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Kardiovaskuläre Erkrankungen gehören trotz zahlreicher medikamentöser und apparativer Therapiemaßnahmen noch immer zu den häufigsten Todesursachen in den Industrienationen. Die Herzinsuffizienz (HI) stellt dabei das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar und beschreibt das Unvermögen des Herzens, die Blutzirkulation im Organismus bei normalem Ventrikeldruck konstant zu halten. Unabhängig von ihrer Ätiologie, wie Koronarerkrankungen, langjähriger Hypertonie oder auch Kardiomyopathien ist die HI neben der Funktionsreduktion des linken und/oder rechten Ventrikels gleichzeitig durch strukturelle Veränderungen (Remodeling) mit Gefäßverengung (Vasokonstriktion), endotheliale Dysfunktion mit Vasokonstriktion, sowie eine generalisierte neurohumorale Aktivierung gekennzeichnet. Die Suche nach neuen und alternativen Therapieverfahren zur Verbesserung der Symptomatik und Prognose der betroffenen Patienten ist daher notwendig. Einer der wichtigsten Mediatoren für die Regulation des Gefäßwiderstandes ist Stickstoffmonoxid (NO, nitric oxide), welches durch NO-Synthasen synthetisiert wird. NO aktiviert die lösliche Guanylatzyklase (sGC, soluble guanylate cyclase), wodurch es zu einer erhöhten Produktion des second messengers cGMP (cyclic guanosine monophosphate) kommt. Eine Beeinträchtigung des NO-sGC-cGMP-Signalweges und der dadurch bedingte Mangel an cGMP trägt zu den Prozessen der myokardialen und endothelialen Dysfunktion bei der Entwicklung und Progression einer HI bei. Die Entwicklung pharmakologisch aktiver Moleküle, die die sGC direkt stimulieren können, ist dabei von besonderem Interesse, da z.B. keine Toleranzentwicklung bei längerer Medikation oder andere negative Nebenwirkungen wie bei der Gabe von NO-Donatoren als Vasodilatatoren entstehen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einfluss einer sGC-Stimulation mittels Riociguat (RIO), einem bereits für die Behandlung der pulmonal arteriellen Hypertonie (PAH) und der chronisch thromboembolischen pulmonalen Hypertonie (CTEPH) zugelassenen Medikament, auf die experimentelle HI untersucht werden. Neben Echokardiographie und histologischen Analysen zur Charakterisierung des Krankheitsphänotyps und der Auswirkung einer Behandlung darauf wurde ebenfalls auf Multi-Omics-Ansätze wie Proteomics und Transcriptomics zurückgegriffen, um detaillierte Einblicke in die molekularen Veränderungen auf Genexpressionsebene, Proteinebene und microRNA-Expressionsebene zu erlangen. Als Modell wurde die transverse Aortenkonstriktion (TAC) an C57BL/6N Mäusen verwendet, welche einen permanenten hämodynamischen Stressreiz auf das Herz ausübt, der schließlich zum Herzversagen führt. Im Hinblick auf die Pathogenese der HI simuliert TAC dabei auf elegante Weise eine arterielle Hypertonie, die unter anderem zu einer progressiven linksventrikulären Hypertrophie und einer reduzierten Herzfunktion unter chronischen Bedingungen führt. Für die medikamentöse Behandlung mit RIO wurde eine experimentelle Strategie gewählt, die der klinischen Situation entspricht. Dementsprechend wurde mit der Medikation zu einem Zeitpunkt begonnen, als die Herzfunktion bereits verschlechtert war und eine pathologische Hypertrophie und interstitielle Fibrose ausgebildet bzw. nachweisbar war.
