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Institute
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Publisher
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- Nature Publishing Group (3)
- S. Karger AG (3)
- Wiley (3)
- American Society for Microbiology (ASM) (1)
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- Elsevier (1)
- Springer Nature (1)
Until today, more than 100 years after its first description in Italy, the highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) has not lost its fearsome character for wild birds, poultry and humans. On the contrary, the number of outbreaks with high casualty rates in wild birds and poultry has multiplied in recent years and cases of zoonotic infections are also increasingly reported from HPAI endemic areas. The epidemiology of these infections is complex and also involves surface water and possibly sediments of shallow standing waters, which could play a role as a vector medium and/or virus reservoir. The goal of this project was to expand current knowledge of the influence of water on the spread of AIV. As part of this project, we were able to ...
1. ...improve AIV detection methods using real time RT-PCR in terms of sensitivity and breadth of viruses detected. In addition, we succeeded in economizing the procedure so that fewer resources are required and results are obtained faster (publication I: [173]).
2. ...develop an ultrafiltration-based enrichment method for AIV from surface water and evaluate it with field samples from HPAI outbreak areas in wild bird habitats (Wadden Sea coast of Schleswig-Holstein) and previously unaffected regions (Antarctic Weddell Sea) (publication II: [174]). Furthermore, protocols for testing different environmental sample matrices for AIV screening were tested and compared to results of passive monitoring by dabbing diseased or dead wild birds. AIV was detected in more than half (61%) of 44 water samples. We received additional sediment samples from 36 of the 44 water samples. In 18 of 36 of the sediments tested, as well as in 4.16% of 1705 fecal samples tested AIV was detected. However, the studies of the environmental samples mostly yielded only generic AIV detections, with viral loads in the range of the detection limit. This massively hampered further investigations for sub- and pathotyping. In contrast, 79.41% of 68 samples from passive monitoring showed high to very high HPAIV viral loads which also allowed sub- and pathotyping.
3. ...demonstrate in animal experiments that even very low titers (0.1 TCID50 ml-1) of HPAI viral infectivity in water can induce productive infection in susceptible but clinically largely resistant mallard ducks (publication III: [175]). Furthermore, we were able to develop evidence that there is a difference in virus spread that depends on the type of (contaminated) water source. This means that infections on poultry farms with inverted or nipple drinkers may follow a different course than infections in the wild, which are mediated via larger surface waters.
Overall, the results of this project highlight the important role of surface and drinking water, as well as aquatic sediments, in the spread of AIV. The methods developed here for AIV detection extend the possibilities for surveillance of AIV infections; however, passive remains superior to active surveillance of HPAIV infections in several aspects. Examination of various environmental samples did not yield a significant advantage in terms of an early warning system that would indicate the presence or spread of HPAIV in wild bird habitats prior to the occurrence of lethal infections in wild birds.
Bacillus subtilis has been extensively used as a microbial cell factory for industrial enzymes due to its excellent capacities for protein secretion and large-scale fermentation. This bacterium is also an attractive host for biopharmaceutical production. However, the secretion potential of this organism is not fully utilized yet, mostly due to a limited understanding of critical rearrangements in the membrane proteome upon high-level protein secretion. Recently, it was shown that bottlenecks in heterologous protein secretion can be resolved by genome minimization. Here, we present for the first time absolute membrane protein concentrations of a genome-reduced B. subtilis strain (“midiBacillus”) expressing the immunodominant Staphylococcus aureus antigen A (IsaA). We quantitatively characterize the membrane proteome adaptation of midiBacillus during production stress on the level of molecules per cell for more than 400 membrane proteins, including determination of protein concentrations for ∼61% of the predicted transporters. We demonstrate that ∼30% of proteins with unknown functions display a significant increase in abundance, confirming the crucial role of membrane proteins in vital biological processes. In addition, our results show an increase of proteins dedicated to translational processes in response to IsaA induction. For the first time reported, we provide accumulation rates of a heterologous protein, demonstrating that midiBacillus secretes 2.41 molecules of IsaA per minute. Despite the successful secretion of this protein, it was found that there is still some IsaA accumulation occurring in the cytosol and membrane fraction, leading to a severe secretion stress response, and a clear adjustment of the cell’s array of transporters. This quantitative dataset offers unprecedented insights into bioproduction stress responses in a synthetic microbial cell.
