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Biorelevante In-vitro-Freisetzungsmodelle werden u. a. für das Screening neuartiger Formulierungen, zur Etablierung von In-vitro-/In-vivo-Korrelationen und zur Vorhersage des In-vivo-Verhaltens einer applizierten Darreichungsform angewendet. Die Entwicklung von In-vitro-Freisetzungsmodellen für peroral verabreichte Arzneiformen fokussierte bisher vorwiegend auf die Abbildung der gastrointestinalen Physiologie eines gesunden, „durchschnittlichen“ Erwachsenen. Patientenspezifische Faktoren, wie z. B. das Alter, Erkrankungen oder Geschlecht sowie individuelle Unterschiede, die die gastrointestinalen Verhältnisse und folglich auch das Freisetzungsverhalten einer peroral applizierten Arzneiform beeinflussen können, wurden bisher kaum berücksichtigt. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Entwicklung und Etablierung von patientenspezifischen, bioprädiktiven In-vitro-Freisetzungsmodellen für perorale Darreichungs-formen unter Berücksichtigung der gastrointestinalen Gegebenheiten zweier unterschiedlicher Patientenpopulationen: pädiatrische Patienten und Parkinson-Patienten.
Eine wichtige Voraussetzung für eine sichere und wirksame perorale Arzneimitteltherapie bei pädiatrischen Patienten sind altersgerechte Darreichungsformen sowie eine geeignete Einnahmepraxis. Peroral applizierte Arzneimittel werden pädiatrischen Patienten häufig zusammen mit Applikationsvehikeln verabreicht, um die Einnahme der Arzneimittel zu erleichtern. Es muss jedoch bei einer solchen Anwendungspraxis sichergestellt werden, dass die eingenommene Arzneiform mit dem jeweiligen Applikationsvehikel kompatibel ist. Die Beurteilung der Kompatibilität ist anhand klinischer In-vivo-Studien an gesunden Kindern jedoch aufgrund ethischer Bedenken kaum möglich. Zur Evaluierung der Kompatibilität könnten In-vitro-Freisetzungsmethoden als eine mögliche Alternative eingesetzt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden pädiatrische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt, um zu evaluieren, ob die Stabilität und das In-vivo-Freisetzungsverhalten der neuartigen Alkindi®-Formulierung durch Co-Verabreichung mit alterstypischen Applikationsvehikeln beeinträchtigt werden. Zur Beantwortung dieser Fragestellung wurden im Anschluss an eine intensive Literaturrecherche Physiologie-basierte In-vitro-Modelle auf Basis der Mini-Paddle-Apparatur entwickelt. In der ersten Studie wurde die In-vitro-Wirkstofffreisetzung nach simulierter Applikation der Alkindi®-Formulierung mit typischen Applikationsvehikeln für Kinder unter 6 Jahren, d. h. Muttermilch, Formulamilch und Vollmilch, untersucht. In der zweiten In-vitro-Studie wurde der Altersbereich der adressierten Patientenpopulation auf 2 - 16 Jahre verändert und eine Reihe weiterer flüssiger sowie halbfester Applikationsvehikel, wie z. B. Orangensaft und Joghurt, verwendet. In beiden Studien konnte deutlich gezeigt werden, dass die Alkindi®-Formulierung ein robustes Freisetzungsverhalten aufwies und kompatibel mit den untersuchten Matrices war. Auf Grundlage der Ergebnisse der In-vitro-Untersuchungen wurde geschlussfolgert, dass die In-vivo-Freisetzung und die Bioverfügbarkeit der untersuchten Arzneiform nicht durch die untersuchten Applikationsvehikel beeinflusst werden und folglich diese Vehikel zur gemeinsamen Einnahme mit der Alkindi®-Formulierung geeignet sind. Diese Beobachtungen wurden darüber hinaus durch publizierte Ergebnisse einer korrespondierenden In-vivo-Studie in Erwachsenen bestätigt.
Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Entwicklung eines neuartigen, Parkinson-spezifischen und Physiologie-basierten In-vitro-Freisetzungsmodells. Für die Entwicklung von biorelevanten In-vitro-Modellen zur Simulation der luminalen Bedingungen im Gastrointestinal-trakt einer spezifischen Patientenpopulation sind umfangreiche Kenntnisse über die jeweiligen gastrointestinalen In-vivo-Bedingungen und deren Variabilität unerlässlich. Im Rahmen einer Literaturrecherche wurde der aktuelle Wissensstand zu den gastrointestinalen Gegebenheiten in Parkinson-Patienten recherchiert, ausgewertet und zusammengefasst. Die Ergebnisse der Literaturstudie machen deutlich, dass sich die gastrointestinalen Bedingungen von Parkinson-Patienten teilweise erheblich von gesunden Erwachsenen unterscheiden. Das bedeutendste gastrointestinale Merkmal von Parkinson-Patienten ist die beeinträchtigte Motilität des Gastrointestinaltrakts, was sich u. a. in einer Verlangsamung der Magenentleerung sowie der intestinalen Passage äußert. Demgegenüber steht jedoch ein großer Mangel an Daten für eine Reihe von gastrointestinalen Parametern. Dies betrifft z. B. die Zusammensetzung und physiko-chemischen Eigenschaften der luminalen Flüssigkeiten des Gastrointestinaltrakts.
