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Aging is a risk factor for stroke. Animal models of stroke have been widely used to study the pathophysiology of ischemic stroke, which in turn helped to develop numerous therapeutic strategies. Despite the considerable success of therapeutic strategies in animal models of ischemic stroke, almost all of them have been proved to be unsuccessful in the clinical trials. One of explanation is that data obtained from young animals may not fully resemble the effects of ischemic stroke in aged animals or elder patients, causing the discrepancy between animal experiments and clinical trials. To investigate these differences with regard to age, pathway specific gene arrays were used to identify and isolate differentially expressed genes in periinfarct following focal cerebral ischemia. The results from this study showed a persistent up-regulation of pro-apoptotic and inflammatory-related genes up to 14 days post stroke, a 50% reduction in the number of transcriptionally active stem cell-related genes and a decreased expression of genes with anti-oxidative capacity in aged rats. Also, it was observed that at day 3 post-stroke, the contralateral, healthy hemisphere of young rats is much more active at transcriptional level than that of the aged rats, especially at the level of stem cell- and hypoxia signaling associated genes. Next, protein levels between young and aged post-stroke rats in periinfarct were compared using proteomic tools. Among others, AnxA3 was identified as differentially regulated protein, but the expression of AnxA3 has no significant changes in periinfarct between these two age groups at day 3 and 14. Different from periinfarct, a strong upregulation of AnxA3 at day 3 in young rats plus a strengthened increase of AnxA3 at day 14 in aged rats using immunohistochemical quantification indicated a delayed microglial accumulation in infarct core of aged rats, suggesting that quick activation of microglia in infarct core of young rats might be beneficial for recovery. Colocalization with established microglial marker demonstrated that AnxA3 as a novel microglial marker is implicated in the microglial responses to the focal cerebral ischemia. In addition, it was found that AnxA3 positive microglial cells incorporated more proliferating cell marker BrdU. Third, the expression, localization and function of several transport proteins were investigated in young rats following focal ischemic stroke. P-gp staining was detected in endothelial cells of desintegrated capillaries and by day 14 in newly generated blood vessels. There was no significant difference, however, in the Mdr1a mRNA amount in the periinfarct region compared to the contralateral site. For Bcrp, a significant mRNA up-regulation was observed from day 3 to 14. This up-regulation was followed by the protein as confirmed by quantitative immunohistochemistry. Oatp2, located in the vascular endothelium, was also up-regulated at day 14. For Mrp5, an up-regulation was observed in neurons in the periinfarct region (day 14). In conclusion, reduced transcriptional activity in the healthy, contralateral sensorimotor cortex in conjunction with an early up-regulation of proapoptotic genes and a decreased expression of genes with anti-oxidative capacity in the ipsilateral sensorimotor cortex of aged rats, plus the delayed up-regulation of AnxA3 positive microglial cells in infarct core may contribute to diminished recovery in post-stroke old rats. In addition, it was demonstrated in this study that after stroke the transport proteins were up-regulated with a maximum at day 14, a time point that coincides with behavioral recuperation. The study further suggests Bcrp as a pronounced marker for the regenerative process and a possible functional role of Mrp5 in surviving neurons. This study provided several evidences for the different responses of young and aged rats using a focal ischemic stroke model. Understanding the effect of age is crucial for the development of relevant therapeutic drugs.
Einfluss der Kochsalzaufnahme auf die renale Genexpression von Komponenten des Endothelinsystems
(2011)
In der vorliegenden Studie wurde das renale Endothelinsystem auf Genexpressions- und Peptidebene bei Variation der diätetischen Kochsalzaufnahme in physiologisch relevanten Größenordnungen bei der Sprague-Dawley-Ratte ubtersucht. Das Ziel war eine systematische Darstellung der Veränderungen der wichtigsten Komponenten des Endothelinsystems mit einer differenzierten Betrachtung von Nierenrinde und Nierenmark. Dazu wurde in einer ersten experimentellen Serie der Kochsalzgehalt der zugeführten Nahrung zwischen 0,15% und 1,80% variiert. Um den Einfluss des Renin-Angiotensin-Systems auf kochsalzinduzierte Veränderungen des renalen Endothelinsystems zu untersuchen, wurde ein Teil der Tiere mit dem AT1-Rezeptorblocker Losartan behandelt. Es wurden simultan Herzfrequenz, arterieller Blutdruck und die renale Na+-Bilanz bei den Tieren gemessen und am Ende des Experimentes die Nieren gewonnen. Anschließend erfolgten die Bestimmung der mRNA-Gehalte von Prä-pro-ET-1, des ETA- und ETB-Rezeptors sowie des renalen