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Plättchenfaktor 4 (PF4, CXCL4) ist ein 7.8 kDa stark positiv geladenes Protein, das zur Familie der CXC-Chemokine gehört. PF4 wird als Tetramer in den alpha-Granula von Thrombozyten gespeichert und bei deren Aktivierung freigesetzt. Seine biologische Funktion ist weitgehend unbekannt. Allerdings spielt PF4 eine wichtige Rolle bei der Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT), einer der häufigsten immunologisch bedingten Arzneimittelkomplikationen, die Blutzellen betreffen. PF4 und Heparin bilden Komplexe, die Neoepitope generieren und die Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern induzieren. Resultierende Immunkomplexe aktivieren Thrombozyten Fc-Rezeptor-vermittelt und führen zu einer paradoxen Thrombinbildung. Die Folgen können Thrombozytopenie und lebensbedrohliche Thrombosen sein. Die pathogenen Antikörper sind nicht spezifisch für Heparin und erkennen auch PF4 gebunden an andere Polyanionen. Die Immunantwort der HIT zeigt einige Besonderheiten. Bereits bei erstmaliger Heparinexposition treten anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgG bereits nach 4-6 Tagen auf. Dies kann keine primäre Immunantwort sein, da bei dieser IgG-Antikörper erst deutlich später gebildet werden. Damit muss eine Vorimmunisierung mit natürlich auftretenden PF4/Polyanion-Komplexen stattgefunden haben. Eine mögliche Quelle wären negativ geladene Strukturen, die auf bakteriellen Zelloberflächen vorkommen. Ziel dieser Arbeit war es, die Bindung von PF4 an Zelloberflächen zu charakterisieren und insbesondere die Frage zu klären, ob PF4 auf der Bakterienoberfläche Komplexe bildet. Zunächst erfolgte die Etablierung einer durchflusszytometrischen Analysemethode zur Messung der PF4-Bindung an Thrombozyten in Abhängigkeit von antikoagulatorischen Polyanionen. Die PF4-Bindung war nicht von der antikoagulatorischen Wirksamkeit der Polyanionen abhängig, sondern von der negativen Ladungsdichte. Geringe Konzentrationen von Heparin haben die PF4-Bindung an Thrombozyten verstärkt, wohingegen hohe Konzentrationen die PF4-Bindung inhibierten. Auch mit PF4 exprimierenden HEK-Zellen konnte eine ladungsabhängige Bindung von PF4 nachgewiesen werden. Als nächstes wurde die Bindung von PF4 an Bakterien untersucht. PF4 hat auch hier, konzentrations- und ladungsabhängig, an Gram-positive und Gram-negative Bakterien gebunden. Mittels der Adsorptions-Elutions-Technik konnte dann gezeigt werden, dass es durch die Bindung von PF4 an Bakterien zur Ausbildung PF4/Heparin-ähnlicher Epitope kommt, welche von anti-PF4/Heparin-Antikörpern aus Patientenserum erkannt werden. Mit einem Phagozytoseassay wurde dann nachgewiesen, dass die durch PF4 vermittelte Bindung der anti-PF4/Heparin-Antikörper an Bakterien die Phagozytose durch polymorph nukleäre Zellen (PMN) fördert. Dass dieser Abwehrmechanismus tatsächlich in vivo bedeutsam ist, konnte in dem Maus-Sepsis-Modell Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) gezeigt werden. Die 6-8 Wochen jungen Mäuse entwickelten ab 3 Tagen nach der CASP-Operation anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgM und ab 14 Tagen der Klasse IgG. Dieser Antikörperverlauf passt zur Immunreaktion nach erstmaligem Antigenkontakt und beweist, dass Bakterienkontakt im Rahmen der Sepsis eine primäre Immunisierung gegen PF4/Heparin induzieren kann. Jedoch ist die Sepsis, eine lebensbedrohliche Erkrankung, viel zu selten um das Auftreten von anti-PF4/Heparin-Antikörpern in der Normalbevölkerung (18.8% anti-PF4/Heparin IgM, 6.1% anti-PF4/Heparin IgG) und bei 50% der Patienten nach kardiochirurgischem Eingriff erklären zu können. Eine häufiger auftretende, chronische, bakterielle Infektion ist die Parodontitis. Im Rahmen der SHIP-Studie (Study of Health in Pomerania) konnte dann gezeigt werden, dass der Parodontitis-Status mit dem Auftreten von anti-PF4/Heparin-Antikörpern korreliert. Unterstützend konnte gezeigt werden, dass PF4 auch von parodontalpathogenen Bakterien gebunden wird und darüber die Bindung von anti-PF4/Heparin-Antikörpern ermöglicht wird. