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Die Wurzeln der meisten Pflanzenarten leben in enger Assoziation mit Mykorrhizapilzen. Insbesondere die arbuskuläre Mykorrhiza (AM) ist weltweit bei mehr als 80 % aller Pflanzen- und Kulturarten von Bedeutung. Es ist eine Symbiose, bei der die Wirtspflanze den Pilz mit organischem Material (Kohlenhydraten) versorgt, während im Gegenzug die Hyphen des Pilzes feinste Bodenporen erschließen und dadurch den Einzugsbereich der Wurzeln für Wasser und Nährstoffe (z.B. Phosphat, Mikronährstoffe) vergrößern. Phosphat und andere Nährstoffe werden in den Hyphen angereichert und an die Wirtspflanze abgegeben, was zu deren besserer Nährstoffversorgung beiträgt. In der vorliegenden Arbeit wurde der von der Firma AMykor in vivo in großen Mengen reproduzierte G. intraradices-Stamm molekularbiologisch eingeordnet und mit anderen Isolaten und kommerziellen Produkten verglichen. Zielregion der verwendeten Primer war die ribosomale DNA (rDNA), welche für die RNA der Ribosomen kodiert. Für die Vergleiche wurde der Bereich der hochvariablen ITS-Region (internal transcribed spacer) genutzt. Dieser „in vivo“ G. intraradices-Stamm konnte erfolgreich in eine monoxenische (in vitro) Kultur überführt werden. Die vereinzelten und sterilisierten AMykor–G. intraradices Sporen wurden zusammen mit sterilen, mit Hilfe von Agrobacterium rhizogenes transfizierten, Karottenwurzeln (Daucus carrota L. Belgien) auf Nährmedium kultiviert. Außerdem konnten noch drei weitere Wurzelkulturen etabliert werden, Fragaria x Ananassa (Duch.) (Gatersleben), Helianthus annuus L. (Gatersleben) und Daucus carota (Gatersleben). Im nächsten Schritt konnten eine asymbiotische, eine symbiotische und zwei subtraktive cDNA-Banken aus asymbiotischem und symbiotischem Myzel (Hyphen und Sporen) erstellt werden. Mit Hilfe der subtraktiven cDNA-Banken lassen sich G. intraradices-Gene isolieren, die speziell im asymbiotischen bzw. im symbiotischen Myzel exprimiert werden. Es konnten Expressed Sequence Tags (EST) identifiziert werden, deren putative Genprodukte eine Rolle bei der Transkription und Translation, dem Zellwachstum und der Entwicklung, dem Metabolismus und der Signaltransduktion spielen. Allerdings zeigten diese Homologievergleiche auch, dass ein Drittel der EST keine oder sehr geringe Ähnlichkeit zu bekannten Genen aufweist und ihre Funktion damit unbekannt bleibt. Sowohl asymbiotisches, präsymbiotisches und symbiotisches Hyphenmaterial (ERM) als auch mit G. intraradices infiziertes Wurzelmaterial dienten als Ausgangsmaterial für die Expressionsanalyse der isolierten Gene. Diese Expressionsanalysen zeigten, dass einige dieser putativen Gene nur im symbiotischen Stadium exprimiert werden. Zum Beispiel konnte ein EST mit Homologie zu einer Diacylglycerol-O-acyltransferase von Umbelopsis ramanniana isoliert werden. Mittels RT-PCR konnte eine Expression nur im ERM nicht aber im asymbiotischen, präsymbiotischen und im symbiotischen Stadium (Sporen, Hyphen und IRM) nachgewiesen werden. Dieses Enzym ist wahrscheinlich auch bei G. intraradices am Lipid-Stoffwechsel beteiligt und katalysiert die Bildung von Triacylglycerin aus Diacylglycerin. Auch ein EST, welches Homologie zu einer Fettsäuredioxygenase ppoA von Aspergillus aufweist, konnte mit Hilfe von Datenbankvergleichen gefunden werden. Dieses Gen ist in die Biosynthese des, von der Linolsäure abgeleiteten Oxylipin psiBα involviert und damit in die Entwicklung des anamorphen und telomorphen Stadiums, wobei eine Deletion des ppoA-Genes zu einer Reduktion der asexuellen und sexuellen Sporen führt. Von G. intraradices und allen anderen Glomus Spezies wurde noch kein sexuelles Stadium beschrieben. So könnte die Fettsäuredioxygenase hier an der Sporulation beteiligt sein. Da die Expression nur im ERM nachgewiesen werden konnte, wäre dies durchaus denkbar. Für das putative G. intraradices Fumaratreduktase-Gen (Gint(Fr)) konnte das vollständige ORF isoliert werden. Die Gint(Fr)-cDNA umfasst ein 1533 Bp großes offenes Leseraster, das 511 Aminosäuren kodiert. Gint(Fr) weist Homologie zu dem OSM1 Gen von Saccharomyces cerevisiae auf und katalysiert die Reduktion von Fumarat zu Succinat. Nur eine EST-Sequenz konnte als vollständiges ORF aus der cDNA-Bank isoliert werden. Die full-length Gint(Cbp)-cDNA umfasst ein 297 Bp großes offenes Leseraster, das 99 Aminosäuren kodiert. Ein NCBI-Datenbank-Vergleich zeigte, dass es sich um ein Putativ-Cruciform-DNA-binde-Protein mit Ähnlichkeit zu dem HMP1 Gen von Ustilago maydis handelt. Dieses Protein ist in die strukturelle Aufrechterhaltung der DNA involviert. Einige der hier isolierten Gene wurden als Sonden für eine Filterhybridisierung eingesetzt. Hier war es möglich, mykorrhizierte (mit G. intraradices) von nichtmykorrhizierten Pflanzen zu unterscheiden. Nun kann versucht werden, über Quantifizierung der in einer Probe enthaltenen Mykorrhizapilz-DNA eine Aussage über den Mykorrhizierungsgrad der Wurzel zu treffen und den Test in der Qualitätskontrolle und –sicherung einzusetzen.