immunreaktiven ET-1-Gehaltes. Zur besseren Lokalisierung und Präzisierung der gefundenen Veränderungen schlossen wir eine zweite experimentelle Serie an, in der eine feinere Präparation des Nierenmarks in äußere und innere Medulla, eine weitere Verringerung des Kochsalzgehaltes der Niedrigsalzgruppe (0,05%) sowie eine Erweiterung der Genexpressionsuntersuchungen um das Endothelin-Converting-Enzym-1 (ECE-1) erfolgte. Die Ergebnisse der Studie lassen sich wie folgt zusammenfassen: Die Variation der Salzdiät beeinflusste weder den arteriellen Blutdruck noch die Herzfrequenz der Tiere. Hinsichtlich der Genexpression war eine Niedrigsalzdiät von 0,15% NaCl mit einem Anstieg der mRNA-Expression von Prä-pro-ET-1 (51%), des ETA- (81%) und ETB- Rezeptors (33%) sowie mit einem erhöhten immunreaktiven ET-1-Gehalt (110%) im gesamten Nierenmark assoziiert. In der weiterführenden Untersuchung unter 0.05% NaCl konnte dieser Effekt auf der Genexpressionsebene in der äußeren Medulla reproduziert werden, allerdings in milderer Ausprägung (Prä-pro- ET-1 37%, ETA 20%, ETB n. sign., ECE-1 16%). Diese Diäteffekte ließen sich durch eine selektive AT1-Rezeptorblockade mittels Losartan teilweise bzw. vollständig aufheben. Der renale Cortex blieb durch Variation der Kochsalzaufnahme sowohl hinsichtlich der mRNA-Expression der einzelnen Komponenten des Endothelinsystems als auch hinsichtlich des immunreaktiven ET-1-Gehaltes weitgehend unbeeinflusst. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass vorwiegend das medulläre Endothelinsystem sowohl auf Transkript- als auch auf Peptidebene auf moderate Veränderungen der nutritiven Kochsalzaufnahme reagiert. Die signifikanten Veränderungen auf Genexpressionsebene betreffen dabei Prä-pro-ET-1 und den ETA-Rezeptor insbesondere in der äußeren Medulla unter Niedrigsalzdiät. Diese Alterationen werden zumindest partiell durch AT1-Rezeptoren vermittelt.
Hintergrund: LOX-1, ein Rezeptor für oxidiertes Low-Density Lipoprotein, wird von Endothelzellen, Makrophagen, vaskulären glatten Muskelzellen und anderen Zellen exprimiert. Seine Expression kann durch oxidiertes LDL (oxLDL), Angiotensin II, inflammatorische Zytokine (zum Beispiel Tumornekrose-Faktor alpha), Scherkräfte am Endothel und andere Faktoren induziert werden. LOX-1 ist bei der Entstehung von oxidativem Stress und der endothelialen Dysfunktion beteiligt und trägt vermutlich zur Instabilität von atherosklerotischen Plaques bei, was bei Patienten mit einer koronaren Herzkrankheit zum akuten Koronarsyndrom führen kann. Material und Methoden: Untersucht wurden Atherektomieproben von 37 Patienten (Alter 62,5 ± 9,7 Jahre, Body-Mass-Index 28,6 ± 5,3 kg/m2), die sich zwischen Juli 2001 und April 2005 wegen Brustschmerzen/Angina pectoris einer medizinisch indizierten Koronarangiographie mit in gleicher Sitzung durchgeführter Direktionaler koronarer Atherektomie (DCA) in der Klinik für Innere Medizin B der Universitätsmedizin Greifswald unterzogen hatten. Die in der DCA gewonnenen Atherektomieproben wurden sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren, am Kryotom (Leica C19) ohne aufzutauen geschnitten (Schnittdicke 5 Mikrometer) und mit Hämatoxylin/Eosin (H.E.), Ölrot O (für Lipide), Elastica-van Gieson (für Kollagen) und von-Kossa (für Verkalkungen) gefärbt. Die LOX-1 Expression wurde durch ein Immunfluoreszenz-Verfahren mit einem polyklonalen Kaninchenantikörper, der gegen die Aminosäuren 143 bis 273 des humanen LOX-1 Proteins gerichtet war, und einem FITC-markierten Sekundärantikörper nach dem ELISA-Prinzip (Enzyme-linked immunosorbent Assay) nachgewiesen. Die digitalen Aufnahmen wurden mit Corel PHOTO-PAINT 12, Scion Image und SigmaPlot 11 analysiert. Die LOX-1 Signalintensitäten wurden mit dem in der Koronarangiographie ermittelten Stenosegrad der betreffenden Plaques, dem Lipidgehalt in der Plaque und anderen Patientenparametern (z.B. Vorliegen eines akuten Koronarsyndroms) verglichen. Zur statistischen Analyse wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman bestimmt und der Mann-Whitney-Rank-Test durchgeführt. Ergebnisse: Die LOX-1 Expression korrelierte mit dem Lipidgehalt der humanen koronaren Atherektomieproben, jedoch im Mittel statistisch nicht signifikant (p=0,056). Im Trend war die LOX-1 Expression in den Proben von Patienten mit einem akuten Koronarsyndrom (n=11), bei Männern (n=26) und Rauchern (n=15) höher und in Patienten, die HMG-CoA-Reduktase-Hemmer einnahmen (zum Beispiel Simvastatin), niedriger (n=16). Keine Korrelationen fanden sich zwischen LOX-1 Expression und Stenosegrad, Plaquelokalisation, Alter, Body-Mass-Index, Arterieller Hypertonie (n=31), Diabetes mellitus Typ II (n=9) und Dyslipoproteinämie (n=32). Schlussfolgerungen: Die LOX-1 Expression in atherosklerotischen Plaques ist positiv mit dem Lipidgehalt der Plaques assoziiert und ist im Trend höher in Patienten mit einem akuten Koronarsyndrom. Eine hohe LOX-1 Expression in atherosklerotischen Plaques könnte zu deren Instabilität somit zum Auftreten eines akuten Koronarsyndroms beitragen. Die Senkung des LDL-Angebots in der Arterienwand und Wege zur Plaquestabilisierung bei manifester Atherosklerose bleiben wichtigste Therapieziele.
