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Beeinflussung der Wundheilung von respiratorischen Epithelzellen in vitro durch Roxithromycin
(2023)
In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss des Makrolid-Antibiotikums Roxithromycin auf die frühe Phase der postoperativen Wundheilung am Zellkulturmodell untersucht werden. Gründe für den Einsatz des Medikamentes sind abseits der bekannten bakterios-tatischen Wirkung insbesondere die in der Langzeitanwendung beschriebenen immunmodulatorischen Effekte. Es sollte untersucht werden, ob diese bereits in der Akutsituation zu einem Benefit in der Wundheilung im HNO-Bereich führen, da Wundhei-lung hier sekundär verläuft und Wundheilungsstörungen durch Fibrosierungen und Re- Stenosen nicht selten zu einer operativen Korrektur zwingen.
Gewählt wurden S9-Zellen als Modell für respiratorisches Epithel, welche einer standardi-sierten Wundsetzung durch Stanzung unterzogen wurden. Mittels AlamarBlue-Assay wurden zytotoxische Medikamentenkonzentrationen herausgearbeitet und im Folgenden durch Konzentrationsfindungsversuche über 120 Stunden mit kombinierter Wundsetzung bestätigt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe beschleunigt Roxithromycin in Konzentrationen von 10 µg/ml, 20 µg/ml und 40 µg/ml eher die Wundheilung, während Konzentrationen von 80 µg/ml und 160 µg/ml zu einer signifikanten (p ≤ 0.01 bzw. p ≤ 0.05) Hemmung der Wundheilung führen. Die Effekte waren jeweils über die ganze Beobachtungsdauer und im Ausmaß zunehmend nachweisbar. Roxithromycin in einer Konzentration von 160 μg/ml konnte die Zellproliferation 96 und 120 h nach Wundsetzung so stark hemmen, dass die residuale Wundfläche sogar anstieg.
In einem Validierungsansatz konnte zudem herausgearbeitet werden, dass die Wundsetzung konsequenterweise von nur einer/m Experimentierenden erfolgen sollte, um ein re-produzierbares Ergebnis zu erhalten, während sich kein Unterschied in der Auswertung der Wundflächen durch verschiedene Personen zeigte.
Zum Verständnis der molekularbiologischen Effekte des Medikamentes auf Epithelzellen wurden unter Berücksichtigung der in der Literatur beschriebenen maximalen Serumkonzentration bei systemischer Anwendung von Roxithromycin (7,28 ± 1,85 mg/l), fehlenden Hinweisen auf einen zytotoxischen Effekt sowie tendenziell beschleunigter Wundheilung nachfolgend 2D–DIGE-Experimente gekoppelt mit massenspektrometrischen Proteinidentifikationen für die Roxithromycinkonzentration von 10 µg/ml durchgeführt. Es ergaben sich Hinweise auf eine Förderung des Zellwachstums durch Beeinflussung des Polyaminmetabolismus über Induktion der Spermidinsynthase und darüber hinaus Spermidin-abhängige Modifikation des Translationsfaktors EIF5A. Des Weiteren wurde eine Nrf2-assoziierte Antwort auf oxidativen Streß bereits bei niedriger Roxithromycin- Konzentration von 10 µg/ml als protektiver Faktor ermittelt. Durch quantitative LC-MS/MS-Analysen wurde dieser Effekt ebenso für Konzentrationen von 20 und 40 µg/ml Roxithromycin bestätigt. Der weitläufig dokumentierte konzentrationsabhängige zytotoxische Effekt des Medikamentes bei höheren Konzentrationen konnte auch in dieser Arbeit gezeigt werden. Während apoptoseauslösende Proteine in der Konzentration von 10 µg/ml nicht nachgewiesen werden konnten, gelang in höheren Roxithromycin-Konzentrationen eine Darstellung von regulierten Proteinen des intrinsischen und extrinsischen Apoptoseweges, bis hin zur bereits mikroskopisch erfassbaren Zelldepletion bei Konzentrationen von 80 und 160 µg/ml. Insbesondere bei der Konzentration von 20 µg/ml fanden sich Hinweie, dass eine Regulation über den ERK1/2-Pathway stattfindet, welcher umfangreiche Funktionen wie Zytokinfreisetzung, Zellmigration, Zellproliferation und auch Zelltod moderiert.
