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Durch zymografische Untersuchungen und Massenspektrometrie (MS) wurden neun Proteasen vom Subtilisin-Typ im Wurzelexsudat von Nicotiana tabacum identifiziert. Ein Peptid-Antikörper wurde produziert, der die affinitätschromatografische Anreicherung einer tobacco root exuded subtilase (TREXS, XP_016501597.1) und zweier Isoformen sowie eines Peroxidase-artigen und eines SERK2-artigen Proteins ermöglichte. Basierend auf dem Subtilase-EST, der in der MS identifiziert worden war, wurde die full-length cDNA von TREXS durch 5'RACE und 3'RACE sequenziert und die gDNA kloniert. Das intronfreie TREXS-Gen codiert eine 756 Aminosäuren lange Subtilase mit Signalpeptid, I9-Inhibitordomäne, PA- und Fn-III-artiger Domäne. Der Nachweis von TREXS-mRNA in Blattgewebe zeigte, dass TREXS nicht exklusiv auf Wurzeln beschränkt ist. Phylogenetische Analysen zeigten, dass SDD1 die ähnlichste Subtilase aus A. thaliana zu TREXS ist. Mit großer Wahrscheinlichkeit ist TREXS jedoch nicht das Ortholog zu SDD1, weil zum einen strukturähnlichere Subtilasen zu SDD1 in Tabak existieren und zum anderen SDD1 an der Ausprägung von Stomata in der Blattepidermis beteiligt ist, TREXS hingegen im Wurzelexsudat vorkommt. Das
MS-identifizierte SERK2-artige Protein, das bei der Peptid-Antikörper-Affinitätschromatografie zusammen mit TREXS angereichert wurde, ist Kandidat als Substrat für TREXS, weil es potenziell durch IgG–TREXS–SERK2-like-Interaktion co-angereinigt wurde, die in-silico docking-Vorhersagen zwischen den modellierten Molekülen von TREXS und SERK2-like einen proteolytisch relevanten Bindungszustand vorhersagt und es strukturelle Ähnlichkeit mit LRP, einem bekannten Substrat der Subtilase P69C, hat. Die transiente Expression rekombinanter TREXS in N. benthamiana war möglich, zeigte sich jedoch kritisch gegenüber C- und N-terminal fusionierten Anhängen: Transiente Transformation mit TREXS oder TREXS:Strep-tag führte zu proteolytisch aktivem Protein. Jedoch war der C-terminale Strep-tag nicht funktionell. Längere C-terminale Anhänge und auch TREXS-Mutanten mit inaktiviertem katalytischen Zentrum erbrachten kein Genprodukt. C-terminales GFP erbrachte – auch bei mutiertem katalytischen Zentrum – stets nur den GFP-Anteil des Fusionsproteins.
Histondeacetylaseinhibitoren stellen eine neue Klasse von Substanzen für die Krebsbehandlung dar und besitzen ein vielversprechendes therapeutisches Potential. Ihre antineoplastische Wirkung wird durch die Acetylierung von Histonen und Nicht-Histonproteinen hervorgerufen und bewirkt über die Aktivierung von Tumorsupressorgenen und Genen der Zellzyklusregulation präferenziell in malignen Zellen Zellzyklusarrest, terminale Zelldifferenzierung und Apoptose. Mit der Substanz Vorinostat ist in den USA bereits der erste Histondeacetylaseinhibitor für die Therapie des kutanen T-Zell-Lymphoms zugelassen, während weitere Substanzen im Rahmen von klinischen Studien geprüft werden. Die genauen Wirkmechanismen der Histondeacetylaseinhibitoren sind jedoch bislang nicht vollständig aufgeklärt. Es ist insbesondere unklar, welche Bedeutung Caspasen und andere Proteasen in diesem Zusammenhang für den Ablauf des Zelltodes haben. