Doctoral Thesis
Der Replikationszyklus der Herpesviren ist sehr komplex und im Detail unzureichend verstanden. Die Funktionen und Eigenschaften einiger viraler Proteine sind bisher kaum charakterisiert. Folglich gibt es wenige Strukturmodelle dieser Proteine, wodurch beispielsweise eine rationale Medikamentenentwicklung kaum möglich war. Die Zielstellung dieser Arbeit war, neun dieser Proteine (pUL4, -7, -11, -16, -21, -26, -26.5, -32 und -33) aus dem pseudorabies virus (PrV) zu charakterisieren und nach Möglichkeit deren Struktur aufzuklĂ€ren. Hierzu wurden die zur VerfĂŒgung gestellten Gensequenzen in geeignete bakterielle Expressionsvektoren umkloniert und in E. coli exprimiert. Lösliche Proteine wurden gereinigt und anschlieĂend Kristallisationsexperimenten unterzogen, wĂ€hrend unlösliche Proteine zum Teil auf ihre Renaturierbarkeit getestet wurden. Die Strukturen des kristallisierten N-terminalen Teils von pUL26 (Assemblin) wurden mittels Röntgenkristallographie aufgeklĂ€rt. AuĂerdem wurden alle Proteine in silico auf Signalsequenzen, Phosphorylierungen und Sequenzmuster untersucht. Von der N-terminalen SerinproteasedomĂ€ne (Assemblin) von pUL26 wurden drei Strukturen durch Röntgenkristallographie bestimmt: eine native dimere, eine inhibierte dimere, sowie eine native monomere Struktur. Letztere ist das erste bekannte Strukturmodell der monomeren Form eines Assemblins. In Verbindung mit den dimeren Strukturen konnte experimentell bestĂ€tigt werden, dass die Aktivierung der Assembline ĂŒber die Verschiebung eines loop bei der Dimerisierung erfolgt. Die Umlagerung dieses loop basiert darauf, dass sich der in der monomeren Form teilweise flexible Dimerisierungsbereich durch die Dimerisierung etwas verĂ€ndert und eine weitestgehend starre Konformation einnimmt. Die Helix α8 wird etwas verkĂŒrzt und die Helix α7 etwas verlĂ€ngert und begradigt, wodurch sich der Oxyanionenloch-Loop vom Dimerisierungsbereich entfernt und ein ausgedehntes WasserstoffbrĂŒckenbindungsnetzwerk aufbaut. In dieser Konformation stabilisiert der loop das Oxyanionenloch, wodurch die Protease aktiviert wird. Weiterhin wurde durch small-angle X-ray scattering bestĂ€tigt, dass der Dimerisierungsgrad von der Assemblin- und Mg²+;-Ionenkonzentration abhĂ€ngig ist. Diese Informationen zur Dimerisierung des PrV-Assemblins können dazu beitragen, rationale Medikamentenentwicklung zu betreiben. Daraus resultierende Wirkstoffe können die Dimerisierung und somit die Aktivierung dieses SchlĂŒsselproteins verhindern. Durch die hohe Ăhnlichkeit der Assembline in anderen Herpesviren, kann die nun bekannte monomere Struktur des PrV-Assemblins als Modell fĂŒr die monomere Struktur anderer, zum Teil humanpathogener Herpesviren genutzt werden. Demzufolge könnte dieses Modell auch die Entwicklung von Medikamenten beispielsweise gegen das Epstein-Barr virus oder das herpes simplex virus 1 ermöglichen. Es stellte sich zudem heraus, dass die bisher fĂŒr das PrV-pUL26 bzw. -pUL26.5 vorhergesagte zweite Assemblinschnittstelle (M-site) vermutlich nicht korrekt ist. Es wurde eine andere M-site vorgeschlagen, welche ebenfalls infrage kommt. Eine Charakterisierung in vitro war bei fĂŒnf der neun zu untersuchenden Proteine möglich. Die anderen vier Proteine (pUL7, -16, -21 und -32) konnten aus verschiedenen GrĂŒnden nicht erfolgreich exprimiert werden. Die Proteine pUL4, pUL26.5 und pUL33 wurden unlöslich exprimiert, wobei pUL33 renaturiert werden konnte. Der Membrananker pUL11 und die N-terminale SerinproteasedomĂ€ne von pUL26 konnten löslich exprimiert werden. Untersuchungen in silico ergaben, dass der Membrananker pUL11 aus dem pseudorabies virus wahrscheinlich ein nukleĂ€res Exportsignal trĂ€gt, was bisher nicht bekannt war. Es ist zudem wahrscheinlich, dass pUL11 selbst keine definierte Struktur hat, da es mit 63 AminosĂ€uren ein sehr kleines Protein ist und ĂŒber Sequenzmuster mit anderen Proteinen interagiert.
