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Diese Arbeit war Teil eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten interdisziplinären Forschungsnetzwerks (#1HealthPREVENT) und stellte eine einmalige peri-operative antibiotische (Penicillin/Gentamicin (P/G)) Prophylaxe (PAP) im Zuge eines operativen Eingriffs nach diagnostizierter Kolik beim Pferd der bislang üblichen fünf-Tage-Antibiose gegenüber, mit dem Ziel den Einfluss der PAP auf die Häufigkeit von (engl.) Extended Spectrum β-Lactamase produzierenden Escherichia coli (ESBL-EC) und die Veränderungen im enteralen Mikrobiom der Pferde zu untersuchen und zur Verbesserung des sorgfältigen Einsatzes von Antibiotika in der Veterinärmedizin beizutragen. Die per Los jeweils einer der zwei Gruppen („single shot“ Gruppe (SSG); „5 days“ Gruppe (5DG)) zugeordneten Pferde wurden dafür jeweils an drei verschiedenen Zeitpunkten (Klinikaufnahme (t0), Tag 3 (t1) und Tag 10 (t2) postoperativ) beprobt (Kotproben und Nüsternabstriche). Zusätzlich zur Gruppe der hospitalisierten Pferde wurde auch eine nicht-hospitalisierte Kontrollgruppe ohne klinische Auffälligkeiten einbezogen. Alle Proben wurden hinsichtlich positiver ESBL-EC untersucht und die identifizierten Isolate phänotypisch (durchgeführt vom Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen, Freie Universität Berlin) und genotypisch charakterisiert. Unabhängig vom P/G PAP-Schema stieg für die Pferde die Wahrscheinlichkeit von t0 zu t1 sowie von t0 zu t2 an, positiv für ESBL-EC zu sein. Die Ganzgenom-Sequenzierung der Isolate ergab außerdem eine enge räumliche und zeitliche Beziehung zwischen Isolaten mit gemeinsamen Sequenztypen, was auf eine lokale Ausbreitung hindeutete. Die 16S rRNA-Gen Sequenzierung der Kotproben (durchgeführt vom Institut für Klinische Molekularbiologie der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel) zur Untersuchung der Veränderungen im enteralen Mikrobiom zeigte nach der bioinformatischen Aufbereitung (durchgeführt von Silver Anthony Wolf, Robert Koch-Institut) und Fach-übergreifenden Analyse eine Beeinträchtigung in der Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota (Alpha-Diversität) für Pferde mit akuter Kolik im Vergleich zur Kontrollgruppe, welche jedoch nicht signifikant war. Die mikrobielle Gesamtkomposition der untersuchten Proben (Beta-Diversität) wies vor allem für die 5DG an t1 erhebliche Einschränkungen auf, was höchstwahrscheinlich auf die fortlaufende Verabreichung von Antibiotika zurückzuführen war. In beiden Studiengruppen wurde zudem an t1 eine erhöhte Abundanz von Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia, festgestellt. Insgesamt wiesen die Ergebnisse dieser Arbeit einen starken Einfluss des Krankenhausaufenthaltes an sich auf, vor allem auf die ESBL-EC-Isolationsraten, wodurch möglicherweise Unterschiede zwischen den verschiedenen PAP-Behandlungen überdeckt wurden. Trotzdem stellen die in dieser Studie gesammelten Ergebnisse und gewonnenen Erkenntnisse einen ersten wichtigen Schritt in der Etablierung von Antibiotic Stewardship-Programmen in Pferdekliniken dar und könnten somit einen langfristigen Einfluss auf die lokale Verbreitung von ESBL-EC haben.
Transportproteine spielen für viele Arzneistoffe eine bedeutende Rolle bei der Absorption, Verteilung und Elimination und können folglich auch maßgeblich über die Anflutung eines Wirkstoffs am Ort der Wirkung und / oder Nebenwirkung(en) entscheiden. Ziel dieser Arbeit war es, die Affinität von Tigecyclin zu hepatischen Aufnahme- und Effluxtransportern zu bestimmen. Aus pharmakokinetischen Studien war bekannt, dass das Glycylcyclin hauptsächlich hepatisch ausgeschieden wird, wobei die zugrundeliegenden molekularen Transportmechanismen unbekannt waren, d.h. wie Tigecyclin von den Hepatozyten aufgenommen wird und wieder in die Galle bzw. in das Blut abgegeben wird. Die physikochemischen Eigenschaften der Substanz (logP-Wert: 0,8; pKs-Wert: 0,25/ 8,76) sprechen gegen eine rein passive Diffusion über biologische Membranen.