Die gleichzeitige Gabe von Arzneimitteln kann durch Inhibition oder Induktion von intestinalen Transportproteinen bzw. metabolischen Enzymen unerwünschte Arzneimittelinteraktionen verursachen. Bewirkt wird der induktive Effekt durch die Aktivierung von nukleären Rezeptoren wie PXR. Aktuell sind keine in vitro-Modelle verfügbar, die die Interaktion auf intestinaler Ebene infolge von Induktionsprozessen prognostizieren können. Für intestinale Absorptions- und inhibitorische Arzneistofftransportstudien werden bisher die häufig genutzten Caco-2-Zellen verwendet, da sie enterozytenartige Eigenschaften besitzen. Allerdings gibt es einige Unklarheiten, die das Caco-2-Modell betreffen, wie bspw. der optimale Zeitraum der Zellkultivierung, das fragliche Vorhandensein von nukleären Rezeptoren und die umstrittene Repräsentanz von Colon-Karzinomzellen für den intestinalen, jejunalen Arzneimitteltransport.
Ziel dieser Arbeit war es somit, die Eignung der präklinisch genutzten Caco-2-Zellen als in vitro-Modell für Transporter-bedingte Arzneimittelinteraktion und intestinalen Arzneimitteltransport zu untersuchen. Hierzu wurde die Expression klinisch relevanter intestinaler Arzneistofftransporter, Metabolisierungsenzyme und nukleärer Rezeptoren in Caco-2-Zellen auf Gen- und Proteineben mittels real time-RT PCR (TaqMan®-Prinzip) und LC-MS/MS-basiertem targeted proteomics bestimmt und mit der Expression in humanem Jejunum verglichen. Ferner wurde die Expression der erwähnten Determinanten in Abhängigkeit von der Kultivierungszeit und nach Induktion mit den prototypischen Induktoren Carbamazepin, Efavirenz, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin untersucht. Zuletzt wurde der Einfluss der Induktoren auf die Funktion des Transporters ABCB1, anhand eines bidirektionalen Transportassays mit den radioaktivmarkierten ABCB1-Substraten [3H]-Digoxin und [3H]-Talinolol, ermittelt.
Die Expression der Transporter und nukleären Rezeptoren auf Gen- und Proteinebene in Caco-2-Zellen unterschieden sich deutlich zu der von jejunalem Gewebe. Für die Transporter ABCB1, ABCC2, OATP1A2, OATP2B1, PETP1 und das Enzym UGT1A1 konnte eine signifikante Zunahme der mRNA-Expression mit der Dauer der Kultivierungszeit festgestellt werden, die auf Proteinebene nicht gezeigt werden konnte. Die Induktoren Carbamazepin, Hyperforin, Hypericin und Rifampicin wiesen einen Effekt auf die mRNA-Expression, nicht aber auf die Proteinmenge der Transporter auf. In Übereinstimmung zu den Befunden der fehlenden Transporterinduktion konnte kein Effekt der Induktoren auf die Funktion von ABCB1 beobachtet werden.
Caco-2-Zellen sind daher nicht als in vitro-Modell geeignet um Arzneimittel-interaktionen prognostizieren zu können, die durch die Induktion von Transportern entstehen.