TAC führte zu einer kontinuierlichen Abnahme der linksventrikulären Ejektionsfraktionsfraktion (LVEF) und einer kontinuierlichen Zunahme der linksventrikulären Masse (LVM). Eine fünfwöchige Behandlung mit RIO (3 mg/kg/d) ab der vierten postoperativen Woche führte zu einer Verbesserung der LVEF und zu einer Verringerung des Verhältnisses von LVM zu Gesamtkörpergewicht (LVM/BW), myokardialer Fibrose und Myozytenquerschnittsflächen. RNA-Sequenzierungsanalysen der linken Ventrikel ergaben, dass RIO die Expression von myokardialen Stress- und Remodeling-Genen, wie z.B. Nppa, Nppb, Myh7 und Kollagen, verringerte und die Aktivierung biologischer Signalwege abschwächte, die mit kardialer Hypertrophie und HI in Verbindung stehen. Diese protektiven Effekte einer RIO-Behandlung konnten auch auf Proteinebene beobachtet werden und spiegelten sich in einer deutlichen Reduktion der TAC-induzierten Veränderungen des linksventrikulären Proteoms wider. Durch die Aortenkonstriktion betroffene Signalwege, die mit kardiovaskulären Erkrankungen assoziiert sind, wie gewebe- und zellstrukturspezifische Signalwege, besonders aber Signalwege des Energiemetabolismus, zeigten eine Verbesserung nach einer RIO-Behandlung. Zudem schwächte RIO auch die TAC-induzierten Veränderungen auf microRNA-Ebene in den linken Ventrikeln ab.
Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit RIO positive Auswirkungen auf die kardiale Struktur bzw. das pathologische kardiale Remodeling und die Funktion in einem murinen Modell der chronischen Nachlasterhöhung/Drucküberlastung hat, was mit einer Umkehrung bzw. Abschwächung der TAC-induzierten Veränderungen des kardialen linksventrikulären Genexpressions-, Proteom- und microRNA-Profils einhergeht. Die vorliegenden Ergebnisse unterstützen die bisherigen Vermutungen und Erkenntnisse zum Potential von RIO als neuartigem HI-Therapeutikum. Des Weiteren wurden große Omics-Datensätze generiert, die als Informationsquelle zukünftigen Untersuchungen helfen können, die molekularen Mechanismen der chronischen HI und möglicher therapeutischer, medikamentöser Interventionen besser zu verstehen und weiter zu entschlüsseln.
Hintergrundinformationen: Bakterien gehören zu den ältesten Lebensformen und sind ein elementarer Bestandteil aller ökologischen Lebensräume auf der Erde. Der Mensch als Holobiont ist ein eigenständiges Ökosystem mit einer Vielzahl von ökologischen Nischen und einer großen bakteriellen Vielfalt. Durch innere oder äußere Einflüsse kann es zu Veränderungen der Umweltbedingungen kommen, die eine veränderte Zusammensetzung des Mikrobioms zur Folge haben. Eine solche Dysbiose wirkt sich auf den Gesundheitszustand des Menschen aus und kann zu schweren Krankheiten führen. Das orale Mikrobiom gehört mit zu den komplexesten Mikrobiomen des Menschen. Es bildet eine natürliche Barriere gegen Krankheitserreger und beugt somit u.a. lokalen Krankheiten wie Karies oder Parodontitis vor. Die Metaproteomik ermöglicht es, die exprimierten Proteine des Mikrobioms und deren Interaktion mit dem Wirt zu untersuchen. Diese Technologie überwindet somit die Beschränkung auf Laborkulturen und ermöglicht die Untersuchung des Mikrobioms direkt in seinem natürlichen Lebensraum. Die Metaproteomik bietet eine Reihe von Instrumenten zur Vertiefung des Verständnisses des oralen Mikrobioms hinsichtlich des Gesundheitszustandes des Menschen.