Abbau von Phenylalkanen und weiteren alkylsubstituierten Aromaten durch Hefen und filamentöse Pilze
(2009)
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war es, den Abbau von Phenylalkanen durch eukaryotische Mikroorganismen, insbesondere Pilze, zu untersuchen. Im Focus der Dissertation lagen dabei Untersuchungen mit der Hefe Trichosporon asahii SBUG-Y 833. Des Weiteren erfolgten Analysen mit Candida maltosa SBUG Y 700, Trichosporon mucoides SBUG Y 801 und neun filamentösen Pilzen der Gattungen Cunninghamella, Fusarium, Lecanicillium, Mucor, Penicillium, Sporothrix und Umbelopsis. Als Substrate wurden Phenylalkane mit fünf bis zehn und zwölf Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette eingesetzt. Zur Charakterisierung der Abbau- und Transformationsleistungen der Hefen, insbesondere von T. asahii, erfolgten darüber hinaus Biotransformationsexperimente mit Phenylalkan-Derivaten und aromatischen Säuren. Candida maltosa 1. Mit der Hefe C. maltosa, die zur Assimilation von n Alkanen befähigt ist, konnte ein Wachstum mit Phenylalkanen (0,5 % [v/v]), deren Alkylseitenkette mindestens 8 Kohlenstoff-Atome aufwiesen, ermittelt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ungeradzahligen Phenylalkanen (Phenylheptan und Phenylnonan) konnte eine kontinuierliche extrazelluläre Akkumulation von Benzoesäure nachgewiesen werden. Phenylalkane mit einer geraden Anzahl von Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette (Phenylhexan, Phenyloctan, Phenyldecan und Phenyldodecan) werden via Phenylbuttersäure und 4 Phenyl 3-butensäure zu Phenylessigsäure abgebaut, die ebenso wie Benzoesäure extrazellulär angereichert wird. 3. C. maltosa ist nicht zur weiteren Oxidation von Benzoesäure und Phenylessigsäure befähigt und akkumuliert daher diese Säuren während des Phenylalkan-Abbaus als dead-end-Produkte. Trichosporon asahii 1. In Wachstumsexperimenten mit T. asahii konnte gezeigt werden, dass die Hefe n Alkane (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) und Phenylalkane mit mindestens sieben Kohlenstoff-Atomen in der Alkylseitenkette assimilieren kann. 2. In Biotransformationsexperimenten mit ruhenden Zellen und Phenylheptan konnten anhand von HPLC-, GC-MS- und z. T. NMR-Analysen neun Produkte identifiziert werden: 7 Phenylheptansäure, 7-(2 Hydroxyphenyl)-heptansäure, 3 (2 Hydroxyphenyl) propionsäure, Benzoesäure, 3,4 Dihydroxybenzoesäure, Cumarin, 4 Hydroxycumarin, 4,6 Dihydroxycumarin und 4,8 Dihydroxy-cumarin. 3. Die Bildung der Metaboliten 2 Hydroxyphenylheptansäure und 2 Hydroxyphenylpropionsäure sowie der Cumarine konnte erstmals durch die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit für den mikrobiellen Abbau von Phenylalkanen beschrieben werden. Die hydroxylierten Cumarine 4 Hydroxy-, 4,6 Dihydroxy- und 4,8 Dihydroxycumarin wurden bis Versuchende kontinuierlich im Inkubationsmedium akkumuliert, während die übrigen sechs Produkte nur zwischenzeitlich durch die Hefe ausgeschieden wurden. Die Inkubation von T. asahii mit Phenyloctan führte dagegen nur zum Nachweis der hydroxylierten Cumarine. In Biotransformationsexperimenten mit Phenylnonan, Phenyldecan und Phenyldodecan konnte als einziger Metabolit 4 Hydroxy-cumarin detektiert werden. Die für andere Hefen typischen Abbauprodukte wie Benzoesäure und Phenylessigsäure wurden durch diese Aromaten verwertende Hefe nicht akkumuliert. 4. Die Bildung von 4 Hydroxycumarin konnte auch in Biotransformationsexperimenten mit Phenylheptansäure, 2 Hydroxyphenyl-propionsäure, trans 2 Hydroxyzimtsäure sowie Cumarin nachgewiesen werden. Während die Transformation der zwei ortho-hydroxylierten Säuren in Ausbeuten von über 70 % 4 Hydroxycumarin innerhalb von 24 h resultierte, wurden nur 9,4 % der Phenylheptansäure und ca. 13 % des Cumarins in 4 Hydroxycumarin transformiert. 6. Im Hinblick auf die medizinische Bedeutung der Cumarine wurde die Bildung von Cumarinen aus den Präkursor-Stoffen 2,4 Dihydroxyphenylpropionsäure und 7 Hydroxycumarin durch T. asahii geprüft. Dabei konnte 4,7 Dihydroxycumarin während der Inkubation mit 2,4 Dihydroxyphenyl-propionsäure und 7 Hydroxycumarin nachgewiesen werden und zusätzlich 6,7 Dihydroxycumarin mit 7 Hydroxycumarin als Substrat. Eine 20-fache Steigerung der 6,7 Dihydroxycumarin-Konzentration wurde mit Zellen einer Phenol-Kultur im Vergleich zu Zellen, die mit Hefeextrakt kultiviert wurden, erreicht, was auf die Beteiligung einer induzierbaren Phenolhydroxylase hindeutet. 