Die Duchenne Muskeldystrophie und sein Mausmodell, die mdx-Maus, sind durch eine Kalzium-induzierte Muskelschädigung gekennzeichnet. Der grundlegende Effekt scheint ein erhöhter sarkolemmaler Einstrom von Kalziumionen durch Kationenkanäle zu sein. Um die möglicherweise verantwortlichen Kationenkanäle zu identifizieren, analysierten wir die Expression von 22 Mitgliedern der Transient Rezeptor Potential Kationenkanalfamilie sowie 8 Mitglieder der DEG/ENaC-Familie. Von den TRP-Transkripten waren TRPC3, TRPC6, TRPV4, TRPM4 und TRPM7 die am stärksten exprimierten Isoformen im Skelettmuskel. Die mRNAs der Mitglieder der DEG/ENaC Familie wurden im Skelettmuskel nur auf geringfügigem Level nachgewiesen. Im Vergleich zu Kontrolltieren waren die Expressionen der dominierenden TRP-Kanäle in mdx-Muskeln durchschnittlich reduziert, besonders TRPC6 und TRPM7. TRPC5, TRPM1 und TRPA1 waren im Skelettmuskel nur gering exprimiert, aber ihre Expressionen waren im mdx-Muskel signifikant erhöht. Die in-situ Hybridisierung und Immunfluoreszensfärbung von Muskelquerschnitten zeigte die Expression der mRNA und des Proteins von den dominerenden TRPs im Sarkolemm von Muskelfasern. Für TRPC6 wurde dieses Bild deutlich beobachtet. Zwei andere Proteine, nämlich TRPV4 und TRPM7, zeigten vorzugsweise eine perinukleäre Lokalisation, während das Sarkolemm nur schwach gefärbt war. TRPC3 wurde begrenzt in der Nähe des Sarkolemms gefunden, während es in den regenerierenden Muskelfasern der mdx-Muskeln nur in zytoplasmatischen Spots detektiert wurde. Daraus schlussfolgern wir, dass möglicherweise TRP-Ionenkanäle für den beobachteten Ruhekalziumeinstrom in mdx-Muskelfasern verantwortlich sind. Eine veränderte Expression der Isoformen wirkt möglicherweise am dystrophischen Prozess in mdx-Muskelfaser mit.
Die Duchenne Muskeldystrophie stellt eine X-chromosomal rezessiv vererbte, schwere Form der Muskeldystrophie dar. Die Ursache ist eine Mutation im Dystrophingen und die Folgen äußern sich in Muskelschwäche, Muskelfasernekrosen und einer verstärkten Fibrosierung. Der genaue Pathomechanismus ist noch nicht abschließend geklärt. Durch Muskelbiopsien von DMD Patienten und mit Hilfe des homologen Tiermodells, der mdx-Maus, konnte herausgefunden werden, dass der intrazelluläre Kalziumgehalt der Dystrophin-defizienten Muskelfasern erhöht ist. Einen möglichen Therapieansatz könnte die Blockierung von Kationenkanälen der Muskelfasermembran, die den pathologischen Kalziumeinstrom ermöglichen, darstellen. In vorangegangenen Arbeiten werden die TRP-Kanäle (Transient Receptor Potential channels) für den pathologischen Kalziumeinstrom mitverantwortlich gemacht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus in erster Linie auf einen Vertreter der TRP-Kanal-Superfamilie, den TRPV4, gelegt. Zu diesem Zweck wurde die TRPV4-Knock out Maus näher untersucht. Zunächst führte man eine Standardhistologie mit Hilfe von HE, Sirius RED und ATPase-Färbung durch. Sowohl die Faserkaliberbestimmung als auch die Messung des Bindegewebsanteils zeigten keine Unterschiede zum Wildtypen. Eine anschließende Genstudie mittels RT-PCR ermöglichte die Quantifizierung der mRNA Expression von 22 TRP-Kanälen in der murinen Skelettmuskulatur. Dabei sollte in dieser Arbeit unter anderem die Frage einer möglichen Gegenregulation anderer-Kanäle auf Grund des TRPV4-Mangels in der TRPV4-KO Maus geklärt werden. Des Weiteren wurde auch ein Vergleich der mRNA Kanal-Expression zwischen schnellen (EDL) und langsamen (SOL) Muskel vorgenommen. Die Untersuchungen zeigten, dass von den 22 analysierten TRP-Kanälen 16 auf mRNA Ebene exprimiert werden. Dabei wiesen TRPV2 und TRPV3 eine erhöhte mRNA Expression in der TRPV4-KO Mutante im Vergleich zum Wildtyp auf. Signifikant war dieser Unterschied für TRPV2 im M. soleus und für TRPV3 in allen drei untersuchten Skelettmuskeln (TA, EDL, SOL). Dies könnte für eine Gegenregulation dieser 2 TRP-Kanäle in TRPV4-defizienten Muskelfasern sprechen. Des Weiteren wurde eine signifikant verstärkte mRNA Expression von TRPM3, M4, M6, M8, V2, V4, und V6 im langsam zuckenden M. soleus im Vergleich zum schnell zuckenden EDL beobachtet. Dies trifft sowohl für die TRPV4-KO als auch für die WT Mäuse zu und könnte für eine stärkere Expression dieser TRP-Kanäle in den langsamen TYP 1 Fasern des M. soleus sprechen. Aus den vorliegenden Ergebnissen geht hervor, dass im Falle des Verlustes eines TRP-Kanals höchstwahrscheinlich andere Vertreter dieser Kanalfamilie in der Lage sind durch eine verstärkte Expression den Mangel zu kompensieren. Dies gilt es im Rahmen einer möglichen Therapie der Duchenne Muskeldystrophie, zum Beispiel mit Hilfe von TRP-Kanalblockern, zu beachten.
