540 Chemie
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Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige alpha-Phosphanylaminosäuren untersucht. Die Verbindungen wurden durch eine Dreikomponenten-Eintopfreaktion bei Raumtemperatur aus Diphenylphosphan, einem primären Amin und Glyoxylsäure hergestellt. Alle Verbindungen sind luftempfindlich und bilden in Lösung langsam Zersetzungsprodukte. Es wurden P-Sulfide, P-Oxide und P-Pentacarbonylmetall(0)komplexe hergestellt, Versuche zur Synthese von BH3-Addukten in Molverhältnis 1:1 und 1:3 durchgeführt. Das enantiomerenreine 1-(p-methoxyphenyl)ethyl-substituierte Phosphanylglycin wurde als Ligand auf Eignung in enantioselektiven, katalytischen Hydrierungen verschiedener alpha-, beta-ungesättigter Ketoverbindungen untersucht. Sieben Verbindungen aus verschiedenen Gruppen N-substituierter Phosphanylglycine wurden als Liganden mit Ni(COD)2 zu in situ in Katalysatoren umgesetzt und damit die Poly/Oligomerisation von Ethylen untersucht. Die meisten untersuchten Liganden bewirkten hohe katalytische Umsätze von Ethylen und zeigten somit gute Eignung als Liganden zur Stabilisierung aktiver Ni-Oligomerisationskatalysatoren.
Im Laufe der letzten Jahre hat sich herausgestellt, dass Transportproteine einen entscheidenden Beitrag zur Absorption, Verteilung und Elimination zahlreicher Endo- und Xenobiotika leisten. Vor allem die hepatobiliäre Elimination nimmt eine Schlüsselrolle in systemischen Clearance-Prozessen ein. Vor dem Hintergrund, dass immer mehr hochmolekulare und metabolisch stabile Stoffe Eingang in die Arzneistoffentwicklung finden und diese vorwiegend hepatobiliär eliminiert werden, wurde es erforderlich, differenziertere Kompartimentmodelle zu entwickeln, um singuläre Substanzeffekte auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Gerade Interaktionen zwischen simultan verabreichten Arzneistoffen können zu erheblichen Nebenwirkungen durch Veränderung pharmakokinetischer Eliminationsprozesse in Kombination mit erhöhter oder eingeschränkter Bioverfügbarkeit führen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, für die frühe Arzneistoffentwicklung ein In vitro-Modell auf Basis des pharmakokinetischen Standardtiermodells der Ratte zu konzipieren, welches eine einfache Analyse hepatobiliärer Elimination auf indirektem Weg über die Interaktion mit fluoreszierenden Modellsubstraten ermöglicht. Die Zielvorgabe wurde umgesetzt, indem auf Basis literaturbeschriebener Methoden ein In vitro-Rattenhepatozytenmodell etabliert wurde. Hierfür war es zunächst unerlässlich, geeignete Kultivierungsbedingungen zu identifizieren und zu optimieren. Es konnte gezeigt werden, dass primäre Hepatozyten nur befähigt wurden, sich in vitro zu repolarisieren und eine in vivo-ähnliche Morphologie anzunehmen, wenn sie eingebettet zwischen zwei extrazellulären Kollagenmatrices kultiviert wurden. Diese sogenannte Sandwichkultivierung der Zellen und die Supplementierung des Zellkulturmediums mit dem Glukokortikoid Dexamethason erwiesen sich hierfür als wesentliche Faktoren. Die Hepatozyten reformierten sich folglich innerhalb von 96 Stunden unter Ausbildung eines vollständigen und sehr einheitlichen Gallengangssystems, welches nahezu jeden Hepatozyten umschloss. Nach Etablierung der Zellkultur wurden die sandwichkultivierten Hepatozyten hinsichtlich der Proteinexpression, ausgewählte Transportproteine und Cytochrome umfassend, über einen Kultivierungszeitraum von 10 Tagen charakterisiert, um die Validität des Zellsystems zu gewährleisten. Unter Bei-behaltung der optimierten Kultivierungsbedingungen konnte mit zunehmendem Repolarisierungsstatus der Zellen ein Anstieg der apikalen Transportproteinexpression unter Begleitung einer Erhöhung der molekularen Masse der Transportproteine verzeichnet werden. Als Grund für die Molekulargewichtszunahme im Laufe des Redifferenzierungsprozesses der Zellen konnte die posttranslationale N-Glykosylierung am Beispiel der Transportproteine P-gp, Mrp2 und Bcrp identifiziert werden. Verifiziert