole ring systems of 35 whereas in other cases reductive side reactions occur, e.g. the N-CH2R substitution to 36 in reactions with two equivalents of aldehyde. Thus the synthesis of 1,5-dimethyl-1,3-benzazaphosphole (36a) was achieved by double cyclocondensation of 12b and formaldehyde in a 1:2 molar ratio. This provides the so far shortest way to synthesize N-substituted 1,3-benzazaphospholes and suggests, that the reaction is generally applicable in reactions with two equivalents of monoaldehyde. This puts the question if N-secondary o-phosphinoanilines such as N-neopentyl-2-phosphinoaniline (12d) can be cyclocondensed with aldehydes to benzazaphospholes or if a primary amino group is required. The successful experiment shows that cyclocondensation of N-secondary o-phosphinoanilines with suitable aldehydes is possible. N-Neopentyl-2-pyrido-1,3-benzazaphosphole was obtained in high yield. An interesting extension of the above reaction are cyclocondensations with compounds bearing two aldehyde groups. Double condensation of 12b with o-phthaldialdehyde was performed. It proceeded fast and gave tetracyclic-1,3-benzazaphosphole in high yield. Based on the NMR monitored primary formation of organoammonium phosphino glycolates from amines, phosphines and glyoxylic acid, followed by conversion to phosphinoglycines, it is assumed that the reaction proceeds by initial attack of the primary phosphino group of 12b at the carbonyl carbon atom of R-CHO, polarized with the help of the acid catalyst. The resulting P-C bonded secondary phosphine, containing an α-hydroxy group, may release water after transfer of a proton to oxygen in equilibrium, followed by attack of amine. This leads to formation of the dihydro-intermediate 34, observed by NMR reaction monitoring in several cases. Possible ways are releasing of H2 during reflux, directly giving 2-substituted NH-1,3-benzazaphospholes 35, or hydrogen transfer, connected e.g. with N-substitution leading to 1,2-disubstituted 1,3-benzazaphospholes 36. The second path is observed mainly when excess or double molar quantities of aldehydes are used at the start of the reaction. The two hydrogen atoms at P and C2 are consumed during the second condensation and formation of the NCH2R group and generate the P=C double bond. Finally, cyclocondensation of o-phosphinoanilines with aldehydes has proven as a useful method for the synthesis of biaryl type benzazaphosphole ligands. After thorough investigations, N-primary and secondary phosphino anilines were found cyclisable with various heteroaryl aldehydes upon refluxing in toluene in the presence of a suitable acid catalyst, and 11 new compounds were synthesized following this procedure and characterized by 1H, 31P, 13C NMR and HRMS data. For two compounds crystal structures were also obtained. First attempts to synthesize chelate complexes with the 2-(hetero)aryl-1,3-benzazaphospholes were started. A soluble 2-(o-diphenylphosphinophenyl)-1,3-benzazaphoasphole-Cr(CO)4 chelate complex was detected by NMR spectroscopy, whereas most products of the new ligands with Rh(COD) or NiCp complexes were insoluble in usual NMR solvents and require further efforts for synthesis and full analytical and structural characterization.
Tertiary alcohols have become interesting targets for organic synthesis themselves or as building blocks for valuable pharmaceutical compounds. However, the synthesis of optically pure tertiary alcohols is still a challenge both chemical and enzymatic means. Enzymes containing the GGG(A)X motif in the active site region have been known to show activity towards these sterically demanding substrates. Several tertiary alcohols have been resolved with high enantioselectivity by using this biocatalytic synthetic route. This thesis aims at providing a better understanding of enantiorecognition of GGG(A)X motif hydrolases in the enzymatic synthesis of enantiomerically enriched tertiary alcohols. Kinetic resolution of a wide range of tertiary alcohols using hydrolases provided insights on factors that can influence enantioselectivity of GGG(A)X motif enzymes. Additionally, a newly proposed chemoenzymatic method to synthesize protected alpha,alpha-dialkyl-alpha-hydroxycarboxylic acids has broadened the application of these enzymes to synthesize optically pure tertiary alcohols. Newly found biocatalysts through functional screening, database mining and rational protein design approaches provided a better enzyme platform for optically pure tertiary alcohol resolution.
Die Verlängerung des Aufenthalts einer Arzneiform im Magen kann enorme Vorteile insbesondere für Arzneistoffe mit einem Absorptionsfenster im oberen Dünndarm oder schlechter Bioverfügbarkeit bieten. Bei gleichzeitig kontrollierter Freisetzung eines enthaltenen Wirkstoffs können Plasmaspitzen und Fluktuationen im Blutplasma vermieden werden. Ziel der Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung solcher potentiell gastroretentiver Darreichungsformen in vitro und in vivo. Der Hauptteil der Arbeit umfasste die Entwicklung einer neuartigen Arzneiform, die bei nüchterner und postprandialer Gabe eine zuverlässige Gastroretention über mehrere Stunden zeigen und den Wirkstoff kontrolliert im Magen freigeben sollte. Das System bestand aus einer wirkstoffhaltigen Kerntablette und einem den Kern umgebenden, quellenden Mantel, welcher durch Expansion die angestrebte Gastroretention ermöglichen sollte. Im Rahmen der Formulierungsentwicklung erwies sich die Mischung aus einem hoch- und niedrigmolekularen Polyethylenoxid als geeignet für die Kontrolle der Wirkstofffreisetzung aus dem Kern. Die Ergänzung wasserlöslicher, osmotischer Hilfsstoffe ermöglichte eine weitgehend pH-unabhängige und vollständige Wirkstofffreigabe. In vitro-Quellungsstudien mit den entwickelten Manteltabletten ergaben eine schnelle und ausgeprägte Größenzunahme bei Testung in einfachen Freisetzungsmedien. Zur Prüfung des tatsächlichen gastroretentiven Potentials der entwickelten Manteltabletten mit dem Diuretikum Furosemid wurde eine Magnetic Marker Monitoring (MMM)-Studie durchgeführt. Das MMM basiert auf der magnetischen Markierung einer Arzneiform und der Bestimmung ihrer Lokalisation im Gastrointestinaltrakt mittels empfindlicher Sensoren. Nach Nüchterneinnahme wurden die Manteltabletten innerhalb von 38 ± 12 min aus dem Magen der Probanden entleert. Bei Applikation der Manteltabletten nach Einnahme einer hochkalorischen, standardisierten Mahlzeit konnte eine durchschnittliche Gastroretentionszeit von 8 ± 3 h erzielt werden. Die AUC(0-24 h) konnte im Studienarm mit Nahrung im Vergleich zur Nüchterneinnahme von 89 ± 56 ng·h/mL auf 708 ± 304 ng·h/mL gesteigert werden. Weiterhin wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuartiges mechanisches Antrummodell entwickelt, mit dem der Einfluss antraler Kontraktionswellen auf die Tendenz zur Entleerung von Objekten untersucht wurde. Große, starre Objekte wie eine Glaskugel wurden aufgrund ihrer geringen Reibung vor der Welle hergeschoben und aus dem Modell entleert. Auch die reibungsverminderte Oberfläche eines Cryogel-Schaums erhöhte die Tendenz zur Entleerung aus dem Modell. Vielversprechend war dagegen die unter allen variablen Testbedingungen beobachtete Gastroretention eines Trichobezoars. Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass weiterhin eine große Herausforderung in der Entwicklung von Arzneiformen besteht, die eine nachweisliche Gastroretention beim Menschen in Abwesenheit von Nahrung zeigen.