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit eine bislang unbekannte Funktion von PF4 in der anti-bakteriellen Wirtsabwehr. Gleichzeitig wurde die Frage geklärt, warum Patienten, die das erste Mal Heparin erhalten bereits an Tag 4-6 IgG-Antikörper gegen PF4/Heparin bilden. Somit konnte ein wichtiger Beitrag zur pathophysiologischen Erklärung einer der derzeit häufigsten immunvermittelten, unerwünschten Arzneimittelwirkungen geleistet werden. Hinsichtlich der biologischen Bedeutung von PF4 ist von besonderer Wichtigkeit, dass PF4 ladungsabhängig an viele verschiedene Bakterienspezies bindet. Damit sind Antikörper gegen PF4/Polyanion-Komplexe nicht spezifisch für eine Bakterienspezies, sondern können eine Form der Wirtsabwehr darstellen, bei der eine IgG-Spezifität eine Vielzahl von PF4-markierten Bakterien bindet. Es wäre denkbar, dass es sich hierbei um ein grundlegendes, evolutionär altes Abwehrprinzip handelt, dass möglicherweise auch bei anderen immunvermittelten Erkrankungen Relevanz hat.
Die transfusionsassoziierte akute Lungeninsuffizienz (TRALI) ist eine der schwerwiegendsten Komplikationen bei der Transfusion von Blutprodukten. Rund 80% der TRALI Fälle wird von Alloantikörpern gegen Humane Leukozyten Alloantigene (HLA) und Humane Neutrophilen Alloantigene (HNA) ausgelöst. TRALI zeigt starke Parallelen zur akuten Lungeninsuffizienz (ALI), einer häufigen und schwerwiegenden Komplikation in der Intensivmedizin. Die Aufklärung des Pathomechanismus der TRALI könnte daher sehr weitreichende Implikationen für das Verständnis des akuten Lungenversagens haben. Der Fokus dieser Arbeit war die Untersuchung der HNA-2- und HNA-3a-Antikörper-vermittelten Aggregation von Granulozyten, welche eventuell ein bedeutender Bestandteil der TRALI-Pathogenese ist. Das wichtigste angewendete Messverfahren war der Granulozytenagglutinationstest (GAT), mit dessen Hilfe die Rolle der Zellmotilität, des Energiestoffwechsels und der Proteaseaktivität in der HNA 2- und HNA-3a-Antikörper-vermittelten Granulozytenaggregation (GA) untersucht wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Aggregation der Granulozyten ein aktiver und energiearmer Prozess ist. Während die Hemmung der aeroben Atmungskette und der Aktin-Reorganisation nur einen geringen, nicht signifikanten Einfluss auf die Aggregation der Granulozyten hat, resultierte sowohl die Inhibition der NADPH-Oxidase als auch die Inhibition von Serinproteasen mit Trypsin-ähnlicher oder Chymotrypsin-ähnlicher Spezifität in einer signifikanten Abschwächung der GA. Es ist jedoch bisher unklar, ob die Wirksamkeit der verschiedenen Inhibitoren auf die Hemmung eines gemeinsamen Signalweges zurückzuführen ist, oder ob unterschiedliche, in derselben Zellantwort mündenden, Signalwege gehemmt werden. Eine Beteiligung von Cystein-, Aspartat- und Metalloproteasen wurde ebenso ausgeschlossen, wie die Beteiligung der Proteinase 3, der humanen Neutrophilen-elastase und Cathepsin G. Die Arbeit zeigt auch, dass sich die HNA-2- und HNA-3a-Antikörper-vermittelte GA mechanistisch von der klassischen, entzündungsbedingten Aggregation unterscheidet. Die in dieser Arbeit zum ersten Mal beschriebene Rolle von Serinproteasen in der HNA-2- und HNA-3a-Antikörper-vermittelten GA stellt den ersten Schritt zur Entwicklung und Erprobung neuer therapeutischer Ansätze in einem Tiermodell dar und eröffnet möglicherweise Wege zur Behandlung von Antikörper-induzierter TRALI und der akuten Lungeninsuffizienz in der Intensivmedizin.