wurden die Proteinexpressionsdaten, die apikalen Effluxtransporter P-gp, Mrp2, Bsep und Bcrp betreffend, über die Bestimmung der funktionellen Aktivität unter Verwendung fluoreszierender Modellsubstrate über einen Kultivierungszeitraum von 8 Tagen. Diese funktionelle Aktivität der Transportproteine wurde durch das Erscheinen fluoreszierender Moleküle in den Lumina der Gallenkanälchen ersichtlich und nahm mit voranschreitender Maturierung des Gallenkanalnetzwerkes sowie mit Verstärkung der Transportproteinexpression, gekoppelt mit dem Grad der N-Glykosylierung, zu. Die Selektivität der einzelnen Modellsubstrate wurde mittels in der Literatur beschriebener Substrate und Inhibitoren untersucht und bestätigt. Auf Basis der funktionellen Charakterisierung wurde im Anschluss eine indirekte In vitro-Methode entwickelt, welche die Voraussetzung schuf, Interaktionspotentiale von Arzneistoffen mit Effluxtransportproteinen zu evaluieren. Die Inhibition eines apikalen Transportproteins resultierte dabei prinzipiell in Abhängigkeit der eingesetzten Substanzkonzentration in einer Reduktion des eliminierten fluoreszierenden Modellsubstratanteils, was mit einer Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz korrelierte. So konnte aufgezeigt werden, dass bekannte Inhibitoren und Substrate die Transport-proteinaktivität konzentrationsabhängig reduzierten, ohne dass der sichtbare Effekt auf toxische Effekte der eingesetzten Substanzen zurückzuführen war. Dies konnte mittels des Zelltoxizitätsmarkers Alamar blue nachgewiesen werden. Clonidin, welches nicht als ABC-Transportersubstrat beschrieben worden ist, interagierte erwartungsgemäß auch mit keinem der Transportprozesse. Der Einsatz eines derartigen In vitro-Systems in der frühen Arzneistoffentwicklung könnte helfen, geeignete Arzneistoffkandidaten auszuwählen, welche ein geringes Potential aufweisen, mit hepatobiliären Effluxsystemen zu interagieren, um die Gefahr schwerer Arzneimittelnebenwirkungen zu minimieren.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die funktionelle Expression der 4-Hydroxyacetophenon-Monooxygenase (HAPMO) aus Ps. putida JD1 etabliert werden. Die im Kolbenmaßstab entwickelte Expressionsstrategie konnte auf einen Kultivierungsmaßstab von bis zu vier Litern übertragen werden. Außerdem konnten die Reaktionsbedingungen für die enantioselektive enzymatische Baeyer- Villiger-Oxidation von 3-Phenyl-2-butanon durch die HAPMO optimiert werden, auch hier war die Übertragung auf einen größeren Maßstab möglich. Durch die Verwendung von Lewatit® VP OC 1064 MD PH, einem hydrophoben Adsorbens, als zweiter Phase konnte in einem in situ SFPR-System (substrate feed and product removal) die Inhibierung der HAPMO auch bei höheren Substratmengen umgangen werden. Auf diese Weise war es möglich, in Biokatalysen das Substrat in einer Konzentration von 40 mM einzusetzen. Im Verlauf dieser Biokatalysen konnte im Schüttelkolben ein Umsatz von annähernd 50% erreicht werden. Auch in Ganzzellbiotransformationen im 500 mL-Maßstab konnte ein Umsatz von 30% erreicht werden. Mit p-Nitroacetophenon, α-Acetonaphthon und 3-Acetylindol konnten im Rahmen dieser Arbeit Substrate mit der HAPMO umgesetzt werden, die für den colorimetrischen Nachweis von Baeyer-Villiger-Monooxygenase-Aktivität verwendet werden können. In einem weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit wurde nach einer Möglichkeit gesucht, den Ausgangsstoff für die Biokatalysen, 3-Phenyl-2-butanon, in ausreichendem Umfang zu synthetisieren. Die bisher für die Synthese verwendete Umsetzung von 2-Phenylpropionsäure mit Methyllithium ist durch das Gefahrenpotential von Methyllithium nur bedingt in größerem Maßstab durchführbar. In einer alternativen Syntheseroute wurde 1-Phenyl-2-propanol oxidiert und das entstehende Keton mit Methyliodid methyliert. Beide Reaktionsschritte konnten mit nahezu vollständigem Umsatz durchgeführt werden. Durch die Verwendung der Vakuumdestillation zur Aufreinigung des Produktes konnten Ausbeuten von über 90% erreicht werden.