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Rolle verschiedener Proteasen für den Histondeacetylaseinhibitor-vermittelten Zelltod mit Hilfe spezifischer Inhibitoren analysiert. Die Experimente wurden an den Ovarialkarzinomzelllinien OVCAR-3 und SK-OV-3, der Mammakarzinomzelllinie MCF-7 und der kindlichen Medulloblastomzellinie DAOY durchgeführt. Dabei zeigte die Inhibition von Calpainen oder Cathepsinen (Cysteinproteasen) keine schützende Wirkung. Jedoch bewirkten Vorbehandlungen mit dem Caspasehemmstoff z-VAD-fmk und mit dem Serinproteasehemmstoff AEBSF protektive Effekte. Zunächst wurden für den Hemmstoff z-VAD-fmk die ausgeprägteren Effekte vermutet, da dieser mit den Caspasen die hauptverantwortlichen Proteasen der Apoptose direkt hemmt. Erstaunlicherweise war in den Experimenten jedoch zu beobachten, dass die Schutzwirkung von AEBSF bereits ab einer Behandlungsdauer von circa 48–72 Stunden stärker ausgeprägt war als diejenige von z-VAD-fmk und dass sie über einen längeren Zeitraum anhielt. Weitere Versuche zum Serinprotease-abhängigen Zelltod zeigten, dass die verantwortliche Serinrotease am mitochondrialen Weg der Apoptose beteiligt ist und im Proteasenetzwerk der Apoptose möglicherweise parallel oder übergeordnet zu den Caspasen agiert. Für die mitochondriale Serinprotease HtrA2/Omi wird eine wichtige Rolle beim Caspase-unabhängigen Zelltod diskutiert. Um eine mögliche Beteiligung nachzuweisen wurde diese Protease durch den Hemmstoff UCF-101 inhibiert. Dies führte jedoch zu keinen protektiven Effekten. Mit den spezifischen Hemmstoffen TPCK und TLCK wurden ebenso trypsinähnliche beziehungsweise chymotrypsinartige Serinproteasen gezielt gehemmt, ohne jedoch protektive Effekte hervorzurufen, so dass die Serinprotease, auf der die Effekte beruhen, zwar durch AEBSF gehemmt wurde, jedoch durch den Einsatz weiterer Inhibitoren nicht näher spezifiziert werden konnte. Für den Zelluntergang bei der Behandlung mit Histondeacetylaseinhibitoren und unter Proteasehemmung sind auch alternative apoptotische Mechanismen und Arten des Zelltodes beschrieben. Bei der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung sowohl bei der Behandlung mit Vorinostat als auch unter Vorbehandlung mit den Proteasehemmstoffen z-VAD-fmk und AEBSF zeigte sich, dass der Zelltod morphologisch den Kriterien der Apoptose entsprach und kein nekrotischer Zelltod auftrat. Über die Untersuchung des serinproteaseabhängen Zelltodes bei der Behandlung mit Vorinostat hinaus, wurden weitere Histondeacetylaseinhibitoren und Zytostatika auf protektive Effekte einer Vorbehandlung mit AEBSF analysiert. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Serinproteaseabhängigkeit durchaus wirkstoffabhängig ist. So konnte für Vorinostat und Trichostatin A aus der Gruppe der Hydroxamsäuren der Histondeacetylaseinhibitoren eine Serinproteaseabhängigkeit nachgeweisen werden. Ebenso war dies der Fall bei den Zytostatika Cisplatin (Platinderivat) und Etoposid (Podophyllotoxin). Hingegen kam es bei der Behandlung mit den Histondeacetylaseinhibitoren MS-275 (Benzamid) und Natriumbutyrat (kurzkettige Fettsäure) sowie mit Paclitaxel (Taxan) zu keiner Protektion und Reduktion des Zelltods durch die Vorbehandlung mit AEBSF. Besonders interessant ist es, dass es innerhalb der Histondeacetylaseinhibitoren große Unterschiede hinsichtlich der Serinproteaseabhängigkeit gibt. Offensichtlich existieren mechanistisch deutliche Unterschiede zwischen den Substanzen, welche diese Unterschiede bedingen. Andererseits spricht die Tatsache, dass diese Effekte stoffklassenübergreifend auch bei der Verwendung von Zytostatika unterschiedlicher Wirkstoffklassen beobachtet werden können dafür, dass Serinproteasen in der Tat eine wichtige Rolle im Proteasenetzwerk der Apoptose spielen und somit für das Verständnis der Wirkweise zytotoxischer Behandlungen von großem Interesse sind.