Die Implantation von Arzneistoff-freisetzenden (drug-eluting) Stents in durch Ballonangioplastie revaskularisierte Koronararterien stellt heutzutage eine der wichtigsten Methoden zur Prävention von Restenosen der betroffenen Gefäßabschnitte dar. Die Erzielung wirksamer Konzentrationen der hochpotenten Wirkstoffe in der Gefäßwand unter Vermeidung von unerwünschten systemischen Arzneimittelwirkungen soll durch die kontrollierte Arzneistofffreisetzung im stenosierten Gefäßabschnitt gewährleistet werden. Aufgrund der Unzugänglichkeit des Wirkortes für direkte Konzentrationsbestimmungen liegen bis dato jedoch nur wenige Daten bezüglich der Wirkstofffreisetzung und -verteilung aus Humanstudien vor. Da die zur Verfügung stehenden offizinellen und nicht offizinellen Methoden zur Untersuchung des In vitro-Verhaltens von Arzneiformen lediglich ein Akzeptorkompartiment aufweisen, sind sie ebenfalls nur bedingt zur Vorhersage der Freisetzung aus einem Stent am Implantationsort geeignet. Verteilungprozesse können mit diesen Methoden nicht beschrieben werden. Aus diesem Grund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, einen an die In vivo-Bedingungen am Implantationsort adaptierten In vitro-Freisetzungstest für Arzneistoff-freisetzende Stents basierend auf den Methoden des Europäischen oder US-Amerikanischen Arzneibuchs zu entwickeln. Der Freisetzungstest sollte dazu geeignet sein, sowohl die Wirkstofffreisetzung und -verteilung zwischen verschiedenen Kompartimenten als auch räumliche Verteilungsmuster innerhalb eines Gefäßwand-simulierenden Kompartiments zu untersuchen. Als Basis für die Modellentwicklung wurde aufgrund der am Implantationsort in vivo vorliegenden Bedingungen die Durchflusszellen-Apparatur ausgewählt, die die einzige offizinelle Methode darstellt, bei der ein gerichteter Fluss erzeugt wird. Zur Simulation der Gefäßwand sollte ein zusätzliches Akzeptorkompartiment in die Durchflusszelle eingebracht werden. Da das Kompartiment einerseits formstabil sein sollte und andererseits die Aufnahme und den Transport des Arzneistoffs durch Diffusion ermöglichen sollte, wurden verschiedene Hydrogele hinsichtlich ihrer Eignung zur Integration in die Durchflusszelle untersucht. Calciumalginat wurde als geeignetes Hydrogel für das zusätzliche Akzeptorkompartiment identifiziert und durch Veränderungen an der Durchflusszellen-Apparatur erfolgreich in den Freisetzungstest integriert. Es wurde eine zentrale Aussparung im Hydrogel geschaffen, die im Modell das Gefäßlumen simuliert und in die ein Stent mittels Ballonkatheter implantiert werden kann. Nach der Implantation des Stents kann die Öffnung im Hydrogel mit dem Freisetzungsmedium mit einer Flussrate von 35 ml/min, die dem Blutfluss in Koronarien entspricht, perfundiert werden. Durch Einsatz geeigneter Medienvolumina kann die Einhaltung von Sinkbedingungen, die als das größte Problem der häufig eingesetzten nicht offizinellen Testsysteme gilt, sichergestellt werden. Nach erfolgter Entwicklung wurde die Eignung des Modells durch die Testung verschiedener Stentmodelle geprüft werden. Neben der Bestimmung der Freisetzung der Modellsubstanzen ins Durchflussmedium während der Perfusion und der am Versuchsendpunkt in der Stentbeschichtung verbliebenen Modellsubstanz-Anteile wurden verschiedene Methoden zur Untersuchung des Hydrogels nach Beendigung der Perfusion entwickelt. Zur direkten Quantifizierung der ins Hydrogel diffundierten Modellsubstanz wurde eine geeignete Methode zur Verflüssigung des Gels identifiziert. Zur Untersuchung der räumlichen Verteilung innerhalb des Hydrogels wurden zwei Methoden zur Präparation des Hydrogels entwickelt, die die Untersuchung im Fluoreszenzmikroskop ermöglichten. Einerseits wurde anhand von Mikrotomschnitten die Diffusionstiefe im Querschnitt untersucht. Unter Verwendung von Alginatfilmen war andererseits die Untersuchung der Innenseite des simulierten Gefäßlumens parallel zur Flussrichtung möglich. Unter Verwendung einer Finite-Elemente-Methode konnten zudem ausgewählte Freisetzungsversuche mathematisch modelliert werden. Für die Berechnungen wurden im Rahmen dieser Arbeit experimentell bestimmte Diffusionskoeffizienten zu Grunde gelegt. Die Ergebnisse der Freisetzung mit dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Testsystem wiesen im Vergleich zur Testung mit offizinellen Methoden eine Verlangsamung der Entleerung der Stentbeschichtung bei allen Modellsubstanzen durch die an die In vivo-Situation adaptierten Einbettungs- und Flussbedingungen auf. Diese Beeinflussung der Freisetzungsgeschwindigkeit durch die Freisetzungsbedingungen unterstreicht die Notwendigkeit, für die In vitro-Evaluation von Arzneistoff-freisetzenden Stents spezialisierte, an die In vivo-Bedingungen adaptierte Testsysteme einzusetzen. Mit dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Freisetzungsmodell steht erstmals ein solches Testsystem zur Verfügung.
Pentathiepine sind siebengliedrige, heterocyclische Polysulfane. Sie gehören damit zur Gruppe organischer Polysulfide und somit zu einer Stoffklasse, die in den letzten Jahren wachsendes Interesse hinsichtlich pharmazeutisch/medizinisch nutzbarer Eigenschaften geweckt hat. Sie besitzen unterschiedliche biologische Wirkungen, die möglicherweise auf die Aktivierung durch Thiole, wie zum Beispiel Glutathion (GSH), zurückzuführen sind. Dazu gehören die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies und die oxidative Fragmentierung von DNA.
Pentathiepine zeigen sich als gelbe, schwer lösliche Feststoffe und sind in sauren Lösungen sehr stabil. In Lösungen, die Basen oder Nukleophile enthielten, nahm der Gehalt an Pentathiepinen jedoch sehr schnell ab. In dieser Arbeit sollte hauptsächlich untersucht werden, inwieweit sich die Stabilität der Pentathiepine auf die biologischen Eigenschaften auswirkt. Neben der Ermittlung der Verteilungskoeffizienten 23 verschiedener Pentathiepine, wurden auch enzymbasierte Assays durchgeführt.
Dazu gehörte die Bestimmung der Reversibilität der Hemmung an boviner Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) sowie der Einfluss unterschiedlicher Inkubationsbedingungen auf die inhibitorische Wirkung. Dabei wurde für das untersuchte Pentathiepin mittels jump dilution keine irreversible Hemmung an boviner GPx-1 gefunden. Eine irreversible Inhibierung konnte jedoch für Mercaptobernsteinsäure gezeigt werden. Die Ergebnisse der unterschiedlichen Inkubationsbedingungen erlauben die Schlussfolgerung, dass der intakte Pentathiepinring wahrscheinlich nicht an der Hemmung der GPx-1 beteiligt ist, sondern die aus der Reaktion mit GSH gebildeten Abbauprodukte. Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass der Pentathiepinring mindestens als „Schwefeltransporter“ benötigt wird. Ein Übertrag des GPx-Assays auf die HPLC konnte als prinzipiell möglich, für die Pentathiepine jedoch als nicht geeignet gezeigt werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden sechs Pentathiepine mit vier unterschiedlichen Grundgerüsten hinsichtlich ihrer Stabilität in Gegenwart von GSH untersucht. Dabei gab es hinsichtlich der Reaktivität der Pentathiepine sehr starke Unterschiede. Trotz dieser großen Unterschiede konnten keine Unterschiede hinsichtlich der GPx-Hemmung und der antiproliferativen Eigenschaften beobachtet werden. Auch eine Absenkung der intrazellulären GSH-Konzentration durch Inkubation mit DL-Buthioninsulfoximin in drei humanen Krebszelllinien mit unterschiedlichem Glutathiongehalt ergab keine Unterschiede zwischen den getesteten Substanzen. Sie waren nach Vorinkubation der Zellen durchgehend aktiver.