Discovery of novel Baeyer-Villiger monooxygenases and their application in organic synthesis.
(2009)
The application of BVMOs in kinetic resolution is a versatile alternative for the synthesis of optically pure esters. Within this thesis BVMOs proved to be highly active against a broad range of linear and aryl aliphatic ketones yielding a variety of enantiopure products. Among the beta-hydroxy ketones several CHMOs and BVMOPsfl showed the best results (E > 100), whereas the application of the latter enzyme also allowed access to the abnormal esters (regioisomeric excess > 40%). Interestingly, some enzymes showed a reduced activity and selectivity with a growing chain length of the ketone, suggesting that middle-chain ketones (C8-C10) might be preferred. Moreover, the production of optically pure 1,2-diols was observed (yields 8-50%), resulting from an in vivo hydrolysis of the 2-hydroxy alkyl acetates. Regarding the N-protected beta-amino ketones, results were different. While the majority of CHMOs catalyzed linear substrates showing high enantioselectivities (for CHMOBrevi1 and CHMOBrachy E > 100, c = 40-50%), BVMOPsfl did not convert nitrogen bearing linear ketones, although this might also be justified with the methylcarbamate protecting group. Interestingly, the number of BVMOs catalyzing oxidation of spatially more demanding linear branched beta-amino ketones was greatly reduced, indicating steric hindrance that was also combined with a decrease in selectivity. Similar to the observation for beta-hydroxy ketones, also the 2 amino alkyl acetates hydrolyzed furnishing 2-amino alcohols (yields 9-52%). Moreover, hydrolysis of the “abnormal“ esters allowed an alternative access to valuable native and non-native β-amino acids. In a two step process, using CDMO from R. ruber and CAL-B, it was possible to generate N-protected (+)-beta-leucine. During kinetic resolutions of aryl aliphatic ketones it was observed that the highest enantio¬selectivities could be achieved utilizing HAPMOJD1, HAPMOACB and PAMO, enzymes typically preferring aromatic substrates. Biotransformation with 3-phenyl-2-butanone revealed an E-value > 100 for HAPMOJD1 (S-selective). Nevertheless, also BVMOPsfl converted this sub¬strate (E = 43), and also CHMOAcineto and CPMO oxidized it, although selectivity was rather low (E < 5). Interestingly, BVMOKT2440 was the only examined enzyme showing R selectivity (E = 13). Additionally, increasing the scale and performing biotransformation in a baffled flask could increase enantioselectivity of BVMOPsfl from E = 43 to 82. The discovery of novel enzymes with diverse properties is still a main goal of the biotechnological industry. Within these studies, two BVMOs (BVMOKT2440 and HAPMOJD1) could be successfully amplified from genomic DNA using different PCR-methods. Then, expression in E. coli was optimized, revealing that the reduction of expression temperature, implementation of E. coli JM109 or RosettaTM (DE3), possessing the pRARE plasmid to facilitate translation of rare codons in the latter case, and/or co-expression of chaperones (pGro7: GroEL/ES-familiy) could increase the amount of soluble and active protein. Both enzymes were subjected to biocatalysis and it was found that BVMOKT2440 preferentially oxidized linear ketones, while HAPMOJD1 dominantly converted aryl aliphatic ketones. The latter enzyme could be purified by anion exchange and affinity chromatography allowing examination of kinetic parameters. Thereby, HAPMOJD1 displayed lowest KM-values for acetophenone derivatives bearing their substituent in para-position (KM < 320 µM). Moreover, also aldehydes and heteroaromatic compounds were oxidized and also sulfoxidation was observed. Interestingly it was found, that both BVMO genes are located in the direct neighborhood of a dehydrogenase and a hydrolase. This led to the suggestion that these enzymes may be metabolically connected in the degradation of their natural substrate.