Die Behandlung mit Roxithromycin führt in niedriger Konzentration (10 µg/ml) tendenziell zu einer beschleunigten Wundheilung ohne Auftreten zytotoxischer Effekte. Grundlage könnte die Aktivierung von Translationsfaktoren (EIF5A) und Protektion vor den Schäden durch oxidativen Streß sein. Damit stellt diese Therapie eine Option in der frühen postoperativen Situation im HNO-Bereich dar, welche allerdings weiterer Untersuchung z. B. durch Testung an Fibroblasten bedarf. Attraktiver erscheint das Outcome bei einer Medikamentenkonzentration von 20 µg/ml, da die epitheliale Wundheilung signifikant schneller abläuft und somit zu einem schnelleren Wundverschluß führt. Die molekularbiologischen Hinweise auf Induktion der Apoptose werden bei dieser Konzentration offenbar noch durch protektive Mechanismen über Beeinflussung der Zellmigration, Neutralisierung von Schäden durch oxidativen Streß und Eingriff in den ERK-Pathway aufgefangen, was bei höheren Roxithromycinkonzentrationen nicht mehr gelingt und in einer Zelldepletion mündet. Daher bietet sich für die Konzentration von 20 µg/ml insbesondere die topische Applikation als Salbenstrang oder Nasenspray an, um die positiven Effekte zu nutzen und die Limitation durch vorheriges Erreichen der maximalen Serumkonzentration zu umgehen. Empfehlenswert ist die Untersuchung des Medikamentes in weiteren Zell-reihen und in vivo da Wundheilung ein multimodaler Prozeß ist. Eine topische Applikation von ggf. höheren lokalen Konzentrationen scheint hier keinen zusätzlichen Nutzen darzustellen.
Kardiovaskuläre Erkrankungen gehören trotz zahlreicher medikamentöser und apparativer Therapiemaßnahmen noch immer zu den häufigsten Todesursachen in den Industrienationen. Die Herzinsuffizienz (HI) stellt dabei das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar und beschreibt das Unvermögen des Herzens, die Blutzirkulation im Organismus bei normalem Ventrikeldruck konstant zu halten. Unabhängig von ihrer Ätiologie, wie Koronarerkrankungen, langjähriger Hypertonie oder auch Kardiomyopathien ist die HI neben der Funktionsreduktion des linken und/oder rechten Ventrikels gleichzeitig durch strukturelle Veränderungen (Remodeling) mit Gefäßverengung (Vasokonstriktion), endotheliale Dysfunktion mit Vasokonstriktion, sowie eine generalisierte neurohumorale Aktivierung gekennzeichnet. Die Suche nach neuen und alternativen Therapieverfahren zur Verbesserung der Symptomatik und Prognose der betroffenen Patienten ist daher notwendig. Einer der wichtigsten Mediatoren für die Regulation des Gefäßwiderstandes ist Stickstoffmonoxid (NO, nitric oxide), welches durch NO-Synthasen synthetisiert wird. NO aktiviert die lösliche Guanylatzyklase (sGC, soluble guanylate cyclase), wodurch es zu einer erhöhten Produktion des second messengers cGMP (cyclic guanosine monophosphate) kommt. Eine Beeinträchtigung des NO-sGC-cGMP-Signalweges und der dadurch bedingte Mangel an cGMP trägt zu den Prozessen der myokardialen und endothelialen Dysfunktion bei der Entwicklung und Progression einer HI bei. Die Entwicklung pharmakologisch aktiver Moleküle, die die sGC direkt stimulieren können, ist dabei von besonderem Interesse, da z.B. keine Toleranzentwicklung bei längerer Medikation oder andere negative Nebenwirkungen wie bei der Gabe von NO-Donatoren als Vasodilatatoren entstehen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss einer sGC-Stimulation mittels Riociguat (RIO), einem bereits für die Behandlung der pulmonal arteriellen Hypertonie (PAH) und der chronisch thromboembolischen pulmonalen Hypertonie (CTEPH) zugelassenen Medikament, auf die experimentelle HI untersucht werden. Neben Echokardiographie und histologischen Analysen zur Charakterisierung des Krankheitsphänotyps und der Auswirkung einer Behandlung darauf wurde ebenfalls auf Multi-Omics-Ansätze wie Proteomics und Transcriptomics zurückgegriffen, um detaillierte Einblicke in die molekularen Veränderungen auf Genexpressionsebene, Proteinebene und microRNA-Expressionsebene zu erlangen. Als Modell wurde die transverse Aortenkonstriktion (TAC) an C57BL/6N Mäusen verwendet, welche einen permanenten hämodynamischen Stressreiz auf das Herz ausübt, der schließlich zum Herzversagen führt. Im Hinblick auf die Pathogenese der HI simuliert TAC dabei auf elegante Weise eine arterielle Hypertonie, die unter anderem zu einer progressiven linksventrikulären Hypertrophie und einer reduzierten Herzfunktion unter chronischen Bedingungen führt. Für die medikamentöse Behandlung mit RIO wurde eine experimentelle Strategie gewählt, die der klinischen Situation entspricht. Dementsprechend wurde mit der Medikation zu einem Zeitpunkt begonnen, als die Herzfunktion bereits verschlechtert war und eine pathologische Hypertrophie und interstitielle Fibrose ausgebildet bzw. nachweisbar war.