Aufgrund der vergleichsweise hohen Reaktivität in Gegenwart von GSH sollte ein Pentathiepin in einem proof of concept in Liposomen formuliert werden. Diese Formulierung sollte einerseits das Pentathiepin vor Reaktionen mit Thiolen wie GSH schützen, andererseits die Wasserlöslichkeit erhöhen. Dabei ergab sich, dass die Wasserlöslichkeit der Pentathiepine durch Formulierung in DOPC-Liposomen von unter 3 μM auf über 400 μM erhöht werden konnte. In Hinsicht auf die Stabilität ergab sich eine erhöhte Stabilität des untersuchten Pentathiepins in Anwesenheit von 10 mM GSH um den Faktor 4 in der Zeit bis zum vollständigen Abbau. Hinsichtlich der antiproliferativen Eigenschaften ergab sich keine Abnahme der Wirkung des Pentathiepins durch Formulierung in Liposomen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Synthese von Fettsäureestern aus Pflanzenölen mit Methanol bzw. Ethanol in Gegenwart von Wasser durch die Lipase CAL-A zu optimieren, wobei insbesondere die Bildung von freien Fettsäuren minimiert werden sollte. Zunächst wurde ein Hochdurchsatztest zur Bestimmung der Acyltransferaseaktivität der CAL-A etabliert, welcher auf der Abnahme des Alkoholgehalts in Umesterungsreaktionen basiert. Dabei zeigte sich eine gute Übereinstimmung zwischen den Umsätzen, die mit GC und dem Oxidase-Assay ermittelt wurden, wobei die Umsätze nicht zu gering sein sollten da sonst größere Schwankungen im Oxidase-Assay möglich sind. Durch das rationale Design anhand der gelösten Struktur der CAL-A konnten vier Mutagenesepositionen identifiziert werden: Thr118, Asp122, Thr221 und Glu370. Durch den Austausch der Aminosäurereste an diesen Positionen gegen hydrophobere Aminosäuren wurden 28 CAL-A Varianten generiert. Diese wurden für eine initiales, qualitatives Screening eingesetzt, indem drei CAL-A Varianten eine ähnliche bzw. erhöhte Esterbildung im Vergleich zum Wildtyp zu haben schienen. Die drei Varianten Thr118Ile, Asp122Leu und Thr221Ala wurden daraufhin für weitere Untersuchungen in P. pastoris im Bioreaktor hergestellt und in Biokatalysen verwendet. Eine erhöhte Esterbildung für die Varianten Thr118Ile und Thr221Ala ließ sich jedoch nicht bestätigen, allerdings zeigte sich, dass die CAL-A Variante Asp122Leu deutlich weniger freie Säure bildete als der CAL-A WT. In der anschließenden Charakterisierung von CAL-A Asp122Leu zeigte sich, dass diese Variante wie CAL-A WT auch thermostabil ist und dass beide Enzyme das gleiche pH- und Temperaturoptimum haben. Des Weiteren wurden CAL-A WT und Asp122Leu adsorptiv auf Lewatit VP OC 1600 immobilisiert und in Biokatalysen eingesetzt, in denen CAL-A Asp122Leu erneut deutlich weniger freie Säure bildete. Darüber hinaus wurde auch der Einfluss der Reaktionsbedingungen auf die Acyltransferaseaktivität der CAL-A untersucht. Es wurden dazu Biokatalysen mit Ethanol oder Methanol durchgeführt, in denen der Wassergehalt (5% oder 10% bezogen auf die Einwaage an Öl) und die Reaktionstemperatur (30°C, 40°C oder 50°C) variiert wurden. Die Biokatalysen mit Methanol zeigten dabei generell einen hohen Umsatz zwischen 85-95%, während die Biokatalysen mit Ethanol nur zu geringeren Umsätzen führten (55-85%). Allerdings zeigte sich in einem Langzeitstabilitätstest mit einer Biokatalysedauer von 97 h auch, dass Methanol das verwendete CAL-A Immobilisat stärker inaktiviert als Ethanol. Ebenso musste bei einem Wassergehalt von nur 5% die Methanolzugabe schrittweise erfolgen, um eine Inaktivierung des CAL-A Immobilisats zu verhindern. Somit konnte eine Optimierung der CAL A katalysierten Umesterungsreaktionen sowohl durch das Protein-Engineering des Biokatalysators als auch durch die Anpassung der Prozessbedingngen erreicht werden. Dabei wurden Erkenntnisse gewonnen, die auch zur Beurteilung der industriellen Anwendbarkeit eines solchen Prozesses beitragen können.
Die Dissertation beschreibt die Synthese verschiedener Nukleosidanaloga mit den notwendigen Modifizierungen und Funktionalitäten für einen Einsatz in der Phosphoramidit-basierten chemischen Oligonukleotidsynthese an fester Phase. Im Rahmen der Arbeit wurde ein nicht-kanonisches Desoxyadenosinderivat ausgehend von Allopurinol hergestellt. Außerdem wurden verschiedene Azid-modifizierte Nukleoside synthetisiert und Untersuchungen zur Herstellung eines Borono-modifizierten Adenosinderivats durchgeführt. Des Weiteren wurde ein Verfahren zur Bestimmung der Stabilität der Azidogruppe unter Standardbedingungen der Phosphoramidit-basierten chemischen Oligonukleotidsynthese demonstriert.
Cascade reactions are not only of interest to chemists and biotechnologists, but also to life in general, because every metabolic reaction resembles a cascade reaction. This principle of substrate/intermediate channeling was only adapted by scientists. That way especially one-pot reactions became very attractive as for this no isolation of intermediates is necessary. Furthermore, unstable or toxic intermediates are only produced in low amounts and directly transformed in situ. In this PhD thesis two previously established cascade reactions were subject of further optimization. In the first part, a cascade reaction established in a DFG-funded project (Bo1862/6-1)in cooperation with the Vienna Technical University (Austria) for the production of chiral lactones was further optimized and extended. Therefore, on the one hand the genes encoding the needed enzymes were cloned for co-expression into a single plasmid in different arrangements to be expressed in pseudo-operon mode, with the aim to lower the metabolic burden of the cascade host cell. One out of the welve created constructs showed a reasonable activity of 15.3 ± 1.2 U · gCDW-1. On the other hand, this cascade reaction was aimed to be extended by the use of a hydroxylating enzyme to enable the use of limonene as renewable and chiral precursor for the proposed production of chiral polymers. Therefore, the feasibility of cytochrome P450-monooxygenases was studied. These turned out to be not applicable due to their bad regioselectivity for the hydroxylation of limonene or due to the difficulties of activity reconstitution. As alternative system for an initial hydroxylation step the use of a Rhodococcus equi strain, which was isolated from Cellulosimicrobium cellulans EB-8-4 and which is capable of very regioselective limonene-hydroxylation, was investigated. Therefore, the dioxygenase cluster responsible for the desired reaction was identified and especially the recombinant expression in a suitable host (Pseudomonas putida S12) was further studied. The results from these experiments revealed that the recombinant expression needs to be further optimized to enable the use of the recombinant dioxygenase in combination with the other enzymes for cascade reactions. The third part of this PhD thesis dealt with the immobilization of an established cascade reaction for the synthesis of poly-[caprolactone] precursors. Therefore, the use of a rotating bed reactor (RBR) was investigated. Preliminary studies using single enzymes involved in the desired cascade reaction demonstrated the general feasibility of this reactor concept. Especially the reusability of the catalysts was highly improved, because the catalytic particles were protected very effectively from mechanical forces within the voids of the reactor. For further work-flow optimization the immobilization was transformed into an in situ process by the application of a gas-shear device, which leads to decreased capsule size and thereby to increased mass transfer inside the particles. The developed methods were applied for encapsulation of the cells containing the enzymes needed for the reaction. After additional improvement of the reaction parameters a conversion of 93% (based on substrate depletion) was reached using catalysts produced by the established encapsulation procedure. In summary, the described cascade reactions were successfully optimized by either co-expression, extension applying a dioxygenase or immobilization. Furthermore, the general feasibility of an RBR was demonstrated.