Twinribozyme vermitteln den Austausch eines internen Teilfragments gegen ein extern hinzugefügtes Reparaturoligonukleotid abweichender Sequenz innerhalb einer RNA Sequenz durch ortsspezifische Katalyse zweier Spalt- und Ligationsereignisse. Eine twinribozymvermittelte RNA Sequenzmanipulation kann deshalb zur spezifischen Reparatur genetischer Dispositionen auf mRNA-Ebene verwendet werden. Das Potential von Twinribozymen zur Reparatur kurzer Deletionsmutationen wurde bereits an Modellsystemen erfolgreich demonstriert. Zur Erweiterung der Twinribozym-Strategie hinsichtlich therapeutischer Applikationen wurde ein Twinribozym durch rationales Design mit kombinierter Mutagenese entwickelt, welches die Reparatur einer in frame Deletion eines UCU343-345 Codons innerhalb der onkogenen CTNNB1 mRNA Zielsequenz vermittelt. Mehr als 23% der mutierten CTNNB1 mRNA Zielsequenz konnten in die entsprechende Wildtyp-Sequenz in vitro überführt werden. Eine Twinribozym-vermittelte Reparatur der β-Catenin kodierenden CTNNB1-mRNA könnte deshalb eine Wnt-Liganden abhängige Regulation der Proliferation, Mobilität und Differenzierung von Zellen wiederherstellen.
Esterasen und Lipasen finden große Anwendung für die organische Synthese, da sie ein breites Substratspektrum besitzen, in organischen Lösungsmitteln oftmals stabil sind und hohe Enantioselektivitäten auch gegenüber nicht-natürlichen Substraten erreichen können. Die Schweineleberesterase (PLE) ist die bedeutenste Esterase für die Feinchemie. Für die biotechnologische Anwendung ist jedoch der Extrakt aus Schweinelebergeweben, aufgrund des tierischen Ursprungs und der Heterogenität (Vorkommen von verschiedenen Isoenzymen), eher ungeeignet. In dieser Arbeit wird die erfolgreiche rekombinante Expression der PLE in E. coli, die Optimierung der Kultivierung und die Etablierung eines Fermentationsprozesses beschrieben. Weitere Isoenzyme wurden ebenfalls identifiziert, charakterisiert und biokatalytische Umsetzungen von pharmazeutisch relevanten Substraten, wobei neben den PLE-Varianten auch Enzyme aus dem Metagenom verwendet wurden, durchgeführt.