7. Unter Verwendung des Cytochrom P450-Inhibitors 1 Aminobenzotriazol konnte eine Beteiligung von Cytochrom-P450-Enzymen an der ortho-Hydroxylierung des Benzenrings von Phenylalkanen bzw. alkylsubstituierten aromatischen Säuren ermittelt werden. Diese Reaktion ist neben der Einführung einer Doppel-bindung in der Alkylseitenkette eine wesentliche Voraussetzung für die Bildung von Cumarinen. 8. Während der Inkubation von T. asahii mit dem Phenylheptan-Derivat Heptanophenon wurden primär Metaboliten detektiert, die am C1-Atom der Alkylseitenkette eine Hydroxy-Gruppe aufweisen und/oder subterminal am C4-, C5- und C6-Atom oxidiert sind. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte für Hefen erstmals eine subterminale Oxidation von gesättigten Alkylketten nachgewiesen werden. Trichosporon mucoides 1. In den Untersuchungen mit T. mucoides konnte gezeigt werden, dass die Hefe nicht zur Assimilation von n Alkanen (n Dodecan, n Tetradecan, n Hexadecan) befähigt ist. Die Kultivierung mit Phenylnonan und Phenyldecan führte zwar nur zu einer geringen, dennoch signifikanten Zunahme der Biomasse. 2. Obwohl T. mucoides keine n Alkane verwerten kann, wurden in Biotransformationsexperimenten mit Phenylalkanen Metaboliten detektiert, die nicht nur aus terminalen und ß Oxidationsreaktionen an der Alkylseitenkette hervorgegangen sind, sondern auch subterminalen und am Ring stattfindenden Reaktionen zugeschrieben werden konnten. Das Metabolitenspektrum, das in den Untersuchungen mit Phenylalkanen und aromatischen Säuren ermittelt wurde, glich im Allgemeinen dem von T. asahii. Filamentöse Pilze 1. Mit Ausnahme von Penicillium chrysogenum zeigten alle Stämme der getesteten filamentösen Pilze die Fähigkeit zum Wachstum mit Phenyldodecan. Eine besonders starke Zunahme der Biomasse war dabei mit Sporothrix nivea SBUG M 35 und Umbelopsis isabellina SBUG M 1145 zu verzeichnen. Phenylalkane mit kürzeren Alkylseitenketten konnten von den meisten der untersuchten Pilze kaum bzw. nicht als Wachstumssubstrate genutzt werden. 2. In Biotransformationsexperimenten mit C. elegans, M. hiemalis und U. isabellina konnten 5 neuartige Metaboliten identifiziert werden: Zimtaldehyd, Zimtalkohol, Phenylpropanol und Benzylalkohol (deren Bildung wird auf reduktive Reaktionen der entsprechenden Carbonsäuren zurückgeführt) sowie ein Glycinamid der Zimtsäure, das eine Art Konjugat darstellt. 4. Während der Inkubation der filamentösen Pilze Sp. nivea SBUG-M 25 und SBUG M 242 sowie C. elegans und U. isabellina mit Phenylheptan wurde – analog zu Versuchen mit T. asahii - auch 4 Hydroxycumarin als Metabolit nachgewiesen.
In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Interaktion der Rabiesvirus Polymerase L und des Hendravirus Matrixproteins M mit zellulären Proteinen und intrazellulären Strukturen durchgeführt. Mit ASS1 und DLC1 wurden zwei zelluläre Proteine identifiziert, die direkt oder indirekt mit der Rabiesvirus Polymerase L interagieren. Zellkulturuntersuchungen zum Einfluss von ASS1 auf die Rabiesvirus Replikation lieferten bisher keinen Hinweis auf eine Beeinflussung der Polymerasefunktionen und die Diskussion möglicher Mechanismen einer Interferenz mit der NO-Synthese in infizierten Organismen blieb spekulativ. Für DLC1 wurde erstmals gezeigt, dass das L Protein des Rabiesvirus ein Konsensusmotiv für die Bindung von DLC1 enthält und die Effizienz der viralen Primärtranskription durch die Anwesenheit dieses Motivs beeinflusst wird. Vergleichende Untersuchungen mit Virusmutanten, in denen das in L identifizierte Motiv und ein bereits beschriebenes DLC1-bindendes Motiv in P mutiert waren, zeigten, dass beide Motive in vergleichbarer Weise die virale Primärtranskription beeinflussen. Die Kombination entsprechender Mutationen hatte jedoch keinen additiven Effekt auf die Polymeraseaktivität. Für die Funktionalität des Rabiesvirus Polymerasekomplexes P/L im Rahmen der viralen Primärtranskription scheint eine Interaktion mit beiden Komponenten des Komplexes erforderlich zu sein. Quantitative Analysen zur Verteilung von in die Zelle eingedrungenen Viruspartikeln zeigten, dass eine Akkumulierung viraler Ribonukleoproteine (RNP) nur in Anwesenheit des DLC1 Motivs in P erfolgte, und dass dies unabhängig von Mutationen in L war. Dies deutete darauf hin, dass die P-abhängige Akkumulierung von RNPs in frühen Phasen der Virusinfektion und die P und L abhängige Steigerung der Primärtranskription zwei funktionell voneinander trennbare Prozesse sind. Neben der DLC1 abhängigen Regulation der viralen Primärtranskription zeigten Untersuchungen zur Regulation der DLC1 Mengen in virusinfizierten Zellkulturen, dass die zelluläre DLC1 Genexpression durch die Anwesenheit der DLC1 Motive in P und in L reguliert wird. Diese Erkenntnisse und neuere Erkenntnisse zur Autoregulation der DLC1 Genexpression zeigen, dass die Bindung von DLC1 an beide Proteine des P/L Polymerasekomplexes, sowie die Retention von DLC1 in viralen Inclusion Bodies vermutlich die Verfügbarkeit an freiem DLC1 limitiert, und damit eine DLC1 abhängige Inhibition des DLC1 Genexpression regulierenden Transkriptionsfaktors ASCIZ aufhebt. Inwieweit dieses Modell einer virusabhängigen DLC1 Regulation zutrifft, weitere über einen derartigen Mechanismus regulierte Zellgene betroffen sind und diese einen Einfluss auf die Virusreplikation haben, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. Darüber hinaus wurde mittels Fluoreszenzprotein-markiertem L von Rabies- und verwandten Lyssaviren erstmals gezeigt, dass die virale Polymerase an Mikrotubuli akkumuliert und diese reorganisiert. Die Abhängigkeit der Mikrotubuli-Lokalisation von einem intakten DLC1 Motiv in L deutete darauf hin, dass DLC1 ein Faktor bei der Rekrutierung von L an die Mikrotubuli ist. Auch für das Hendravirus M-Protein wurden mittels Affinitätschromatographie und Analyse von M haltigen Proteinkomplexen potentielle Interaktionspartner identifiziert. Dabei zeigte sich, dass nukleäres ANP32B Hendravirus M entweder direkt oder indirekt bindet. Aufgrund einer ANP32B-abhängigen Kernretention von M und der hier gezeigten Analysen zur Interaktion dieser Proteine, kann davon ausgegangen werden, dass ANP32B eine nukleäre Zielstruktur für das Hendravirus M darstellt. Ebenso kann davon ausgegangen werden, dass die Interaktion entweder direkt die Virusreplikation oder pro oder antiviral wirkende Mechanismen der Wirtszelle beeinflusst. Im Hinblick auf Funktionen von ANP32B beim Crm1 vermittelten Kernexport von mRNAs, der Regulation der zellulären Genexpression und der Apoptoseregulation erscheint eine weiterführende funktionelle Charakterisierung der entsprechenden ANP32B abhängigen Mechanismen sinnvoll. Auch wenn die Rolle von ANP32B im Replikationszyklus von Hendraviren noch nicht geklärt ist, zeigten Untersuchungen mit M Proteinen anderer Paramyxoviren (Newcastle Disease Virus und Bovines Respiratorisches Synzytialvirus), dass die Interaktion mit ANP32B in mindestens zwei unterschiedlichen Virusgattungen innerhalb der Unterfamilie der Paramyxovirinae konserviert ist. Daher wird angenommen, dass die Interaktion mit ANP32B Teil eines bei Paramyxoviren konservierten Mechanismus ist. Zusammenfassend wurde mit den in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen ein wesentlicher Beitrag zur Aufklärung von wirtszellabhängigen Funktionen viraler Proteine geleistet. Mit der Identifizierung von zellulären Zielproteinen der Rabiesvirus Polymerase und paramyxoviraler Matrixproteine wurde eine wichtige Grundlage für weiterführende Arbeiten zu den involvierten molekularen Mechanismen und deren Relevanz im infizierten Wirt geschaffen.
Orthohantaviruses are rodent-borne pathogens distributed all over the world, which do not cause visible disease in their reservoir host. Puumala orthohantavirus (PUUV) causes most human hantavirus disease cases in Europe and is transmitted by the bank vole (Clethrionomys glareolus). Hantaviruses have a tri-segmented genome consisting of the large (L) segment, coding for the RNA-dependent RNA polymerase (RdRP), the medium (M) segment, encoding the glycoproteins, and the small (S) segment. The S-segment contains two major overlapping open reading frames (ORF) coding for the nucleocapsid (N) protein and a non-structural (NSs) protein, a putative type I interferon (IFN-I) antagonist. To date, pathogenesis and reservoir host adaptation of hantaviruses are poorly understood due to missing adequate cell culture and animal models.