Um den hepatozellulären Aufnahmetransport aufzuklären, wurden Kompetitionsversuche und direkte Aufnahmeversuch mit Hilfe von stabil transfizierten HEK293-Zellmodellen, die Transportproteine der SLC- und SLCO-Familie stabil überexprimieren, durchgeführt. Unter Verwendung von inside-out-Vesikeln wurde der Effluxtransport von Tigecyclin über MRP2- und MRP3-Transporter untersucht. Um sicher zu gehen, dass die Zellmodelle funktionstüchtig sind, wurde deren Funktionalität vor jedem Versuch mittels bekannter Standardsubstrate und Standardinhibitoren bestätigt. Die direkten Aufnahmeversuche wurden mittels LC-MS/MS analysiert.
Tigecyclin zeigte im verwendeten Konzentrationsbereich und den angewendeten Inkubationszeiten keine zytotoxische Wirkung auf die Versuchszellen. Mit den Kompetitionsassays konnte nachgewiesen werden, dass Tigecyclin einen hemmenden Einfluss auf den Transport von bekannten OATP1B3- und OATP2B1-Referenzsubstraten hat, jedoch keine Beeinflussung von OATP1B1 und NTCP zeigte. Des Weiteren konnte in direkten Aufnahmeversuchen gezeigt werden, dass Tigecyclin ein Substrat des ubiquitär exprimierten Transporters OATP2B1 ist. Ein signifikanter Nachweis, dass Tigecyclin ein Substrat von OATP1B1-, OATP1B3- und NTCP-Transportern ist, gelang jedoch nicht.
Im Bezug auf Effluxtransporter konnte eine Kompetition von Tigecyclin mit dem MRP2- und MRP3-vermittelten Transport in inside-out-Vesikeln nachgewiesen werden. Ein direkter Transport von Tigecyclin über die Vesikel ließ sich jedoch nicht beweisen. Aufgrund methodischer Schwierigkeiten und der sehr begrenzten Bearbeitungszeit, konnten die Versuche nicht oft genug durchgeführt und keine entsprechend belastbaren Daten generiert werden.
Zusammenfassend kann aus den durchgeführten Untersuchungen abgeleitet werden, dass Tigecyclin ein Substrat von OATP2B1 ist und OATP2B1 somit möglicherweise für die hepatische Aufnahme des Arzneistoffes verantwortlich ist. Ob noch andere Transporter eine Rolle spielen, bleibt weiterhin unbekannt. Auch die konkrete Transportkinetik mit der Affinität (Km) und der Transportkapazität (vmax), bleibt nach diesen Versuchen noch unklar. Des Weiteren legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass bei gleichzeitiger Tigecyclin-Gabe ein gewisses Risiko für unerwünschte pharmakokinetische Interaktionen mit Substraten der Transporter OATP1B3, OATP2B1, MRP2 und MRP3 besteht.
Als Fazit kann gesagt werden, dass mit dieser Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung des Arzneimitteltransports und der Transporteigenschaften von Tigecyclin in den Hepatozyten geleistet werden konnte. Zusätzlich konnten weitere Erkenntnisse zur Kompetition gewonnen werden. In wie weit die in vitro Resultate auf in vivo Mechanismen übertragbar sind, ist unklar und bietet Möglichkeiten für weiterführende Untersuchungen.