Metabolomics is the scientific study of metabolites of an organism, cell, or tissue. Metabolomics makes use of different analytical approaches. In this thesis, an analytical platform consisting of proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR), gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS, EI/quadrupol) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS, ESI/TOF) was used for metabolite analysis. Due to the high physicochemical diversity of metabolites, the usage of different analytics is profitable. Focusing on metabolome analysis of microorganisms, the development of viable protocols was prerequisite. To ensure metabolome samples of best possible quality, particularly the sampling procedure has to be optimized for each microorganism to be analyzed individually. In microbial metabolomics, the energy charge value is a commonly used parameter to assure high sample quality (Atkinson 1968). The pathogenic bacterium Staphylococcus aureus and the biotechnical relevant bacterium Bacillus subtilis were main target of research. The sampling protocol development “A protocol for the investigation of the intracellular Staphylococcus aureus metabolome” (Meyer et al. 2010) and “Methodological approaches to help unravel the intracellular metabolome of Bacillus subtilis”s (Meyer et al. 2013) confirmed the need for development and verification of viable protocols. It was observed, that minor differences in the sampling procedure can cause major differences in sample quality. Using the validated analytical platform and the optimized protocols, we were able to investigate the metabolome of S. aureus and B. subtilis under different conditions. Investigations of the pathogenic bacterium S. aureus are of major interest due to its increasing resistance to antibiotics. Methicillin (multi)-resistant S. aureus (MRSA) strains are responsible for several difficult-to-treat infections. The cell wall of bacteria is the target of an array of antibiotics, like the beta-lactam antibiotics. Our study “A metabolomic view of Staphylococcus aureus and Its Ser/Thr kinase and phosphatase deletion mutants: Involvement in cell wall biosynthesis” (Liebeke et al. 2010) revealed the influence of the serine-threonine kinase on cell wall biosynthesis of S. aureus. LC-MS based metabolome data uncovered prevalent wall teichoic acid precursors in the serine-threonine kinase deletion mutant (ΔpknB), and predominantly peptidoglycan precursors in the phosphatase deletion mutant (Δstp), compared to the S. aureus wild type strain 8325. This uncovered a so far undescribed importance of the serine-threonine kinase on the cell wall metabolism and provides new insights into its regulation. The nasopharynx and the human skin are often the ecological niche of S. aureus. Furthermore, S. aureus exists outside its host, for example on catheters. Depending on its niche, S. aureus is exposed to several stress factors and limitation conditions, such as carbon source limitation and starvation. To cope with the latter, a number of regulatory cellular processes take place. In “Life and death of proteins: a case study of glucose-starved Staphylococcus aureus” (Michalik et al. 2012) protein degradation during glucose starvation was monitored. An intriguing observation was that proteins involved in branch chain amino acid biosynthesis and purine nucleotide biosynthesis were distinctly down-regulated in the clpP mutant. This lead to the assumption of a stronger repression of CodY-dependent genes in the clpP mutant. Intracellular metabolome data revealed higher GTP concentrations in the clpP mutant. This may explain the higher CodY activity and thereby stronger repression of CodY-dependent genes in the clpP mutant. Since different S. aureus strains are known to colonize different niches, global carbon source (glucose, glucose 6-phosphate, glycerol, lactate, lactose and a mixture of all) and carbon source limitation dependent exo-metabolome analyses were performed using three different S. aureus strains (HG001: laboratory strain, EN493: human endocarditis isolate and RF122: bovine mastitis strain). The most apparent observation was that RF122 can utilize lactose best, while EN493 and HG001 are better at utilizing glucose-6-phosphate compared to the bovine RF122 strain. Bacillus subtilis is an extensively studied Gram-positive and non-pathogenic bacterium. In the functional genomics approach “System-wide temporal proteomics profiling in glucose-starved Bacillus subtilis” (Otto et al. 2010) growth phase dependent changes in the proteome, transcriptome and extracellular metabolome were monitored. By mass spectrometric analysis of five different cellular subfractions, ~ 52% of the predicted proteins could be identified. To confirm and complete the proteomic data transcriptome and extracellular metabolome analyses were performed. The extracellular metabolome data ensured that cells were glucose-starved and revealed growth phase dependent metabolic footprints. In “A time resolved metabolomics study: The influence of different carbon sources during growth and starvation of Bacillus subtilis” ((Meyer et al. 2013) submitted) four different compounded cultivation media were investigated as only glucose, glucose and malate, glucose and fumarate and glucose and citrate as carbon source. It could be shown, that B. subtilis is able to maintain an intracellular metabolite homeostasis independent of the available carbon source. On the other hand, in the exo-metabolome, carbon source as well as growth phase dependent differences were detected. Furthermore, in this study the influence of ATP and GTP on the activation of the alternative RNA polymerase sigma factor B (σB) was discussed. The concentration of ATP and GTP decreased for all conditions, as cells entered the stationary growth phase. While cell growth on solely glucose and during growth on glucose and additional malate, the ATP and GTP concentrations increased slightly when the consumption of the second carbon source was initiated. Only under these conditions, a considerable σB activity increase during the transition from exponential to stationary growth phase was observed. Furthermore, the developed sampling protocol for metabolome analysis of B. subtilis enabled us to be part of a “multi omics” system biological approach to study the physiological adjustment of B. subtilis to cope with osmotic stress under chemostat conditions.
Der akute Myokardinfarkt ist die häufigste Todesursache in den Industrieländern. Um die Spätfolge Herzinsuffizienz so gering wie möglich zu halten, ist eine schnelle Wiederherstellung des koronaren Blutflusses entscheidend. Dieser gewünschten Reperfusion wird jedoch eine zusätzliche Schädigung des Myokardgewebes zugeschrieben. Durch kurze Intervalle von Ischämie und Reperfusion nach Wiederöffnung des Koronargefäßes konnte die Infarktgröße drastisch gesenkt werden, so dass dieses als ischämische Postkonditionierung bezeichnete Verfahren, hohes Potential zur Reduktion der Myokardschädigung nach einem Infarkt bietet. Für den klinischen Einsatz erweist sich dieses Verfahrens jedoch als technisch aufwendig, so dass der Wunsch nach pharmakologischen Ansätzen zu Beginn der Reperfusion steigt. Die vorliegende Arbeit befasste sich daher mit der Untersuchung möglicher kardioprotektiver Substanzen und der Charakterisierung wichtiger Elemente der zugrunde liegenden Signalkaskade. Hierfür wurde in dem Modell der ex vivo perfundierten Rattenherzen die kardioprotektive Wirkung des endogenen Mediators Bradykinin während der Reperfusion und die mögliche Beteiligung des EGF-Rezeptors untersucht. In einem kardiomyozytenbasierten Zellmodell, bei dem HL-1-Zellen mit den Kalziumionophor Calcimycin gestresst wurden, sollte die Beteiligung wichtiger Signalelemente bestätigt werden. Zur Charakterisierung der Rolle der Adenosinrezeptoren während der Reperfusion wurde ein in vivo Maus Modell etabliert, welches die Untersuchung der Infarktgröße im Tier erlaubt. Hierfür wurden selektive Adenosinrezeptoragonisten und -antagonisten sowie CD73-/- Mäuse, die kein endogenes Adenosin durch die 5’-Ektonukleotidase (CD73) bilden können, verwendet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Bradykinin während der Reperfusion zu einer signifikanten Reduktion der Infarktgröße führt und dass dieser Schutzmechanismus von einer Transaktivierung des EGF-Rezeptors und der survival Kinase Akt abhängig ist. Des Weiteren konnte sowohl bei den Infarktgrößen als auch im zellbasierten Modell eine Beteiligung der MMP-8 bei der Transaktivierung des EGF-Rezeptors nachgewiesen werden. Anhand des in vivo Maus Modells konnte gezeigt werden, dass der durch die ischämische Postkonditionierung vermittelte Myokardschutz durch den selektiven A2bAR Antagonisten MRS1754 aufgehoben werden konnte und dass eine Aktivierung des A2bAR durch den selektiven A2bAR Agonisten BAY60-6583 während der Reperfusion zu einer Senkung der Infarktgröße führt. Des Weiteren konnte mit Hilfe der CD73-/- Mäuse und unter Verwendung von selektiven Adenosinrezeptoragonisten und -antagonisten gezeigt werden, dass bei fehlendem extrazellulärem Adenosin kein Schutz durch eine ischämische Postkonditionierung, dem selektiven A2bAR Agonisten BAY60-6583 oder dem A2aAR Agonisten CGS21680 erzielt werden kann, sondern dass nur die gleichzeitige Aktivierung von A2aAR und A2bAR zum Schutz des Herzens vor Reperfusionsschäden führt. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen mögliche Ansätze für pharmakologische Interventionen zur Behandlung des akuten Myokardinfarkts auf. Die Verwendung von Agonisten zur Aktivierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren rückt damit immer mehr in den Vordergrund für mögliche klinische Ansatzpunkte.
Autoclaved aerated concrete (AAC) is a building material that combines heat insulation
properties with sufficient mechanical strength for masonry construction. Compared to
ordinary concrete, the matrix is highly porous (>50%) and hardened by a hydrothermal curing
process at 150°C - 200°C. During this process, quartz sand and portlandite react to form first
calcium silicate hydrates (C-(A)-S-H) with Ca/Si ratios <1.3 and then tobermorite. Especially
tobermorite, which has a much larger crystallite size than C-(A)-S-H, provides improved
mechanical strength. This reaction sequence is influenced by many parameters and
additives of which calcium sulfate is probably the most important. Despite several attempts to
investigate these hydrothermal reactions, the actual reaction mechanism involved when
adding sulfate ions is not fully understood. It has been suggested that the addition of ca.
1.5 wt% significantly improves the mechanical properties due to the enhanced formation and
arrangement of tobermorite in the porous matrix. Since the sulfate content in AAC waste is
exceeding regulatory threshold for low-quality reuse in some countries, the aim of this study
was to investigate in detail the reaction mechanisms involving sulfate addition. Such
knowledge may open up the possibility to improve AAC production and to avoid the need for
sulfate addition. To achieve this goal, this research work focused on investigating the
hydrothermal curing process to determine the sequence of hydrothermal reactions and the
spatial distribution of the phases formed. For this purpose, a new setup for in situ X-ray
diffraction was specifically designed to study hydrothermal reactions and to conduct time
intensive experiments on a normal laboratory diffractometer. In order to quantitatively
evaluate the in situ measurements by Rietveld analysis using TOPAS, it was also necessary
to develop atomistic structure models for C-(A)-S-H phases. This was made possible by
adopting a supercell approach that was previously used to describe turbostratically stacked
clay minerals. The structure models, derived from tobermorite, are placed in an otherwise
empty supercell to simulate the C-(A)-S-H nanostructure. Adopting these methodological
advances, it was possible to obtain absolute phase quantities from in situ data and to track
the reaction kinetics of the hydrothermal curing process. These results were then combined
with ex situ X-ray diffraction and scanning electron microscopy. Confirming previous studies,
the major effect of sulfate ions was the formation and decomposition of hydroxylellestadite. It
was further revealed that C-(A)-S-H formation was delayed during hydroxylellestadite
formation, which is supposed to support the silicate ion diffusion and hence the tobermorite
formation at a stage critical for improved hardening of AAC. This can be linked to the
formation of lower amounts of capillary pores in the range of 1-5 µm, as observed by
scanning electron microscopy, and therefore a lower concentration of inherent defects that
resulted in the improved mechanical properties. This research work highlights how important the spatial distribution of crystallites is for the properties of a building material and how this
distribution can be influenced by small alterations in reaction chemistry.