Der Kernexport neusynthetisierter Kapside stellt einen SchlĂŒsselprozess in der Herpesvirus-Replikation dar. Die zugrundeliegenden Mechanismen dieser Vesikel-vermittelten Translokation sind jedoch noch nicht vollstĂ€ndig verstanden. Der nuclear egress wird dabei maĂgeblich von zwei viralen Proteinen dirigiert, die in PrV und HSV-1/-2 als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden und in allen Herpesviren konserviert sind. Beide Proteine interagieren an der inneren Kernmembran, wo sie den sogenannten nuclear egress complex (NEC) bilden. WĂ€hrend pUL34 ein membranstĂ€ndiges Protein in der Kernmembran ist, gelangt das lösliche pUL31 ĂŒber einen aktiven Transport in den Kern. Obwohl der erste Schritt der Freisetzung aus dem Kern, die Vesikelbildung und AbschnĂŒrung an der inneren Kernmembran, schon gut untersucht ist und auch die Kristallstrukturen des NEC fĂŒr verschiedene Herpesviren ermittelt werden konnte, sind noch viele Fragen offen. So war zu Beginn dieser Arbeit noch unklar wie die Kapside in diese HĂŒllen rekrutiert werden und welche Rolle die nicht konservierte und offensichtlich flexible N-terminale DomĂ€ne von pUL31, die nicht in den Kristallstrukturen dargestellt werden konnte, fĂŒr die Regulierung dieses Prozesses spielt. So konzentrierte sich diese Arbeit auf die Fragen, wie die Kapside mit dem NEC interagieren (Paper I und II) und wie der pUL31-N-Terminus diesen ungewöhnlichen Transportweg beeinflusst (Paper III).
Paper I und II: Untersuchungen zur Nukleokapsid/NEC Interaktion
Unklar ist, wie der NEC mit seiner Fracht, den Nukleokapsiden, interagiert. Auf Grundlage der vorhandenen Kristallstrukturen des Komplexes unterschiedlicher Herpesviren wurde eine InteraktionsdomĂ€ne in pUL31 postuliert und angenommen, dass dies mittels elektrostatischer Wechselwirkungen erfolgt. Um dies nĂ€her zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit geladene AminosĂ€uren, die als mögliche Interaktionspartner in Frage kommen, zu Alanin mutiert. Die so generierten pUL31 Mutanten wurden, nach Transfektion entsprechender Expressionsplasmide in Kaninchennierenzellen (RK13), auf ihre Lokalisation und nach Koexpression mit pUL34 auf Interaktion getestet. Die FunktionalitĂ€t der mutierten Proteine wĂ€hrend der Virusreplikation wurde mit Hilfe stabiler Zelllinien nach Infektion mit PrV-âUL31 untersucht. Ăber elektronenmikroskopische Analysen wurde der Einfluss auf den Kernexport im Detail betrachtet. Hierbei konnte einem konservierten Lysin an Position 242 in PrV pUL31 im Prozess der KapsidumhĂŒllung eine SchlĂŒsselrolle zugeordnet werden. Dieses Lysin befindet sich im membrandistalen Bereich des NECs, in der Alphahelix H10 von PrV pUL31. Die Substitution des K242 zu Alanin fĂŒhrte zu einem AbschnĂŒren und einer Akkumulation leerer, VirushĂŒllen-Ă€hnlicher Vesikel im PNS, obwohl reife Kapside im Kern und in unmittelbarer NĂ€he zu den Akkumulationen vorhanden waren. Dies fĂŒhrte zu der Hypothese, dass die Ladung des Lysins direkt an der Interaktion mit dem Kapsid beteiligt ist (Paper I).