Zusammenfassung: Heparin ist ein häufig verwendetes Medikament, das zur Prophylaxe und Therapie von Thrombosen eingesetzt wird. Eine unerwünschte Nebenwirkung des Heparins ist die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT), die paradoxerweise mit potentiell lebensbedrohlichen arteriellen und venösen Gefäßverschlüssen assoziiert ist. Die Erkrankung wird durch die Bil-dung von Thrombozyten-aktivierenden Antikörpern der Klasse Immunglobulin G (IgG) aus-gelöst. Diese sind gegen Komplexe aus dem Thrombozytenprotein Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin gerichtet. Die zugrunde liegende B-Zell-vermittelte Immunität entspricht nicht der klassischen Immunantwort und führt zu einer frühzeitigen und transienten Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern der Klassen IgM und IgG. In der vorliegenden Arbeit wurden die B-Zellen, die an der Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern beteiligt sind, identifiziert. Hierfür wurden die Mäuse systemisch mit PF4/Heparin-Komplexen immunisiert. Das Vorliegen einer Immunantwort wurde durch den Nachweis der Antikörperproduktion mittels eines neu entwickelten Fluid-Phase ELISA nach-gewiesen. Der Einsatz von rekombinanten Maus-PF4/Heparin-Komplexen zeigte, dass die beim Menschen für die HIT charakteristisch frühe und transiente Antikörperproduktion auch im Mausmodell auftritt. Diese Immunantwort war spezifisch für PF4/Heparin-Komplexe und konnte nicht durch andere unspezifische Reize wie ein Gewebetrauma oder dem Modellanti-gen Ovalbumin ausgelöst werden. Der Nachweis der anti-PF4/Heparin-Antikörper-sezernierenden B-Zellpopulation(en) wurde durch die Etablierung des Zell-spezifischen Enzym-gekoppelten Immun-Spot Tests (ELISPOT) auf der Fluid-Phase Basis – Detektion der PF4/Heparin-Antikörper-Komplexe in der löslichen Phase – ermöglicht. Unterschiedliche Gewebe/Kompartimente (Milz, Knochen-mark, Peritonealhöhle) von naiven, nicht-immunisierten und PF4/Heparin-immunisierten Mäusen wurden mit diesem Assay auf das Vorliegen von PF4/Heparin-spezifischen B-Zellen untersucht. Während in nicht-immunisierten Mäusen ausschließlich B-Zellen nachgewiesen werden konnten, die anti-PF4/Heparin-Antikörper der Klasse IgM produzierten, wurden in immunisierten Mäusen sowohl kurzlebige PF4/Heparin-spezifische IgM (7%)- als auch IgG (25%)-sezernierende B-Zellen detektiert. Die spezifischen Zellen befanden sich in beiden Fällen in der Milz. Dieses Gewebe dient als Nische für follikuläre, Marginalzonen (Mz)- und B1-B-Zellen, wobei sie im Fall der Mz-B-Zellen die einzige Überlebensnische darstellt. Den Hauptanteil der Antikörper-produzierenden Milzzellen bilden die follikulären B-Zellen, deren Antikörperproduktion T-Zell-abhängig ist. Als Hauptquelle der anti-PF4/Heparin-Antikörper konnte diese Zellpopulation ausgeschlossen werden, da T-Zell-defiziente Mäuse nach der Behandlung mit PF4/Heparin weiterhin spezifische Antikörper produzierten. Normale Mäuse, denen vor der PF4/Heparin-Behandlung die Milz und somit die Mz-B-Zellen operativ entfernt wurden, konnten hingegen keine anti-PF4/Heparin-Antikörper mehr bilden. Dies zeigt, dass B1-Zellen allein nicht ausreichend sind, um die anti-PF4/Heparin-Antikörperproduktion zu induzieren, und dass Mz-B-Zellen für die Immunantwort notwendig sind. Der Mechanismus, der die Aktivierung der PF4/Heparin-spezifischen Mz-B-Zellen auslöst, ist bisher nicht im Detail bekannt. Jedoch konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die in vitro Stimulation von B-Zellen mit Mitogenen wie CpG und SAC antigenunabhängig zur Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörpern führt. Dies lässt vermuten, dass neben dem Kontakt mit dem Antigen auch andere immunstimulatorische Faktoren in die Induktion der Immunantwort gegen Maus-PF4/Heparin-Komplexe involviert sind.
Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie (HIT) ist eine seltene, aber lebens-bedrohliche unerwünschte Wirkung einer Therapie mit Heparin. Ausgelöst wird sie durch die Bildung von Antikörpern, die gegen Komplexe aus dem positiv geladenem Thrombozytenprotein Plättchenfaktor 4 (PF4) und negativ geladenem Heparin gerichtet sind und Thrombozyten aktivieren können, welches sich klinisch in einer schweren prothrombotischen Diathese bei gleichzeitiger Thrombozytopenie äußert. Bemerkenswert ist, dass im Widerspruch zur klassischen Immunantwort bei der HIT auch von Heparin-naiven Patienten binnen weniger Tage anti-PF4/Heparin-Antikörper der Immunglobulinklasse G gebildet werden, welche eigentlich eine sekundäre Immunantwort repräsentieren. Darüber hinaus ist bekannt, dass PF4 auch mit verschiedenen polyanionischen Nichtheparinen Komplexe bildet, die von anti-PF4/Heparin-Antikörpern erkannt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob Nukleinsäuren, die aufgrund ihres Reichtums an Phosphatgruppen ebenfalls stark negativ geladenen sind, mit PF4 Komplexe bilden, die von anti-PF4/Heparin-Antikörpern erkannt werden. Da eine Bildung antigener Komplexe mit PF4 für therapeutisch eingesetzte Nukleinsäuren von hoher praktischer Relevanz wäre, wurde außerdem die Interaktion von PF4 mit verschiedenen Aptameren untersucht. Dazu wurde die Interaktion zwischen PF4 und Nukleinsäuren in systematischen Bindungsstudien mit verschieden strukturierten Nukleinsäuren charakterisiert. Mittels Circulardichroismus-Spektroskopie wurde der Einfluss eines Modellaptamers auf die Sekundärstruktur von PF4 mit dem Einfluss von Heparin auf die PF4-Struktur verglichen. Die Kreuzreaktivität von anti-PF4/Heparin-Antikörpern gegen PF4/Nukleinsäure- bzw. PF4/Aptamer-Komplexe wurde mittels Immunassay und Thrombozytenfunktionstest untersucht. Schließlich wurde im Mausmodell die in-vivo-Immunogenität eines PF4/Aptamer-Komplexes überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass Nukleinsäuren längen- und strukturabhängig mit PF4 interagieren. Die Neigung zur Komplexbildung mit PF4 stieg mit der Länge der Nukleinsäure und dem Anteil doppelsträngiger Abschnitte. PF4/Nukleinsäure-Komplexe wurden von anti-PF4/Heparin-Antikörpern erkannt und konnten in Gegenwart dieser Antikörper eine Thrombozytenaktivierung vermitteln. Mit PF4/Aptamer-Komplexen immunisierte Mäuse produzierten anti-PF4/Aptamer-Antikörper, welche gegen PF4/Heparin-Komplexe kreuzreagierten. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass insbesondere Aptamere mit hohem Anteil an doppelsträngigen Abschnitten mit PF4 Komplexe bilden können, die ein ähnliches Epitop exprimieren wie PF4/Heparin-Komplexe und damit ein potentielles Risiko für die Erzeugung HIT-ähnlicher prothrombotischer Komplikationen bergen. Nukleinsäuren könnten einen endogenden Interaktionspartner von PF4 darstellen und das höhere HIT-Risiko von Patienten nach großen orthopädischen Eingriffen oder schweren Infektionen erklären, welche mit höheren Plasmaspiegeln zellfreier Nukleinsäuren einhergehen. Darüber hinaus könnte die Interaktion von PF4 mit endogenen Nukleinsäuren eine Erklärung für die frühe Produktion von anti-PF4/Heparin-Antikörper der Immunglobulinklasse G liefern.