Tricholoma populinum, der Pappel-Ritterling, ist ein einheimischer, eine Mykorrhiza mit Populus sp. ausbildender Speisepilz. Als in-vitro-Testmodell diente die Quantifizierung der Degranulation von RBL-2H3-Zellen nach Sensibilisierung mit einem IgE-Antikörper und Stimulierung mittels DNP-HSA. Anschließend wurde die Aktivität eines membranständigen Enzyms, der β-Hexosaminidase, im Überstand bestimmt. Es konnte beobachtet werden, dass der DCM-Extrakt aus Fruchtkörpern des Pappel-Ritterlings eine signifikante Inhibition der Degranulation aufwies. Nach Säulenchromatographie an offener Säule konnten aktive und nicht-aktive Fraktionen ausgemacht werden. Eine Aufreinigung des DCM-Extraktes geschah durch SPE, präparative TLC und Säulenchromatographie. Der letzte Aufreinigungsschritt geschah bei allen Substanzen durch semipräparative HPLC. Reinsubstanzen wurden mit MS- und NMR-Techniken charakterisiert. Die aus dem Pappel-Ritterling isolierten Reinsubstanzen aus den Klassen der aliphatischen Säuren und C28-Sterole wiesen einzeln keine Degranulationshemmung im in-vitro-Modell auf. Ein weiterer untersuchter Organismus war Armillaria ostoyae, der Dunkle Hallimasch. Auch der DCM-Extrakt aus Fruchtkörper und Myzel von A. ostoyae zeigte eine signifikante Reduktion der Degranulation. Dieser Effekt konnte erstmals für A. ostoyae festgestellt werden. Fruchtkörper wurden in Wildsammlung erhalten, das Myzel kultiviert und durch molekularbiologische Untersuchung identifiziert. Aus dem Myzel des Dunklen Hallimaschs konnten Sesquiterpen-Arylester isoliert werden. Hierbei handelte es sich um die Melleolide C, H und J, Melledonal C, 10‑Hydroxymelleolide, Armillarin und Armillaridin sowie einen bisher unbekannten Naturstoff, dessen Struktur durch weitere IR- und CD-spektroskopische Untersuchungen bestätigt werden sollte. Des Weiteren wurde auch das Fettsäure-Derivat Linolsäure-Methylester isoliert und mittels NMR identifiziert. Die Substanzen Melleolide H und J verminderten die Degranulation von RBL-2H3-Zellen, Linolsäure-Methylester wies diesen Effekt nicht auf. Eine Zytotoxizitäts-Untersuchung von Extrakten und Reinsubstanzen wurde mittels des Neutral-Red-Uptake-Assay durchgeführt. Die Extrakte von T. populinum und A. ostoyae zeigten zytotoxische Wirkungen. Nach 24 h Inkubationszeit war diese deutlich stärker als nach 1 h. Auch die isolierten Reinsubstanzen wiesen eine Zytotoxizität auf. Der zytotoxische Effekt kann nicht für die Verminderung der Degranulation verantwortlich gemacht werden. Schädigende Effekte wären bereits im Degranulationsassay sichtbar, konnten jedoch bei Konzentrationen um den IC50-Wert nicht beobachtet werden. Der DCM-Extrakt aus dem Fruchtkörper des Pappel-Ritterlings zeigte einen inhibierenden Einfluss auf die Interleukin-2-Freisetzung stimulierter Jurkat-T-Zellen. Die in der mykologischen Literatur als essbar deklarierten Arten T. populinum und A. ostoyae könnten mittel- bis langfristig zumindest unterstützend bei allergischen Reaktionen Anwendung finden. Bei den Untersuchungen zur Qualitätssicherung standen Methoden zur Gehaltsbestimmung von Polysacchariden, β-Glucanen und Agaritin im Mittelpunkt. Diese wurden etabliert, optimiert und validiert. Einen guten Überblick über allgemeine Kohlenhydratgehalte gibt die Anthron-Methode. Bei dieser werden Polysaccharide hydrolysiert und zu Furfuralen umgewandelt, welche mit Anthron zu einem photometrisch bestimmbaren Produkt reagieren. Validierung erwies die Methode als geeignet für die Bestimmung des Gehaltes von Polysacchariden in Pilzextrakten. Weitergehende Informationen über die dreidimensionale Struktur der in Extrakten enthaltenen β-Glucane können durch die Anilinblau-Fluoreszenz-Methode erhalten werden. Die Methode erwies sich als selektiv für β-1,3-d-Glucane und bewies auch bei Untersuchung anderer Validierungsparameter ihre Eignung für eine β-Glucan-Gehaltsbestimmung. Mit der Kongorot-Methode sollen verzweigte β-1,3;1,6-d-Glucane erfasst werden. Diesen Glucanen wird häufig eine immunologische Aktivität zugerechnet. Allerdings erwies sich die Kongorot-Methode für die Informationsgewinnung über eine 3D-Struktur als weniger geeignet, da ihre Sensitivität zu gering und ihre Selektivität zu schwach ausgeprägt ist. Agaritin als Substanz mit interessanten und widersprüchlichen biologischen Effekten. Es wurde eine Methode etabliert, bei der Agaritin aus pulverisierten Fruchtkörpern extrahiert, durch SPE aufgereinigt und mittels LC-MS/MS und MRM im positiven Ionisationsmodus bestimmt wurde. Die Quantifizierung geschah mithilfe der Extern-Standard-Kalibration mit Agaritin als Referenzsubstanz. Die untersuchte Methode ist dazu geeignet, Agaritin zu quantifizieren, was durch die durchgeführte Validierung belegt wurde.