Obwohl das Lysin 242 in der Struktur des Dimers oberflĂ€chenexponiert erschien, zeigten Modellierungen im NEC Oligomer, dass diese AminosĂ€ure vermutlich zu tief in der Struktur verborgen ist um als direkter Interaktionspartner in Frage zu kommen. Um die im vorherigen Paper aufgestellte Hypothese zu verifizieren oder auch zu widerlegen, wurde das Lysin nicht nur durch Alanin, sondern auch durch andere nicht geladene, sowohl positiv als auch negativ geladene oder in ihrer GröĂe variierende AminosĂ€uren substituiert (Paper II).
Die neu generierten Substitutionsmutanten wurden nach Transfektion der Expressionsplasmide auf ihre Lokalisation und nach Kotransfektion mit pUL34, auf ihre Interaktion untersucht. Die FunktionalitĂ€t der mutierten Proteine wurde ebenfalls mit Hilfe stabil exprimierender Zelllinien analysiert. Die vorliegenden PhĂ€notypen wurden weiter mittels elektronenmikroskopischer Analysen bestimmt. Es stellte sich heraus, dass unabhĂ€ngig von der vorhandenen Ladung der AminosĂ€ure an Position 242 der Kernexport signifikant beeintrĂ€chtigt wurde. In Strukturanalysen der einzelnen Mutanten zeigte sich, dass vielmehr die Ausrichtung und GröĂe der Seitenkette der ersetzten AminosĂ€ure entscheidend war. So störte beispielsweise die Substitution zu Serin und Tyrosin, die die Lage der Seitenketten des ursprĂŒnglich vorliegenden Lysins imitierten, die Funktion des pUL31 am wenigsten und die Titer erreichten fast Wildtypwerte. Dagegen fĂŒhrten Substitutionen zu deutlich lĂ€ngeren AminosĂ€uren, wie GlutaminsĂ€ure oder Arginin, zu massiven BeeintrĂ€chtigungen des nuclear egress. Allerdings fĂŒhrte keine der Substitutionen zu einem unkontrollierten AbschnĂŒren von Vesikeln ohne Aufnahme eines Kapsids an der inneren Kernmembran.
Die hier gezeigten Ergebnisse entkrĂ€fteten die Annahme einer elektrostatischen Interaktion ĂŒber pUL31 K242 mit den Nukleokapsiden in PrV. Vielmehr deuteten sie auf eine strukturell basierte Störung der Kapsidaufnahme in die Vesikel hin (Paper II).
Mittels serieller Passagen von Virusmutanten die das UL31 mit der K242A Substitution exprimierten, wurde nach möglichen kompensatorischen (second-site) Mutationen gesucht, die den Defekt ausgleichen und darĂŒber hinaus Aufschluss auf die molekularen Ursachen ziehen lassen.