Ziele: Ein Ziel dieser Dissertation war es einen Arbeitsablauf für die Durchführung von Metaproteomstudien des oralen Mikrobioms zu erarbeiten, beginnend bei der Probensammlung über die Präparation der Proben für die Massenspektrometrie bis hin zur bioinformatischen Auswertung. Diesen Arbeitsablauf galt es für das Mikrobiom des Speichels sowie für die Biofilme auf der Zunge und des supragingivalen Plaques zu etablieren bzw. zu adaptieren. Darauf aufbauend wurden Metaproteomstudien durchgeführt, um die drei Mikrobiome bei gesunden Probanden hinsichtlich ihrer exprimierten Proteine, deren metabolischer Bedeutung und Interaktionen mit dem Wirt sowie deren taxonomische Zuordnung zu studieren.
Studiendesign: Die Dissertation umfasst drei Studien mit drei unterschiedlichen Kohorten. Allen Studien ist gemein, dass die Kohorten sich aus oral gesunden Probanden im Alter von 20-30 Jahren zusammensetzten.
In der ersten Studie verglichen wir die Salivette® sowie den Paraffinkaugummi anhand von fünf Probanden, um die effektivste Methode zur Sammlung von Speichel für Metaproteomstudien zu identifizieren.
In der zweiten Studie wurden die Mikrobiome von Speichel und Zunge anhand von 24 Probanden miteinander verglichen und dafür eine Auswertestrategie entwickelt, um der Komplexität dieser Metaproteomstudie gerecht zu werden.
Im Rahmen unserer dritten randomisierten Einzelblindstudie, die auf einem Cross-over-Design basierte, erhielten 16 Probanden vier unterschiedliche lokale Behandlungsschemata, um deren Auswirkung auf das Plaque-Mikrobiom zu untersuchen. Die Behandlungen bestanden aus zwei Lutschtabletten, die Bestandteile des Lactoperoxidase-Systems in unterschiedlichen Konzentrationen enthielten, einer Lutschtablette mit einem Placebo-Wirkstoff sowie Listerine® Total Care™ Mundspülung als Positivkontrolle.
Alle Proben wurden, basierend auf einem Bottom-Up-Ansatz, unter Verwendung von nano LC-MS/MS Massenspektrometern in einer datenabhängigen Messstrategie (DDA, data- dependant acquisition mode) vermessen. Die bioinformatische Auswertung erfolgte für die erste Studie mit Hilfe der Proteome Discoverer Software. Für die Studien zwei und drei wurde die Trans-Proteomic Pipeline eingesetzt. Die taxonomische sowie funktionelle Zuordnung der identifizierten Proteine erfolgte für alle Studien anhand der Prophane Software.
Ergebnisse:
Für den Paraffinkaugummi konnten wir mit 1.005 bakteriellen Metaproteinen dreimal so viele Metaproteine identifizieren im Vergleich zur Salivette® mit 313 Metaproteinen. 76,5 % der Metaproteine der Salivette® wurden ebenfalls mit dem Paraffinkaugummi gefunden. Insgesamt wurden 38 Genera und 90 Spezies identifiziert, wovon 13 Genera und 44 Spezies nur mit dem Paraffinkaugummi identifiziert werden konnten. Die größte funktionelle Diversität wurde ebenfalls mit dem Paraffinkaugummi detektiert.
Das Metaproteom des Speichel- und Zungen-Mikrobioms basiert auf 3.969 bakteriellen Metaproteinen sowie 1.857 humanen Proteinen. Die Anzahl der nur für das Zungen-Mikrobiom identifizierten Metaproteine, war doppelt so hoch, im Vergleich zum Speichel.
Die Metaproteine konnten 107 Genera sowie 7 Phyla zugeordnet werden. Funktionell wurden für das Speichel-Mikrobiom signifikant höhere Metaproteinabundanzen für die Zellmotilität gefunden. Beim Zungen-Mikrobiom hingegen wiesen die Metaproteine der Biosynthese von sekundären Metaboliten, Signaltransduktion oder der Replikation höhere Abundanzen auf.
