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Zerebrale kavernöse Malformationen (CCMs) sind Gefäßfehlbildungen im Gehirn oder Rückenmark und können sich klinisch aufgrund einer erhöhten Blutungsbereitschaft mit Kopfschmerzen, Gefühls- und Sprachstörungen bis hin zu Krampfanfällen äußern. Sie treten sporadisch oder im Rahmen einer autosomal-dominant erblichen Form auf. Kausale Sequenzveränderungen sind dabei in den drei Genen CCM1, CCM2 und CCM3 bekannt. Die Detektionsrate für pathogene Varianten ist mit bis zu 60 % für sporadische Fälle und mit weit über 90 % für familiäre Fälle sehr hoch. Während Genpanel-Analysen sehr verlässlich Einzelnukleotidveränderungen, kleine Insertions- und Deletionsvarianten sowie Kopienzahlveränderungen detektieren können, werden komplexe Strukturvarianten oder Veränderungen in nicht-kodierenden Regionen kaum erfasst. Diese rücken jedoch für die bisher genetisch unaufgeklärten Fälle immer mehr in den Fokus des Interesses. Diese Arbeit adressiert daher zum einen die Identifizierung neuer Strukturvarianten und deren funktionale Interpretation im Kontext der CCM-Erkrankung.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist der erstmalige Nachweis einer interchromosomalen Insertion bei einem CCM-Patienten gelungen. Die unbalancierte Insertion genomischen Materials von Chromosom 1 in die kodierende Region des CCM2-Gens konnte durch die Verbindung von bioinformatischen Auswertestrategien der Next Generation Sequencing-Genpanel-Daten, molekularzytogenetischen Analysen und einer molekularen Bruchpunktkartierung genau charakterisiert werden. Die Identifikation einer weiteren Strukturvariante, einer Deletion des Transkriptionsstarts von CCM1, verdeutlichte die Herausforderungen bei der Bewertung von Veränderungen in nicht-kodierenden Genbereichen. Für eine eindeutige Klassifikation der Variante wurden daher funktionale Analysen durchgeführt, die auf einer CRISPR/Cas9-vermittelten Nachbildung der Deletion in iPSCs und der anschließenden Differenzierung in Endothelzellen beruhte. Damit konnte gezeigt werden, dass die Deletion zu einem Verlust der CCM1 mRNA- und Proteinexpression führt. Zudem wurde in den differenzierten Endothelzellen eine für die CCM-Pathogenese charakteristische Deregulation von KLF2, THBS1, NOS3 und HEY2 beobachtet. Schließlich war es auf Basis dieser in vitro-Analysen möglich, die Variante entsprechend den ACMG-Richtlinien als wahrscheinlich pathogen zu bewerten und somit die molekulare CCM-Diagnose zu sichern.
Die Verbindung des CRISPR/Cas9-Systems mit iPSCs ist nicht nur für die Variantenbewertung von großem Nutzen, sondern bietet auch das Potential zum besseren Verständnis von Krankheitsmechanismen. Ein weiterer Fokus der vorliegenden Arbeit lag daher auf der Etablierung und Verwendung iPSC-basierter Zellkulturmodelle für die CCM-Modellierung. Zunächst ist es gelungen, mehrere iPSC-Linien mit einer kompletten CRISPR/Cas9-vermittelten CCM1-, CCM2- oder CCM3-Inaktivierung zu generieren. Diese wurden anschließend für die Differenzierung in hBMEC-ähnliche Zellen und innovative dreidimensionale vaskuläre Organoide verwendet. In diesen Systemen konnte beispielsweise eindrücklich eine tumorähnliche Proliferation CCM3-defizienter Endothelzellen nachvollzogen werden, die nur in Kontakt mit Wildtyp-Zellen auftrat. RNA-Sequenzierungen in einem CCM1-basierten Knockout-Modell konnten darüber hinaus die Rolle von CCM1 als Endothel-spezifisches Suppressorgen stärken. Die im Rahmen der Arbeit etablierten Systeme werden zukünftig für weitere Fragestellungen der CCM-Pathogenese wie der endothelialen Barrierestörung eingesetzt und stellen darüber hinaus sehr gut geeignete Plattformen für die effektive Entwicklung dringend benötigter therapeutischer Ansätze dar.