TAC führte zu einer kontinuierlichen Abnahme der linksventrikulären Ejektionsfraktionsfraktion (LVEF) und einer kontinuierlichen Zunahme der linksventrikulären Masse (LVM). Eine fünfwöchige Behandlung mit RIO (3 mg/kg/d) ab der vierten postoperativen Woche führte zu einer Verbesserung der LVEF und zu einer Verringerung des Verhältnisses von LVM zu Gesamtkörpergewicht (LVM/BW), myokardialer Fibrose und Myozytenquerschnittsflächen. RNA-Sequenzierungsanalysen der linken Ventrikel ergaben, dass RIO die Expression von myokardialen Stress- und Remodeling-Genen, wie z.B. Nppa, Nppb, Myh7 und Kollagen, verringerte und die Aktivierung biologischer Signalwege abschwächte, die mit kardialer Hypertrophie und HI in Verbindung stehen. Diese protektiven Effekte einer RIO-Behandlung konnten auch auf Proteinebene beobachtet werden und spiegelten sich in einer deutlichen Reduktion der TAC-induzierten Veränderungen des linksventrikulären Proteoms wider. Durch die Aortenkonstriktion betroffene Signalwege, die mit kardiovaskulären Erkrankungen assoziiert sind, wie gewebe- und zellstrukturspezifische Signalwege, besonders aber Signalwege des Energiemetabolismus, zeigten eine Verbesserung nach einer RIO-Behandlung. Zudem schwächte RIO auch die TAC-induzierten Veränderungen auf microRNA-Ebene in den linken Ventrikeln ab.
Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit RIO positive Auswirkungen auf die kardiale Struktur bzw. das pathologische kardiale Remodeling und die Funktion in einem murinen Modell der chronischen Nachlasterhöhung/Drucküberlastung hat, was mit einer Umkehrung bzw. Abschwächung der TAC-induzierten Veränderungen des kardialen linksventrikulären Genexpressions-, Proteom- und microRNA-Profils einhergeht. Die vorliegenden Ergebnisse unterstützen die bisherigen Vermutungen und Erkenntnisse zum Potential von RIO als neuartigem HI-Therapeutikum. Des Weiteren wurden große Omics-Datensätze generiert, die als Informationsquelle zukünftigen Untersuchungen helfen können, die molekularen Mechanismen der chronischen HI und möglicher therapeutischer, medikamentöser Interventionen besser zu verstehen und weiter zu entschlüsseln.
Das gram-negative Stäbchenbakterium Burkholderia pseudomallei, Erreger der Melioidose, ist ein fakultativ intrazelluläres Pathogen. Ein detailliertes Wissen über das Proteom dieses Pathogens liefert eine wichtige Grundlage für das Verständnis der Pathomechanismen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden detailierte „reference maps“ des intra- und extrazellulären Proteoms von B. pseudomallei Stamm E8 erstellt. Es wurden hierbei insgesamt 353 intrazelluläre und 154 extrazelluläre Proteine identifiziert und anschließend einer funktionellen Klassifizierung unterzogen. Die „reference maps“ stellen ein wichtiges Werkzeug für weitere vergleichende Proteomanalysen dar. In weiterführenden Experimenten wurde das Proteom dreier Wildtypstämme verglichen. Hierbei zeigten sich insgesamt nur geringe Unterschiede zwischen den drei analysierten Stämmen E8, E212 und K96423. Die Proteomanalysen bestätigten die Ergebnisse der Genotypisierung – beide Ansätze ergaben eine engere Verwandtschaft der Stämme E212 und K96423 als mit Stamm E8.
Im Infektionsverlauf von B. pseudomallei ist das sonst aerob lebende Bakterium in der Lage sich auch unter anaroben Bedingungen auszubreiten. Über die anaerobe Physiologie von B. pseudomallei ist bisher wenig bekannt. Es konnte ein Screeningsystem entwickelt werden, mit dem aus insgesamt 2344 Transposonmutanten 16 Mutanten mit reduziertem Wachtum unter anaeroben Bedingungen identifiziert wurden. Die vier Mutanten mit dem am stärksten verringerten Wachstum wurden für weitere Analysen im Rahmen dieser Arbeit ausgewählt. Drei der Mutanten hatten Molybdän bezogene Gendefekte und bei einer Mutante betraf der Gendefekt eine putative Sensor-Kinase. Die untersuchten Mutanten konnten erfolgreich komplementiert werden und somit polare Effekte ausgeschlossen werden. Die Komplentanten wiesen wieder dem Wildtyp entsprechendes anaerobes Wachstum auf und wiesen auch bei allen weiteren Experimenten, wie z.B. Infektionsversuchen, die Eigenschaften des Wildtyps auf. Dass unter den 2344 gescreenten Transposon Mutanten drei der vier auffälligsten Mutanten Molybdän bezogene Gendefekte aufwiesen, unterstreicht die Wichtigkeit von Molybdän und im Zusammenhang damit der anaeroben Nitratreduktase. Die Attenuierung der drei Mutanten im C57BL/6-Maus-Infektionsmodell deutet auf die Wichtigkeit des anaeroben Stoffwechsels bei chronischen Infektionsverläufen von B. pseudomallei hin. Bei der weiteren näher untersuchten Mutante liegt ein Defekt einer putativen Sensorkinase vor. Diese gehört zu einem Zwei-KomponentenSignaltransduktionssystem, welches Homologien zum RegB-RegA-System aufweist. Es konnte gezeigt werden, dass die hier untersuchte Sensorkinase einen entscheidenen Einfluss auf die Virulenz von B. pseudomallei hat. Der exakte Mechanismus der Attenuierung durch die Mutation von BPSL0201 bleibt vorerst jedoch noch ungeklärt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit dem hier entwickelten Screeningsystem erfolgreich Transposonmutanten identifiziert werden konnten, welche ein reduziertes Wachstum unter anaeroben Bedingungen aufweisen. Durch die anschließende Charakterisierung konnten tiefere Einblicke in den anaeroben Lebensstil von B. pseudomallei gewonnen werden. Die Ergebnisse deuten auf einen Zusammenhang zwischen der Fähigkeit des anaeroben Wachstums von
B. pseudomallei und der vollen Virulenz hin. Die gewonnenen Erkenntnisse stimulieren weitere Untersuchungen im Hinblick auf den Einfluss des anaeroben Wachstums von B. pseudomallei bei der Pathogenese der Melioidose.
Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives pathogenes Bakterium, welches bei ca. 30 % der gesunden Bevölkerung zur kommensalen Flora der Nasenschleimhaut gehört. Jedoch zählt S. aureus auch zu den häufigsten Erregern bakterieller Infektionen beim Menschen. Aus diesem Grund wurden S. aureus-Stämme in zahlreichen Studien untersucht, um die Pathophysiologie und Virulenz der Bakterien sowie die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen zu verstehen. Die Expression von Virulenzfaktoren wird direkt oder indirekt durch verschiedene Regulatoren beeinflusst. Zu diesen zählen beispielsweise das Quorum-Sensing-System Agr, der alternative Sigma-Faktor SigB und das Zweikomponentensystem SaeRS. Bei der Regulation der Genexpression spielt neben Mechanismen, die die Transkriptionsinitiation beeinflussen, auch die Transkriptions-termination eine Rolle. Bei Bakterien unterscheidet man zwischen der Rho-unabhängigen und der Rho-abhängigen Transkriptionstermination. In bisherigen Studien wurde die Rolle des Transkriptionsterminationsfaktors Rho in Escherichia coli, Bacillus subtilis und Mycobacterium tuberculosis untersucht. Hierzu zählt unter anderem das Silencing von horizontal erworbenen Genen, die Verhinderung von DNA-Doppelstrangbrüchen und die Unterdrückung der persistierenden Antisense-Transkripten. Besonders die erhöhte Antisense-Transkription konnte auch in einer Tiling Array-Studie des S. aureus Wildtypstammes HG001 und einer isogenen Δrho-Mutante ST1258 festgestellt werden. In dieser Transkriptom-Analyse wurden die S. aureus-Stämme in RPMI- und TSB-Medium in der exponentiellen und stationären Wachstumsphase untersucht. Es konnten insgesamt 416 chromosomale Regionen identifiziert werden, deren Transkriptmenge in einer der vier Bedingungen in der Δrho-Mutante im Vergleich zum Wildtyp wenigstens 4-fach erhöht waren. Von diesen Regionen ließen sich nur 11 % annotierten Genen zuordnen, während eine massive Erhöhung der Menge solcher Transkripte festgestellt wurde, die vom Gegenstrang kodierender Gene stammen.
Ausgehend von diesen Befunden wurde in dieser Studie das zelluläre und extrazelluläre Proteom des S. aureus Wildtyps HG001 und der Δrho-Mutante ST1258 verglichen, um die Auswirkungen der Abwesenheit von Rho auf das Proteom zu untersuchen. Dabei lag die Mehrheit der relativ quantifizierten Proteine in erhöhten Mengen in der Δrho-Mutante im Vergleich zum Wildtyp vor. Viele dieser Proteine konnten dem SaeRS-Zweikomponentensystem von S. aureus zugeordnet werden. In der Proteomanalyse konnten 34 von 39 Proteinen, die durch SaeR reguliert werden, quantifiziert werden. Von diesen wiesen 29 erhöhte Proteinmengen in der Δrho-Mutante auf. Durch das Sae-System werden Gene reguliert, von denen die meisten für Virulenzfaktoren, wie Adhäsine, Toxine und immune evasion-Proteine, kodieren. Die Daten der Proteomanalyse zeigen, dass in S. aureus-Zellen, denen die Aktivität von Rho fehlt, das Sae-System aktiviert wird und dadurch die Induktion des SaeR-Regulons zu beobachten ist.
Die Relevanz dieser Ergebnisse wurde durch ein in vivo-Infektionsexperiment untersucht. In einem Bakteriämie-Modell führte die Inaktivierung von Rho zu einer signifikant erhöhten Virulenz von S. aureus, welche sich in einer signifikant reduzierten Überlebensrate der Mäuse äußerte. Zwischen dem Wildtyp und dem Komplementationsstamm konnte kein signifikanter Unterschied in der Überlebensrate der infizierten Mäuse gezeigt werden.
Es ist bekannt, dass SaeRS-abhängige Virulenzfaktoren auch für die Invasion in Epithel- und Endothelzellen entscheidend sind. Anhand der Zahl der internalisierten S. aureus-Bakterien nach Infektion von humanen Lungenepithelzellen konnten in dieser Arbeit keine Unterschiede zwischen dem Wildtyp HG001 und ∆rho-Mutante ST1258 im zeitlichen Verlauf festgestellt werden. Dabei konnten weder Unterschiede im Überleben in 16HBE14o- Zellen noch in der Internalisierungsrate in A549-Zellen zwischen den beiden Stämmen gezeigt werden.
