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Die t(14;18)-Translokation ist eine zufällig und spontan auftretende Aberration, die bei Ver-wendung hoch sensitiver PCR-Methoden in über 60 % aller gesunden Menschen detektiert werden kann. Diese Translokation wird darüber hinaus als initiales Ereignis in der Pathogene-se des follikulären Lymphoms angesehen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine Assozia-tion zwischen dem Alter und der Prävalenz und Frequenz zirkulierender t(14;18)-positiver Zellen bei gesunden Personen besteht. Dazu wurden über 700 gesunde Menschen mit Hilfe der quantitativen real-time PCR auf die Prävalenz und Frequenz t(14;18)-positiver B-Zellen untersucht. Im peripheren Blut von Kindern bis 9 Jahren konnten keine zirkulierenden t(14;18)-positive Zellen nachgewiesen werden. Ab dem zehnten Lebensjahr steigt die Prävalenz bis zum vier-zigsten Lebensjahr signifikant auf 65 % an und weist eine starke Korrelation mit dem Alter auf. Die mediane Prävalenz der zirkulierenden t(14;18)-positiven Zellen aller getesteter ge-sunder Personen betrug 46 % (327 von 715). Nur 4,3 % (31 von 715) der untersuchten Perso-nen hatten mehr als eine t(14;18)-positive Zelle pro 25000 PBMNC (> 40 / 106) und waren bis auf eine Ausnahme über 40 Jahre alt. Untersucht wurden außerdem Tonsillen, Knochenmark, Lymphknoten und Milz von gesunden Probanden im Alter zwischen 0 bis 32 Jahren. In allen untersuchten lymphatischen Gewebsproben von Neugeborenen konnten keine t(14;18)-positive Zellen detektiert werden. Bei gesunden Personen im Alter zwischen 17 und 32 Jahren wurden t(14;18)-positive Zellen mit den höchsten Frequenzen in den Tonsillen und der Milz nachgewiesen und nur zwei Knochenmarksproben enthielten t(14;18)-positive Zellen. Diese Ergebnisse werden das Verständnis über die Relevanz von t(14;18)-positiven Zellen in gesunden Menschen als ein Risiko-Marker im Bezug auf die Entwicklung zu einer Vorstufe zum Lymphom weiter verbessern.
Das Zellerkennungsmolekül Tenascin-R spielt eine wichtige Rolle für die synaptische Plastizität im zentralen Nervensystem und für die Regulation des Verhaltens von Säugetieren. Viele der Erkenntnisse über in vivo - Funktionen von Tenascin-R wurden durch Untersuchungen der durch Insertion eines Neomycin-Resistenzgens in das Tnr-Gen hergestellten Tenascin-R-Knockout-Mäuse (Tnr-/-) erlangt. So weisen Tenascin-R-Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Maus (Tnr+/+) Tieren ein deutlich ängstlicheres Verhalten und starke Defizite in der Motorkoordination auf. In der vorliegenden Arbeit sollten mögliche molekulare Mechanismen, welche die großen Unterschiede zwischen dem Verhalten der Mutante und dem wildtypischer Mäuse verursachen könnten, untersucht werden. Gene, deren Expression im Gehirn von Tenascin-R-Knockout-Mäusen im Vergleich zum Gehirn von Tnr+/+-Mäusen dysreguliert sind, sollten mit Hilfe von Expressionsprofilen identifiziert werden. Die Unterschiede zwischen den Expressionsprofilen der beiden Genotypen waren relativ gering. Dem am stärksten dysregulierten und daher eingehender untersuchten Transkript Gas5 fällt eine ungewöhnliche Funktion zu. Durch enzymatische Prozessierung entstehen aus dem Primärtranskript von Gas5 neun kleine nucleoläre RNAs (small nucleolar RNAs, snoRNAs). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben der Expression von Gas5 auch die einer seiner snoRNAs, nämlich U44, in Tnr-/--Mäusen im Vergleich zu Tnr+/+-Mäusen in allen untersuchten Organen dramatisch verringert ist. Um einen in Betracht gezogenen dysregulationsauslösenden unspezifischen Effekt durch die zur Herstellung der TNR-/--Maus verwendeten Neomycinkassette auf die Expression von Gas5 auszuschließen, wurde eine zweite Tenascin-R-Knockout-Mauslinie mit Hilfe einer Neomycinkassetten-unabhängigen Methode hergestellt. Beide Dysregulationen konnten mit dieser Methode, bei der das mit loxP-Elementen flankierte erste kodierende Exon des Tenascin-RGens durch die separat exprimierte Cre-Rekombinase herausgeschnitten wurde, bestätigt werden. Erstaunlicherweise wurde diese Abnahme der Expression von Gas5 und U44 auch bei Mäusen beobachtet, die keine Cre-Rekombinase exprimierten, sondern die nur die loxP-Flankierung des ersten codierenden Exons von Tnr aufwiesen. Daher wurde für die Dysregulation des Gas5- Transkriptes die Zerstörung eines regulatorischen Elementes, welches zur post-transkriptionalen Regulation von U44 und Gas5 führt, im Tnr-Gen postuliert. Nach heutigem Kenntnisstand ist dies das erste Beispiel dafür, dass das Einfügen von loxP-Sequenzen in ein Mausgen die Expression eines benachbarten Gens selektiv beeinflusst. Ferner wurde erstmals das Expressionsmuster der aus Gas5- Primärtranskripten gebildeten snoRNAs in verschiedenen Organen analysiert. Dabei zeigte sich, dass in jedem Organ deutlich verschiedene Mengen der einzelnen snoRNAs vorliegen, aber auch, dass jede einzelne snoRNA von Organ zu Organ große Expressionsunterschiede aufweist. Dies wirft die Frage auf, welche Bedeutung Gas5 und dessen snoRNAs, speziell U44, für die Physiologie der Zellen des ZNS und somit letztlich für das Verhalten der Maus haben. Zur Klärung, ob Gas5 für die bei der Tenascin-R defizienten-Maus beobachteten Verhaltensauffälligkeiten verantwortlich sein könnte, wurden Untersuchungen durchgeführt, welche zeigten, dass das basale Gas5-mRNAExpressionsniveau Unterschiede im Angstverhalten bzw. in der Stressantwort von C57Bl/6-Mäusen erklären könnte. Die Verhaltensanalysen zeigten, dass die basale Expression der Gas5-mRNA im Hippocampus, aber nicht im restlichen Gehirn negativ mit stressanzeigenden Parametern des open field - und des elevated plus maze –Tests korreliert. Mit der Leistung der Mäuse im water maze-Test, einer räumlichen Lernaufgabe, korrelierte die Gas5-Expression hingegen nicht. Dies deutet darauf hin, dass der Gas5-Level für die hippocampale Stress- und Angstantwort wichtig ist, allerdings nicht für das räumliche Gedächtnis. Darüber hinaus ist die Expression von Gas5, aber nicht die seiner snoRNAs, 24 h nach einem, für die Maus stark stressauslösenden, olfaktorischen Kontakt mit einer Ratte um bis zu 50 % erhöht. Die Tenascin-R-mRNA-Menge ist bei denselben Mäusen um 25 % vermindert. Diese Gas5-mRNA-Expressions-Änderung wird hingegen nicht bei einem gemilderten Stressreiz, wie einer neuen Umgebung, beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt, dass geringe Stressoren wie eine neue Umgebung nicht ausreichen, um die Gas5-Expression zu stimulieren, starke Stressoren wie Rattenkontakt hingegen zu einem Anstieg der Gas5-Expression führen. Gas5 scheint eine wichtige Funktion bei der Verarbeitung von Stress einzunehmen. Diese Verarbeitung könnte in der Tenascin-R defizienten-Maus derart gestört sein, dass eine normale Stressantwort nicht möglich ist und sich diese somit letztlich auch auf die motorischen Fähigkeiten der Tenascin-R defizieten Maus auswirkt.