Die Evaluation des Einflusses der Antibiotika Linezolid und Tigecyclin auf die Mikrozirkulation im Rahmen einer akuten experimentellen Endotoxinämie war Ziel unserer Arbeit. Das Monitoring der Vitalparameter erfasste Herzfrequenz, mittleren arteriellen Blutdruck, Atemfrequenz und Körpertemperatur über die gesamte Dauer des Experiments. Mit Hilfe der Intravitalmikroskopie ermittelten wir in postkapillären mesenterialen Venolen die temporäre und permanente Leukozyten-Adhärenz nach Anfärben mit Rhodamin sowie das Ausmaß der Plasmaextravasation aus dem Gefäß in das Interstitium mittels FITC-markiertem Albumin. Zudem wurden die Konzentrationen pro- und antiinflammatorischer Zytokine aus Serumproben zu Beginn und am Ende des Versuches ermittelt. Durch die experimentelle Endotoxinämie kam es tendenziell zu einem Blutdruckabfall in den LPS-belasteten Gruppen, durch hämodynamische Stabilisierung mit Hilfe von Volumentherapie wurde dieser allerdings begrenzt. An den drei Mikroskopierzeitpunkten befanden sich alle Gruppen auf etwa gleichem Blutdruck-Niveau. Des Weiteren führte die LPS-Applikation zu einem Anstieg der Herz- und Atemfrequenz. Die Körpertemperatur wurde auf konstant 36°C gehalten. Aus den Untersuchungsergebnissen ist abzuleiten, dass die beiden Antibiotika keinen Einfluss auf die Makrohämodynamik haben. Zudem zeigte sich in unseren Messungen unter Endotoxinämie ein erwarteter Anstieg aller gemessenen Zytokinspiegel (TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6 und IFN-γ), welche weder von Linezolid noch von Tigecyclin beeinflusst wurden. Die endotoxämischen Bedingungen erzeugten typische pathophysiologische Veränderungen im Gebiet des Mesenteriums: eine gesteigerte Leukozytenaktivierung und Adhäsivität am Endothel sowie die daraus bedingte Reduktion des Rollerflows. Die Therapie mit Tigecyclin konnte eine signifikante Zunahme der adhärenten Leukozyten im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht verhindern, erzielte allerdings eine signifikante Abnahme der Anzahl der „Sticker“ im Vergleich zur LPS-Gruppe. Dementsprechend konnte die Tigecyclin-Applikation den Roller-Flow signifikant verbessern, erreichte aber nicht das statistische Niveau der Kontrollgruppe. Linezolid konnte hatte ebenfalls die Leukozytenaktivierung vermindern, jedoch ohne eine statistische Signifikanz zu erzielen. Zusammenfassend bewirkte der Einsatz des Antibiotikums Tigecyclin eine signifikante Verminderung der Leukozytenaktivierung in der intestinalen Mikrozirkulation, was die Evaluation dieses Medikamentes für die eine immunmodulatorische Therapie der Sepsis in weiterführenden tierexperimentellen und klinischen Studien sinnvoll erscheinen lässt. Linezolid zeigte eine nur tendenzielle Abnahme der Leukozyten-Endothel-Interaktion, was jedoch in weiteren Studienmodellen evaluiert werden sollte.
Im Klinikalltag sind das Auftreten neuer Antibiotikaresistenzen und die steigende Anzahl an chronisch infizierten Wunden ein Problem. Um dem zu begegnen, stehen derzeit die Entwicklung neuer antimikrobieller Chemotherapeutika sowie die kalkulierte, auf Antibiogrammen begründete Antibiotikatherapie im Fokus. Auch die kombinierte Anwendung von systemisch wirksamen Antibiotika und lokal wirksamen Antiseptika auf chronisch infizierten Wunden ist bereits gängige Praxis im Klinikalltag. Untersuchungen, die Kombinationen aus Antibiotika und Antiseptika auf Wechselwirkungen bzw. Interaktionspotenziale prüfen, sind trotz ihrer häufigen Anwendung bisher aber kaum durchgeführt worden. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb das Interaktionsverhalten von AB/AS-Kombinationen untersucht. Getestet wurden die Antibiotika Ciprofloxacin, Gentamicin, Amikacin, Vancomycin, Mupirocin und Linezolid in Kombination mit den Antiseptika Octenidindihydrochlorid, Chlorhexidindigluconat und Polihexanid. Die Auswahl der Bakterien orientierte sich an den in chronisch infizierten Wunden häufig nachzuweisenden Erregern Staphylokokken, Enterokokken, Pseudomonaden und E. coli [17][15]. An Nährmedien kamen Isosensitest-, Müller-Hinton-, CSA- und Blut-Agar zum Einsatz. Dem Blut-Agar wurde in Hinblick auf die Problematik im Klinikalltag die größte Bedeutung bezüglich der Ergebnisinterpretation