Das Antibiotikum Bicyclomycin ist ein spezifischer Inhibitor des Transkriptionsterminationsfaktors Rho und wird in Studien zur Rho-abhängigen Transkriptionstermination in Gram-negativen Bakterien eingesetzt, da in diesen Rho ein essentielles Protein ist. In Transkriptom- und Proteomanalysen konnten vergleichbare Effekte durch die Behandlung des Wildtyps mit Bicyclomycin wie in der ∆rho-Mutante hervorgerufen werden. Die Antisense-Transkription und die Expression SaeRS-abhängigen Gene waren im Wildtyp nach Gabe von Bicyclomycin deutlich erhöht. Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des Sae-Systems unter Rho-defizienten Bedingungen direkt mit der Transkriptionsterminationsaktivität von Rho verbunden ist und eine neue Verbindung zwischen antibiotischer Wirkung und schädlicher Virulenzgenexpression in S. aureus herstellt werden konnte. In anderen Studien konnten Effekte von Antibiotika auf die Expression von Virulenzfaktoren in S. aureus gezeigt werden, jedoch wurden in diesen Studien die Effekte von Anti-Staphylokokken-Wirkstoffen untersucht. Im Gegensatz dazu ist im Fall von Bicyclomycin ein Antibiotikum verwendet worden, das gegen Gram-negative Bakterien wirksam ist und dennoch die Expression von Virulenzfaktoren in S. aureus beeinflusst. Diese Untersuchungen haben damit auch klinische Relevanz, nicht nur für Patienten, die an gemischten Infektionen mit verschiedenen Bakterienarten leiden, sondern auch für Patienten mit einer Gram-negativen bakteriellen Infektion, die jedoch Träger von S. aureus sind.
In der vorliegenden Forschungsarbeit wurde untersucht, zu welchen Veränderungen es im Proteom der pankreatischen β-Zelle durch Erzeugung von Hyperglykämie und/oder Hyperlipidämie kommt, die z.B. im Rahmen des Metabolischen Syndroms auftreten können.
Für die Experimente wurde die Zelllinie BRIN BD11 verwendet. Eine Behandlung erfolgte vergleichend mit Glucose (25 mM) und/oder Docosahexaensäure (DHA 0,1 mM) für 24 Stunden.
Das Proteom der BRIN-BD11 Zellen wurde mit Hilfe von 2D Differenzial-Fluoreszenz-Gelelektrophorese (DIGE) analysiert und die Proteine unter Verwendung der Massenspektrometrie identifiziert. Es konnten insgesamt 1101 Proteine in 1487 detektierten Spots bestimmt werden. Darunter stellten sich 90 Spots unter den oben genannten Stimulationen als signifikant reguliert dar. Aus diesen wurden 63 regulierte Proteine identifiziert, die sich verschiedenen Bereichen des Stoffwechsels zuordnen lassen, u.a. dem Glucosestoffwechsel, der Atmungskette, katabolen Prozessen oder den Reparatur- und Schutzmechanismen.
Eine Ingenuity Pathway Analyse anhand der regulierten Proteine ergab Zuordnungen zu 3 Netzwerken:
1 Nukleinsäuremetabolismus, Lipidmetabolismus und Biochemie kleiner Moleküle,
2 DNA -Replikation, -Rekombination und -Reparatur, Nukleinsäuremetabolismus und Biochemie kleiner Moleküle,
3 Kohlenhydratmetabolismus, molekularer Transport und Biochemie kleiner Moleküle.
Weiterhin konnte eine funktionelle Einteilung sowie die Verteilung der Proteine nach Zellkompartimenten dargestellt werden.
Eine Verifizierung der Ergebnisse mittels RT-qPCR erfolgte für Cathepsin D, Endoplasmic reticulum lipid raft-associated protein 2, Melanocyte proliferating gene 1, Glutamat-Cystein-Ligase sowie für die Thioredoxin-Reduktase und das Dihydropyrimidinase-related protein 2. Desweiteren wurden Western Blot Analysen zu Thioredoxin-Reduktase und das Dihydropyrimidinase-related protein 2 durchgeführt.
Die Ergebnisse weisen auf eine Regulation im Sinne einer Kompensation der Stressoren hin, die durch gesteigerte Expression/Aktivität antioxidativer Systeme wie Glutathion und Thioredoxin erklärbar wären. Zudem konnte ein Proteommuster der BRIN BD11 Zellen erstellt werden und bildet mit der massenspekrometrischen Identifizierung der Proteine eine Grundlage für weitere Untersuchungen an der Zelllinie.
Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe
(2017)
Der Einsatz von Tierversuchen in Forschung und Entwicklung nimmt trotz fortschreitender Optimierung von Testmethoden und –verfahren weiter zu. Zeitgleich werden fortwährend neue Substanzen isoliert oder synthetisiert, deren Wirkungen auf den humanen Organismus und speziell das Immunsystem nicht bekannt sind. In vitro Methoden stellen deshalb sowohl eine günstige und schnelle als auch eine ethisch unbedenkliche Alternative zu Tierversuchen dar. In der vorliegenden Arbeit sollten proteom- und transkriptombasierte Methoden dazu dienen, immuntoxische Eigenschaften von Naturstoffen zu identifizieren und diese Verfahren als Alternative zu Tierversuchen zu etablieren. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien mit Naturstoffen behandelt und das intrazelluläre Proteom sowie das Transkriptom spezifischer Biomarker-Gene analysiert. Zusätzlich dienten weitere Methoden wie Metaboliten-, Zellzyklus- und Apoptoseanalysen sowie die Identifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies dazu, Ergebnisse zu verifizieren oder zusätzliche Informationen zu erhalten. Wie zu erwarten war, zeigten die Proteomanalysen, dass sowohl immuntoxische als auch nicht-immuntoxische Substanzen eine breite Wirkung auf das intrazelluläre Proteom haben. Vor allem Proteine, die in den allgemeinen Metabolismus, zelluläre Prozesse und Prozesse der Informationsverarbeitung involviert sind, wurden durch die Behandlung mit den Substanzen in ihrer relativen Menge auf den 2D-Gelen verändert. Allein durch die Zuordnung von Proteinen zu Stoffwechselwegen war eine Abgrenzung immuntoxischer und nicht immuntoxischer Substanzen nicht möglich. Dennoch gibt die Methode einen Einblick in die Wirkungsweise der Substanzen, wodurch Wirkmechanismen entschlüsselt und Reaktionen auf das Immunsystem abgeleitet werden können. Dies wird vor allem nach der Behandlung der Zellen mit Tulipalin A und Helenalin deutlich, da auch allgemeine Stoffwechselwege wie die Purinsynthese und die anaerobe Glykolyse einen Einfluss auf das Immunsystem haben. Zusätzlich zu den allgemeinen Stoffwechselwegen wurden einzelne Proteine in ihrer Abundanz verändert, die in Reaktionen des Immunsystems wie der Zytokinbildung oder der Bildung von MHC-Molekülen involviert sind. Außerdem konnten Biomarker für Immuntoxizität auf Proteomebene entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Daten war eine Klassifizierung der Substanzen nach ihrer Immuntoxizität möglich. Anhand dieser Analysen wurden die Testsubstanzen Tulipalin A, Helenalin, Vincristin und Cannabidiol als immuntoxisch klassifiziert. Die Klassifizierung der Substanzen als immuntoxisch aufgrund der Biomarker-Proteine und Stoffwechselwege konnte durch die Anwendung von Transkriptom-Biomarkern bestätigt werden. Neben den über 2D-Gelelektrophorese-basierten Proteomanalysen getesteten Substanzen wurden auch Bisphenol A und Ergosterolperoxid aufgrund der Transkriptombiomarker als immuntoxisch klassifiziert. Agaritin und p-Tolylhydrazin sowie der Bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether haben keine immuntoxische Wirkung. Neben den Proteom-basierten Methoden dient der entwickelte Entscheidungsbaum basierend auf verschiedenen Methoden als Grundlage für die Immuntoxiztätsklassifizierung. Mit dem erstellten Entscheidungsbaum konnten beispielsweise Cyclosporin A, Helenalin und Tulipalin A durch die Anwendung gezielter Tests als immuntoxisch eingestuft werden, während Mannitol als nicht-immuntoxisch bestätigt wurde. Zusammenfassend war es mittels in vitro Methoden möglich, die Immuntoxizität verschiedener Naturstoffe zu identifizieren. Neben Proteom-basierten Methoden wurden auch Transkriptom- sowie funktionelle und Metabolomanalysen genutzt. Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Alternative zu Tierversuchen für eine erstes Screening Testung neuer Substanzen ermöglichen und so sowohl Zeit und Kosten sparen als auch ethische Bedenken minimieren.
In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal in der aktuellen Literatur das Proteom von einer humanen und einer bakteriellen Zellreihe nach Behandlung mit sogenanntem tissue-tolerable Plasma hypothesenfrei analysiert. Mit diesem neuartigen Ansatz konnten die vorliegenden aktuellen Literaturdaten größtenteils bestätigt und erheblich erweitert werden. So konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit TTP dosisabhängig zu einer signifikant vermehrten Proliferation der humanen respiratorischen S9-Zellen führt. Als therapeutisch vielversprechendste Dosis wurde dabei, wie auch schon in der Literatur vermutet, die 120s-Behandlung identifiziert, wobei auch kleinere Dosen eine vorteilhafte Tendenz aufzeigten. Nichtsdestotrotz sind weitere Studien dringend erforderlich, um insbesondere die Langzeit- und Nebenwirkungen von TTP aufzuzeigen. Dass die Behandlung auch Risiken bergen könnte, zeigen die auf Proteinebene erhaltenen Ergebnisse, wo mit steigenden TTP-Dosen auch die Veränderungen der Expression von Proteinen der Funktionskomplexe DNA-Schäden und Apoptosefaktoren zunehmen. Unklar ist bislang, wie sich der Verlauf über den 120h-Zeitraum hinaus darstellt und mit welcher Häufig- und Regelmäßigkeit die Behandlung in der Klinik erfolgen müsste, um einen nachhaltigen, therapeutisch relevanten Effekt zu erzielen. Zum Nachweis der Praxistauglichkeit der Plasmatherapie sind weitere Studien erforderlich, um eben diese Fragen zu beantworten und auszuschließen, dass die negativen Auswirkungen bedingt bspw. durch verstärkte Apoptoseinduktion eventuell zu einem späteren Zeitpunkt die positiven Effekte der TTP-Behandlung überlagern oder antagonisieren. Notwendig sind auch klinische Studien in der Hals-Nasen-Ohrenkunde, die das Wachstumsverhalten der Zellen im Allgemeinen, aber auch im Speziellen der respiratorischen Zellen in vivo zeigen. Die in vitro gefundenen Resultate geben maximal einen kleinen Fingerzeig auf das, was in einem komplexen, wechselwirkenden Organismus zu erwarten ist. Bislang sind in diesem Bereich noch keine größeren Studien erfolgt.