In der vorliegenden Arbeit wurden 40 nicht vorbehandelte Patienten mit histologisch gesichertem follikulären Lymphom Stadium III oder IV nach MCP-Chemotherapie oder MCP-Chemotherapie plus Rituximab auf das Erreichen einer molekularen Remission, Einfluss des Behandlungsarms auf eine molekulare Remission und deren möglicher prognostischer Bedeutung untersucht. Als Material standen Blut- und Knochenmarkproben zur Verfügung, die vor, während und nach der Behandlung gewonnen wurden. Dabei wurde DNA aus mononukleären Zellen mit Hilfe der real-time PCR auf molekulare Marker wie t(14;18)-Translokation bzw. spezifische rearrangierte CDR 3-Region getestet. Der Unterschied der initialen medianen Zahl zirkulierender Lymphomzellen im peripheren Blut zeigte sich als nicht statistisch signifikant. Einen Zusammenhang zwischen der initialen Zahl zirkulierender Lymphomzellen und dem klinischen Ansprechen konnten wir nicht nachweisen. Das klinische Gesamtansprechen (partielle und komplette Remissionen) lag in der R-MCP Gruppe der MRD-Studie bei 100% gegenüber 71% in der MCP-Gruppe. Die Rate der kompletten Remissionen lag bei Patienten aus dem R-MCP-Therapiearm bei 75% und in dem MCP-Therapiearm bei 29%. Auch auf molekularer Ebene war die Chemoimmuntherapie der alleinigen Chemotherapie deutlich überlegen. Im R-MCP-Therapiearm erreichten 83% (19/23) der Patienten eine molekulare Remission, im MCP-Arm erreichte kein Patient eine molekulare Remission. Bei 100% der Patienten im R-MCP-Therapiearm konnte eine Lymphomzellzahlreduktion von mindestens 2 log-Stufen nachgewiesen werden, im MCP-Therapiearm waren es 6 Patienten (40%). Für Patienten mit einer CLC-Reduktion ≥ 2 log konnte noch kein medianes EFS festgelegt werden (noch nicht erreicht), gegenüber einem EFS von 24 Monaten im Falle einer CLC-Reduktion < 2 log. Somit zeigte sich eine CLC-Reduktion um mindestens 2 log-Stufen als wichtigster prognostischer Parameter für einen Erfolg der Therapie. Wir konnten zeigen, dass die Behandlung mit R-MCP zu einer wesentlich effektiveren Reduktion zirkulierender Lymphomzellen und damit zu einer wesentlich höheren Rate von molekularen Remissionen führte, als die Behandlung mit einer alleinigen MCP-Chemotherapie. Insgesamt betrachtet ist das wohl bedeutsamste Ergebnis der Stellenwert einer CLC-Reduktion um mindestens 2 log-Stufen. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit der prognostisch wichtige Stellenwert eines quantitativen MRD-Monitorings bestätigt werden.
Zusammenfassung Das Simian Virus 40 (SV40) ist ein sehr potentes DNA Tumorvirus. Sein natürliches Infektionsreservoir sind Rhesus Affen (Maccaca mulatta) in Nord Indien. Seit seiner Entdeckung im Jahre 1960 in Nierenzellkulturen von Affen, die zur Gewinnung menschlicher Impfstoffe verwendet wurden, gibt es sehr widersprüchliche Befunde bezüglich einer möglichen Rolle des Virus bei der Entstehung verschiedener maligner menschlicher Tumoren. Mit sehr unterschiedlicher Frequenz - zuletzt in zwei amerikanischen Publikationen bei bis zu 40% der Patienten - konnten in einigen Studien bei Patienten mit malignen Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) DNA Sequenzen des "Large T-Antigens" des SV40 mit Hilfe sensitiver PCR-Techniken nachgewiesen werden. Um festzustellen, ob SV40 DNA Sequenzen auch bei deutschen Patienten in malignen Lymphomzellen zu finden sind, und ob eine klonale Beziehung zwischen Virus und Tumorzelle besteht, untersuchten wir malignes Lymphomgewebe von 27 Patienten mit NHL und 6 Patienten mit Hodgkin Lymphomen, periphere mononukleäre Zellen (PBMNC) mit quantitativ bestimmtem Lymphomzellgehalt von 47 Patienten mit NHL und 61 Kontrollen, 14 Lymphknoten ohne Lymphombefall und 46 PBMNC von gesunden Freiwilligen. Für den Nachweis von SV40-DNA-Sequenzen etablierten wir eine hoch-sensitive quantitative real-time PCR für das SV40 "Large-T-Antigen" Gen, um den direkten qualitativen und quantitativen Nachweis von SV40 DNA-Kopien an Blut, Knochenmark und lymphatischem Gewebe von Patienten mit malignen Lymphomen und Kontrollpersonen zu ermöglichen. Um zu gewährleisten, daß virale DNA von BK- und JC-Virus nicht zu falsch positiven PCR Ergebnissen führen konnte, wurde für die real-time PCR nach dem Taqman-Prinzip eine Fluoreszenzsonde ausgewählt, die