In contrast to previous studies, in this work, data from spring and summer 2019 indicated a high vole abundance, a high PUUV prevalence in voles and high human incidence for some endemic regions in Germany, but elsewhere values were low to moderate. Regional and local human health institutions need to be aware about the heterogeneous distribution of human PUUV infection risk.
For a better understanding of virus-host associations, two novel cell lines from bank voles and common voles each were generated and their susceptibility and replication capacities for a variety of zoonotic and non-zoonotic viruses were analyzed. The PUUV strain Vranica/Hällnäs showed efficient replication in a new bank vole kidney cell line, but not in four other cell lines of bank and common voles. Vice versa, Tula orthohantavirus (TULV) replicated in the kidney cell line of common voles, but was hampered in its replication in other cell lines. Several viruses, such as Cowpox virus, Vaccinia virus, Rift Valley fever virus, and Encephalomyocarditis virus 1 replicated in all four cell lines. West Nile virus, Usutu virus, Sindbis virus and Tick-borne encephalitis virus replicated only in a part of the cell lines. These results indicate a tissue or species specific tropism for many of the tested viruses and the potential value of vole cell lines to address such questions in detail.
Using one of these new cell lines, the first German PUUV strains were isolated from bank voles caught in the highly endemic region around Osnabrück. Complete genomes were determined by target-enrichment-mediated high-throughput sequencing from original lung tissue, after isolation and after additional passaging in VeroE6 cells and a bank vole-derived kidney cell line. Different single amino acid substitutions were observed in the RdRP of the two stable PUUV isolates. The PUUV strain isolated on VeroE6 cells showed a lower titer when propagated on bank vole cells compared to VeroE6 cells. Additionally, glycoprotein precursor (GPC)-derived virus-like particles of a German PUUV strain from the same region allowed the generation of monoclonal antibodies that reacted with the isolated PUUV strains.
To investigate the role of PUUV and other vole-borne hantavirus NSs proteins, the evolution of the NSs and N encoding sequences was investigated by a field study in bank voles and the NSs sequences were characterized in vitro for their inhibitory effect on the human interferon-β promoter. Analysis of blood and lung samples of 851 bank voles trapped during 2010-2014 in Baden-Wuerttemberg and North Rhine-Westphalia resulted in detection of 27.8% PUUV-specific antibody positive bank voles, whereas in 22.3% PUUV-specific RNA was detected. In the hantavirus outbreak years 2010 and 2012 PUUV prevalence in bank voles was higher compared to 2011, 2013 and 2014. Sequences of the S segment of all positive bank voles showed amino acid and nucleotide sequence types of the NSs-ORF with temporal and/or local variation, whereas the N-ORF was highly conserved. One sequence type persisted over the whole observation period in both regions. The NSs coding sequence was highly divergent among regional bank vole populations in the outbreak year 2012.
Transfection experiments resulted in the detection of different products of the NSs-ORF of PUUV, TULV, Prospect Hill and Khabarovsk orthohantaviruses, due to translation initiation at different methionine codons along the coding sequence. Using luciferase reporter assays, the NSs proteins of PUUV, TULV, Prospect Hill and Khabarovsk orthohantaviruses showed inhibition of IFN-I induction of up to 70%, whereas Sin Nombre and Andes orthohantavirus NSs proteins showed a reduced effect compared to the other NSs proteins. The first 20 amino acids of the N-terminal region of PUUV NSs were found to be crucial for IFN-I promoter inhibition.
In conclusion, the newly established cell lines, antibodies, reporter assays and PUUV isolates are highly valuable tools for future hantavirus research. The activity of PUUV NSs protein in human cells contributes to our understanding of virus-host interactions and highlights the importance of corresponding future reservoir host studies. Hantavirus surveillance studies showed the necessity for timely information of the potential human PUUV infection risk to public health institutions in endemic areas to initiate appropriate actions.