Die generierten Virusrekombinanten erreichten bereits nach ca. 10 Passagen Wildtpy-Ă€hnliche Titer. Aus den Passagen wurden verschiedene Isolate charakterisiert. Es zeigte sich zwar keine Reversion zum Lysin 242, vielmehr waren jedoch entweder weitere Mutationen in pUL31 oder in pUL34 zu finden. WĂ€hrend die detektierten pUL34 Mutationen zu einem spĂ€teren Zeitpunkt charakterisiert werden mĂŒssen, wurden die second-site mutierten pUL31 Proteine auf Lokalisation, Kolokalisation und Kompensation des K242A Defektes getestet. Die Ergebnisse bestĂ€rkten die Annahme eines Strukturdefektes durch K242A. DarĂŒber hinaus konnten durch RĂŒckmutation des K242A Defektes in den second-site mutierten pUL31 zwei Helices bestĂ€tigt werden (H5 und H11), die Ă€hnlich der H10 einen starken Einfluss auf den Kernexport besitzen.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass die AminosĂ€ure an Position 242 nicht direkt mit den Nukleokapsiden interagiert, dass eingefĂŒhrte Mutationen jedoch die Umorganisation des NEC-Oligomers, welche offensichtlich notwendig fĂŒr die effiziente KapsidumhĂŒllung an der inneren Kernmembran ist, stört und so den nuclear egress inhibiert (Paper II).
Es zeigte sich, dass sich die Struktur-Funktions-Beziehungen in den NECs komplexer darstellen als vermutet. Die Ergebnisse dieser Arbeit können zwar nicht den Mechanismus des Kapsidexports bzw. der Kapsidbindung und -inkorporation aufklÀren doch zeigen sie, dass die Interaktionen der NECs miteinander sehr viel komplexer aber auch wesentlich flexibler sind als zunÀchst angenommen.
Paper III: Untersuchung der N-terminalen DomÀne von PrV pUL31
Neben einem Kernlokalisationssignal (NLS) beherbergt der N-terminus verschiedener pUL31 Homologer auch zahlreiche vorhergesagte Phosphorylierungsstellen, die an der Regulation des Kernexportes beteiligt sind bzw. sein könnten. Dieser flexible N-terminale Bereich hat in PrV pUL31 eine LĂ€nge von 25 AminosĂ€uren, wobei auffallend viele basische AminosĂ€uren in Clustern und verschiedene mögliche Phosphorylierungsstellen enthalten sind. Computer-unterstĂŒtze Analysen (NLStradamus) erkennen in der AminosĂ€uresequenz ein bipartites NLS (AS 5-20). Um die Rolle des N-terminalen Bereiches in PrV pUL31 nĂ€her zu untersuchen, wurde dieser schrittweise verkĂŒrzt und die basischen AminosĂ€uren, sowie die möglichen Phosphorylierungsstellen, durch gerichtete Mutagenese durch Alanin ersetzt. Getestet wurden diese Mutanten nach Transfektion der entsprechenden Expressionsplasmide in RK13 Zellen auf ihre Lokalisation und, nach Koexpression von pUL34, auf Interaktion und der Umorganisation der Kernmembran. Ăber stabil-exprimierende Zelllinien und nach Infektion mit der UL31 negativen Virusmutante (PrV-âUL31) wurde die FunktionalitĂ€t in eplikationsassays und auch ultrastrukturell charakterisiert. Erstaunlicherweise zeigte sich, dass weder das bipartite NLS noch die vorhergesagten Phosphorylierungsstellen eine entscheidende Rolle spielen. Vielmehr konnte der gröĂte Teil des N-Terminus ohne sichtbaren Funktionsverlust deletiert werden, sofern mindestens ein Cluster basischer AminosĂ€uren in dieser Region erhalten blieb. Die Ergebnisse zeigten, dass der basische Charakter dieser Region entscheidend fĂŒr die korrekte Lokalisation, sowie fĂŒr die Bildung und FunktionalitĂ€t des NEC ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung im N-Terminus von PrV pUL31, wie auch die roteinkinase pUS3, zwar nicht essenziell fĂŒr die Freisetzung der Nukleokapside aus dem perinukleĂ€ren Spalt sind, jedoch diesen Prozess unterstĂŒtzen (Paper III).