Das Material Titan wird Aufgrund seiner biokompatiblen Eigenschaften für orthopädische und dentale Implantate eingesetzt. Neben der erfolgreichen Implantation kommt es jedoch in manchen Fällen zu Komplikationen. Ein Grund für die Komplikationen können Kohlenwasserstoff-Kontaminationen auf der Titanoxid-Oberfläche sein. Diese aus der Luft stammenden Kontaminationen wurden im Rahmen dieser Arbeit analysiert und deren Einfluss auf die Adsorption von Aminosäuren studiert. Als Modellsystem wurden Alkohole gewählt, da deren Konzentration in der Krankenhausluft stark erhöht ist. Zur Analyse der Adsorption auf Titanoxid wurden Isothermen im Druckbereich von 10^-6 bis 10^4 Pa mit Alkoholen und Wasser gemessen. Hierbei konnte beobachtet werden, dass die Adsorption der Alkohole bei geringerem Druck (10^-6 Pa) beginnt als die des Wassers (10^-4 Pa). Eine weitere wichtige Erkenntnis ist, dass sowohl das Wasser als auch die Alkohole schon bei Drücken adsorbieren, die unterhalb der Partialdrücke der jeweiligen Substanz in der Atmosphäre liegen. Zur Ermittlung der zugehörigen Adsorptionsenergien wurden die Daten an die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Brunauer-Emmet-Teller-Freundlich-Isotherme (BFI) angepasst. Die BFI unterscheidet sich von der klassischen Freundlichisotherme in der Beschreibung der lokalen Isothermen der heterogenen Oberfläche. So ist die klassische Freundlich-Isotherme durch eine Summe von Langmuir-Isothermen gegeben, wobei die BFI durch die Summation von lokalen BET-Isothermen entsteht. Aus der Anpassung der Rohdaten folgt, dass die Adsorptionsenergie der ersten Monolage für die Alkohole 95 kJ/mol ist und die Adsorptionsenergie des Wassers im Intervall zwischen 70 und 95 kJ/mol liegt. Sowohl der geringe Druck, bei dem Adsorption statt findet, als auch die Adsorptionsenergien zeigen, dass die Adsorption von Alkoholen aus der Luft an Titanoxid-Oberflächen thermodynamisch günstig ist. Zur Analyse der Haftstärke wurden die Alkohole des Modellsystems von der feuchten Titanoxid-Oberfläche desorbiert. Hierzu wurde die Technik der Thermischen Desorptions Spektrometrie (TDS) angewendet. Dabei wird die TiO2- Oberfläch konstant erhitzt und zu jeder Temperatur ein Massenspektrum der Desorbatgasphase gemessen. Damit im Spektrum zwischen der Oberflächenfeuchtigkeit und den Hydroxylfunktionen aus dem Alkohol unterschieden werden konnte, wurde zuerst D-Wasser und danach der Analyt-Alkohol an die Oberfläche adsorbiert. Aus den Daten der TDS wurden dann die Hauptreaktionen ermittelt und festgestellt, dass die kleinen Moleküle D2O, Methanol und Ethanol signifikant molekular desorbieren wohingegen Propanol und Butanol verstärkt zur Fragment-Desorption neigen. Beim Vergleich der Desorption der Alkohole mit Wasser wurde ermittelt, dass die Oberflächenfeuchtigkeit bei geringerer Temperatur beginnt zu desorbieren als die Alkohole. Bei erhöhter Temperatur über 600 K wurden die Desorptionsreaktionen durch den Zerfall der Desorbate überlagert. Um diese Ergebnisse quantifizieren zu können, wurden die Daten mit dem neu entwickelten RED1-Modell (Desroption mit überlagerter Reaktion) angepasst. Die Ergebnisse der Anpassung sind die Desorptionsenergien für die Alkohole (~162 kJ/mol) und für die Oberflächenfeuchtigkeit (~138 kJ/mol). Aus den Desorptionsenergien geht klar hervor, dass der Alkohol stärker an der TiO2-Oberfläche haftet als das Wasser und somit die Desorption unter physiologischen Bedingungen nicht zu erwarten ist. Außer den Desorptions-Energien wurden die Arrhenius-Parameter der Zerfallsreaktion ermittel. Diese liegen für die Alkohole und das Wasser in der gleichen Größenordnung (k0,rkt=0.07-7.22 s-1 und Erkt=26.91-43.33 kJ/mol). Zum Ende der Arbeit wurde der Einfluss der Kohlenwasserstoffschicht auf die Adsorption von Aminosäuren untersucht. Hierzu wurden die Oberflächen mit verschiedenen Methoden gereinigt, so dass die Adsorption auf der mit Kohlenwasserstoffen kontaminierten Oberfläche mit der Adsorption auf Oberflächen mit reduziertem Kohlenwasserstoffanteil verglichen werden konnte. Die Messungen zeigen, dass die Änderungen der Bedeckungen bei Adsorption auf kontaminierten Oberflächen kleiner sind als auf Oberflächen mit reduziertem Kohlenwasserstoff-Anteil. Dieser Effekt scheint in der Seitenkette der Aminosäure begründet zu sein. Die Kontamination scheint somit die Adsorption von Biomolekülen zu behindern. Unabhängig von dieser Arbeit konnten G. Müller et. al. zeigen51, dass mehr Zellen des Modellstamms für humane Osteoblasten MG63 auf der Oberfläche einer Titanlegierung gebunden werden, wenn der Kohlenwasserstoff-Anteil auf der Oberfläche reduziert ist. Da beide Arbeiten unabhängig und mit unterschiedlichen Methoden ein vergleichbares Ergebnis liefern, kann davon ausgegangen werden, dass die Luft im Operationssaal einen entscheidenden Einfluss auf den Erfolg der Implantation hat.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten Aptamere selektiert und charakterisiert werden, die an PF4 binden. PF4 ist ein kleines Cytokin, das aufgrund seiner Beteiligung an der Heparin induzierten Thrombozytopenie von gesteigertem klinischen Interesse ist und dessen biologische Funktion noch weitgehend unklar ist. Aptamere können aufgrund ihres breiten Anwendungsspektrums einen Beitrag leisten unbekannte Funktionen von Proteinen aufzuklären bzw. pathogene Effekte von Proteinen zu verhindern.Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche Selektionen durchgeführt. In einer ersten Selektion wurden die Bedingungen so angepasst, dass vor allem Sequenzen im Pool verblieben, die besonders große Komplexe mit PF4 bilden. Solch große Komplexe aus PF4 und Heparin stellen das Hauptantigen der HIT dar und durch strukturelle Untersuchungen könnten Vorhersagen getroffen werden, welche therapeutisch eingesetzten Aptamere potentiell immunogen wirken könnten. Nach Analyse der Sekundärstrukturen der erhaltenen Sequenzen durch Faltungsprogramme konnten neben stäbchenförmigen Sekundärstrukturen vor allem three- und four-way junctions als dominierende Sekundärstrukturmerkmale identifiziert werden. Auf Grundlage dieser Resultate wurde ein Modell entwickelt, wonach die Ausbildung großer Komplexe zwischen RNA und PF4 durch das Vorhandensein mehrerer Helices in einem Molekül RNA gefördert wird und dadurch große Netzwerke aus RNA und PF4 entstehen. Um einen Anhaltspunkt zu erhalten, welches der selektierten Aptamere eine erhöhte Neigung zur Komplexbildung aufweist, wurden die Bindungseigenschaften zunächst qualitativ im Gelshift-Assay bei erhöhten NaCl-Konzentrationen untersucht. Dabei kristallisierten sich fünf Aptamere heraus, die auch bei NaCl-Konzentrationen höher als die der finalen Selektionsrunde noch zur Bindung fähig waren.Diese Sequenzen wurden mittels Photonenkorrelationsspektroskopie untersucht um Aussagen zur Komplexgröße und Stabilität zu erhalten. Basierend auf den Ergebnissen der PCS erfolgte die Synthese zweier Derivate der vielversprechendsten Sequenz. Für alle drei Konstrukte konnte die Komplexbildung im Gelshift Assay nachgewiesen werden. In einer zweiten Selektion wurden die Bedingungen so gewählt, dass an deren Ende spezifisch bindende Aptamere erhalten wurden. Zunächst erfolgte ein Vergleich der Bindungseigenschaften der in dieser Selektion erhaltenen Aptamere mit denen der vorangegangenen Selektion. Dabei konnten deutlich Unterschiede mittels Gelshift-Analyse nachgewiesen werden. Zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten wurde versucht einen eigenen Sensorchip aufzubauen unter Verwendung vonPolyethylenglykol. Auch dies führte nicht zum gewünschten Erfolg und führte dazu, dass versucht wurde die Dissoziationskonstanten durch Immobilisierung von PF4 zu bestimmen. Durch die Struktur von PF4, in der die Monomere nichtkovalent miteinander verbunden sind, gelang es wiederum nicht eine stabile Oberfläche zu generieren, wodurch sich die Verwendung des Biacors zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten als ungeeignet herausstellte. Aus diesem Grund wurde versucht die Dissoziationskonstanten durch CD-Spektroskopie zu ermitteln. Nach Auswertung der Spektren konnte festgestellt werden, dass durch die Bindung der RNA an PF4 eine Strukturänderung im Protein induziert wird, durch die der Anteil antiparalleler β-Faltblätter zunimmt und der Anteil α-helikaler Bereiche und β-Turns abnimmt. Gleichzeitig wurde deutlich, dass sowohl spezifische- als auch elektrostatische Interaktionen einen Beitrag zur Bindung der Aptamere an PF4 leisten, wobei bei hohen Konzentrationen der Beitrag der elektrostatischen Wechselwirkungen überwiegt. Durch diese Kombination aus spezifischen und elektrostatischen Wechselwirkungen ist eine genaue Bestimmung der Dissoziationskonstanten nicht möglich und für die Aptamere konnte nur ein erster Anhaltspunkt, bestimmt werden.
Within this thesis the protein engineering, immobilization and application of enzymes in organic synthesis were studied in order to enhance the productivity of diverse biotransformations. Article I is a review about Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMO) and provides a detailed overview of the most recent advantages in the application of that enzyme class in biocatalysis. Protein engineering of a former uncharacterized polyol-dehydrogenase (PDH) identified in the mesothermophilic bacterium Deinococcus geothermalis 11300 is described in Article II. Article III covers the combination of one PDH mutant with a BVMO in a closed-loop cascade reaction, thus enabling direct oxidation of cyclohexanol to ε-caprolactone with an internal cofactor recycling of NADP(H). Article IV and Article V report a process optimization for transamination reactions due to a newly developed immobilization protocol for five (S)- and (R)-selective aminotransferases (ATA) on chitosan support. Furthermore, the immobilized ATAs were applied in asymmetric amine synthesis. In Article VI, an ATA immobilized on chitosan, an encapsulated BVMO whole cell catalyst and a commercially available immobilized lipase were applied in a traditional fixed-bed (FBR) or stirred-tank reactor (STR), and were compared to a novel reactor design (SpinChem, SCR) for heterogeneous biocatalysis.