WOKW-Ratten entwickeln ein komplettes und ein der humanen Erkrankung ähnliches Metabolisches Syndrom mit Adipositas, Hyperinsulinämie sowie Hyperleptinämie, Dyslipidämie und verminderter Glukosetoleranz. In der vorliegenden Arbeit wurden kongene Ratten durch Kreuzung zwischen kranken WOKW und krankheitsresistenten DA-Ratten generiert, die als DA.3aW (Chr. 3; D3Mgh5-D3Rat1), DA.3bW (Chr. 3; D3Mit10-D3Rat189), DA.5W (Chr. 5; D5Mgh6-D5Mit5), DA.10W (Chr. 10; D10Mgh2-D10Rat4) und DA.16W (Chr. 16; D16Rat88-D16Wox7) bezeichnet wurden. Diese kongenen Stämme wurden zunächst longitudinal hinsichtlich einzelner Faktoren des Metabolischen Syndroms untersucht. Die phänotypische Charakterisierung zeigte, dass die kongenen Ratten Facetten des Metabolischen Syndroms entwickeln und somit Gene in den kongenen WOKW-Bereichen auf den Chromosomen 3, 5, 10 und 16 der Ratte den Adipositas Index, die Körpermasse, die Seruminsulin- und Serumleptinwerte sowie die Serumlipide in Abhängigkeit des Chromosoms und des Geschlechts der Ratten beeinflussen. Zur Identifikation möglicher Kandidatengene wurde die mRNA-Expression einzelner Gene, die innerhalb der kongenen Bereiche liegen, mittels qRT-PCR in Fettgewebe, Leber, Hypothalamus und teilweise auch in der Niere untersucht. Basierend auf der Tatsache, dass DA.3aW phänotypisch besonders von DA abweicht, lag der Fokus der Genexpressionsanalysen auf Genen, die innerhalb des kongenen Bereiches auf dem distalen Chromosom 3 (D3Mgh5-D3Rat1) kartieren. Interessanterweise konnte eine signifikant geringere mRNA-Expression von Pck1 in Leber und Niere von DA.3aW sowie WOKW im Vergleich mit DA nachgewiesen werden. In der daran anknüpfenden Sequenzierung konnte ein SNP in der codierenden Sequenz von Pck1 (4384T/C) dokumentiert werden. WOKW sowie DA.3aW, Ratten die ein komplettes bzw. Facetten des MetS entwickeln, sind Träger des C-Allels. Somit könnte dieser SNP das Risiko an Facetten des MetS zu erkranken, in Ratten beeinflussen. Außerdem konnten Snta1, Pofut1, Dlgap4 und Pltp, die auch in der kongenen Region in DA.3aW liegen, als mögliche Kandidatengene identifiziert werden. Auch die auf dem Chromosom 10 liegenden Gene Acox1, Galr2 und Cygb könnten auf Grund der Expressionsergebnisse in der Entstehung von Hyperleptinämie und Hyperinsulinämie in DA.10W bzw. WOKW involviert sein. Des Weiteren wurde mittels Genexpressionsanalyse festgestellt, dass Gene innerhalb des kongenen Bereiches auf dem Chromosom 5 die Expression von Pparg und Adipoq im Fettgewebe beeinflussen, da die Expression dieser Adipokine in DA.5W-Ratten signifikant erhöht ist im Vergleich mit DA. Außerdem müssen Gene in den kongenen Regionen auf den Chromosomen 5 und 16 für eine veränderte Expression von Fasn, Glut4 und Lpl verantwortlich sein. Zum Schluss konnte ein Zusammenhang zwischen der Anzahl von TTT-Repeats in der 3'UTR von Repin1 und der Proteinmenge nachgewiesen werden. Weicht die Anzahl der TTT-Repeats vom WT-Allel ab, dann ist die Repin1-Konzentration im subkutanen sowie epididymalen Fettgewebe verschiedener Rattenstämme erhöht.