Die Glykoproteine gB und gH-gL sind bei allen Herpesviren konserviert und wichtig fĂŒr den Viruseintritt und die direkte Zell-Zell-Ausbreitung. Allerdings kann sich PrV in Abwesenheit von gL noch in einem sehr geringen AusmaĂ von Zelle zu Zelle ausbreiten, was Reversionsanalysen durch serielle Zellkultur-Passagen einer gL-negativen PrV-Mutante erlaubt. So konnte in einem Passageexperiment die Revertante PrV-ÎgLPassB4.1 isoliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Grundlagen der gL-unabhĂ€ngigen InfektiositĂ€t von PrV-ÎgLPassB4.1 untersucht. Dabei wurden Mutationen in den Glykoproteinen gB, gH und gD nachgewiesen und deren Auswirkung auf die Proteinfunktion mit Hilfe von transienten Transfektions-Fusionsassays untersucht. Die AufklĂ€rung der Kristallstrukturen eröffnete die Möglichkeit, ĂŒber zielgerichtete Mutagenese die Funktion von gH-gL besser zu analysieren. Erstaunlich war, dass im gH des Impfstammes PrV-Bartha ein ansonsten hochkonserviertes Prolin durch Serin ersetzt ist. FĂŒr dieses Prolin wurde postuliert, dass es fĂŒr die Ausbildung einer ebenfalls bei allen Herpesviren konservierten DisulfidbrĂŒcke notwendig ist. Um den Effekt der Substitution und die Funktion der DisulfidbrĂŒcke zu testen, wurden gH Mutanten hergestellt, die entweder Prolin oder Serin an Position 438 oder Serin statt Cystein an Position 404 exprimierten. Diese wurden in transienten Transfektions-Fusionsassays sowie wĂ€hrend einer Virusinfektion getestet. Obwohl die AminosĂ€uresequenzen der gH-Proteine der Herpesviren nur eine geringe Homologie aufweisen, sind die Kristallstrukturen erstaunlich Ă€hnlich. Daher sind konservierte Strukturmotive wie die DisulfidbrĂŒcke in der DomĂ€ne III, fĂŒr die eine Bedeutung fĂŒr die Faltung und StabilitĂ€t der DomĂ€ne III postuliert wurde, von besonderem Interesse. Um weitere funktionsrelevante konservierte Regionen in DomĂ€ne III aufzudecken, welche fĂŒr die Lokalisierung und Funktion des gH wichtig sein könnten, wurden zunĂ€chst Sequenzvergleiche zwischen EBV und PrV gH unter BerĂŒcksichtigung der vorhandenen gH-Kristallstrukturen durchgefĂŒhrt. Hierbei wurden komplexe Interaktionsnetzwerke ĂŒber WasserstoffbrĂŒckenbindungen zwischen konservierten und benachbarten nicht-konservierten AminosĂ€uren vorhergesagt. Diese wurden im EBV und PrV gH mutiert und die gH-Proteine anschlieĂend auf ihre OberflĂ€chenexpression und Fusionsfunktion untersucht. ZusĂ€tzlich wurden PrV Rekombinanten mit entsprechenden gH-Mutationen hergestellt und charakterisiert.