Untersuchungen zum Aufbau eines Assays zur in vitro Selektion eines Cytidindesaminase-Ribozyms
(2009)
In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Funktionalisierung von RNAs im Hinblick auf die Selektion eines Ribozyms, das die Desaminierung von Cytidin zu Uridin katalysieren kann, durchgeführt. Die Desaminierung von Cytidin verläuft proteinkatalysiert. Cytidindesaminasen (CDAs) sind im Nukleotidmetabolismus aller Lebewesen zu finden. In höheren Eukaryoten spielen CDAs beim RNA editing eine Rolle. In Säugetieren sind sie bedeutsam für die Immunabwehr. Ein Cytidindesaminase-Ribozym wäre in der Lage die gezielte Veränderung einer RNA-Sequenz zu katalysieren. Diese Eigenschaft wäre ein weiteres Indiz für eine präbiotische RNA-Welt und könnte auch in der Gentherapie nützlich sein. Bei der in vitro Selektion ist die Funktionalisierung der RNA-Bibliothek ein zentraler Punkt. 5’-Transkriptionspriming ist dafür besonders gut geeignet, da es kotranskriptionell, während der Transkription der RNA, stattfindet. Während der Transkription kann die T7 RNA Polymerase ein 5’-modifiziertes Guanosinmonophosphat am 5’-Ende, also am Anfang einer RNA-Sequenz, einbauen. Cytidin, das zu prozessierende Substrat der Selektion, wurde mit einem Guanosinmonophosphat verbunden. Solche modifizierten Guanosinmonophosphat-Verbindungen werden Initiatormoleküle genannt, da sie nur zu Beginn einer RNA-Transkription am 5’-Ende einer RNA eingebaut werden können. Um eine Selektion zu ermöglichen, wurde das Cytidin mit einer Markierung versehen. Es wurden zwei verschiedene Initiatormoleküle synthetisiert. Der eine Initiator bestand aus einer Guanosinmonophosphateinheit und einer Cytidineinheit, die eine Biotinmarkierung trug. Die Biotinmarkierung ermöglicht eine Selektion an der festen Phase durch die starke Wechselwirkung von Biotin und Streptavidin. Bei erfolgreicher Reaktion der RNA wird diese von der Festphase getrennt und kann durch Waschen der Festphase isoliert werden. Der andere Initiator trug statt der Biotinmarkierung eine Fluoreszeinmarkierung. Die Selektion mit diesem Initiator würde in Lösung stattfinden. Fluoreszein-markierte RNAs besitzen eine andere gelektrophoretische Mobilität als unmarkierte RNAs. Bei der Selektion spalten aktive RNAs die Fluoreszeinmarkierung ab. Durch Gelaufreinigung der Selektionsansätze könnten sie so auf Grund ihrer veränderten gelelektrophoretischen Mobilität isoliert werden. Zur Synthese der Moleküle wurden zwei unterschiedliche Synthesestrategien entwickelt und angewandt. Die erste Synthesestrategie bediente sich der Phosphoramiditchemie an der festen Phase und lieferte den Biotin-markierten Initiator in nanomolaren Mengen. Die zweite Strategie führt zur Synthese des Fluoreszein-markierten Initiators und beinhaltete eine 18-stufige Synthese in Lösung, die eine Ausbeute des Initiators im µ-molaren Bereich ermöglichte. Die Funktionalisierung von RNA mit dem Biotin-markierten Initiator wurde qualitativ nachgewiesen mit Hilfe einer auf Northern Blotting und Chemilumineszenzdetektion aufbauenden Methode. Dabei wurden die Transkriptionsprodukte auf einer Nylonmembran immobilisiert und mit einem Fusionsprotein aus Alkalischer Phosphatase und Streptavidin zur spezifischen Bindungen an die Biotinmarkierung inkubiert. Durch Zugabe eines Substrats der Alkalischen Phosphatase wird ein Chemiluminszenzsignal induziert, welches mit einem empfindlichen Photosystem detektiert und dokumentiert werden kann. Der erfolgreiche Einbau der Fluoreszein-markierten Initiatormoleküle wurde qualitativ mit Hilfe denaturierender Gelelektrophorese und Fluoreszenzanregung bei einer Wellenlänge von 365 nm nachgewiesen. Zur quantitativen Bestimmung des Einbaus wurde eine auf fluoreszenzspektroskopischen Anwendungen basierende Methode etabliert und erfolgreich angewendet. Dazu wurde eine zu 100% 5’-Fluoreszein-markierte RNA mit Hilfe des Phosphoramiditverfahrens synthetisiert. Zur Erstellung einer Eichgerade mit dieser Referenz-RNA wurden Proben mit bekannten Konzentrationen mit Hilfe eines Fluoreszenzspektrophotometers vermessen. Die jeweiligen gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Fluoreszenzemissionsmaxima der Proben wurden in einem Diagramm über der dazugehörigen Konzentration aufgetragen. Die so erstellte Eichgerade ermöglichte es anhand der gemessenen Fluoreszenzintensität einer Probe markierter RNAs die Konzentration der Probe zu ermitteln. Zur Bestimmung und Optimierung der Einbaueffizienz des Fluoreszein-markierten Initiators wurden Transkriptionspriming-reaktionen unter Variation der Transkriptionsbedingungen durchgeführt. Nach Optimierung der Reaktionsbedingungen wurde so eine Einbaurate von 18% erreicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit dokumentieren, dass grundsätzlich beide Inititatormoleküle zur Funktionalisierung einer RNA-Bibliothek und den damit verbundenen Selektionsstrategien, Festphase oder Selektion in Lösung, angewendet werden können. Die Fluoreszein-basierende Selektionsstrategie hätte den Vorteil einer direkteren Identifizierung und spezifischeren Quantifizierung der funktionalisierten RNA-Bibliothek.