Acute pancreatitis is a common clinical inflammatory disease with variable severity from mild, self-limiting attacks to a severe lethal attack with a high mortality. In most of the cases, acute pancreatitis is either caused by gallstone obstruction or excessive alcohol consumption. Clinical symptoms include elevated levels (minimum 3 times than normal) of pancreatic enzymes such as amylase or lipase in serum. It is generally believed that earliest event in acute pancreatitis occur in acinar cells which includes premature protease activation and cytoplasmic vacuole formation. Premature trypsinogen activation has been considered as chief culprit as it can activate other proteases in a cascade like manner in acinar cells. Trypsin activity takes place in a biphasic curve with elevated levels at 1 h and 8 h in the initial stages up to 24 h in caerulein induced pancreatitis in mice. It has been shown that cytoplasmic vacuoles observed in pancreatitis are of autophagic nature. The role of autophagy for the disease onset and its role in trypsinogen is much of a debate. Hence, we studied the relation between autophagosome formation and trypsinogen activation in first 12h of pancreatitis. Although autophagosomes were found to be co-localised with trypsin in vivo, this was found to be a late event occuring only by 4 h. Substrate specific trypsin activity and western blotting from both sub-cellular fractions over the time course of pancreatitis and multiple fractions prepared from 1 h caerulein induced pancreatic tissue revealed that trypsin activity observed at 1 h occured in a zymogen enriched fraction. In line simultaneous confocal imaging of trypsin activity and autophagosome formation in hyperstimulated acini isolated from GFP-LC3 mice showed that both processes are independent and take place in parallel. Furthermore, protease inhibition by gabexate mesilate did not prevent autophagosome formation indicating that trypsinogen activation is not a prerequisite for vacuole formation. Even though, autophagosomes and active trypsin were found to be co-localised around 30 minutes to some degree upon cholecystokinin hyperstimulation, the earliest trypsin activation started to appear by 15 minutes and was independent of autophagosomes. The earliest active trypsin was found to be co-localised along with the cis-Golgi complex suggesting that the Golgi apparatus and its pre-condensed zymogen granules are the compartment responsible for the trypsinogen activation. 2) Protease activation in pancreatic acinar cells considered as the early hallmark event in the acute pancreatitis. However, the disease is aggravated by the infiltration of the leukocytes. Activated proteases mediate acinar cell injury and hereby cause the release of chemokines, which in turn attract inflammatory cells. Transmigrated inflammatory cells cause systemic damage that deteriorates the condition of the disease. Neutrophil elastase has been reported to be involved in the dissociation of cell-cell contact at adherens junctions by the extracellular cleavage of E-cadherin. This subsequently leads to transmigration of leukocytes into the epithelial tissue during the initial phase of experimental pancreatitis and aggravates the disease condition. On the other hand, pancreatic elastase substantially contributes to acinar cell necrosis. In this study, ZD0892, an orally bioavailable dual inhibitor against both elastases was tested for its efficacy to ameliorate severity in acute pancreatitis. ZD0892 orally fed mice showed increased survival compared to the control group in the taurocholate model of severe pancreatitis. In the initial stages of pancreatitis up to 24 h, the severity markers were found to be significantly lower in the inhibitor treated group. Treatment of mice with ZD0892 did not impede the defensive property of the leukocytes such as phagocytosis or oxidative burst. In caerulein induced pancreatitis, a mild form of acute pancreatitis, in rats, the local damage measured as serum amylase and lipase, wet dry ratio, and pancreatic myeloperoxidase levels were significantly lower in the inhibitor group. Systemic inflammatory parameters such as myeloperoxidase activity in lung was found to be significantly lower in the inhibitor fed rats. Inhibitor feeding resulted in lesser elastolytic activity compared to control group indicating that extracellular matrix was less damaged. Prophylactic treatment of pancreatitis with an orally available inhibitor with a dual specificity against pancreatic elastase and PMN-elastase was shown to ameliorate both local and systemic damage. Hence, in overall, ZD0892 treatment is proved to be beneficial to the mice and rats in experimental pancreatitis and should be considered for treatment in humans as the substance has been already studied in phase I and II trails for other indications.
In der modernen Augenheilkunde werden Injektionen und Implantate in periokulare Regionen oder direkt in den Glaskörper injiziert. Bei der Entwicklung neuer ophthalmologischer Implantate und Injektionen ist die In vitro-Testung der Wirkstofffreigabe und -verteilung von großer Bedeutung. Dabei stellen viele Testmethoden die In vivo-Situation nicht ausreichend dar. Einerseits bilden die Gewebe des Auges wie beispielsweise die Konjunktiva oder die Sklera Barrieren für den Transport des Arzneistoffes zum Wirkort. Andererseits ist der Einfluss der Gefäßsysteme von Konjunktiva und Choroidea auf die Verteilung und Elimination des Arzneistoffes zu berücksichtigen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Gewebe des Auges hinsichtlich ihrer Permeabilitätseigenschaften untersucht. Als Ergebnis wurden die Permeabilitätskoeffizienten von Ciprofloxacin, Lidocain, Timolol und Dexamethason für die Sklera, Konjunktiva, Kornea, den Retina-Choroidea-Komplex sowie für Kombinationen der aufgezählten Gewebe des Schweineauges erhalten. Als weitere Tiermodelle finden Gewebe von Rinder- und vor allem Kaninchenaugen in der ophthalmologischen Forschung Anwendung. Aus diesem Grund wurden die Permeabilitätsstudien um die Membranen dieser zwei Spezies erweitert. Der Interspezies-Vergleich zeigte sehr große Unterschiede in den Permeabilitäten der Wirkstoffe durch die Gewebe auf, sodass die direkte Übertragbarkeit von Ergebnissen zwischen den Tieren und auf den Menschen nicht gewährleistet ist. Um die Barriere-Eigenschaften der Augengewebe in ein In vitro-Modell zu integrieren wurden synthetische Membranen, die mit den Permeabilitätseigenschaften der Gewebe des Schweineauges übereinstimmen, identifiziert. Diese Membranen wurden zur Simulation der natürlichen Gewebe des Auges in den Mittelteil der neu entwickelten Zwei-Kanal-Durchflusszelle eingespannt. Die Zwei-Kanal-Durchflusszelle besteht aus drei Teilen, wobei die zwei äußeren Akzeptor-Kompartimente je einen Flusskanal, der mit Ringer-Puffer perfundiert wird, enthalten. Durch Etablierung physiologischer Flussraten entlang der korrespondierenden Membranen wurde der konjunktivale und choroidale Blutfluss und somit die Permeabilitäten der Gewebe als auch der Einfluss der Blutgefäße zusammen in einem In vitro-Modell berücksichtigt. Um den Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit in den Flusskanälen und des osmotischen Verhältnis zwischen Probe und Perfusionsmedium auf die Wirkstoffverteilung im System zu untersuchen, wurde eines der zwei Akzeptor-Kompartimente durch eine für Puffer und Wirkstoff undurchlässige Scheibe dicht verschlossen, sodass der Stofftransport nur in eine Richtung sattfinden konnte. Die Ergebnisse zeigten einen bedeutenden Einfluss dieser beiden Parameter auf die Wirkstoffverteilung. Bei Zuschaltung des zweiten perfundierten Akzeptor-Kompartiments der Zwei-Kanal-Durchflusszelle treten zwischen den Kompartimenten vermutlich Kräfte wie zum Beispiel Querströmungen und hydrostatische Druckgefälle auf. Basierend auf den erhaltenen Verteilungskurven der Wirkstoffe in der Zwei-Kanal-Durchflusszelle kann reine konzentrationsgesteuerte Diffusion durch die Membranen als alleiniger Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Die beschriebenen Effekte müssen vor der Etablierung der Zwei-Kanal-Durchflusszelle als biorelevante In vitro-Methode für die Charakterisierung von periokularen Injektionen und Implantaten in weiteren Arbeiten durch Änderungen des Modelldesigns behoben werden. Neben den peripheren Geweben des Auges dient der Glaskörper als Applikationsort für Injektionen makromolekularer Arzneistoffe und Implantate, die den inkorporierten Arzneistoff über einen längeren Zeitraum freigeben. Die intravitreale Freisetzung und Verteilung des Wirkstoffes ist für den therapeutischen Effekt von entscheidender Bedeutung. Um diese Prozesse in vitro zu charakterisieren wurde das Glaskörper-Modell entwickelt. Die Form und das Volumen des kugelförmigen Glaskorpus sind an die Geometrie des menschlichen Glaskörpers angepasst. Als Substitut für den natürlichen Glaskörper wurde