Die nicht-konventionelle, dimorphe, asexuelle und hemiascomycetale Hefe Blastobotrys (Arxula) adeninivorans wurde in den letzten Jahren in vielfältiger Weise eingesetzt und zahlreichen interessanten biotechnologischen Anwendungen unterzogen. Ein herausragendes Merkmal dieser Hefe ist das breite Substratspektrum, welches eine Vielzahl an Zuckern, Alkoholen sowie Purinen und Alkanen umfasst. In Folge der Genomsequenzierung des Stammes A. adeninivorans LS3 wurden drei putative Cutinase-Gene identifiziert. Cutinasen sind Serinhydrolasen, die in der Lage sind, Cutin der pflanzlichen Cuticula abzubauen. Dies ermöglicht es beispielsweise pflanzenpathogenen Pilzen wie Fusarium solani f. sp. pisi, die durch Cutin geschützten Bereiche zu penetrieren, um in die Wirtspflanze einzudringen. Trotz der Isolation von A. adeninivorans Stämmen aus Holzhydrolysat in Sibirien sowie humusreichen Böden wurde diese Hefe bisher nicht als pflanzenpathogen beschrieben. Auch das Vorhandensein von Cutinasen oder Cutinase-ähnlichen Enzymen blieb bisher gänzlich unbemerkt. Cutinasen sind für ein breites Spektrum an technischen Anwendungen zum Beispiel im Bereich des Abbaus und des Recyclings von bioabbaubaren Kunststoffen interessant. Aus diesem Grund wurden die drei Gene ACUT1, ACUT2 und ACUT3 aus dem Genom von A. adeninivorans LS3 isoliert. Mittels Homologie-Modellierung und Sequenzvergleich mit bekannten und charakterisierten Cutinasen konnten die α/β-Hydrolase Struktur, die katalytisch aktive S-D-H Triade mit dem in das G-Y-S-Q-G Motiv eingebetteten nucleophilen Serin, die Substratbindeschleife sowie die sogenannte „Flap-Helix“ identifiziert werden. Außerdem wies Acut3p eine einzigartige C-terminale Glycin-Threonin-Serin reiche Sequenz (GTS-Sequenz) auf, die unabhängig von der katalytisch aktiven Domäne gefaltet ist. Unter Verwendung des Xplor®2 Transformations/Expressionssystems wurden rekombinante Varianten der drei putativen Cutinasen Acut1-6hp, Acut2-6hp und Acut3-6hp mit A. adeninivorans G1212 synthetisiert, im Kulturüberstand lokalisiert sowie über den 6xHistidin-Tag gereinigt. Die anschließende biochemische Charakterisierung ergab ein nahezu uniformes Verhalten bezüglich pH-Optimum (pH 5,0 – 5,5) und Temperatur-Optimum (20 – 30 °C). Darüber hinaus wurde eine Instabilität der drei Cutinasen unter optimalen pH Bedingungen festgestellt. Diese konnte jedoch durch Zugabe von Osmolyten wie PEG200 vollständig behoben werden. Das Substratspektrum wurde als entscheidender Parameter für die Einordnung der putativen Arxula-Cutinasen untersucht. Die höchste Aktivität bei Substraten mit vier bis acht C-Atomen in der Acylkette entsprach dem Verhalten bereits bekannter Cutinasen. Weiterhin konnte der Abbau des Modellpolyesters Polycaprolacton sowie die Degradation von Apfelcutin erfolgreich durchgeführt werden, womit A. adeninivorans LS3 die erste ascomycetale Hefe mit nachgewiesenen cutinolytischen Enzymen ist. Zusätzlich konnte die im Vergleich zu Acut1-6hp und Acut2-6hp erhöhte Temperaturstabilität von Acut3-6hp auf die GTS-Sequenz zurückgeführt werden. Als mögliche Ursache für diesen Effekt wurde eine starke Glykosylierung der GTS-Sequenz angenommen. Durch Übertragung der GTS-Sequenz auf Acut1-6hp konnte die Temperaturstabilität dieses Enzyms erhöht werden. Eine Übertragung auf die bereits stark glykosylierte Tannase 1 führte dagegen nicht zu einer Erhöhung der Stabilität gegenüber der Temperatur. Weiterhin wurden in zwei verschiedenen Fermentationsverfahren mit Fed-Batch-Betriebsweise bis zu 1.000.000 U L-1 (Acut2-6hp) im Medium akkumuliert. Dies stellte bereits einen ersten Hinweis auf das Potenzial für eine Anwendung im technischen Bereich dar. Dieses Potenzial konnte durch den erfolgreichen Abbau von Polyestern wie Polycaprolacton, Polybutylensuccinat, Polylactid, Poly[3-Hydroxybutyrat] sowie Poly[3-Hydroxybutyrat-Co-3-Hydroxyvalerat] verstärkt werden. In weiteren Schritten müssen nun konkrete Anwendungsfelder für die in dieser Arbeit untersuchten Arxula-Cutinasen erschlossen werden. Der Abbau von real anfallenden Kunststoffabfällen aus bioabbaubaren und nicht-abbaubaren Folien oder Behältern sowie die Rückgewinnung der aus der Hydrolyse erhaltenen Monomere sollten dabei überprüft werden. Auf der anderen Seite wäre eine Anpassung der Kultivierungsmedien für die Gewinnung der Cutinasen im Pilot-Maßstab angebracht, um eine Produktionskostenreduktion zu erreichen.