Die Implantation von Arzneistoff-freisetzenden (drug-eluting) Stents in durch Ballonangioplastie revaskularisierte Koronararterien stellt heutzutage eine der wichtigsten Methoden zur Prävention von Restenosen der betroffenen Gefäßabschnitte dar. Die Erzielung wirksamer Konzentrationen der hochpotenten Wirkstoffe in der Gefäßwand unter Vermeidung von unerwünschten systemischen Arzneimittelwirkungen soll durch die kontrollierte Arzneistofffreisetzung im stenosierten Gefäßabschnitt gewährleistet werden. Aufgrund der Unzugänglichkeit des Wirkortes für direkte Konzentrationsbestimmungen liegen bis dato jedoch nur wenige Daten bezüglich der Wirkstofffreisetzung und -verteilung aus Humanstudien vor. Da die zur Verfügung stehenden offizinellen und nicht offizinellen Methoden zur Untersuchung des In vitro-Verhaltens von Arzneiformen lediglich ein Akzeptorkompartiment aufweisen, sind sie ebenfalls nur bedingt zur Vorhersage der Freisetzung aus einem Stent am Implantationsort geeignet. Verteilungprozesse können mit diesen Methoden nicht beschrieben werden. Aus diesem Grund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, einen an die In vivo-Bedingungen am Implantationsort adaptierten In vitro-Freisetzungstest für Arzneistoff-freisetzende Stents basierend auf den Methoden des Europäischen oder US-Amerikanischen Arzneibuchs zu entwickeln. Der Freisetzungstest sollte dazu geeignet sein, sowohl die Wirkstofffreisetzung und -verteilung zwischen verschiedenen Kompartimenten als auch räumliche Verteilungsmuster innerhalb eines Gefäßwand-simulierenden Kompartiments zu untersuchen. Als Basis für die Modellentwicklung wurde aufgrund der am Implantationsort in vivo vorliegenden Bedingungen die Durchflusszellen-Apparatur ausgewählt, die die einzige offizinelle Methode darstellt, bei der ein gerichteter Fluss erzeugt wird. Zur Simulation der Gefäßwand sollte ein zusätzliches Akzeptorkompartiment in die Durchflusszelle eingebracht werden. Da das Kompartiment einerseits formstabil sein sollte und andererseits die Aufnahme und den Transport des Arzneistoffs durch Diffusion ermöglichen sollte, wurden verschiedene Hydrogele hinsichtlich ihrer Eignung zur Integration in die Durchflusszelle untersucht. Calciumalginat wurde als geeignetes Hydrogel für das zusätzliche Akzeptorkompartiment identifiziert und durch Veränderungen an der Durchflusszellen-Apparatur erfolgreich in den Freisetzungstest integriert. Es wurde eine zentrale Aussparung im Hydrogel geschaffen, die im Modell das Gefäßlumen simuliert und in die ein Stent mittels Ballonkatheter implantiert werden kann. Nach der Implantation des Stents kann die Öffnung im Hydrogel mit dem Freisetzungsmedium mit einer Flussrate von 35 ml/min, die dem Blutfluss in Koronarien entspricht, perfundiert werden. Durch Einsatz geeigneter Medienvolumina kann die Einhaltung von Sinkbedingungen, die als das größte Problem der häufig eingesetzten nicht offizinellen Testsysteme gilt, sichergestellt werden. Nach erfolgter Entwicklung wurde die Eignung des Modells durch die Testung verschiedener Stentmodelle geprüft werden. Neben der Bestimmung der Freisetzung der Modellsubstanzen ins