Als geeignete In-vitro-Testplattform wurde die USP-3-Apparatur – auch als Eintauchender Zylinder (Europäisches Arzneibuch, Ph. Eur.) und Reciprocating cylinder (Ph. Eur. und US-amerikanisches Arzneibuch, USP) bezeichnet – ausgewählt, da sich diese Testplattform insbesondere zur Untersuchung von Darreichungsformen mit modifizierter Wirkstofffreisetzung eignet und bereits in einer Vielzahl von analytischen Laboren etabliert ist. Die Nutzung der kompendialen USP-3-Apparatur ließ aufgrund der geringen Variationsmöglichkeiten keine Simulation typischer Motilitätsmuster im humanen Gastrointestinaltrakt zu und eignete sich noch weniger für die Entwicklung und Etablierung von individuellen, patientenspezifischen Motilitätsprofilen. Um diese technischen Limitationen zu überwinden, wurde für die Weiterentwicklung des arzneibuchkonformen Modells ein Lastenheft erstellt, welches detaillierte Anforderungen für die Entwicklung der neuen Testapparatur enthielt. Auf Grundlage des beschriebenen Übersichtsartikels und unter Anwendung einer auf Basis des Lastenheftes modifizierten USP-3-Apparatur wurden unter besonderer Berücksichtigung von Motilität, Passagezeiten und Flüssigkeitsvolumina Parkinson-spezifische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt. Für ausgewählte modifiziert freisetzende Levodopa-Fertigarzneimittel wurde anschließend eine vergleichende Serie von In-vitro-Freisetzungsuntersuchungen unter Anwendung von Parkinson-spezifischen- oder „standardmäßigen“ Testmodellen durchgeführt, wobei letztere die gastrointestinalen Gegebenheiten eines „durchschnittlichen“, gesunden Erwachsenen simulierten. Für eine Beurteilung der Aussagekraft der entwickelten Parkinson-spezifischen Testmodelle wurden die generierten In-vitro-Freisetzungsdaten aus den Parkinson-spezifischen- und den „standardmäßigen“ Freisetzungsuntersuchungen in ein In-silico-PBPK-Modell implementiert und die jeweiligen simulierten Plasmakonzentrations-Zeit-Profile von Levodopa anschließend mit klinischen, durchschnittlichen In-vivo-Daten korreliert. Für PBPK-Modelle mit integrierten Parkinson-spezifischen In-vitro-Freisetzungsdaten wurde eine höhere Prädiktivität des In-vivo-Verhaltens der untersuchten Levodopa-Darreichungsformen beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Parkinson-spezifischen In-vitro-Modelle ein vielversprechendes und prädiktives Instrument zur Vorhersage der In-vivo-Wirkstofffreisetzung von modifiziert freisetzenden Levodopa-Darreichungsformen darstellen. Der diskutierte methodische Ansatz der vorliegenden Studie könnte zukünftig das Screening neuartiger Formulierungen deutlich optimieren und somit zu einer verbesserten Arzneimitteltherapie für Parkinson-Patienten, aber auch für andere spezifische Patientengruppen beitragen
In Germany, around 5.7 million people suffer from osteoporosis. Osteoporosis is characterised by a reduced bone mineral density that leads to an increased risk of fractures. The 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1 (11β-HSD1) is an important regulator of local cortisol metabolism. It converts biologically inactive cortisone to biologically active cortisol, but can also catalyse the reverse reaction. 11β-HSD1 is strongly expressed in liver, but 11β-HSD1 expression and activity were also reported in bone. Moreover, polymorphisms in intron 5 of HSD11B1 (the gene encoding for 11β-HSD1) are associated with bone mineral density (BMD) and risk of fractures.
This work aimed to confirm and refine the associations between polymorphisms in intron 5 of HSD11B1 and BMD, and to identify the underlying molecular and cellular mechanisms. To this end, analyses were performed on three different levels:
i) studies in humans, to confirm and refine the association of polymorphisms in intron 5 of HSD11B1 with BMD, suppressed cortisol levels (PDC) and stiffness index,
ii) cellular analyses, to identify the role of 11β-HSD1 in differentiation of the immortalised human mesenchymal stem cell line SCP-1,
iii) molecular genetic analyses, to reveal the effect of intron 5 polymorphisms on transcriptional regulation.
Fine-mapping analyses of already existing clinical data from 452 osteoporosis patients (HSD study) did not point to another intron 5 SNP as being causative for the observed clinical association. A second prospective clinical study (OsteoGene) was performed to confirm the association of rs11811440 and rs932335 with PDC levels and BMD. A trend to decreased PDC levels and increased BMD was observed in homozygous carriers of the minor A-allele of rs11811440 in patients above the age of 65 years. Pooled analyses of the HSD and the OsteoGene studies revealed a significant association of the minor A-allele with increased Z-scores of the left femoral neck. No associations of rs11811440 and rs932335 with stiffness index, BMI and fat depots were detected the general population using data from the SHIP study.