ein Polyacrylamid-Gel modifiziert, sodass dieses in ausgewählten physiko-chemischen Eigenschaften dem natürlichen Glaskörper entspricht. Nach der Applikation des Wirkstoffes direkt in den Glaskörper muss dieser durch passive oder aktive Transportprozesse an den Wirkort im hinteren Augenabschnitt gelangen. Dabei wird die Wirkstoffverteilung im Glaskörper durch die Augenbewegung maßgeblich beeinflusst. Die Simulation verschiedener Augenbewegungen wurde mit der Entwicklung des Eye Movement Systems in ein In vitro-Modell umgesetzt. Das System ist in der Lage Geschwindigkeiten und Amplituden von langsamen bis schnellen Folgebewegungen, Sakkaden und Mikrosakkaden des Auges nachzuahmen. In die zentrale Halterung des Eye Movement Systems kann das Glaskörper-Modell integriert werden. Die Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell bietet die Möglichkeit den Einfluss der verschiedenen Augenbewegungen auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten von intravitrealen Injektionen und Implantaten zu untersuchen. Nach erfolgreicher Inbetriebnahme der beiden Systeme wurden Verteilungsstudien mit Modellarzneistoffen verschiedener Molekularmassen durchgeführt. Die Ergebnisse der Studien zeigten, dass das Molekulargewicht im vollständig mit Gel gefüllten Glaskörper-Modell Einfluss auf die Geschwindigkeit der vermuteten Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Substitut hat. Mit zunehmendem Anteil der flüssigen Phase im Glaskörper-Modell unterschieden sich die erhaltenen Verteilungen zwischen den Versuchen mit und ohne Bewegung deutlich. Bei der Simulation der hinteren Glaskörperablösung besitzt die Bewegung des Modells einen essentiellen Effekt auf die Konvektions- und Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Modell. Durch das Ersetzen prozentualer Anteile des Gels durch Ringer-Puffer konnten Bedingungen der hinteren Glaskörperablösung simuliert werden. Die Simulation des Alterungsprozesses bewirkte eine Zunahme der Konvektion im Glaskörper-Modell. Als Folge resultierte eine deutlich schnellere Umverteilung der injizierten Modellarzneistoffe. Die hintere Glaskörperablösung besitzt demzufolge einen großen Einfluss auf die Verteilung und darf in In vivo- und In vitro-Studien nicht vernachlässigt werden. Mit der Zwei-Kanal-Durchflusszelle und der Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell sind Konzepte für die Charakterisierung von periokularen und intravitrealen Arzneiformen entwickelt worden. In den Modellen wurde besonderer Wert auf die Anlehnung an die In vivo-Situation gelegt. Durch die Berücksichtigung der okularen Blutflüsse, die Simulation der Permeabilitätseigenschaften bestimmter Gewebe des Auges durch entsprechende synthetische Membranen, die Etablierung verschiedener Arten der Augenbewegung und der Simulation des Glaskörpers durch das Polyacrylamid-Gel wurden biorelevante Voraussetzungen geschaffen, die bisher in keinen anderen In vitro- Modellen zu finden sind. Vor der Etablierung der Zwei-Kammer-Durchflusszelle sind weitere Maßnahmen zur Unterbindung der physikalischen Störfaktoren nötig. Der theoretische Ansatz der Zwei-Kammer-Durchflusszelle konnte noch nicht in die Praxis umgesetzt werden. Unter Verwendung des Eye Movement Systems und des Glaskörper-Modells wird eine kostengünstige, einfache und schnelle Charakterisierung neuartiger intravitrealer Injektionen und Implantate unter In vitro- Bedingungen möglich. Die methodische Etablierung des Eye Movement Systems ist erfolgt. Durch weitere Modifikationen kann das System in Zukunft noch näher an die In vivo-Situation herangeführt werden.
With the development of new functional genomics methods that can access the whole genome, transcriptome, proteome and metabolome more comprehensive insights in cellular processes are possible. Largely based on these advances, our knowledge about molecular constituents for many organisms is increasing at a tremendous rate. Until today, the genomes of several organisms including pathogenic bacteria are already sequenced and pave the way for metabolic network constructions. Interest in metabolomics, the global profiling of metabolites in a cell, tissue or organism, has been rapidly increased. A range of analytical techniques, including nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS), liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS), Fourier Transform mass spectrometry (FT–MS), high performance liquid chromatography (HPLC) are required in order to maximize the number of metabolites that can be identified in a matrix. With the help of microbial metabolomics (qualification and quantification of a huge variety of metabolites from a bacterium) deciphering of the bacterial metabolism is feasible. The metabolome pipeline or workflow encompasses the processes of (i) sample generation and preparation, (ii) establishment of analytical techniques (iii) collection of analytical data, raw data pre-processing, (iv) data analysis and (v) data integration into biological questions. The present work contributes to the above mentioned steps in a metabolomics workflow. A specific focus was set to the exo- and endometabolome analysis of Gram-positive bacteria
Analyse der metabolischen Anpassung von Streptococcus pneumoniae an antimikrobielle Umwelteinflüsse
(2019)
Das Gram-positive Bakterium Streptococcus pneumoniae ist ein humanspezifisches Pathogen des oberen Respirationstraktes. Der opportunistische Krankheitserreger kann jedoch mehrere Organe befallen und tiefer in den Körper vordringen, was zu lokalen Entzündungen wie Sinusitis und Otitis media oder zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Pneumonie, Meningitis oder Sepsis führen kann. Für das Bakterium S. pneumoniae wurden bisher kaum Metabolom-Daten erhoben. Daher war das Ziel dieser Dissertation eine umfassende Charakterisierung des Metaboloms von S. pneumoniae. In dieser Dissertation wurden als analytische Methoden die Gaschromatografie (GC) und Flüssigkeitschromatografie (LC) jeweils gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) sowie die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) verwendet, um die Metaboliten zu analysieren. Es sind mehrere Analysetechniken erforderlich, um den Großteil des Metaboloms mit seinen chemisch verschiedenen Metaboliten zu erfassen. Artikel I fasst die Literatur zu Untersuchungen des Metabolismus von S. pneumoniae in den letzten Jahren zusammen. Um eine Momentaufnahme des biologischen Systems zum jeweiligen Zeitpunkt zu erhalten, ist neben dem reproduzierbaren Wachstum während der Kultivierung auch die exakte Probenahme zu beachten. Aus diesem Grund wurde in dieser Dissertation ein Probenahmeprotokoll für das Endometabolom von S. pneumoniae etabliert (Artikel II). Mithilfe des optimierten Protokolls wurde eine umfassende Metabolomanalyse in einem chemisch definierten Medium durchgeführt (Artikel II). Um S. pneumoniae in einer Umgebung ähnlich der im Wirt zu untersuchen, wurde in einem modifizierten Zellkulturmedium kultiviert. Intermediate zentraler Stoffwechselwege von S. pneumoniae wurden analysiert. Das intrazelluläre Stoffwechselprofil wies auf einen hohen glykolytischen Flux hin und bot Einblicke in den Peptidoglykan-Stoffwechsel. Darüber hinaus widerspiegelten die Ergebnisse die biochemische Abhängigkeit von S. pneumoniae von aus dem Wirt stammenden Nährstoffen. Ein umfassendes Verständnis der Stoffwechselwege von Pathogenen ist wichtig, um Erkenntnisse über die Anpassungsstrategien während einer Infektion zu gewinnen und so neue Angriffspunkte für Wirkstoffe zu identifizieren.
Die zunehmende Verbreitung von resistenten S. pneumoniae-Stämmen zwingt zur Suche nach neuen antibiotisch wirksamen Substanzen. Im Zuge dessen wurde in Artikel III die metabolische Reaktion von S. pneumoniae während des Wachstums unter dem Einfluss antibakterieller Substanzen mit dem Ziel der Identifizierung metabolischer Anpassungsprozesse untersucht. Dabei wurden Antibiotika mit unterschiedlichen Wirkmechanismen verwendet, wie die Beeinflussung der Zellwandbiosynthese (Cefotaxim, Teixobactin-Arg10), der Proteinbiosynthese (Azithromycin) sowie Nukleotidsynthese (Moxifloxacin). Es konnten keine Wirkmechanismus-spezifischen Marker-Metaboliten identifiziert werden. Jedes Antibiotikum verursachte weitreichende Veränderungen im gesamten Metabolom von S. pneumoniae. Die Nukleotid- und Zellwandsynthese waren am stärksten betroffen. Besonders vielversprechend sind Antibiotika mit zwei Wirkorten wie Teixobactin-Arg10 und Kombinationen aus zwei Antibiotika. In dieser Dissertation wurde das erste Mal das synthetisch hergestellte Teixobactin-Arg10 mittels einer der modernen OMICS-Techniken untersucht. Die vorliegende umfassende Metabolom-Studie bietet wertvolle Erkenntnisse für Forscher, die an der Identifizierung neuer antibakterieller Substanzen arbeiten.
Insgesamt tragen die Ergebnisse der Dissertation zu einem besseren Verständnis der bakteriellen Physiologie bei.