Durchflussmedium während der Perfusion und der am Versuchsendpunkt in der Stentbeschichtung verbliebenen Modellsubstanz-Anteile wurden verschiedene Methoden zur Untersuchung des Hydrogels nach Beendigung der Perfusion entwickelt. Zur direkten Quantifizierung der ins Hydrogel diffundierten Modellsubstanz wurde eine geeignete Methode zur Verflüssigung des Gels identifiziert. Zur Untersuchung der räumlichen Verteilung innerhalb des Hydrogels wurden zwei Methoden zur Präparation des Hydrogels entwickelt, die die Untersuchung im Fluoreszenzmikroskop ermöglichten. Einerseits wurde anhand von Mikrotomschnitten die Diffusionstiefe im Querschnitt untersucht. Unter Verwendung von Alginatfilmen war andererseits die Untersuchung der Innenseite des simulierten Gefäßlumens parallel zur Flussrichtung möglich. Unter Verwendung einer Finite-Elemente-Methode konnten zudem ausgewählte Freisetzungsversuche mathematisch modelliert werden. Für die Berechnungen wurden im Rahmen dieser Arbeit experimentell bestimmte Diffusionskoeffizienten zu Grunde gelegt. Die Ergebnisse der Freisetzung mit dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Testsystem wiesen im Vergleich zur Testung mit offizinellen Methoden eine Verlangsamung der Entleerung der Stentbeschichtung bei allen Modellsubstanzen durch die an die In vivo-Situation adaptierten Einbettungs- und Flussbedingungen auf. Diese Beeinflussung der Freisetzungsgeschwindigkeit durch die Freisetzungsbedingungen unterstreicht die Notwendigkeit, für die In vitro-Evaluation von Arzneistoff-freisetzenden Stents spezialisierte, an die In vivo-Bedingungen adaptierte Testsysteme einzusetzen. Mit dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Freisetzungsmodell steht erstmals ein solches Testsystem zur Verfügung.
Rekombinante Expression und Design der Aminoacylase 1 für die Synthese von N-Acyl-Aminosäuren
(2009)
Im Rahmen der Dissertation wurde die Möglichkeit der enzymatischen N Acylierung von Aminosäuren über eine thermodynamisch kontrollierte Reaktion im wässrigen Medium untersucht. Eine Auswahl von Biokatalysatoren wurde auf ihre Eignung hin untersucht und die Aminoacylase 1 aus der Schweineniere (pAcy1) als Wildtyp-Enzym ausgewählt. Es konnte gezeigt werden, dass das primäre Problem bei der pAcy1-katalysierten Synthese der Modellkomponente N-Lauroyl-L-Glutamat (NLLG) in einem sehr ungünstigen thermodynamischen Gleichgewicht liegt. Dieses konnte zwar durch den pH-Wert zugunsten der Synthese verschoben werden, lieferte aber auch unter optimierten Bedingungen nur unzureichende Umsätze. Als primäre Probleme auf Seiten des Biokatalysators wurde ein niedriges Verhältnis zwischen der Synthese und Hydrolyse des Produktes (S/H-Verhältnis) neben einer vergleichsweise schlechten Akzeptanz langkettiger Acyldonoren identifiziert. Um für eine Optimierung des Enzyms die Methoden des rationalen Protein Designs und der gerichteten Evolution zu nutzen, wurde ein rekombinantes Expressionssystem über ein synthetisches Gen der pAcy1 auf dem Vektor pET52(b) realisiert. Durch die Anpassung des Expressionsmediums, der Temperatur sowie der Co-Expression molekularer Chaperone konnten etwa 80 mg