Gezeigt werden konnte in der Arbeit auch, dass die Staphylokokken deutlich anfälliger für TTP sind als die humanen Zellen. Hier konnte das in vitro Wachstum eingeschränkt werden, was den Ergebnissen der aktuellen Literatur entspricht. Allerdings gilt hier ebenfalls, das in vitro erzielte Ergebnisse nicht ohne Weiteres auf die Klinik übertragen werden können. Auch wenn es bereits einige klinische Studien zur antimikrobiellen Wirkung von Plasma gibt, steht die Forschung noch am An-fang. Gezeigt werden muss im Verlauf noch, dass TTP auch im Biosystem Mensch die in-vitro gezeigten Effekte auslöst. Bekannt ist außerdem wie oben beschrieben, dass Staphylokokkus aureus ohnehin zu den sensibleren Keimen gehört. Eine Analyse des Verhaltens von möglicherweise resistenteren Bakterien ist nötig. Auch zu klären bleibt, wie sich Pilze unter der Behandlung verhalten und ob nicht nach Ausschalten der bakteriellen Flora möglicherweise ein Selektionsvorteil entsteht, der zu vermehrten Pilzwundinfektionen führt.
Die Ergebnisse der Arbeit konnten die Entstehung von oxidativen Stress als wichtigsten Mediator der TTP-Wirkung aufzeigen. Diese Erkenntnis deckt sich mit der aktuellen Studienlage und konnte aufgrund der umfassenden Proteomanalyse beider Zellreihen gewonnen werden. Nichtsdestotrotz müssen weitere genaue Auswertungen erfolgen. Aufgrund der sehr großen Datenmenge erfolgte im Verlauf der Analyse eine ausgiebige Ordnungs- und Filterarbeit. Trotz großer Sorgfalt ist es kaum möglich gewesen, alle Informationen zu berücksichtigen und in einer übersichtlichen Form zu erhalten. Daher sind die in der Arbeit dargestellten Ergebnissen lediglich ein kleiner Ausschnitt der offensichtlichsten Erkenntnisse. Es ist außerdem zu bedenken, dass aufgrund der technischen Limitation lediglich 1220 Proteine identifiziert werden konnten, bei aktuell 30.057 bekannten menschli-chen Proteinen [99]. Betrachtet wurden letztlich also lediglich 4% des Proteoms. Weitere globale Analysen sind im Verlauf sinnvoll und nötig, um die gewonnenen Resultate zu stärken oder zu hinterfragen .
Insgesamt präsentiert sich TTP als ambitionierte Therapiealternative, die große Möglichkeiten in der Medizin der Zukunft verspricht. Insbesondere in der HNO birgt es vielversprechende Möglichkeiten bei bislang problematischen Erkrankungen. Die Forschung ist allerdings gefordert, weitere umfassende Studien durchzuführen um die Sicherheit und Praktikabilität zu gewährleisten.