Bis zu 5% der Patienten, welche unfraktioniertes Heparin erhalten, bilden eine immunogene Thrombozytopenie aus. Komplikationen dieser Heparin-induzierten Thrombozytopenie (HIT) können gliedmaßen- und lebensbedrohliche Thrombosen sein. Die HIT wird durch Antikörper ausgelöst, die an Komplexe aus dem körpereigenen Protein Plättchenfaktor 4 (PF4) und Heparin binden. Die Pathogenese der HIT ist weitestgehend aufgeklärt. Jedoch ist immer noch unklar, warum nicht alle Patienten mit anti-PF4/Heparin-Antikörpern eine klinische HIT entwickeln. Testverfahren, die zum Nachweis von anti-PF4/Heparin-Antikörpern aufgereinigte Thrombozyten verwenden sind sensitiver als solche, bei denen Vollblut oder Plättchen-reiches Plasma eingesetzt werden. Daraus ergab sich die Fragestellung, ob Faktoren im Plasma den Durchbruch einer HIT bei Anwesenheit von anti-PF4/Heparin Antikörpern inhibieren können. Ein wichtiger Mechanismus in der Pathogenese der HIT ist die Bindung von PF4 an die Thrombozytenoberfläche. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Plasmafaktoren die PF4-Bindung an Thrombozyten beeinflussen können. Da Blutfette und Zuckerstrukturen ausgeschlossen werden konnten, lag der Fokus auf Proteinen als mögliche Hemmfaktoren. Da nicht nur Plasma, sondern auch Serum die PF4-Bindung inhibieren konnte, kamen keine Gerinnungsfaktoren in Frage. Die gesuchten Faktoren waren auch nicht Hitze sensitiv, sodass es sich auch nicht um Komplementfaktoren handeln konnte. Bei einer Standardmethode zur Aufreinigung von IgG aus dem Serum fiel auf, dass das vom IgG befreite Serum keine hemmende Wirkung mehr auf die PF4-Bindung an Thrombozyten zeigte. Jedoch führte die Substitution mit IgG nicht zu dem erwarteten Hemmeffekt, so dass der gesuchte Faktor ebenfalls bei der Aufreinigung entfernt worden sein musste. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Charakterisierung des Hemmfaktors bildeten eine wichtige Grundlage, um in weiterführenden Versuchen in der gleichen Arbeitsgruppe Fibronektin als möglichen Kandidaten zu identifizieren.
Protamine (PRT) is a positively charged protein, which is widely used in medicine as an adjunct to certain preparations of insulin and as a rapidly-acting antidote for heparin, particularly to neutralize the effects of high heparin concentrations needed for anticoagulation during cardiac surgical procedures using cardiopulmonary bypass. It has been demonstrated that PRT and heparin form multimolecular complexes and that these complexes have high immunogenicity in a mouse model. Studies in this thesis provide new insights into the pathophysiology of anti-PRT/heparin antibodies. The results of study I showed that the administration of PRT combined with heparin is responsible for high immunoglobulin G (IgG) immunization after cardiac surgery. A subset of these antibodies was able to induce platelet activation in a way similar to that observed by heparin-induced thrombocytopenia (HIT). Using an animal model, we demonstrated that anti-PRT/heparin antibodies are capable of platelet destruction in the presence of PRT and heparin. Moreover, our data suggests that platelet-activating anti-PRT/heparin antibodies at surgery are potentially associated with postoperative thrombocytopenia and an increased risk for thromboembolic events. In study II, the immune response against PRT/heparin complexes was investigated. This study showed a relatively fast development of IgG with no general preceding IgM formation. In addition, patients undergoing liver transplantation developed anti-PRT/heparin antibodies without previous exposure to PRT. These results suggest that a previous contact with the antigen(s) itself or other antigens with molecular mimicry induced this immune response. In fact, we were able to identify Neutral Protamine Hagedorn (NPH) insulin and core histones (DNA-binding proteins) as potentially antigenic candidates for a previous immunization. Furthermore, the findings of study III demonstrate the ability of anti-PRT/heparin antibodies to activate platelets in the presence of NPH insulin in a heparin-dependent way suggesting that diabetic patients may have an enhanced risk for thromboembolic complications if treated with NPH insulin and possibly while receiving prophylactic heparin. These observations justify further clinical investigations to assess the impact of the interaction between anti-PRT/heparin antibodies and PRT-mimicking antigens, such as NPH insulin or histones.