aufgereinigtes Enzym pro Liter Fermentationslösung erhalten werden. Das rekombinante Protein wurde biochemisch charakterisiert und die Aktivität gegenüber dem bevorzugten Substrat der pAcy1 N-Acetyl-L-Methionin (NAM) mit 94 U/mg quantifiziert. Die Optimierung des S/H-Verhältnisses der pAcy1 fokussierte sich auf das Potential der katalytischen Base (E146) zur Protonenaufnahme. Als Basis für ein rationales Design wurde ein Strukturmodell erstellt und ein Aspartat an der Position 346 identifiziert, welches den pKa-Wert von E146 maßgeblich beeinflusst. Durch Modellierungen der Elektrostatik im aktiven Zentrum wurde die Substitution von D346 zu Alanin, Asparaginsäure, Glutamat und Glutamin vorgeschlagen und weiterhin die Mutation der katalytischen Base selbst untersucht. Versuche zur Beschreibung des S/H-Verhältnisses von erstellten Varianten der pAcy1 wurden anschließend mit NAM als Modellkomponente durchgeführt. Bei allen Mutanten war ein starker Rückgang der Gesamtaktivität zu verzeichnen, wobei die Restaktivitäten der 146X-Varianten maximal 0,5% und die der 346X-Varianten maximal 9% bei der Hydrolyse betrugen. Durch die parallele Quantifizierung der Synthesereaktion konnte gezeigt werden, dass sich das S/H-Verhältnis durch die Substitution des Asp346 in beide Richtungen verschieben lässt, wobei die gewünschte Erhöhung des Verhältnisses mit einer stark verminderten Gesamtaktivität einhergeht. Die Mutante D346A wies z.B. eine Erhöhung des S/H-Verhältnisses von 0.02 auf 0.18 auf, wobei allerdings die Restaktivität im Vergleich zum Wildtyp-Enzym bei der Synthese 0.2% und die in der Hydrolyse 0.05% betrug. Zur Erklärung dieser Beobachtungen wurde die pH-Abhängigkeit der pAcy1-Varianten für die Hydrolyse des artifiziellen Substrats Furyl-Acyl-M ethionin (FAM) bestimmt. Eine Verschiebung des pH-Optimums ins Saure bzw. ins Basische korrelierte bei D346A bzw. D346E mit der zuvor bestimmten Verschiebung des S/H-Verhältnisses. Weiterhin sollte die Affinität der pAcy1 gegenüber langkettiger Acyldonoren durch gerichtete Evolution erhöht werden. Da aus der Literatur bekannt ist, dass die Reste I177, T345, L370 die Acylbindetasche des Enzyms definieren, wurden diese über iterative Sättigungsmutagenese randomisiert und so etwa 32.000 Varianten der pAcy1 erzeugt. Zur Charakterisierung einer Mutantenbibliothek wurde ein hochdurchsatzfähiges Expressions- und Screeningsystem etabliert, wofür das bereits realisierte Expressionssystem auf den Mikrolitermaßstab übertragen und auf die besonderen Ansprüche hin optimiert wurde. Zur Charakterisierung der Enzyme wurde eine modifizierte Form eines bereits beschriebenen Proteaseassays verwendet, welcher eine kontinuierliche Messung der entstehenden Aminosäure als Produkt der Hydrolysereaktion erlaubte. Eine vorhergehende Selektion aktiver Varianten auf Minimalmedium erlaubt ein effizientes Screening der Mutantenbibliothek. Das Screening- und Selektionssystem wurde bisher mit der Wildtyp-pAcy1 und einer inaktiven Mutante erfolgreich getestet und zeigte Schwankungen von lediglich ±10%. Das noch ausstehende Screening der Mutantenbibliothek wird in laufenden Arbeiten durchgeführt.