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Burkholderia pseudomallei ist ein gram-negatives Stäbchenbakterium, das in tropischen und subtropischen Gebieten endemisch ist. Bedeutung erlangte das Bakterium als Modellorganismus für intrazelluläres Überleben. Als solches ist B. pseudomallei in der Lage in Wirtszellen einzudringen, sich aus dem Phagolysosom zu befreien, im Zytosol zu replizieren, Aktinschweife zu induzieren und sich von Zelle zu Zelle auszubreiten. B. pseudomallei ist der Verursacher der Melioidose, einer Erkrankung mit sehr unterschiedlichen klinischen Verläufen. Sowohl schwere, septische Formen mit hoher Mortalität aber auch milde chronische Manifestationen treten auf. Trotz zunehmender Beachtung in der Öffentlichkeit sind die molekularen Details seiner Virulenz weitestgehend unverstanden. Deswegen beschäftigt sich diese Forschungsarbeit mit der Identifizierung und Charakterisierung von neuen Virulenzfaktoren und -mechanismen bei B. pseudomallei. Dazu wurden mittels Tn5-Transposonmutagenese 2344 Mutanten hergestellt und auf ihre Fähigkeit Plaques in einem Agarose-überschichteten Zellmonolayer zu induzieren gescreent. Mutanten mit Defekten in Genen, die in den intrazellulären Lebenszyklus involviert sind, bilden weniger, kleinere oder keine Plaques im Vergleich zum Wildtyp. Insgesamt 44 Tn5-Transposonmutanten fielen im Screening durch eine veränderte Plaquebildung auf. Durch molekularbiologische Methoden wurden die Transposoninsertionsstellen ermittelt. Es lagen Defekte in Genen vor, die für Stoffwechselproteine, Strukturkomponenten oder hypothetische Proteinen kodieren. Weiterführend wurden die Mutanten auf ihre intrazelluläre Invasion und Replikation in Epithelzellen sowie auf ihre Aktinschweifbildung untersucht. Bei insgesamt vierzehn Mutanten konnte nach intranasaler Infektion eine starke Attenuierung in der Maus nachgewiesen werden, darunter beispielsweise eine Mutante mit einem Defekt in BPSL0918, einer Peptidyl-Proly-cis-trans-Isomerase und fünf Mutanten mit Defekten in Genen unbekannter Funktion. Um polare Effekte auszuschließen, wurde die Komplementation mit dem mini-Tn7-System für diese Tn5-Mutanten etabliert und exemplarisch an der BPSL0918-Mutante durchgeführt. Diese Forschungsarbeit zeigt, dass es möglich ist mit den hier genutzten Methoden Tn5-Transposonmutagenese und anschließendem Plaquescreening neue Virulenzgene zu identifizieren, die essentielle Funktionen im intrazellulären Überleben von B. pseudomallei übernehmen. Die weitere Charakterisierung dieser Gene kann Hinweise darauf geben, mit welchen Strategien das Pathogen sich im menschlichen Körper etabliert, ausbreitet und die Wirtsabwehr außer Kraft setzt.