beigemessen. In Vorversuchen wurden die für die in den Hauptversuchen notwendigen MHK’s der Antiseptika mittels Mikroagardilutionsmethode bestimmt. In den Hauptversuchen wurde mit Hilfe des Agardiffusions-Dilutions-Kombitests ermittelt, wie sich die Hemmhofdurchmesser der AB/AS-Kombinationen im Vergleich zu denen der Kontrollversuche (reiner Agardiffusionstest mit Antibiotika) verändern. Anhand des Änderungsverhaltens im Hemmhofdurchmesser konnte entweder „additives/synergistisches“, „antagonistisches“ oder „indifferentes“ Interaktionsverhalten nachgewiesen werden. Aus insgesamt 372 getesteten Kombinationen (aus Antibiotika, Antiseptika, Erreger und Agar) konnten 65 als (über-)additiv und 20 als antagonistisch bewertet werden. Die hohe Anzahl sich indifferent verhaltender AB/AS- Kombinationen begründet sich in der Größe des geschätzten Standardfehlers. Additives/synergistisches Interaktionsverhalten zeigte sich am häufigsten bei der Testung gegen Staphylokokken, gefolgt von Pseudomonaden. 68 Antagonistisches Interaktionsverhalten trat weder bei Staphylokokken noch bei Enterokokken auf. Gegen Pseudomonaden zeigten die Kombinationen CIP 5/Octenidin, CIP 5/Chlorhexidin und AK 30/Chlorhexidin ein hohes Interaktionspotenzial. Die Kombination CIP 5/Octenidin wirkte maßgeblich antagonistisch, CIP 5/ Chlorhexidin und AK 30/Chlorhexidin dagegen rein additiv/synergistisch. Bei der Testung gegen Enterokokken und E. coli traten kaum Interaktionen auf. Auf Blut-Agar fielen insbesondere die AB/AS-Kombinationen CIP 5/ Chlorhexidin, LZD 30/Chlorhexidin, LZD 30/Octenidin, LZD 30/Polihexanid und VA 30/Chlorhexidin auf. Alle fünf Kombinationen zeigten bei Staphylokokken ein additives/synergistisches Interaktionsverhalten. Kann ihr Interaktionsverhalten in größeren Studien bestätigt werden, könnten diese Kombinationen als neue Therapieoptionen in der Behandlung chronisch infizierter Wunden an Bedeutung erlangen. Antagonismus wurde nur durch eine sehr geringe Anzahl an AB/AS-Kombinationen auf Blut-Agar hervorgerufen. Das stärkste Potenzial wies CIP 5 in Verbindung mit Octenidin bei Pseudomonaden auf. Der Einsatz dieser Kombination sollte daher im Klinikalltag möglichst vermieden werden. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die Interaktionen nicht allein von der AB/AS-Kombination, sondern auch von der Art des Agars und Erregers abhängen. Dennoch sind sie richtungsweisend und sollten Anlass dazu geben, weitere Untersuchungen in der AB/AS-Kombinationstestung durchzuführen, um Fortschritte erzielen zu können.
Im heutigen Klinikalltag werden zur Behandlung chronischer Wunden Antiseptika und Antibiotika häufig kombiniert. Die vorliegende Arbeit hinterfragt diese Kombinationen, da sie oft ohne Wissen möglicher Wechselwirkungen verabreicht werden. Wir haben das Interaktionspotential der drei Antiseptika Octenidindihydrochlorid, Polihexanid und Chlorhexidindigluconat mit folgenden ß-Lactam-Antibiotika untersucht: Oxacillin, Ampicillin, Piperacillin + Tazobactam, Imipenem und Ceftazidim. In der Auswahl der Erreger haben wir uns auf die konzentriert, die statistisch besonders häufig in chronischen Wunden nachgewiesen werden: zwei S. aureus Stämme, ein MRSA-Stamm, zwei Enterococcus-, vier Pseudomonaden- und zwei E. coli-Stämme. In Vorversuchen haben wir mit der Mikroagardilutionsmethode die MHK’s der Erreger der verschiedenen Antiseptika auf den verschiedenen Agarsorten (Müller-Hinton-, Isosensitest-, CSA- und Blutagar) bestimmt. Orientierend an diesen Werten haben wir in den Hauptversuchen mittels Agardiffusions-Dilutions-Combitest das Interaktionspotential der oben genannten Antiinfektiva untersucht. Dazu haben wir Platten mit den Konzentrationen MHK, 1/8 MHK und 1/16 MHK gegossen. Bei der Auswertung wird deutlich, dass nicht alle Kombinationen bedenkenlos zusammengestellt werden sollten. In unseren Versuchen schneidet OCT am besten ab, hier vor allem die Kombination mit IMP 10. Auch PHMB weist gute Ergebnisse auf und nimmt eine Position zwischen OCT und CHX ein. CHX schneidet bei unseren Versuchen am schlechtesten ab und sollte sehr kritisch eingesetzt werden. Die Ergebnisse machen aber auch deutlich, dass es klare Unterschiede bezüglich der Erreger gibt.