Die chronische arterielle Hypertonie erhöht das Risiko für kardiovaskuläre Komplikationen wie Schlaganfall und Myokardinfarkt. In der Pathophysiologie dieser Komplikationen spielen Thrombozyten eine wesentliche Rolle. Hierbei gehen die meisten Experten derzeit davon aus, dass Thrombozyten mit den durch die Hypertonie geschädigten Gefäßwänden reagieren. Ziel unserer Untersuchungen war es, zu untersuchen, ob durch die Hypertonie auch Veränderungen in Thrombozyten entstehen. Thrombozyten zirkulieren im Kreislauf in engem Kontakt mit der Gefäßwand und reagieren sensibel auf hohe Scherkräfte und aktivierte Endothelzellen. Jede Aktivierung, auch in reversiblen Frühstadien führt dabei zu Veränderungen in der Proteinzusammensetzung der Thrombozyten, dem Proteom. Da sie keinen Kern haben, ist die Proteinneosynthese in Thrombozyten stark limitiert. So „speichern“ Thrombozyten Informationen über ihre Aktivierungshistorie während ihrer zehntägigen Überlebenszeit, da die veränderten Proteine nicht, oder nur sehr eingeschränkt durch neu synthetisierte Proteine ersetzt werden. Proteomics bietet einen Ansatz, über tausend Proteine gleichzeitig zu untersuchen. Mittels zweidimensionaler, differentieller in Gel Elektrophorese (2D-DIGE) kann dabei ein sensibler quantitativer Vergleich zweier Proben erfolgen. Die komplexe Methodik erfordert jedoch eine hochgradige Standardisierung der Versuchsgruppen. In diesem Projekt wurde daher ein Tiermodell verwendet, um die ca. 1000, mittels 2D-PAGE dargestellten Proteinspots des Thrombozytenzytosols auf hypertoniebedingte Veränderungen zu untersuchen. Dabei wurden zwei unterschiedliche Rattenmodelle der Hypertonie eingesetzt um die Aussagekraft zu erhöhen. Nach 14tägiger Hypertoniephase wurden 45 Proteinspots detektiert, deren Intensität in beiden Rattenmodellen signifikant verändert war. Die Identifikation dieser Spots mittels Massenspektrometrie zeigte neben spezifischen Thrombozytenproteinen v.a. Zytoskelett- und Zytoskelett -assoziierte Proteine. Wurde an die 14tägige Hypertoniephase eine 10tägige Erholungsphase angeschlossen, waren diese Veränderungen nicht mehr nachweisbar. Überraschenderweise waren die beobachteten Veränderungen unterdrückbar durch mehrmalige Blutentnahme vor- und während der Hypertoniephase. Dabei wurden 8 Tage vor-, sowie zweimal während der Hypertoniephase (Tage 3 und 10) 3 ml Blut entnommen. Die daraufhin durchgeführte Untersuchung auf Veränderungen des Thrombozytenproteoms durch Blutentnahmen an normotensiven Tieren zeigte ein Muster an Veränderungen, dass dem unter Hypertonie beobachteten entgegengesetzt war. Eine denkbare Ursache für diese Beobachtung ist, dass die Thrombozytopoese durch die mehrmaligen Blutverluste gesteigert wurde. Die so vermehrt ausgeschütteten „jungen“ Thrombozyten zeigen ein inverses Proteommuster, gegenüber den durch Hypertonie gestressten Thrombozyten. Um dieser Hypothese nachzugehen wurden Ratten mit dem Thrombopoetinrezeptoragonisten Romiplostim behandelt. Das Thrombozytenproteom von Ratten nach Stimulation der Thrombozytopoese ähnelt dem von Ratten nach mehrmaligen Blutentnahmen. Dies unterstützt unsere Hypothese, dass die durch Blutentnahmen bedingten Proteomveränderungen auf eine gesteigerte Thormobzytopoese zurückzuführen sind und damit auf das gesteigerte Vorkommen junger Thrombozyten im Blutkreislauf. Veränderungen des Thrombozytenproteoms, die in beiden Tiermodellen unter Hypertonie auftraten, können mit großer Sicherheit auf die Hypertonie zurückgeführt werden. Zu beachten ist allerdings, dass beide Modelle auf einer Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron Systems (RAAS) basieren. Es kann also nicht differenziert werden, ob die Veränderungen durch die Hypertonie selbst oder durch das aktivierte RAAS verursacht wurden. Die Tiermodelle spiegeln somit nur eine Subgruppe der Hypertoniepatienten wider. Wir haben mit diesen Experimenten Thrombozyten-Proteine identifiziert, die sich durch einen erhöhten Blutdruck verändern. Diese Proteine sind daher potentielle Kandidaten für Biomarker, die eine Aussage über den Blutdruckverlauf der zurückliegenden Tage ermöglichen. Solch ein Marker, ähnlich dem HbA1c beim Diabetes mellitus, könnte die Hypertoniediagnostik erheblich erleichtern. Für die in dieser tierexperimentellen Studie identifizierten Proteine finden sich analoge Proteine in menschlichen Thrombozyten. Deren Veränderung durch Bluthochdruck sollte in Fall/Kontroll-Studien am Menschen untersucht werden. In Ergänzung zum im Journal of Hypertension veröffentlichten Artikel wird in der vorliegenden deutschen Zusammenfassung detaillierter auf die Methoden eingegangen. Darüber hinaus werden zusätzliche Aspekte in der Diskussion angesprochen.
Teil 1: Pathogeninaktivierung: Es wurde ein neues Verfahren zur Pathogeninaktivierung mittels Proteomanalysen untersucht. Bei diesem wurden Proben von Kaninchenthrombozyten mit Riboflavin bzw. Psoralen inkubiert und mit UV-A Licht bestrahlt. Dadurch werden die in Pathogenen enthaltenen Nukleinsäuren unbrauchbar gemacht, wohingegen gezeigt werden konnte, dass die Plättchen kaum in ihrem Proteom und damit vermutlich in ihrer Funktionalität beeinflusst wurden. Teil 2: Thrombozytenalterung: Durch Apherese wurde an drei auf einander folgenden Tagen die in einem humanen Spender zirkulierenden Plättchen auf 80000/µl depletiert und anschließend Plättchen aus dem Vollblut mittels differentieller Zentrifugation gewonnen. Während der einsetzenden Nachbildung von Thrombozyten wurde das Proteom der Zellen mit den Ausgangswerten verglichen und so versucht, Alterungsmarker im Thrombozytenproteom zu finden.