Die bedeutende Rolle eines insulinomimetischen Stoffwechsel- und Signalmilieus in glykogenotischen hepatozellulären Präneoplasien konnte in zwei etablierten Rattenmodellen der Zirrhose-unabhängigen Hepatokarzinogenese unlängst belegt werden. Trotz des Einwirkens unterschiedlicher Karzinogene verläuft dieser Prozess sowohl im Modell der niedrigdosierten intrahepatischen Pankreasinseltransplantation in diabetischen Ratten als auch im chemischen Modell mit nicht-diabetischen Ratten nach N-Nitrosomorpholin (NNM)-Exposition nach der typischen glykogenotisch-basophilen Entwicklungssequenz mit ausgeprägten Ähnlichkeiten bezüglich Morphologie und molekularbiologischen Veränderungen. Welche Bedeutung insulinomimetische Mechanismen während der weiteren Karzinogenese in diesen Modellen noch haben und welche zusätzlichen pathogenetischen Faktoren hinzukommen, ist bisher weitgehend unbekannt und soll durch eine globale Genexpressionsanalyse näher beleuchtet werden. Dazu wurden verschiedene morphologische Karzinogenesestadien von Ratten aus dem Inseltransplantations- und NNM-Modell mit Hilfe der komparativen cDNA-Mikroarray-Technik auf intraindividuelle Expressionsveränderungen mehrerer tausend Gene untersucht. Neben glykogenotischen Präneoplasien, weiter fortgeschrittenen gemischtzelligen Präneoplasien und hepatozellulären Karzinomen (HCC) aus dem Transplantationsmodell Streptozotocin (Stz)-diabetischer Ratten sowie glykogenotischen Präneoplasien und HCC aus dem NNM-Modell befand sich auch eine Gruppe autoimmun-diabetischer Ratten mit glykogenotischen Präneoplasien nach Inseltransplantation unter den Versuchstieren. Mit Hilfe dieser Versuchsgruppe sollten potentiell relevante Unterschiede der Expressionsveränderungen zwischen den glykogenotischen Präneoplasien der verwandten Transplantationsmodelle aufgedeckt werden, welche auf die einmalige Stz-Applikation im klassischen Transplantationsmodell zurückzuführen sein könnten. Die Expressionveränderungen betreffen in beiden Modellen mehrere hundert Gene aus zahlreichen zellulären Prozessen, wobei insgesamt (2512 versus 1717) und bei Gegenüberstellung der korrespondierenden Stadien im klassischen Inseltransplantationsmodell stets mehr Gene alteriert sind als im NNM-Modell. Am geringsten ist die Zahl alterierter Gene in den glykogenotischen Präneoplasien der autoimmun-diabetischen Ratten. Die in allen Versuchsgruppen prozentual am stärksten von den Expressionsveränderungen betroffenen Gene stammen von intrazellulären Signalmediatoren, Transkriptionsregulatoren und Membranrezeptoren. Aus dem Bereich des Grundstoffmetabolismus sind Lipid- und Kohlenhydratstoffwechsel am stärksten betroffen. Insgesamt gibt es bezüglich der alterierten Zellprozesse keine wesentlichen Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsgruppen. Die Expressionsveränderungen nehmen bis zur Vervierfachung im Karzinomstadium im Verlauf der Karzinogenese in beiden Modellen zu (kumulativer Effekt). Unter den alterierten Genen finden sich neben solchen des Glukose-Turnovers und der Insulin-Signaltransduktion zahlreiche weitere Karzinogenese-assoziierte Gene, darunter lipogene Mediatoren, mehrere Wachstumsfaktoren (ErbB-, FGF- und Annexin-Familie), Mediatoren der Angiogenese, Apoptoseregulation und der intrazellulären Signaltransduktion, onkogene Transkriptionsfaktoren, DNA-Reparaturgene sowie einige bekannte Protoonko- und Tumorsuppressorgene. Die Expressionsveränderungen sprechen auch für eine Rolle von insulinomimetischen Mechanismen in der späten experimentellen Hepatokarzinogenese, wobei diese eher durch andere Karzinogenese-assoziierte Phänomene als durch direkte Insulinrezeptor-Signalübertragung aufrechterhalten werden könnten. So ließen sich einige Expressionsveränderungen des Glukosestoffwechsels zum Beispiel mit Hilfe des Warburgeffekts oder als Hypoxie-induziert erklären. Darüber hinaus liefern vorliegende Ergebnisse Anhaltspunkte für weitere pathogenetisch relevante Mechanismen während der Karzinogeneseprogression in den untersuchten Modellen. Dazu gehören unter anderem der wachstumsfördernde Einfluss von überexprimierten Wachstumsfaktoren der ErbB-Familie und lipogenen Mediatoren aber auch die Dysregulation des intrazellulären Signalkaskadennetzwerks und des programmierten Zelltods. Die Alteration derselben zellulären Prozesse im Transplantations- und NNM-Modell bestätigt eine große Übereinstimmung im Verlauf der Karzinogenese in beiden Modellen auf Transkriptionsebene. Insgesamt sind die Alterationen im Stz-Modell stärker ausgeprägt. Sowohl die Anzeichen für mögliche vorübergehende Stz-induzierte Genexpressionsveränderungen in den klarzelligen Präneoplasien als auch Ursache und tatsächliche kausalpathogenetische Bedeutung der hier nachgewiesenen Expressionsveränderungen müssen durch weitere Untersuchungen validiert und gezielter analysiert werden.