Genome-wide responses and regulatory mechanisms to thiol-specific electrophiles in Bacillus subtilis
(2008)
The soil-dwelling bacterium Bacillus subtilis is regarded as model organism for functional genomic research of low GC Gram-positive bacteria. Recently, the group of Haike Antelmann has monitored the expression profile of B. subtilis after exposure to phenolic compounds. Interestingly, proteome and transcriptome analyses showed a strong overlap in the expression profile after exposure to catechol, MHQ that auto-oxidized to quinones and the thiol-reactive electrophile diamide. The response to electrophilic quinones and diamide is governed by a complex network of transcription factors, including Spx, CtsR, PerR, CymR and the novel MarR-type repressors MhqR (YkvE), YodB and YvaP. The regulatory mechanisms of these novel thiol-stress sensors YodB and YvaP are studied as part of this thesis in collaboration with the group of Peter Zuber (Oregon). YodB negatively regulates the expression of the nitroreductase YodC and the azoreductase YocJ (AzoR1) after exposure to electrophilic quinones and diamide. The azoreductase AzoR1 is a paralog of AzoR2 that is under control of MhqR. Both paralogous azoreductases (AzoR1 and AzoR2) have common functions in quinone and azo-compound reduction to protect cells against the thiol reactivity of electrophiles. DNA binding activity of YodB is directly inhibited by thiol-reactive compounds in vitro. Mass spectrometry approaches suggested that YodB is regulated by a thiol-(S)-alkylation mechanism in response to quinones. Mutational analyses revealed that the conserved Cys6 residue of YodB is required for optimal repression in vivo and in vitro. Recent studies further suggest that YodB is redox-regulated by intersubunit disulfide formation in vivo by diamide. In addition to the azoreductases, several thiol-dependent dioxygenases confer resistance to quinones. In collaboration with Kazuo Kobayashi (Nara), the YodB-paralogous MarR/DUF24-family regulator, YvaP was identified as repressor of the catechol-2,3-dioxygenase encoding yfiDE (catDE) operon. DNA binding activity of YvaP was also directly inhibited by quinones and diamide in vitro indicating that also YvaP is regulated via post-translational modifications. Mutational analyses showed that the conserved Cys7 is essential for YvaP regulation in vivo and serves as sensor for thiol-reactive compounds. In addition, also the basic amino acids K19, R20 are essential for YvaP repression in vivo as well as conserved basic arginine and lysine residues located in the DNA binding helix-turn-helix (HTH) motif. Non-reducing PAGE analysis suggests the formation of an intersubunit disulfide bond in a YvaP dimer upon treatment with quinones and diamide in vitro. Besides quinones, also aldehydes are electrophilic compounds which react via the thiol-(S)-alkylation reaction with thiols. Thus, we were also interested in the response of B. subtilis to the toxic electrophiles methylglyoxal (MG) and formaldehyde (FA). We analyzed the changes in the transcriptome and proteome of B. subtilis after exposure to MG and FA. Like quinone compounds, both MG and FA induce the thiol-specific stress response. Metabolomic approaches confirmed that these reactive aldehydes deplete the cellular thiol pool and thus act like quinones as another class of thiol-reactive electrophiles. Additionally, MG and FA also triggered responses to overcome DNA damage. Our studies further revealed the specific induction of two FA detoxification pathways regulated by the MarR/DUF24 family repressor HxlR, and the novel MerR/NmlR-type regulator YraB (AdhR). HxlR positively regulates the hxlAB operon encoding the ribulose monophosphate pathway. AdhR positively regulates an adhA-yraA operon that encodes the thiol-dependent formaldehyde dehydrogenase (AdhA) and the DJ1/PfpI-like cysteine proteinase (YraA), and the yraC gene that encodes a γ-carboxymuconolactone decarboxylase. Thus, the AdhR regulon is involved in the detoxification of FA to formate via the formaldehyde dehydrogenase AdhA which catalyzes the cleavage of S-hydroxymethylcysteine adducts. In addition, the cysteine proteinase YraA could be involved in the degradation of S-hydroxymethylcysteine-modified and damaged protein thiols. In collaboration with the group of John Helmann (Ithaca), it was shown that AdhR binds in vitro to a conserved inverted repeat between the -10 and -35 promoter elements upstream of adhA, yraB and yraC. In addition, we showed that the conserved Cys52 of AdhR is essential for aldehyde sensing and activation of adhA-yraA transcription in vivo. Thus, we speculate that redox regulation of AdhR involves thiol-(S)-alkylation of this Cys52 residue by aldehydes as another novel mechanism of bacterial physiology.