Im Rahmen der Plaque-Studie identifizierten wir durchschnittlich 1.916 (± 465) bakterielle Metaproteine je Probe, die wir taxonomisch und funktionell 116 Genera sowie 1.316 Proteinfunktionen zuordnen konnten. Die Plaque inhibierende Wirkung von Listerine® zeigte sich durch eine Reduktion der Metaproteinidentifikation von durchschnittlich 23,5 % nach der Behandlung. Darüber hinaus zeigte die Mehrheit der bakteriellen Metaproteine reduzierte relative Abundanzen während für die Metaproteine humanen Ursprungs eine Erhöhung der Proteinabundanzen gegenüber der Kontrolle vor Behandlung zu verzeichnen war. Aus funktioneller Sicht waren insbesondere metabolische Prozesse, welche für das Zellwachstum und die Zellteilung wichtig sind, betroffen. Im Gegensatz dazu erhöhten sich durch die LPO Lutschtabletten sowohl die Identifikation der Metaproteine als auch die relative Abundanz für die Mehrheit der Proteine. Nach den durch die Metaproteomdaten erhaltenen funktionellen Informationen liegen Hinweise für einen wachsenden Biofilm vor. Die Metaproteine, die eine erhöhte Abundanz nach Behandlung mit den LPO-Dragees zeigten, wurden taxonomisch hauptsächlich Erst- (S. gordonii) und Zweitbesiedlern (F. nucleatum) sowie Bakterien zugeordnet, die einem gesunden Biofilm zuträglich sind.
Fazit: Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein vollständiger Metaproteom Arbeitsablauf von der Probensammlung, über die Probenpräparation bis hin zu Datenanalyse für das Speichel-, Zungen- und Plaque-Mikrobiom erarbeitet. In drei Studien konnten wir dessen Anwendbarkeit demonstrieren und erreichten vergleichbare Ergebnisse zu anderen Metaproteomstudien, beispielsweise bezüglich der Proteinidentifikation. Für die Sammlung von Speichelproben stellte sich der Paraffinkaugummi für Metaproteomstudien als die Methode der Wahl heraus. Für das Zungen-Mikrobiom veröffentlichten wir die ersten Metaproteomdaten. Darüber hinaus publizierten wir die erste Metaproteomstudie, welche die beiden Mikrobiome von Speichel und Zunge miteinander vergleicht. Hinsichtlich des Plaque-Mikrobioms handelte es sich ebenfalls um die erste Metaproteomstudie, die ein
anerkanntes und etabliertes zahnklinisches Modell mit den Vorzügen der Metaproteomiks verbindet. Die Ergebnisse liefern erste Daten, um (auf längere Sicht gesehen) ein Produkt zur täglichen Mundhygiene entwickeln zu können, welches die bakterielle Zusammensetzung des Plaque-Biofilms positiv beeinflusst.
Cardiovascular diseases are the most common cause of death in industrial nations. The basis of these diseases is a dysfunction in the interaction between the cells the heart is composed of. The main types of cells making up the human heart are cardiomyocytes that build the myocardium and provide the contraction properties, endothelial cells that delimit the blood flowing through the inner chambers and coronary arteries from the myocardial tissue, and fibroblasts, which build the connective tissue. A common process in the development of cardiovascular diseases is the formation of fibrosis due to injury of the endothelium and subsequent infiltration of the cardiac tissue by immune cells, and inflammatory agents like cytokines. Cytokines exert different functions in cardiac cells. Tumor necrosis factor α (TNFα) is an inducer of apoptosis. Transforming growth factor ß (TGFß) is known for activation of proliferation. Other cytokines like C-X-C motif chemokine 11 (CXCL11), interleukin-6 (IL-6), or brain-derived neurotrophic factor (BDNF) have not yet been investigated or their impact on such cells is unknown. Eventually, however, fibrotic scar tissue arises from the transition from fibroblasts to myofibroblasts leading to a stiffening of the cardiac muscle and impaired pump function. In order to prevent the occurrence of these events the balance of proliferation, migration, and differentiation of cardiac cells needs to be controlled very delicately.