Patienten mit Sepsis haben eine schlechte Mikrozirkulation sowie kardiovaskuläre Depression. Zur Therapie müssen unbedingt und schnellstmöglich Antibiotika gegeben werden, die oft kombiniert wird mit Antikoagulantien-Therapie. Nun stellt sich die Frage, welchen direkten Effekt Antibiotika und Antikoagulantien auf den Gefäßtonus beim septischen Patienten haben. Als ersten Schritt dieser Forschung wurden an gesunden Ratten-Aortenringen Antibiotika und Antikoagulantien durch Messung der isometrischen Kontraktion in vitro getestet. Alle Medikamente wurden hinsichtlich ihrer Relaxationsfähigkeit bei Vorkontraktion mit 20/40 mM KCl oder Phenylephrin (5x10-7M oder 5x10-8M) getestet, sowie die Phenylephrin Dosis-Wirkungs-Kurve nach 30 Minuten bzw. 20 Stunden Inkubation (bei 37°C) konstruiert. Zudem wurde die Wirkung des Medikaments in hohen Konzentrationen auf den Ruhezustand der Ringe erprobt. Bei den Antibiotika konnte festgestellt werden, dass Linezolid möglicherweise ein K+-Kanal Aktivator ist, da es bei einer Präkontraktion von 40mM KCl und darauffolgender kumulativer Gabe von Linezolid signifikant weniger stark relaxiert, als bei 20mM KCl Vorkontraktion (P=0,02). Weiterhin könnten sowohl Linezolid als auch Daptomycin intrazelluläre Mechanismen beeinflussen, da sie bei der Inkubation von 30 Minuten (pEC50: 7.47±0.06(Lin)/7.45±0.08(Dap) vs 6.96±0.05(Kon)) und 20 Stunden (pEC50: 7.2±0.04 (Lin)/ 7.45±0.04 (Dap) vs 6.89±0.05(Kon)) und folgender Phenylephrin-Dosis-Wirkungs-Kurve beide eine Linksverschiebung der Kurve im Vergleich zur Kontrolle bewirken (P<0,05). Zudem ist ihre erreichte Maximalspannung in beiden Versuchsreihen signifikant höher als die der Kontrolle. Bei den Antikoagulantien wurde ermittelt, dass bei Enoxaparin (P=0,00002), Tinzaparin (P=0,0002) und Danaparoid (P=0,005) möglicherweise eine K+-Kanal Aktivierung vorliegen könnte, da sie alle bei 20mM KCl Vorkontraktion stärker relaxieren als bei 40mM KCl Präkontraktion. Zudem konnte bei Tinzaparin (P=0,002) und Enoxaparin (P=0,01) nach Vorkontraktion mit Phenylephrin eine signifikante Relaxation im Vergleich zur Kontrolle festgestellt werden, was eventuell hinweist auf eine α-adrenerge Stimulation. Nach 30 Minuten Inkubation fanden wir heraus, dass Argatroban und Danaparoid eine Linksverschiebung der Phenylephrin-Dosis-Wirkungs-Kurve gegenüber der Kontrolle bewirken (pEC50: 7.17±0.08(Arg)/7.12±0.05(Dan) vs 6.96±0.05(Kon)), während Enoxaparin (pEC50: 6.77±0.03) eine Rechtsverschiebung zeigte (bei allen P<0,05). Bei der 20-stündigen Inkubation hingegen zeigten alle Antikoagulantien im Vergleich zur Kontrolle eine erhöhte Sensitivität gegenüber Phenylephrin (pEC50: 7.37±0.05(Arg)/7.13±0.04(Dan)/7.1±0.05(Eno)/ 7.06±0.04(Tin) vs 6.89±0.05(Kon)). Möglicherweise beeinflussen sie also intrazelluläre Mechanismen. Die Maximalspannung war, im Vergleich zur Kontrolle, bei Enoxaparin und Argatroban erhöht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass einige der getesteten Substanzen möglicherweise eine K+-Kanal Aktivierung, eine α-adrenerge Stimulation oder eine intrazelluläre Modulation bewirken. Ob diese Ergebnisse eine Bedeutung für den Menschen haben und ob sie bedeutsam bei Sepsis sind, muss noch untersucht werden.