ausschließlich mit SV40-DNA reagieren kann. In den peripheren Blutproben der NHL Patienten waren zirkulierende Lymphomzellen über den Nachweis Lymphom-spezifischer Translokationen, wie z.B. der t(14;18) und t(11;14) Translokation, bzw. über das klonale VDJ- Rearrangement des IgH-Locus quantitativ bestimmt worden. Um die Intaktheit und Amplifizierbarkeit der isolierten zellulären DNA festzustellen, wurden die Proben auf EBV und K-ras getestet. Das K-ras Gen diente außerdem als Referenzgen, um den Gehalt zellulärer DNA, ausgedrückt in Genkopien zellulärer DNA (2 Genkopien K-ras/Zelle), im Einzeltest zu bestimmen. Durch den Vergleich der quantitativen Bestimmung der zirkulierenden Lymphomzellen und der SV40 Genomkopien wäre es im positiven Fall möglich, die Frage nach einer direkten Assoziation von SV40 mit den Tumorzellen maligner Lymphome zu beantworten. Keine der 47 Lymphknotenproben enthielt SV40 DNA bei einer Sensitivität von 1-3 Kopien in 50.000 bis 100.000 Zellen. Auch konnten keine SV40 DNA Sequenzen in den DNA Proben, die von PBMNC von 47 NHL Patienten isoliert worden waren und zwischen 0,1% und >90% Lymphomzellen enthielten, nachgewiesen werden. Zum Vergleich waren 30/46 (65,2%) der Proben positiv für EBV-DNA: sie enthielten zwischen 5 und 82.800 EBV Kopien pro 100.000 Zellen, ein Beweis für die Möglichkeit, an den isolierten DNA-Präparationen virale DNA-Kopien zu quantifizieren. Diese Ergebnisse schließen eine direkte klonale Assoziation des SV40 Virus mit malignen Lymphomzellen in allen untersuchten Proben aus. In Übereinstimmung mit neueren Daten aus Italien, Spanien, England, Frankreich und Kanada sprechen auch unsere Ergebnisse dafür, daß SV40 keine wesentliche Rolle bei der Ätiologie und Pathogenese maligner Lymphome spielt.
Das Follikuläre Lymphom ist ein kleinzelliges, langsam wachsendes und indolentes Non-Hodgkin-Lymphom, welches eine geschlechtsunabhängige Erkrankung des mittleren Alters darstellt [17, 46, 52, 59]. Die t(14;18)-Translokation kann als zusätzlicher Marker zur Diagnostik eines FL eingesetzt werden, da in bis zu 95% die Detektion dieser Chromosomenveränderung gelingt. Um ein solch hohes Resultat zu erzielen, reicht die Standard-PCR-Methode mit den Primern mbr und / oder mcr nicht aus. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue PCR-Methode entwickelt: die Multiplex-PCR. Durch eine Kombination von 12 bcl-2-Primern mit 6 JH-Primern ist die Multiplex-PCR im Stande, Bruchpunkte zwischen den Bereichen mbr und mcr auf dem Chromosom 18, sowie auf den einzelnen Verbindungselemente des Chromosoms 14 aufzudecken. Für die PCR-Analyse stehen 40 Patienten zur Verfügung, welche im Zeitraum zwischen Februar 1989 und November 2005 in der Klinik für Hämatologie und Onkologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald diagnostiziert bzw. therapiert wurden. Als Voraussetzungen werden ausreichende Materialien und vorhandene Daten aus der Standard-PCR angesehen. Die mittlere Beobachtungszeit beträgt 62,5 Monate. Der bcl-2-Nachweis mittels Immunhistochemie gelingt in 94%. Insgesamt lassen sich mit der Standard- und der neuen Multiplex-PCR lediglich bei 50% der Patienten eine Translokation nachweisen. Wobei die Standard-PCR mit dem mbr-Primer 18/40 und die Multiplex-PCR alleine 16 der 40 Erkrankten positiv detektiert. Fünf positiv getestete Patienten mittels der Standard real-time PCR und 1 Patient der Multiplex-PCR weisen Ergebnisse im Normalpersonenbereich auf. Eine sichere Lymphomassoziation ist daher nicht gegeben. Damit lassen sich wahrscheinlich mit der Standard-PCR 13, mit der Multiplex-PCR 15 lymphomassoziierte Translokationen aufspüren. Von den 16 Patienten mit t(14;18)-Translokation in der Multiplex-PCR sind 81% in der mbr und 19% in der icr auf Chromosom 18 lokalisiert. Durch die neue PCR-Methode können bei 69% der t(14;18)-Translokation Bruchpunkte in der JH6-Region, bei 12% bzw. 19% in den Bereichen JH4 und JH5 des Chromosoms 14 gefunden werden. Die PCR-Ergebnisse liegen im Mittel der europäischen Bearbeitungen. Die neu entwickelte Multiplex-PCR detektiert bei 3 Patienten eine Translokation im icr-Bereich, von denen 2 vermutlich durch ein FL bedingt sind. Eine Weiterentwicklung, sowie die Testung der Multiplex-PCR an weiteren Patientenproben sind erforderlich.