To analyse the effect of 11β-HSD1 on differentiation of mesenchymal stem cells, HSD11B1 overexpressing and HSD11B1 knockout SCP-1 cells were generated. HSD11B1 was stably overexpressed in SCP-1 cells using targeted chromosomal integration. The successful overexpression was shown by 243-fold increased HSD11B1 mRNA expression levels and a 9 fold increased 11β-HSD1 activity, compared to the wildtype cells. Knockout cells were generated by CRISPR-Cas9 mediated gene editing targeting exon 2 and exon 5 of HSD11B1. Using next generation sequencing, the clones 1C4 and 2D10 were confirmed to carry two inactive HSD11B1 alleles and were chosen for further analyses. mRNA expression was unchanged in both knockout clones. However, a clear enzyme activity was detected in the 2D10 clone, whereas no cortisol production was detected in the 1C4 clone. SNaPshot analyses revealed the presence of wildtype cells in the 2D10 clone that became predominant with increased passages. Therefore, further analyses were focused on the 1C4 clone only. The protein expression in the 1C4 clone decreased to 30% of the expression of the wildtype cells.
HSD11B1 expression and cortisol production were compared between wildtype, knockout and overexpressing SCP-1 cells under three differentiation conditions: adipogenic, osteogenic with 1α,25-dihydroxyvitamin D3 and osteogenic with dexamethasone. HSD11B1 expression increased upon adipogenic differentiation and in the presence of cortisone in the wildtype and the overexpressing, but not in the knockout cells. Also, the cortisol production from cortisone increased over time in the overexpressing and the wildtype cells, but not in the knockout cells. The increase was dependent on the differentiation used between 3-fold and 9-fold higher in the overexpressing than in the wildtype cells.
The generated and validated overexpressing and knockout cell lines were used to analyse the influence of 11β-HSD1 on adipogenic and osteogenic differentiation. Upon adipogenic differentiation, the overexpressing cells accumulated significantly more lipid droplets than the wildtype cells. The accumulation of lipid droplets was not abolished in the knockout. However, when dexamethasone was substituted by cortisone, the knockout cells accumulated less lipid droplets than in the presence of dexamethasone, supporting the involvement of 11β-HSD1 in adipogenic differentiation. Expression of the adipogenic markers FABP4 and LPL increased upon adipogenic differentiation, but a distinct influence of the presence or absence of HSD11B1 on the FABP4 and LPL expression was not detected. Upon osteogenic differentiation with 1α,25-dihydroxyvitamin D3, ALP activity increased only in the knockout cells (more than 5-fold). Accordingly, the strongest increase in ALPL expression was detected also in the knockout cells. Both, ALP activity and gene expression were independent of cortisone. Addtionally, BGLAP expression was increased upon osteogenic differentiation. Unexpectedly, in the presence of cortisone, BGLAP expression increased in the overexpressing cells. Expression of the Wnt inhibitor DKK1 also increased in the overexpressing cells in the presence of cortisone indicating a decreased osteogenic differentiation. Moreover, expression of the adipogenic markers FABP4 and LPL increased in the overexpressing cells in the presence of cortisone indicating a switch from osteogenic to adipogenic differentiation. Upon osteogenic differentiation with dexamethasone, ALP activity and matrix mineralisation was lowest in the overexpressing cells.
Finally, the effects of the SNPs rs11811440, rs11119328, rs1000283 and rs932335 in intron 5 of HSD11B1 on transcriptional regulation were analysed by reporter gene assays and electrophoretic mobility shift assays. All four SNPs are genetically linked and are localized within evolutionary conserved regions. The minor C-allele of rs932335 significantly increased luciferase activity. In contrast, the major G-allele of rs932335 showed strong protein binding. However, no transcription factor binding sites were identified at the SNP sites. Additionally, bioinformatics analyses of publicly available RNA-Seq data of adipose tissue and liver confirmed the absence of alternative splicing. Alignment of HSD11B1 intron 5 to the Rfam database predicted the presence of non-coding RNAs (ncRNAs) in intron 5. However, none of the ncRNAs overlapped with the SNP sites.
In conclusion, 11β-HSD1 was shown to be involved in adipogenic differentiation and peripheral cortisol production by 11β-HSD1 promotes a switch from osteogenic to adipogenic differentiation. Moreover, among osteoporosis patients, homozygous carriers of the minor A-allele of rs11811440 have increased Z-scores of the femoral neck. Furthermore, HSD11B1 knockout and overexpressing cell lines were successfully generated and validated. These cell lines could be a useful tool in future analyses of the role of peripheral cortisol activation by 11β-HSD1 in differentiation of mesenchymal stem cells.