The mechanisms controlling these interactions are still not well understood, which is why this work aimed at the elucidation of molecular mechanisms within the three main cell types that might play a role in the regulation of cardiac function. A proteomic approach using mass spectrometry was used to identify alterations in protein levels that could provide hints about the involved pathways and find new players as candidates for more detailed investigation. Initially, the proteomic composition of HL-1 cardiomyocytes, L929 fibroblasts, and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) that were cultivated in standard growth conditions without stress was investigated. Half of the total protein intensity was made up by only 42 to 53 proteins, depending on the cell type. More than a third of all proteins were identified in all three cell types, which may be proteins performing common cell functions. Indeed, the proteins displaying the highest abundance seem to be predominantly involved in such common cellular functions as the regulation of glucose metabolism or the cytoskeleton. More specific functions like heart development and muscle contraction were found enriched in cardiomyocytes as were mitochondrial proteins. The proportion of proteins with extracellular localization and function was higher in fibroblasts and endothelial cells.
Secondly, the impact of cytokines on the proliferative behavior and the proteomic composition of cardiomyocytes and fibroblasts was analyzed. HL-1 cardiomyocytes and L929 fibroblasts were treated with different concentrations of cytokines with a cytotoxic, proliferative, or yet unknown effect on these cells. While HL-1 cells exhibited no macroscopic reaction to any of the cytokines used, cytotoxic/growth inhibitory (TNFα, CXCL11) and proliferative (TGFß, IL6, BDNF) effects were observed for L929 cells. The latter also showed CXCL11-induced upregulated EIF2 signaling, pointing to a higher need of protein synthesis.
The third aim was the examination of proteome adaptations in endothelial cells due to different kinds of stress, as these cells are the first line of defense against inflammatory agents or injury and therefore prone to wounding. The role of the growth factors vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) in wounding and starvation was another object of this study as they are known for their angiogenic and cell survival supporting properties. Additionally, the impact of the cellular sex on the response to stress and growth factors was examined, because a person’s sex plays an important role in susceptibility, risk factors, and outcome of cardiovascular diseases. This has mainly been attributed to the different hormone levels, especially the higher levels of estrogen in premenopausal women, which exerts cardioprotective properties, but also genetic background was reported to play an important role. Only few studies that examined the molecular properties of HUVECs considered the cellular sex and if so, the genetic bias of unrelated samples was not taken into account. This is why Lorenz and colleagues at the Charité in Berlin collected HUVECs from newborn twins of opposite sex, cultivated them without stress in standard growth medium, exposed them to wounding and serum starvation, and investigated the impact of the growth factors and the sex on migrational behavior and metabolic issues. The current work focused on the alterations of not only the intra- but also the extracellular proteome, because paracrine signaling is crucial for intercellular communication in order to cope with stress. General differences between male and female cells were observed for proteins encoded on the X chromosome with higher levels in females (DDX3X, UBA1, EIF1AX, RPS4X, HDHD1), except for one protein with higher levels in male cells (G6PD). A Y-chromosomal protein was, for the first time, identified in endothelial cells (DDX3Y). Wounding, starvation, and growth factor treatment led to alterations and sex-specific different levels in an unexpectedly high number of proteins, with VEGF showing a stronger impact than bFGF. Many proteins with alterations observed without taking the sex into account, were actually only changed in male or female cells. Some proteins were regulated in opposite directions, or growth factors inhibited their secretion in a sex-specific way by unknown mechanisms. Tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2) should be emphasized as a protein with sex-specific differences, especially in the extracellular space and with increased levels after starvation and VEGF treatment. These observations suggest a temporal lack in TFPI2 synthesis and secretion in male cells, which might explain the enhanced adaptation of females to wounding.
The results of this work lay the basis for future investigation by providing a database of intra- and extracellular proteome changes due to different environmental circumstances. It strongly suggests the investigation of male and female HUVECs, and other cells, separately to avoid the impact of the sex observed in this work. Essentially, the observations suggest a number of candidate proteins for more detailed investigations of endothelial and cardiovascular diseases.