Protamine is administered as protamine sulfate to reverse the anticoagulant effect of heparin following cardiopulmonary bypass surgery. Immunogenicity of protamine has been recognized for decades in several patient groups including vasectomized men, diabetic patients on protamine-containing insulin and patients undergoing cardiopulmonary bypass surgery. Anti-protamine/heparin antibodies are a newly described class of heparin-dependent antibodies found in about 30% of patients exposed to protamine and heparin during cardiac surgery. A subset of seropositive patients especially who tested positive for platelet-activating anti-protamine/heparin immunoglobulin G (IgG) antibodies before surgery have prolonged postoperative thrombocytopenia with an increased risk for arterial occlusions. Studies presented in this thesis shed light on potential approaches that may prevent antibody-mediated platelet activation by anti-protamine/heparin antibodies. Two approaches are presented in this thesis, partially desulfated heparin (ODSH) and low molecular weight protamine (LMWP). Our studies demonstrated the ability of ODSH to inhibit anti-protamine/heparin antibody-mediated platelet destruction in the NOD/SCID mouse model by: i) reduction of antibody binding to preformed protamine/heparin complexes, as shown by enzyme immunoassay, ii) interfering with the binding of protamine/heparin complexes to platelets as shown by flow cytometry and fluorescence microscopy, and iii) inhibition of antibody-mediated platelet activation. Interestingly, ODSH was also able to block ongoing platelet destruction by displacing pre-bound complexes from the platelet surface. In addition, our data suggest the use of synthesized LMWP as a substitute for protamine in heparin reversal. The in vitro investigations showed that synthesized LMWP efficiently neutralizes heparin using the activated partial thromboplastin time. Anti-protamine/heparin antibodies have low binding properties to LMWP/heparin complexes as indicated in enzyme immunoassay. The ability of platelet-activating anti-protamine/heparin antibodies to induce platelet activation in the functional assay was significantly reduced in the presence of LMWP/heparin compared to protamine/heparin complexes. Owing to findings obtained in our studies, both approaches might be a promising future option to reduce anti-protamine/heparin antibody-mediated adverse effects.
Thrombozytenkonzentrate (TKs) sind wichtige Blutprodukte für die Therapie von Blutungen unter Thrombozytopenie oder bei Thrombozytenfunktionsstörungen. Trotz moderner Sicherheitsmaßnahmen können Infektionsübertragungen und immunologische Nebenwirkungen durch die Transfusion von Thrombozyten nicht gänzlich ausgeschlossen werden. Pathogeninaktivierungsverfahren (PIV) wurden entwickelt, um Bakterien und Viren in TKs zu inaktivieren und die Sicherheit von TKs weiter zu erhöhen. Zu diesen Verfahren zählen u.a. das Intercept-Verfahren (Amotosalen und UVA-Bestrahlung) und das Theraflex-Verfahren (ausschließlich UVC-Bestrahlung). In dieser Arbeit wurde der Einfluss der PIV durch Amotosalen/UVA und durch UVC auf das Thrombozytenproteom untersucht, welches mit Massenspektrometrie (LC-ESI MS/MS) untersucht wurde.