Herpesviren nutzen einen Vesikel-vermittelten Transportweg fĂŒr die Translokation von Nukleokapsiden aus dem Zellkern, um fĂŒr die weitere Virusmorphogenese in das Zytoplasma zu gelangen. Den dafĂŒr notwendigen Kernfreisetzungskomplex (nuclear egress complex; NEC) bilden zwei konservierte herpesvirale Proteine, die als pUL34 und pUL31 bezeichnet werden. Die Kristallstrukturen der NECs aus verschiedenen Herpesviren zeigten eine stabile Interaktion zwischen der N-terminalen DomĂ€ne von pUL31 und dem Kern von pUL34. DarĂŒber hinaus gehören die am stĂ€rksten konservierten Reste von pUL31 zu einem Zinkfinger-Motiv (ZNF). Zur KlĂ€rung der funktionellen Bedeutung des ZNF-Motivs in PrV pUL31, das aus drei Cysteinen (C73, C89 und C92) der CR1 und einem Histidin (H188) der CR3 besteht, wurden die Cysteine einzeln zu Serinresten und das Histidin H188 zu Alanin substituiert. Funktionelle Analysen der mutierten Proteine, die in vitro mit artifiziellen Membranen und in situ in eukaryotischen Zellen durchgefĂŒhrt wurden, zeigten, dass das ZNF-Motiv eine wesentliche Voraussetzung fĂŒr die NEC-Bildung und die notwendige MembranverĂ€nderung darstellt. Der N-terminale Bereich von pUL31 und der anderen Homologen ist sehr variabel und wurde daher in den Konstrukten fĂŒr die Kristallisierung weggelassen. Wie auch einige andere pUL31-Homologe enthĂ€lt PrV pUL31 ein Kernlokalisationssignal (NLS) im N-Terminus fĂŒr einen effizienten Kernimport. Neben der FunktionalitĂ€t des Kernimports scheint dieser spezifische Bereich ebenfalls eine Rolle bei der Freisetzung von Nukleokapsiden aus dem Kernspalt, der Vorbeugung von einer vorzeitigen Komplexbildung im Zytoplasma, der Translokation der reifen Kapside an die INM und bei der Regulierung des envelopment/deenvelopment Prozesses ĂŒber Phosphorylierung zu spielen. Um zu untersuchen welche zusĂ€tzlichen Funktionen der N-terminale Bereich einnimmt, wurde der N-Terminus von PrV pUL31 schrittweise verkĂŒrzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die AminosĂ€uren 2-13 (pUL31-N14), einschlieĂlich des Hauptteils des vorhergesagten NLS, fĂŒr die NEC-Bildung und -Funktion entbehrlich sind. Die Deletion von vier zusĂ€tzlichen AminosĂ€uren (pUL31-N18), die alle grundlegenden Patches eliminierte, fĂŒhrte jedoch zu einem defekten Protein. Die vollstĂ€ndige Deletion der 25 N-terminalen AminosĂ€uren zeigte in Gegenwart von Wildtyp pUL31 eine Inhibierung des Kernaustritts. pUL31-N18, was ĂŒberwiegend im Zytoplasma gefunden wurde, zeigte keinen dominant-negativen Effekt. Die Phosphorylierung der beiden vorhergesagten Stellen im N-Terminus von PrV pUL31 (S12/S13) spielt offensichtlich keine Rolle beim Kernaustritt. Die Titer von PrV-Mutanten denen pUL34 oder pUL31 fehlt, werden drastisch reduziert, jedoch die Freisetzung infektiöser Nachkommen nicht komplett inhibiert, was auf einen alternativen Austrittsweg hinweist. Wiederholtes Passagieren dieser Mutanten fĂŒhrte zu Revertanten, die eine Wildtyp-Ă€hnliche Replikation wiedererlangten. PrV-ÎUL34Pass und PrV-ÎUL31Pass umgingen dabei den vesikulĂ€ren Transportweg durch das Induzieren einer Fragmentierung der Zellkernmembran (NEBD). Um zu testen, ob CDKs eine Rolle im viral induzierten NEBD spielen, wurden Wildtyp- (wt) oder dominant-negative (DN) Versionen der zellulĂ€ren CDKs 1-6 getestet. In Gegenwart von CDK2DN wurden die Titer fĂŒr beide Viren signifikant reduziert. Ultrastrukturelle Analysen zeigten, dass die Freisetzung von PrV-Ka primĂ€ren Virionen aus dem perinukleĂ€ren Raum beeintrĂ€chtigt oder verzögert war und NEBD nur selten in PrV-ÎUL34Pass-ÎgG-CDK2DN-infizierten Zellen beobachtet wurde. Die genaue Zusammensetzung der primĂ€ren Virionen sowie der Maschinerie fĂŒr die Verschmelzung der primĂ€ren HĂŒlle mit der Ă€uĂeren Kernmembran sind nicht bekannt. Um virale und/oder zellulĂ€re Proteine und andere primĂ€re Virion-Komponenten zu identifizieren, sollen primĂ€r umhĂŒllte Virionen aus dem perinukleĂ€ren Raum isoliert und durch Massenspektrometrie analysiert werden. Da die Reinigung der primĂ€ren Virionen aus dem perinukleĂ€ren Raum nicht ganz einfach ist, wurde das membranverankerte pUL34 mit verschiedenen AffinitĂ€tsmarken markiert. Vier markierte pUL34-Konstrukte wurden nach Transfektion und Infektion generiert und getestet. Drei von ihnen erwiesen sich als funktionell wĂ€hrend des herpesviralen Kernaustritts und es konnten stabil exprimierende Zelllinien hergestellt werden. Diese Zelllinien bilden nun eine solide Grundlage fĂŒr weitere Experimente, um zuverlĂ€ssige Protokolle fĂŒr die Reinigung von primĂ€ren Virionen aus dem perinukleĂ€ren Raum zu etablieren.