Schon kurze Zeit nach ihrer Entdeckung in den 1950er Jahren wurde bekannt, dass Tetracycline (Tcs) neben ihrer antibiotischen Wirkung auch nicht-antibiotische Effekte zeigen. In dieser Arbeit werden die strukturellen Grundlagen sowohl antibiotischer als auch nicht-antibiotischer Wirkungsweisen der Tetracycline untersucht und miteinander verglichen. Die detaillierte Beschreibung der spezifischen Wechselwirkungen zwischen Tetracyclin und den verschiedenen Proteinen wird durch Röntgen-Strukturanalysen ermöglicht. Phospholipase A2 Spezifische Wechselwirkungen der Tetracycline mit verschiedenen Proteinen sind Ursache nicht-antibiotischer Eigenschaften. Tetracycline beeinflussen durch Inhibierung von Phospholipasen A2 (PLA2), neutralen Matrixmetalloproteinasen oder alpha-Amylasen neben Entzündungen auch eine Reihe von verschiedenen Körperfunktionen. Seit einiger Zeit sind anti-inflammatorische Eigenschaften der Tcs bekannt. Die PLA2 katalysiert die erste Reaktion, die zur Bildung der Eicosanoide führt. Eicosanoide sind hormonähnliche Signalmoleküle, die als Neurotransmitter wirken und an inflammatorischen Prozessen im Körper beteiligt sind. Bei entzündlichen Krankheiten wie Rheuma oder Arthritis wurde eine vermehrte Eicosanoidproduktion beobachtet. Experimentelle Studien zeigten, dass die sekretorische Phospholipase A2 durch das Tetracyclin-Derivat Minocyclin inhibiert wird. Bei Patienten mit rheumatoider Arthritis zeigte die Anwendung von Minocyclin in ersten klinischen Tests signifikante Wirkungen. Die struktuelle Grundlage der Inhibierung der PLA2 durch Minocyclin war bislang unbekannt. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die strukturelle Ursache einer nicht antibiotischen Wechselwirkung zwischen einer sekretorischen Phospholipase A2 und Minocyclin beschrieben. Dies ist die erste Röntgenkristallstruktur, die eine nicht-antibiotische Wechselwirkung eines Tetracyclins zeigt und somit deren strukturelle Grundlage erklärt. Die Phospholipase A2 wurde aus dem Gift der Indischen Kobra (Naja naja naja) gereinigt. Dabei konnten im Rahmen dieser Arbeit die ersten Kristalle des PLA2/Minocyclin-Komplexes gezüchtet werden. Die Qualität der Kristalle erlaubte die Sammlung von Röntgendiffraktionsdaten bei 100 K mit einer maximalen Auflösung von 1,65 Å. In der Struktur wird sichtbar, dass Minocyclin im hydrophoben Tunnel der PLA2 bindet, der zum aktiven Zentrum des Enzyms führt. Als Folge dieser Interaktion ist der Zugang für die Substratmoleküle zum aktiven Zentrum blockiert. Das Wissen über die spezifischen Interaktionen zwischen der PLA2 und Minocyclin kann verwendet werden, um eine Leitstruktur zur Entwicklung neuer anti-inflammatorischer Medikamente zu schaffen. Tetracyclin-Repressor Im zweiten Teil der Arbeit wird eine antibiotische Wirkungsweise der Tetracycline strukturell untersucht. Hier soll geklärt werden, welche Interaktionen zwischen dem Tet Repressor der Klasse D (TetR(D)) und dem Tetracyclin entscheidend sind, um den Induktionsmechanismus auszulösen und den β-Turn Typ II zu stabilisieren. Die hier vorgestellten Strukturanalysen des TetR(D)s liefern somit neue detaillierte Informationen zum Induktionsmechanismus. Das Tetracyclin-Derivat Anhydrotetracyclin (AnTc) zeigt die bisher höchste beobachtete Bindungskonstante an den TetR(D). Experimente ergaben dass AnTc in der Lage ist, den Induktionsmechanismus des TetRs auch in Abwesenheit von Magnesium-Ionen auszulösen. Es wurden Röntgendiffraktionsdaten von Komplexen des TetR(D)s mit