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Collapsin response mediator protein 2 (CRMP2) ist ein gut erforschtes Molekül,
welches in verschiedenen Geweben, wie z.B. dem zentralen Nervensystem (ZNS),
vorkommt. Es wurde bereits gezeigt, dass CRMP2 in den Semaphorin3A-Weg involviert
ist. In diesem Signalweg legen wir den Schwerpunkt auf den Redoxstatus von
CRMP2. Es bewirkt im reduzierten Zustand eine Aktivierung von Aktinpolymerisation
und -quervernetzung, mittels dem Aktin-related-Protein-Komplex (ARP 2/3-Komplex).
Diese Regulation des Zytoskeletts ermöglicht das Ausbilden von Axonen und Quervernetzungen und spielt somit eine entscheidende Rolle in der neuronalen Differenzierung.
In dieser Arbeit sollte die Rolle des CRMP2 in einem Zellmodell für neuronale
Differenzierung näher charakterisiert werden. Als Zellmodell wurden SH-SY5Y-Zellen
gewählt, eine dedifferenzierte Neuroblastomazelllinie, die sich zur Untersuchung neuronaler
Entwicklungsprozesse eignet.
Zunächst wurden initial Versuche zur Validierung einer geeigneten siRNA, für die
posttranskriptionelle Genausschaltung von CRMP2 in HeLa-Zellen, durchgeführt.
Als Kontrolle diente dabei eine unspezifische Kontroll-siRNA. Nach Validierung
wurden die Kontroll-siRNA und die CRMP2-siRNA zur Transfektion von SH-SY5Y-Zellen
eingesetzt. Zur Induktion der Differenzierung in einen Neuronen-ähnlichen Phänotyp
wurden SH-SY5Y-Zellen mit all-trans Retinsäure (RS) oder Dimethylsulfoxid
(DMSO), als Kontrolle, behandelt. Die morphologischen und biochemischen Veränderungen
auf Proteinebene zeigten, dass eine Transfektion der SH-SY5Y-Zellen mit
siCRMP2 zu einem verlängerten Phänotyp mit stärkerer Quervernetzung führt. Die
Analyse der Veränderungen auf Proteinebene mittels Westernblot ergab, dass die
Transfektion von SH-SY5Y-Zellen mit siCRMP2, im Vergleich zu Kontrolle-
siRNA-transfizierten Zellen, zu einer Zunahme von Molecules interacting with
CasL (MICAL1), sowie zu einer Abnahme von cytoplasmic FMR1-interacting protein1
(CyFip1) führte. Beide Proteine sind Bestandteil des Semaphorin3A-Signalweges und
somit ebenfalls an der neuronalen Differenzierung beteiligt. Auch eine Beeinflussung
der Proteine Aktin und Tubulin, zwei Komponenten des Zytoskeletts, konnte nachgewiesen.
Die Transfektion von siCRMP2 führte zu einer Zunahme der Aktin- und Tubulinproteinmengen,
im Vergleich zu den siKontrolle-transfizierten Zellen, auch wenn
diese nicht mit RS behandelt wurden.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Herstellung eines Plasmides zur Expression
eines Proteins mit Redoxsensorfunktion in eukarytotischen Zellen. Mit diesem lässt
sich in vivo die Verteilung von Glutathion ermitteln. Hierfür wurde die Sequenz, welche
das Grx1-roGFP2-Protein kodiert in den Expressionsvektor pExpress eingebracht.
Die Sequenzierung der Basenabfolge im Abgleich mit der Referenzsequenz
von Tobias Dick, zeigte eine 100%ige Übereinstimmung. Die Transfektion dieses
Sensors im Zellmodell war im zeitlichen Rahmen dieser Arbeit nicht mehr möglich und
wird Bestandteil zukünftiger Forschungsarbeiten sein.