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Zerebrale kavernöse Malformationen (CCM) sind Gefäßfehlbildungen des zentralen Nervensystems. Diese können durch Blutungen zu rezidivierenden Kopfschmerzen, epileptischen Anfällen oder hämorrhagischen Schlaganfällen führen. CCMs treten sowohl sporadisch als auch familiär mit autosomal-dominantem Erbgang auf. Die Prävalenz für symptomatisch erbliche Kavernome liegt bei 1:5400 bis 1:6200. Es wurden pathogene Sequenzveränderungen in den Genen CCM1, CCM2 und CCM3 mit der familiären Kavernomatose assoziiert. MicroRNAs (miRNA) sind kurze, nichtkodierende RNAs, die die Expression von vielen Zielgenen regulieren können. Bisher ist wenig über die posttranskriptionale Regulation der CCM3-Expression durch miRNAs bekannt.
Durch in silico Analysen wurde die Regulation von CCM3 durch die miRNAs miR- 103a-3p, miR-30a-5p und let-7f-2-3p vorhergesagt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte die Bindung dieser miRNAs an die 3'-UTR von CCM3 bestätigt werden. Die Transfektion von miR-103a-3p, miR-30a-5p- und let-7f-2-3p-Analoga in humane Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVECs) führte zudem zu einer signifikanten oder tendenziellen Herunterregulation der CCM3-Expression auf mRNA-Ebene. Auf Protein-Ebene wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. In vitro-Untersuchungen zur Wirkung der miRNA-Analoga auf die angiogenetischen Eigenschaften von Endothelzellen zeigten besonders nach miR-30a-5p-Transfektion einen proangiogenen Effekt auf HUVECs. Daher wurde die Wirkung dieser miRNA nachfolgend durch Transfektion eines miR-30a-5p-Inhibitors weiter untersucht. Diese führte zu einer Erhöhung der CCM3-Proteinmenge, nicht jedoch zu einer gesteigerten Expression auf mRNA-Ebene. In Übereinstimmung mit der Annahme einer proangiogenen Wirkung dieser miRNA zeigten sich negative Auswirkungen auf die angiogenetischen Eigenschaften von HUVECs nach Transfektion des miR-30a- 5p-Inhibitors. Zusammenfassend ergeben sich Hinweise, dass CCM3 von miR-103a- 3p, miR-30a-5p und let-7f-2-3p reguliert wird und dass besonders miR-30a-5p proangiogene Eigenschaften aufweist. Die Rolle der ausgewählten miRNAs bei der Pathogenese der CCMs ist jedoch nicht abschließend geklärt, wobei die Regulation von CCM3 durch ein großes, größtenteils noch unbekanntes Netzwerk von miRNAs anzunehmen ist.
Untersuchungen zur Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im klarzelligen Nierenzellkarzinom
(2011)
Mit einer steigenden Anzahl der Neuerkrankungen in den letzten 20 Jahren ist das Nierenzellkarzinom in Deutschland die dritthäufigste bösartige Erkrankung des Urogenitaltrakts. 75 % dieser malignen epithelialen Tumoren sind klarzellige Nierenzellkarzinome. Trotz des technischen Fortschritts in der Medizin ist die Diagnose Nierenzellkarzinom noch häufig ein sonografischer Zufallsbefund, denn klinische Symptome sind initial meist unspezifisch. Nach einer Tumornephrektomie erleiden 30 bis 40 % der Patienten ein Rezidiv, wobei zirka 2/3 in den ersten zwei Jahren nach Primärtherapie beobachtet werden. Spätmetastasen können beim Nierenzellkarzinom charakteristischerweise auch nach mehr als 15 Jahren auftreten. Diese Fakten legen nahe, dass eine frühzeitige Diagnosestellung den Erfolg einer entsprechenden Behandlungsstrategie mitbestimmt. Dieser Arbeit vorausgegangene Proteomanalysen zeigten eine differentielle Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im klarzelligen Nierenzellkarzinom. Auf der Grundlage der gefundenen tumorassoziierten Enzymalteration