LPAIV H9N2 and HPAIV H5N8 clade 2.3.4.4 viruses have been frequently isolated from domestic and wild birds in Germany and they are endemic in poultry worldwide. H9N2 is known to donate gene segments to other AIV with high case fatality rate in humans (e.g. H5N1, H7N9). Similarly, H5N8 devastated poultry worldwide since 2014 and has been recently isolated from humans. Therefore, it is important to understand the genetic predisposition for adaptation of H9N2 and H5N8 AIV in poultry and mammals. In the first publication, we focused on the variable hemagglutinin cleavage site (HACS) of European and Non-European H9N2 viruses, since the HACS is a main virulence determinant of AIV in birds. We found a preferential substitution of non-basic amino acids (G, A, N, S, D, K) in the HACS at position 319 of European H9N2 viruses compared to non-European H9N2 viruses. Recombinant viruses carrying different non-basic amino acids in the HACS modulated replication in vitro. While these non-basic amino acids did not affect virulence or transmission in chickens, they modulated virulence and replication in turkeys. Moreover, H9N2 viruses with non-basic amino acids in the HACS were able to replicate in mammalian brain cells for multiple cycles even without trypsin. In the second publication, we addressed the question whether reassortment between two recent German H9N2 and H5N8 clade 2.3.4.4. B viruses is possible and analysed the impact on virus fitness in mammals and birds. We found that H9N2 PB1 and NP segments were not compatible to generate infectious H5N8 viruses and this incompatibility was due to mutations outside the packaging region. However, H9N2 NS alone or in combination with PB2 and PA significantly increased replication of H5N8 in human cells. Moreover, H9N2 PB2, PA and/or NS segments increased virulence of H5N8 in mice. Interestingly, in chickens, reassortment with H9N2 gene segments, particularly NS, partially or fully impaired chicken-to-chicken transmission. These results indicate that the evolution of H9N2/H5N8 reassortants showing high virulence for mammals is unlikely to occur in chickens. In the third publication, we focused on the NS1 protein of different HPAIV H5N8 clade 2.3.4.4 viruses from 2013 to 2019 and studied the impact of its C-terminus (CTE) variation on virus fitness in chickens and ducks. Our findings revealed a preferential selection for a certain NS1 CTE length in 2.3.4.4. H5N8 clade A (237 aa) and B (217 aa) viruses over the common length of 230 aa. Indeed, the NS1 CTE can affect virus virulence and pathogenesis in a species and virus clade dependent manner. In chickens, although there was no impact on virulence, NS1 CTE of H5N8-A and H5N8-B, regardless of the length, have evolved towards higher efficiency to block the IFN response. In ducks, NS1 CTE contributed to efficient transmission, replication and high virulence of H5N8-B. In the fourth publication, we assessed the impact of variable length of NS1 on H5N8 virus replication in human cells and virulence in mice. We showed that NS1 of H5N8-B virus unlike the vast majority of NS1 of AIV, shared preferences for short NS1 similar to human and zoonotic influenza viruses. This virus (i) was able to efficiently block IFN and apoptosis induction which might be the first steps for efficient adaptation to human cells and (ii) without prior adaptation replicated at higher levels and was more virulent in mice than H5N8-A. The virulence of the latter virus increased after shortening the NS1 similar to H5N8-B virus. Therefore, it is conceivable that truncation in NS1 is a determinant for adaptation of H5N8 in mammals irrespective of its impact on virus fitness in poultry. Findings in this dissertation indicated that HA mutations in the European H9N2 and NS1 variations in H5N8 viruses play a role in virus fitness in poultry and/or mammals. These results improve our current understanding for AIV adaptation and are useful to assess the potential of these viruses to infect mammals.