Anhydrotetracyclin und Mg2+ oder K+ und eines Komplexes von TetR(D) mit AnTc in Abwesenheit von spezifisch bindenden Metallionen gesammelt und ausgewertet. Die Strukturananlyse ermöglicht die Aufklärung der Interaktionen zwischen dem TetR(D) und AnTc und zeigt die Eigenschaften der Metallkoordination. Außerdem wurden die Röntgenkristallstrukturen von TetR(D)-Mutanten untersucht, um weitere Informationen zu den ausschlaggebenden Interaktionen zwischen TetR(D), Tc und dem Metallion während der Induktion zu erhalten. Hierbei war speziell die TetR(D)T103A-Mutante von großem Interesse, da die Seitenkette von Thr103 entscheidend an der Stabilisation des β-Turns Typ II (His100-Thr103) beteiligt ist. Von der TetR(D)T103A-Mutante wurden jeweils mit einem Mg2+-Ion ein Anhydrotetracyclin- und ein Chlortetracyclin-Komplex analysiert. Der TetR(D)T103A-Komplex mit Anhydrotetracyclin zeigt die nicht-induzierte und der Komplex mit Chlortetracyclin weist überraschenderweise die induzierte Struktur des TetR(D)s auf. Die hier beschriebenen Strukturanalysen ermöglichen somit im Vergleich zur bekannten Struktur des TetR(D)s in Komplex mit Tetracyclin und dem physiologisch bevorzugten zweiwertigen Metallion Mg2+, die strukturelle Rolle des Metallions und weiterhin die Bedeutung der Seitenkette von Thr103 für den Induktionsmechanismus aufzuklären.
Tobramycin und Imipenem sind zwei im klinischen Alltag häufig eingesetzte Medikamente, insbesondere in der Therapie einer Sepsis. Antibiotika können neben der antimikrobiellen Wirkung, anti-/proinflammatorische Effekte haben. Die klinische Relevanz dieser Studie besteht darin, einen Beitrag zum weiteren Verständnis der Wirkungen einer antibiotischen Therapie zu leisten. Potentielle Nebenwirkungen bei der Auswahl einer Antibiose mit dem Wissen, dass die intestinale Mikrozirkulation die wichtigste Rolle bei der Entwicklung eines septischen Organversagens spielt, sollten gezielt untersucht werden. Dazu wurden intravitalmikroskopische Untersuchungen der Darmwand am terminalen Ileum der gesunden Ratte durchgeführt. Die Vitalparameter wurden erfasst, der intestinale mikrovaskuläre Blutfluss gemessen. Zu Beginn und zum Abschluß des Experimentes wurden die Zytokinspiegel bestimmt. Imipenem in Kombination mit Cilastatin verminderte die funktionelle Kapillardichte und den intestinalen mikrovaskulären Blutfluss in der gesunden Ratte, die Leukozyten–Endothel-Interaktion war vermindert. Tobramycin hatte keine Auswirkungen auf die funktionelle Kapillardichte. In den postkapillären Venolen waren vermehrt aktivierte Leukozyten nachweisbar. Weder Imipenem noch Tobramycin hatten Auswirkungen auf die Makrohämodynamik. Die Zytokinspiegel blieben, mit Ausnahme von erniedrigten IL-10-Spiegeln nach Tobramycingabe, unbeeinflusst. Es ist bekannt, dass Imipenem und Tobramycin neben ihren antibiotischen Wirkungen auch immunmodulatorische Fähigkeiten haben. Die reduzierte Kapillardichte in der gesunden Ratte nach Zienamgabe könnte durch die Auswirkungen des obligat mit Imipenem kombinierten Zusatzstoffs Cilastatin erklärt werden. Der erhöhte Anteil an fest adhärenten Leukozyten nach Tobramycingabe stützt die bekannten, teils kontrovers diskutierten, Einflüsse von Aminoglykosiden direkt auf Leukozyten. Inwiefern diese Effekte durch die Antibiose auf die kommensale Besiedlung verursacht werden, lässt sich durch die vorliegende Arbeit nicht klären. Weitere tierexperimentelle Arbeiten sollten die kombinierten Stoffe Imipenem und Cilastatin getrennt untersuchen.