Die at-line Expressionsanalyse von Bioprozess-relevanten Markergenen auf der Grundlage von elektrischen Biochip-Verfahren ist eine viel versprechende Strategie für eine prozessbegleitende Beurteilung der Zellphysiologie des Produktionswirtes. Eine derartige direkte Methode für die Bestimmung des physiologischen Status würde zu einer umfassenderen Überwachung und Kontrolle von industriellen Fermentationsprozessen beitragen. Die Expressionsanalyse der Markergene mit den verwendeten elektrischen Biochips beruht auf dem Nachweis der entsprechenden mRNA über eine Sandwich-Hybridisierung und der elektrochemischen Detektion der Hybride. Hierbei sind sowohl Bead-basierte als auch Array-basierte Formate möglich. Der Bead-basierte mRNA-Nachweis nutzt paramagnetische Partikel (Beads) für die Immobilisierung von Gen-spezifischen Fängersonden. Während der Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den Beads gebunden. Gleichzeitig hybridisiert eine Detektionssonde in einem anderen Bereich der mRNA und ermöglicht so die Markierung mit einem Enzym. Dieses setzt para-Aminophenol (pAP) frei, das an den Elektroden des Biochips über zyklische Oxidations- und Reduktionsprozesse (Redox-Recycling) amperometrisch detektiert wird. Der resultierende elektrische Strom dient als Maß für die mRNA-Menge in der Probe. Die Array-basierte mRNA-Detektion nutzt elektrische Biochips mit 16 individuell auslesbaren Elektrodenpositionen. In diesem Format werden die Fängersonden direkt auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Durch die Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den jeweiligen Elektrodenpositionen gebunden. Die Detektion erfolgt positionsspezifisch über das Enzym-kontrollierte Redox-Recycling von pAP. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag vor allem auf der Verkürzung, Optimierung und Automation der Bead-basierten mRNA-Detektion. Durch erste Optimierungen einzelner Protokollschritte der Bead-basierten Sandwich-Hybridisierung konnte eine Verkürzung des Protokolls von ursprünglich 4 h auf unter 3 h erzielt werden. Der Übergang zu einer Sandwich-Hybridisierung in Lösung führte vor allem zu einer verbesserten Handhabbarkeit und Reproduzierbarkeit des Protokolls. Die Neuanordnung der Sondenbindestellen auf der Ziel-mRNA und die Einführung einer zweiten Detektionssonde resultierten in signifikanten Steigerungen der Hybridisierungssignale. Dies ermöglichte eine Verkürzung der Detektionszeit auf ca. 75 min. Durch weitere Optimierungen einzelner Aspekte des Protokolls konnte schließlich eine mRNA-Detektionszeit von ca. 45 min realisiert werden. Somit wurde das Protokoll für die Bead-basierte mRNA-Detektion mit dem elektrischen Biochip, ausgehend von isolierter Gesamt-RNA, von ursprünglich 4 h auf 45 min verkürzt. Gleichzeitig konnte die Sensitivität des Protokolls um das etwa Fünffache gesteigert werden. Die Automatisierung mithilfe eines Pipettierroboters erlaubte eine parallele Bearbeitung und die automatische, sequentielle Detektion von 8 Proben innerhalb von ca. 1 h. Weiterhin wurde die Array-basierte mRNA-Detektion etabliert und teilweise optimiert. Dies ermöglichte eine parallele, elektrochemische Detektion von derzeit 4 verschiedenen mRNAs in einer Probe isolierter Gesamt-RNA innerhalb von 20 min. Allerdings sind vor der automatischen Messung noch zusätzliche Schritte für die manuelle Bearbeitung der RNA-Proben (ca. 25 min) erforderlich. Die Anwendbarkeit der entwickelten Protokolle wurde jeweils am Beispiel von ausgewählten Markergenen des industriell bedeutsamen Wirtes Bacillus licheniformis getestet. Die mithilfe der elektrischen Biochip gemessenen Expressionsprofile der Markergene korrelierten mit den mittels real-time RT-PCR bestimmten mRNA-Mengen. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Grundlage für eine Bioprozess-begleitende mRNA-Analytik, basierend auf elektrischen Biochips, geschaffen werden.