wurden im Rahmen dieser Arbeit Gewebeproben von 20 Patienten mit klarzelligem NZK molekularbiologisch untersucht um den Expressionsunterschied des Enzyms Nicotinamid N-Methyltransferase zu verifizieren. Pro Patient wurde die Expression der Nicotinamid N-Methyltransferase im Tumorgewebe sowie im makroskopisch unauffälligen Nierenrandgewebe analysiert. Der Nachweis der NNMT erfolgte anhand folgender Methoden: semiquantitative RT-PCR, quantitative real-time-PCR (SYBR® Green I- sowie TaqMan®-Assays), Western Blot, Immunhistochemie. Alle Untersuchungsmethoden bestätigten eine erhöhte Expression der NNMT im klarzelligen NZK im Vergleich zum Kontrollgewebe, wobei ein statistisch signifikanter Unterschied in der Western Blot-Analyse am deutlichsten war. Ein Zusammenhang zwischen der NNMT-Expression und Tumorstadium beziehungsweise Grading wurde weder auf Protein- noch auf RNA-Ebene gefunden. Mögliche Forschungsansätze könnten unter anderem die Untersuchung genetischer Polymorphismen, Mutationsanalysen, die Korrelation von NNMT-Genexpression und HNF-1beta-Genexpression im Nierenzellkarzinom sowie die Interaktion der NNMT in Angiogeneseprozesse bieten.
Tumorbiologische Charakterisierung der Tumorprogressionsfaktoren miR-1 und HSP27 im CAM-Modell
(2021)
Der HET-CAM-Assay kombiniert die Vorteile von Zellkultursystemen und Tiermodellen, indem er leicht und rasch durchzuführende, vergleichsweise kostengünstige Untersuchungen in einem physiologischen Umfeld gestattet, ohne zu den Tierversuchen zu zählen. Das schwach ausgebildete Immunsystem des Hühnerembryos und die starke Vaskularisierung der CAM ermöglichen es, onkologische Prozesse wie das Tumorwachstum und die Angiogenese zu analysieren. In dieser Arbeit wurden verschiedene Durchführungen des Assays getestet und schließlich eine Methode entwickelt, mit der sowohl maternale als auch gentechnisch veränderte Varianten der PC-Zelllinien LNCaP und PC-3 auf der CAM inokuliert und das Tumorwachstum induziert werden konnten. Nach der Etablierung dieses Modell-Systems wurden die tumorprogressiven Effekte der Mikro-RNA miR-1 und des Hitzeschockproteins HSP27 in ovo evaluiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass beide Faktoren Einfluss auf die Progression der PC-Tumoren auf der CAM hatten. Für miR-1 konnte erstmals die in der Literatur beschriebene tumorsuppressive Wirkung durch die Inhibition der Angiogenese in einem in vivo-Modell für das PC nachgewiesen werden. Zudem schien ihre Überexpression einen anti-proliferativen Effekt zu haben. Hinsichtlich der Funktionen von HSP27 deuteten sich Tendenzen an. Auch hier wurden erstmals angiogene Prozesse in einem in vivo Modell für das PC analysiert. Diese Untersuchungen bestätigten die postulierten tumorbiologischen Eigenschaften von HSP27 als Onkogen durch die Förderung der Angiogenese, aber auch der Proliferation.
Zerebrale kavernöse Malformationen (CCM) sind maulbeerartige Gefäßfehlbildungen, die sich klinisch in Form von rezidivierenden, migräneartigen Kopfschmerzen, epileptischen Anfällen oder hämorrhagischen Schlaganfällen äußern können. CCMs treten sowohl sporadisch als auch in einer autosomal-dominant erblichen Form auf. Die Prävalenz der symptomatischen erblichen Kavernome liegt bei 1:5400 bis 1:6200. Somit zählen sie zu den seltenen Erkrankungen. Pathogene Varianten in den Genen CCM1, CCM2 und CCM3 sind mit der Entstehung der Malformationen assoziiert. Speziell Träger einer pathogenen CCM3-Variante zeigen meist ein frühes Manifestationsalter und einen schwerwiegenderen klinischen Krankheitsverlauf.