Herpesviruses are a fascinating group of enveloped DNA viruses, which rely on membrane fusion for infectious entry and direct cell-to-cell spread. Compared with many other enveloped viruses, they utilize a remarkably complex fusion machinery. Three conserved virion proteins, the bona fide fusion protein gB, and the presumably gB activating gH/gL heterodimer constitute the conserved core fusion machinery and are believed to drive membrane fusion in a cascade-like fashion. Activation of this cascade in most alphaherpesviruses is proposed to be triggered by binding of gD to specific host cell receptors. The molecular details of this fusion process, however, remain largely elusive. Yet, a detailed mechanistic knowledge of this process would be greatly beneficial for the development of efficient countermeasures against a variety of diseases. In this thesis, the functional relevance of individual components of the essential gH/gL complex of the alphaherpesvirus PrV has been assessed by two different approaches: by reversion analysis (paper II) and site-directed mutagenesis (papers III-V). In contrast to other herpesviruses, gL-deleted PrV is able to perform limited cell-to-cell spread, providing the unique opportunity to passage the entry-deficient virus in cell culture to select for PrV revertants capable of infecting cells gL-independently. This approach already resulted in an infectious gL-negative PrV mutant (PrV-ÎgLPass), in which the function of gL was compensated by formation of a gDgH hybrid protein. Here, the requirements for gL-independent infectivity of a second independent revertant (PrV-ÎgLPassB4.1), were analyzed. Sequencing of the genes encoding for gB, gH and gD, revealed mutations in each of them. By means of a robust infection-free, transfection-based cell-cell fusion assay (paper I), we identified two amino acid substitutions in the gL-binding domain I of gHB4.1 (L70P, W103R) as sufficient to compensate for lack of gL. Two mutations in gB (G672R, ÎK883) were found to enhance fusogenicity, probably by lowering the energy, required for gB refolding from pre- to postfusion conformation. Coexpression of gHB4.1 and gBB4.1 led to an excess fusion, which was completely suppressed by gDB4.1 in the fusion assays. This was surprising since PrV gD is normally not required for in vitro fusion or direct viral cell-to-cell spread, clearly separating this process from fusion during entry, for which PrV gD is essential. The fusion inhibiting effect of gDB4.1 could be attributed to a single point mutation resulting in an amino acid substitution within the ectodomain (A106V). In conclusion, these results indicated that gL is not central to the fusion process, as its function can be compensated for. As found so far, gL-independent infectivity can be realized by compensatory mutations in gH (as in PrV-ÎgLPass) or in gH plus gB (as in PrV-ÎgLPassB4.1). Excessive fusion induced by gHB4.1 and gBB4.1 was counter-regulated by gDB4.1, indicating that the interplay between these proteins is precisely regulated and further implies that gL and gD, despite being not absolutely essential for the fusion process, have important regulatory functions on gH and/or gB.