Influenza-A-Viren sind wichtige Pathogene von Mensch und Tier. Als Erreger der klassischen Geflügelpest führen hoch-pathogene aviäre Influenzaviren (HPAIV) weltweit zu hohen Verlusten in der Geflügelindustrie. Des Weiteren stellen der zoonotische Charakter und das pandemische Potential, vor allem von Stämmen des Subtyps H5N1, eine ernste gesundheitliche Bedrohung für die Bevölkerung dar. Zur Risikobewertung dieser Viren ist es daher notwendig, genetische Marker zu ermitteln, welche die Virulenz und das Wirtsspektrum beeinflussen. Für die Identifizierung dieser Virulenzdeterminanten sind Pathogenese-Studien in verschiedenen Tiermodellen wie Hühnern und Mäusen essenziell. Bisher wurde gezeigt, dass HPAIV aus niedrig-virulenten Vorläufern durch den Erwerb eines polybasischen Spaltmotives im Hämagglutinin (HA) im Zuge der Adaptation an terrestrisches Geflügel hervorgehen. Im ersten Teil dieser Arbeit sollte daher die Fähigkeit eines niedrig-pathogenen aviären Influenzavirus (LPAIV) vom Subtyp H5N1 zur Ausbildung eines HPAIV-Phänotyps untersucht werden. Dazu wurde das revers-genetische System für das Isolat A/Teal/Germany/Wv632/05 (H5N1) etabliert und das Virus TG05 generiert. In-vitro konnte die Trypsin-Abhängigkeit als Merkmal von LPAIV bestätigt werden. Im Huhn verhielt sich dieses Virus avirulent. Durch zielgerichtete Mutagenese wurde die HA-Spaltstelle in ein polybasisches Motiv mutiert und das Virus TG05poly generiert. Das Virus war wie ein HPAIV zur in-vitro-Replikation ohne Trypsin-Zusatz fähig, löste aber nach der Infektion von Hühnern nur eine zeitlich begrenzte Erkrankung aus. Des Weiteren wurde die HA-Reassortante TG05-HAR65 generiert, deren Genom aus dem HA-Gen des HPAIV-Isolates A/Swan/Germany/R65/06 (H5N1) (R65) und den anderen sieben Gensegmenten von TG05 besteht. Dieses Virus konnte in-vitro ebenfalls Trypsin-unabhängig replizieren, führte aber zu einer Letalität von 30%. Eine weitere Reassortante, R65-HATG05poly, enthielt die umgekehrte Genkonstellation: das mutierte TG05-HA und die anderen Gensegmente des R65. An der Infektion verstarben acht von zehn Hühnern, was der Letalität von „natürlichen“ HPAIV entspricht. Der Erwerb einer polybasischen HA-Spaltstelle ist daher ein notwendiger, aber nicht hinreichender Schritt in der Evolution von LPAIV zu HPAIV. So kann nicht jeder H5- oder H7-LPAIV-Stamm als unmittelbarer HPAIV-Vorläufer dienen. Zusätzlich zur HA-Spaltstelle sind weitere Virulenz-Determinanten im HA selbst, aber auch in den anderen viralen Proteinen, vorhanden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher auch der Einfluss der Aminosäuren der unmittelbaren Spaltstellen-Umgebung untersucht. Dazu wurden verschiedene Virus-Mutanten des R65 mit Aminosäure-Substitutionen in der HA-Spaltstelle selbst (Motive ETR und ER) und in ihrer direkten Umgebung (HA-S346V) generiert und hinsichtlich der in-vitro-Replikation und der Virulenz im Huhn untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass HA-346S einen Vorteil für die Replikation von LPAIV und HPAIV vermittelt. T an Position 2 der Spaltstelle unterstützt die Replikation von LPAIV. Bei Erwerb der polybasischen Spaltstelle während der Evolution von LPAIV zu HPAIV müssen also auch die benachbarten Regionen im HA angepasst werden. Die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 verbreiteten sich über infizierte Vögel von Südostasien nach Europa, infizierten aber auch eine Vielzahl von Säugerspezies. Normalerweise weisen aviäre Influenzaviren PB2-627E auf; im Gegensatz dazu besitzen die Clade 2.2-Viren PB2-627K, was sonst in humanen Stämmen zu finden ist. Um im dritten Teil dieser Arbeit den Einfluss dieser Mutation auf das breite Wirtspektrum der Clade 2.2-Viren zu untersuchen, wurde im HPAIV-Isolat R65 PB2-627K durch E ersetzt und die Virusmutante R65-PB2K627E generiert. Im Vergleich zu R65 war die Replikation von R65-PB2K627E in Säugerzellen drastisch reduziert, in Vogelzellen replizierten beide Viren jedoch gleich. Des Weiteren führte die Substitution zu einer extrem verringerten Polymerase-Aktivität auf 5% in Säugerzellen, aber nur zu einer vergleichsweise wenig verringerten Aktivität in Vogelzellen. Während die Virulenz im Huhn durch die Mutation nicht verändert wurde, konnte bei der Bestimmung der LD50 in der Maus eine drastische Attenuierung gezeigt werden. Interessanterweise revertierte bereits nach einer Mauspassage PB2-K627E zurück zu K, im Huhn erfolgte diese Reversion aber nicht. Um zu untersuchen, ob andere virale Proteine für diese Reversion notwendig sind, wurden Reassortanten generiert, welche R65-PB2-K627E und ein oder mehrere Gensegmente des R65 im Hintergrund des HPAIV A/Hong Kong/156/97 (H5N1) tragen, welches natürlicherweise PB2-627E besitzt. Mittels Zellkultur-Passagen dieser Reassortanten konnte gezeigt werden, dass die Reversion zu PB2-627K nur in Säugerzellen auftritt, und dass dazu das Nukleoprotein des R65 notwendig ist. Die schnelle Reversion zu PB2-627K in Säugerzellen und in Mäusen zeigt, dass die H5N1 HPAIV der Clade 2.2 in ihrer Evolution möglicherweise mehrere Wirte gehabt haben, zu denen wahrscheinlich auch Säuger gehörten.