Durch in der Greifswalder Arbeitsgruppe durchgeführte Transkriptomanalysen von CCM3-/- CI-huVECs konnten die im Vergleich zu den CCM3+/+ Zellen neben FN1 (Fibronektin-1-Gen) am stärksten herunterregulierten Gene FBLN5 und POSTN identifiziert werden. Sie kodieren für Proteine der EZM. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen der matrizellulären Proteine FBLN5 und POSTN erstmals im Rahmen der CCM3-Pathogenese untersucht. Weder die akute Herunterregulation von FBLN5 noch die von POSTN hatte einen Einfluss auf die Wachstumsmorphologie oder die Organisation des Aktinzytoskeletts. In Bezug auf die Angiogenese führten die akuten Herunterregulationen von FBLN5 und POSTN zu einer verminderten Ausbildung gefäßähnlicher Strukturen. Im nächsten Schritt wurde eine mögliche Rettung des Phänotyps der CCM3-/- Endothelzellen durch die Hinzugabe der rekombinanten Proteine FBLN5 und POSTN untersucht. Die Addition von rFBLN5 veränderte die Morphologie der Endothelzellen maßgeblich und führte zu einer gezielten Reorganisation des Aktinzytoskeletts. Die Supplementierung von rPOSTN wirkte im Zeitverlauf stabilitätssteigernd auf die gefäßähnlichen Strukturen und hatte einen rettenden Einfluss auf die angiogenetischen Eigenschaften der CCM3-/- Endothelzellen. In Zusammenschau mit den von Schwefel et al. (2020) publizierten Daten über Fibronektin ist davon auszugehen, dass Bestandteile der EZM eine modulatorische Rolle in der Entstehung von CCMs einnehmen. Allerdings bleibt bisher ungeklärt welche Mechanismen hierbei von Bedeutung sind.
Zerebrale kavernöse Malformationen sind Gefäßfehlbildungen des menschlichen zentralen Nervensystems, die mit einer Prävalenz von etwa 1:650 in der Bevölkerung auftreten und zu rezidivierenden Kopfschmerzen, Krampfanfällen und Gehirnblutungen führen können. Diese Läsionen treten sowohl sporadisch als auch als Konsequenz von erblichen Mutationen (familiäre Kavernomatose) mit unvollständiger Penetranz und variabler Expressivität auf. Kausale Mutationen sind für die Gene CCM1 ( KRIT1), CCM2 (Malcavernin) und CCM3 (PDCD10) beschrieben. Die vorliegende Dissertationsarbeit mit dem Titel „Identifizierung und Charakterisierung eines neuen Kandidatengens für kavernöse Gefäßmalformationen des zentralen Nervensystems“ hatte die Suche neuer CCM-assoziierter Gene und deren Beschreibung zur Aufgabe. Als Ausgangspunkt dienten fünf Indexpatienten aus der Kohorte Stahl et al. 2008, bei denen keine ursächliche Mutation in den bekannten CCM-Genen identifiziert werden konnte. Die Exomsequenzierung mittels SOLiD™ 5500XL ergab für die vier isolierten und den familiären Fall mehr als 210.000 Varianten. Nach Filterung und Priorisierung dieser Veränderungen wurden acht Kandidatengene definiert, von denen fünf mittels klassischer Sanger-Sequenzierung validiert werden konnten. Das vielversprechendste Kandidatengen, FAM222B (C17orf63), in dem 2012 keine Loss-of-function Mutationen bekannt waren und das für ein Protein unbekannter Struktur und Funktion kodiert, wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Zunächst konnten durch einen Yeast Two-Hybrid Screen Interaktionspartner identifiziert werden, die sich in die bekannten CCM-Signalwege integrieren ließen. Funktionelle Studien mittels Morpholino- und TALEN-Technik im Zebrafischmodell und mit humanen Nabelschnurvenenendothelzellen zeigten jedoch keinen signifikanten Effekt von FAM222B auf die Angiogenese. Auch eine detaillierte Bewertung der Informationen, die erst Ende 2014 in der ExAC-Datenbank veröffentlicht wurden, spricht in Zusammenschau mit den experimentellen Daten eher dagegen, FAM222B als neues Kandidatengen für die Entstehung von CCMs einzustufen. Parallel zu den funktionellen Studien wurde die Kohorte von Stahl et al. 2008 kontinuierlich erweitert. Bei den molekulargenetischen Analysen fanden sich mehr kausale Mutationen im CCM3-Gen als bisher angenommen. Ferner konnte gezeigt werden, dass rund ein Drittel der Probanden vor Erreichen des Erwachsenenalters und ein Fünftel der Mutationsträger bereits vor dem 10. Lebensjahr erkranken.