Since its introduction in 2006, the NOD/scid mouse model has greatly contributed to the understanding of the pathomechanisms of antibody-mediated thrombocytopenia. This progress has however been hampered by inter-laboratory differences. With this work, we make several suggestions to minimise these differences:
We suggest that human platelets (blood group 0) be injected into the mice (age- and sex-matched, 8-16 weeks) via the tail vein. For antibody injection, scientists may choose between intraperitoneal and tail vein injection, each of which has strengths and drawbacks. In case of low antibody titer or low avidity antibodies, preincubation of the platelets with the patient serum prior to injection promotes platelet elimination where standard protocols fail. For subsequent sample preparation, we found that newly-launched ready-to-use kits present a good alternative to classical density gradient centrifugation by reducing man-hours and turnover time without affecting the quality of flow cytometry analysis.
In a second part, we used the revised mouse model to study anti-CD36 mediated thrombocytopenia in vivo. Anti-CD36 antibodies have been suggested as frequent case for FNAIT in Asia. The mechanisms behind this remain partly unclear. After injecting anti-CD36 monoclonal antibody or anti-CD36 patient immunoglobulin into the system, circulating human platelets were rapidly cleared. Interestingly, the polyclonal patient immunoglobulins used were not uniform in their anti-platelet reactivity. On further examination, we found that the anti-CD36 antibodies induce platelet activation and aggregation, which we were able to inhibit by the addition of an Fcγ-receptor blocking agent. This suggests a possible role for Fcγ-receptor in the activation and elimination process.
As our results from the experiments on the role of complement in the elimination process are however ambiguous, further studies are needed. The clinical relevance of anti-CD36 antibody-mediated platelet activation and aggregation for the high abortion rates in affected women has yet to be evaluated.
Der Bedarf an Blutprodukten ist in den letzten Jahren gestiegen, während der Kreis der möglichen Blutspender bei alternder Bevölkerung abgenommen hat und weiter abnehmen wird. Blutspende-Einrichtungen betreiben viel Aufwand, Blutspender zu gewinnen und als Dauerspender zu binden. Frühere Studien zeigten, dass ein Drittel der Dauerspender ein positives „Well-being“ nach der Spende erfahren und dies als Grund für regelmäßige Blutspenden angeben. In dieser Studie wurde ntersucht, ob ein „Well-being“ auch bereits bei Erstspender ausgeprägt ist und ob dies einen Einfluss auf das Rückkehrverhalten von Erstspendern hat. Zusätzlich sollte gezeigt werden, dass die Studie als Intervention einen Einfluss auf das Rückkehrverhalten bei Erstspendern hat. Über drei aufeinander folgende Monate wurden 235 Erstspender in die Studie eingeschlossen und entweder in die Fragebogengruppe oder in die Kontrollgruppe randomisiert. Bei allen Studienteilnehmern wurde zwölf Monate nach der initialen Spende deren Rückkehrverhalten ausgewertet. Die Teilnehmer der Fragebogengruppe sollten zusätzlich zu sieben verschiedenen Zeitpunkten, verteilt über acht Wochen, den „Multidimensionalen Befindlichkeitsfragebogen“ ausfüllen. An Hand der Ergebnisse des MDBF sollte der Verlauf des „Well-being“ aufgezeigt werden. Folgende Ergebnisse wurden erhoben: Erstspender scheinen keine größeren Veränderungen des „Well-beings“ nach ihrer ersten Blutspende zu erfahren. Des Weiteren beeinflusste das „Well-being“ nicht das Rückkehrverhalten der Erstspender. Die durchgeführten Interventionen führten zu einer erhöhten Wiederkehrrate der männlichen Erstspender, nicht jedoch der weiblichen Erstspender. Um eine praktikable Schlussfolgerung aus den Ergebnissen dieser Studie ziehen zu können, sollten zukünftige Studien den hier in der Wiederkehrrate aufgetretenen Geschlechterunterschied spezifischer untersuchen. Interessant wäre vor allem, welche der durchgeführten Interventionen oder eine Kombination aus diesen zu der gesteigerten Wiederkehrrate männlicher Erstspender geführt hat. Mit Hilfe weiterführender Ergebnisse wäre es dann möglich, gezielt Interventionen zu betreiben, die effizient die Spendefrequenz der Blutspender erhöht.