Doctoral Thesis
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Im Rahmen dieser Arbeit wurde ausgehend vom nicht zytopathogenen (nzp) Wildtypvirus BVDV-2 Stamm 890 (v890WT) erstmalig ein infektiöser cDNA Volllängenklon (p890FL) konstruiert. In vitro synthetisierte RNA des Volllängenklons p890FL replizierte nach Transfektion in bovine Zellen autonom und aus dem Überstand transfizierter Zellkulturen konnte infektiöses Virus (v890FL) isoliert werden. Die in vitro Charakterisierung ergab ein ähnliches Wachstumsverhalten des rekombinanten Virus v890FL im Vergleich zum Wildtypvirus v890WT. Im Tierexperiment zeigte v890FL jedoch einen geringfügig attenuierter Phänotyp gegenüber dem Wildtypvirus v890WT. Mit Hilfe des nzp Volllängenklons p890FL konnte zudem gezeigt werden, dass auch ein nzp BVDV-2 -Stamm stabil messbare Mengen an freiem NS3-Proteins bilden kann, wie es bisher nur für zytopathogene (zp) BVDV Stämme beschrieben worden ist. Der Volllängenklon p890FL diente weiterhin als Basis für die Etablierung zweier Deletionsmutanten, p890dNpro und p890dC, welche sich jeweils durch eine partielle Deletion des Nichtstrukturproteins Npro bzw. durch eine partielle Deletion des Kapsidproteins C auszeichnen. Die Deletion der Autoprotease Npro resultierte in einem verminderten viralen Wachstum auf Interferon-kompetenten bovinen Zellen, auf Interferon-inkompetenten Zellen können jedoch mit dem rekombinanten Virus v890FL vergleichbare Titer erreicht werden. Die Deletion des Strukturproteins C resultierte in der Bildung eines sogenannten Replikons, die in vitro synthetisierte virale RNA von p890dC war zwar in der Lage nach Transfektion in bovinen Zellen autonom zu replizieren, jedoch können keine Virusnachkommen isoliert werden. Für die Generierung infektiöser Virusnachkommen (sogenannter „Pseudovirionen“) wurde das Replikon p890dC unter Verwendung der Helferzelllinie WT-R2 in trans komplementiert und zu (einmal infektiösen) Pseudovirionen verpackt. Beide Deletionsmutanten offerieren einen neuartigen Ansatz in der Etablierung von sicheren und effizienten BVDV-2 Vakzinen und stellen einen wichtigen Schritt bei der Entwicklung neuer BVDV-Impfstoffe dar. Der infektiöse cDNA Volllängenklon p890FL ist mit seiner 228 nt großen Insertion im NS2-kodierenden Bereich zudem ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung von Insertionen im NS2/3 und dem Verständnis für die Ursachen der Zytopathogenität von Pestiviren.