Makrophagen stellen einen wesentlichen Bestandteil des leukozytären Infiltrates des Kolonkarzinoms und anderer maligner Tumoren dar. Für eine Reihe anderer Tumorentitäten konnte bereits nachgewiesen werden, dass tumor-assoziierte Makrophagen das Wachstum, die Neoangiogenese und die Metastasierung fördern. Bisherige Studien zur Rolle der Makrophagen im Kolonkarzinom zeigten hingegen widersprüchliche Ergebnisse.
Um den Einfluss von Makrophagen auf das Wachstums- und Metastasierungsverhalten im Kolonkarzinom genauer zu untersuchen, wurde zum einen ein orthotopes, syngenes Kolonkarzinommodell, zum anderen ein Lebermetastasenmodell unter Verwendung der murinen Kolonkarzinomzelllinie CT-26 in der immunkompetenten Balb/c-Maus verwendet und die Makrophagen bzw. Kupffer-Zellen mittels intraperitonealer Injektion von Clodronat-Liposomen selektiv depletiert. Die Tumorvolumina bzw. die Metastasenanzahl wurden mittels 7-Tesla Kleintier-MRT bestimmt und das Tumorgewicht per Feinwaage ermittelt. Die Makrophagen- und Gefäßdichte in den orthotopen Tumoren sowie die Kupffer-Zelldichte im Lebermetastasenmodell wurden mit Hilfe der Immunhistochemie ausgewertet.
Die Makrophagendepletion führte zu einer signifikanten Verringerung des Tumorwachstums im orthotopen Kolonkarzinommodell und verminderte hier gleichzeitig die Anzahl an Tieren, die eine Peritonealkarzinose bzw. Lebermetastasen entwickelten. Darüber hinaus führte die Depletion zu einer signifikanten Hemmung der Neoangiogenese im Kolonkarzinom. Im Lebermetastasenmodell führte die Kupffer-Zelldepletion zu einer signifikant geringeren Anzahl an Lebermetastasen, wobei die Kupffer-Zelldichte direkt mit der Metastasenanzahl korrelierte.
Die Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass tumor-assoziierte Makrophagen im Kolonkarzinom, wie auch in einigen anderen malignen Erkrankungen, eine tumor-unterstützende Rolle ausüben. Darüber hinaus scheinen Kupffer-Zellen einen entscheidenden Promotor bei der Ausbildung von Lebermetastasen darzustellen.
Zukünftige Therapien könnten darauf abzielen, selektiv bestimmte Makrophagenpopulationen wie die tumor-assoziierten Makrophagen oder Kupffer-Zellen zu depletieren. Eine weitere Möglichkeit bestünde in der Umdifferenzierung von tumor-assoziierten Makrophagen (M2) in proinflammatorische Makrophagen (M1), die dann suppressiv oder zytotoxisch auf den Tumor wirken.
Des Weiteren wurden zwei Untersuchungsmethoden zur Darmbildgebung in der Maus mittels MRT entwickelt, die eine deutliche Steigerung der Bildqualität und einen zusätzlichen Informationsgewinn in Tierversuchen ermöglichen. Beide Untersuchungstechniken erwiesen sich als gut reproduzierbar und erlauben eine longitudinale Beurteilung von Darmerkrankungen über einen längeren Zeitraum.
In weiteren Versuchen müsste nun die Sensitivität und Spezifität der beiden beschriebenen Methoden bei der Untersuchung pathologischer Läsionen des Darmes beurteilt werden.