Pestivirus-Replikons als Werkzeug für heterologe Genexpression und molekulare Charakterisierung
(2021)
Replikons sind autonom replizierende RNA-Moleküle die nicht in der Lage sind, infektiöse Viren zu bilden. Sie sind wichtige Hilfsmittel zur molekularen Charakterisierung von Viren. Außerdem werden sie erfolgreich als Expressionssystem für Proteine und zur Entwicklung von Impfvektoren eingesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Replikon-basiertes Testsystem für den Nachweis spezifischer Antikörper gegen das atypische porzine Pestivirus (APPV) in Schweineseren etabliert. Auf Basis eines Klons des Virus der bovinen Virusdiarrhoe Typ 1 (BVDV) wurden die ursprünglichen BVDV Glykoproteine E1 und E2 gegen die Glykoproteine des APPV ausgetauscht. Die Expression mittels Replikon gewährleistet die natürliche Konformation der Proteine und damit die Bindung der entsprechenden Antikörper. Dieses System ermöglichte die serologische Untersuchung von 1115 Schweineseren ohne vorherige Isolation oder Zellkulturadaptation des Virus. Mit diesem neu entwickelten System konnte eine Seroprävalenzstudie gestartet und eine hohe Prävalenz von APPV in der untersuchten deutschen Schweinepopulation gezeigt werden.
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden Replikons zur Charakterisierung des atypischen Pestivirus Bungowannah Pestivirus (BuPV) eingesetzt. Während die Replikons mit Deletionen der Gene für die einzelnen Strukturproteine C, E1 und E2 oder die gesamte Strukturproteinregion keine Besonderheiten im Vergleich zu bereits untersuchten Pestivirus-Replikons aufwiesen und keine infektiösen Virionen mehr produzieren konnten, zeigten BuPV-Replikons mit ERNS-Deletion die Fähigkeit, zwei weitere Replikationszyklen zu durchlaufen und Zellen zu infizieren, allerdings mit einem sehr deutlichen Wachstumsdefizit. Dieser Defekt scheint in der Virusassemblierung und/oder der Freisetzung aus der Zelle zu liegen. Es konnte somit erstmals gezeigt werden, dass ERNS nicht essentiell für die Bildung infektiöser Bungowannah-Viren ist, jedoch sehr wichtig für eine effiziente Virusvermehrung. Diese Eigenschaft der ERNS deletieren BuPV macht diese besonders interessant als Vektoren für die Entwicklung neuer Replikon-basierter Expressionssysteme und einer Vakzinplattform. ERNS-Deletionsmutanten wurden daher auf ihre Fähigkeit hin untersucht, eine effiziente Expression verschiedener immunogener Proteine zu gewährleisten. Die Konstrukte waren dabei in der Lage, die ausgewählten Proteine effizient zu exprimieren und konnten zudem effizient zu Virus-Replikon-Partikel (VRP) verpackt und in einer trans-komplementierenden Zelllinie vermehrt werden.
Auch der für das parentale Virus beschrieben Zelltropismus konnte für die generierten BuPV-VRP gezeigt werden. Zusätzlich zu den beschriebenen Eigenschaften sind es der nicht-zytopathogene Charakter und die in den meisten Regionen fehlende Immunität gegen BuPV, die das hohe Potential dieses Systems als universellen Vakzinvektor herausstellen.
Zusätzlich wurde im Rahmen dieser Arbeit ein erstes DNA-basiertes System zur Herstellung rekombinanter BuPVs etabliert. Dieses System ermöglicht sowohl die Virusproduktion ausgehend von einem T7-RNA-Polymerase Promotor, als auch von einem Polymerase-II-Promotor. Die infektiösen Viren zeigten gleiche Wachstumseigenschaften wie Viren, welche mit dem konventionellen RNA-System generiert wurden. Auf Basis des neuen DNA-Systems konnte auch ein Replikon mit Deletion im ERNS-Gen etabliert werden. Dieser Klon zeigte nach der Transfektion eine sehr geringe Replikationsrate, konnte jedoch zur weiteren Konstruktion eines „single round infectious particle“ (SRIP) eingesetzt werden. Diese SRIP sind durch die Koexpression des deletierten ERNS in der Lage, sich selbst zu verpacken und bilden damit ein ideales System zum Transport selbst-replizierender RNA. Durch seine selbstlimitierenden Eigenschaften könnte es zur Entwicklung und Etablierung einer effizienten und sicheren Vakzineplattform eingesetzt werden. Allerdings ist dafür eine weiterreichende Optimierung notwendig.
Insgesamt zeigten die Untersuchungen, dass sich pestivirale Replikons sowohl als effizientes und schnelles Testsystem für die Untersuchung der Verbreitung neu auftretender Pestiviren, als auch zur Entwicklung effizienter RNA- und DNA-basierter Transport- und Verpackungssysteme viraler Proteine, eignet.