Both PrV-ÎgLPass mutants had acquired compensatory mutations in gH affecting the predicted gL-binding domain I in gH. By construction of an artificial gH32/98, which lacked the predicted gL-binding domain and was similar to the recently crystallized gH-core fragment present in the gDgH hybrid protein, we identified the N-terminal part of PrV gH as essential for gH function during fusion (paper III). gH32/98 was unable to promote fusion of wild-type gB in fusion assays and led to a total loss of function in the viral context. These results indicated that the gD moiety, present in gDgH, is critical for proper function of the gH-core fragment. We hypothesize that the gD moiety may adopt a stabilizing or modulating influence on the gH structure, which is normally executed by gL and important for interaction of gH with wild-type gB. Remarkably, substitution of wild-type gB by gBB4.1 rescued function of gH32/98 in the cellular and viral contexts. These findings suggest that gBB4.1 has been selected for interaction with âgL-lessâ gH. In conclusion, these results demonstrated that gL and the gL-binding domain are not strictly required for membrane fusion during virus entry and spread but that compensatory mutations must be present in gB to restore a fully functional fusion machinery. These results strongly support the notion of a functional gH-gB interaction as a prerequisite for membrane fusion.
In addition to the N-terminal domain, we identified the transmembrane domain of PrV gH as an essential component of the fusion machinery, while the cytoplasmic domain was demonstrated to play a modulatory but nonessential role (paper IV). Whereas truncation or substitution of the PrV gH TMD by a gpi-anchor or the analogous sequence from PrV gD rendered gH non-functional, the HSV-1 gH TMD was found to functionally substitute for the PrV gH TMD in cell-cell fusion and complementation assays. Since residues in the TMD which are conserved between HSV and PrV gH but absent in PrV gD, are placed on one face of an α-helical wheel plot, we hypothesize that the gH TMD has an intrinsic property to interact with membrane components such as lipids or other molecules as a requirement for promoting membrane fusion.
In a final study focusing on the function of gH, we identified the N-glycosylation sites utilized by PrV gH, and determined their individual role in viral infection (paper V). PrV gH was found to be modified by N-glycans at five potential glycosylation sites. N-glycans at PrV specific N77 and the highly conserved site N627 were found to be critical for efficient membrane fusion in the fusion assays, and during viral entry and cell-to-cell spread. N627 was further shown to be crucial for proper gH transport and maturation. In contrast, inactivation of N604, conserved in the Varicellovirus genus, enhanced in vitro fusion activity and viral cell-to-cell spread. These findings demonstrated a role of the N-glycans in proper localization and function of PrV gH.
The virosphere comprises all known and unknown viruses in our ecosystems. Advanced sequencing technologies in combination with metagenomic analysis have become a key tool for exploring this global diversity of viruses. However, discovery of novel viruses and comparative analyses are often based on small sequence fragments or lack biological context, which restricts a proper classification. In this study advanced genomic methods were used that included comprehensive knowledge of viral genomes along with supporting biological metadata in order to identify and classify viruses at different levels of genetic relationships. In a first example, the genetic background of vaccine-induced rabies cases was revealed by analyzing and comparing the genetic diversity of viral populations. Furthermore, the fundament for a taxonomic reclassification of orthopoxviruses was established on basis of a wide scale genomic analysis. In addition, novel neurotropic mamastroviruses from sheep and cattle were classified as members of a single species that provided evidence of interspecies transmission. Finally, two putative novel species of alphaherpesviruses and orthopoxviruses were identified. These examples are based on field cases that provide substantial corresponding clinical metadata and information of host-pathogen interactions. The analyses, therefore, puts taxonomic classification into biological and epidemiological context, rather than addressing generic phylogenetic relationships. Furthermore, the presented work demonstrates that a universal approach for virus classification is neither feasible nor reasonable as analyses must be adjusted the nature of the addressed virus. All results with impact on the current taxonomic classification will be or are already reported to the International Committee on Taxonomy of Viruses. In conclusion, this thesis contributed to the classification concepts of viruses and expanded the knowledge of virosphere diversity.
