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Vorhofflimmern ist die häufigste Herzrhythmusstörung des Menschen. Die Generierung neuen Wissens über Prozesse der Zellregulation und Zellkommunikation kann unser Verständnis über zugrundeliegende Pathomechanismen dieser Erkrankung erweitern und bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien helfen. Diese Phosphoproteom-Analyse beschreibt Veränderungen des Phosphorylierungsstatus von Proteinen in HL-1 Kardiomyozyten in Abhängigkeit verschiedener Rapid Atrial Pacing (RAP) Stimulationsprotokolle. Um den Einfluss von Regenerationsphasen, wie es sie z. B. auch beim paroxysmalen Vorhofflimmern gibt, auf den Phosphorylierungsstatus von Proteinen zu untersuchen, wurden die Zellen nicht nur kontinuierlich, sondern auch in Intervallen RAP-stimuliert. Insgesamt konnten in dieser Arbeit 9626 Phosphorylierungen in 3463 Proteinen identifiziert werden, von denen 295 Phosphorylierungen in 261 Proteinen signifikant verändert waren. Stark veränderte Phosphorylierungen konnten z. B. in den Proteinen DOCK7 und MARK2 für kontinuierlich stimulierte HL-1 Zellen und OBSCN und JPH2 für Intervall-stimulierte HL-1 Zellen gefunden werden. Neben spezifisch regulierten Proteinphosphorylierungen konnten auch solche beschrieben werden, deren Regulation für kontinuierliches bzw. Intervall-RAP identisch waren (Overlap). Vertreter dieser Gruppe waren z. B. Phosphorylierungen der Proteine KCNH2 und ABLIM3. Eine Vielzahl beobachteter Unterschiede bezüglich der Richtung und Stärke der Regulation von Proteinphosphorylierungen zwischen kontinuierlich und Intervall- stimulierten HL-1 Zellen ist dabei ein deutliches Indiz für einen bestehenden Einfluss der Regenerationsphasen auf die Modulation zellulärer Signalwege. Bei der Zuordnung veränderter Protein-Phosphorylierungen zu definierten Signalwegen zeigte sich das Netrin-Signaling als signifikantes Beispiel für Signalwege, die sowohl bei kontinuierlich als auch bei Intervall-stimulierten HL-1 Zellen einer Modulation unterliegen. Veränderungen in der Regulation der Proteinphosphorylierung bzw. der Proteinexpression konnten dabei vor allem in einem bestimmten Teil des Signalweges identifiziert werden, an dem die Proteine Netrin, DCC-Rezeptor, NCK, RAC und ABLIM beteiligt sind.
Das aus antarktischem Meereis stammende und auch bei geringen Temperaturen schnell wachsende γ Proteobakterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PhTAC125) ist ein Modellorganismus für kälteangepasste Bakterien und Enzyme. Zusätzlich ist es ein alternativer Expressionswirt für die lösliche Überproduktion von heterologen Proteinen, die in etablierten Expressionswirten zur Bildung von inclusion bodies neigen. Bisher sind bei PhTAC125 im Rahmen der Erforschung von Kälteanpassungsmechanismen bzw. der Optimierung des kälteangepassten Expressionssystems nur Teilaspekte der Physiologie, des Stoffwechsels und der Bioprozessoptimierung untersucht worden. Bis zum Beginn dieser Dissertation gab es kaum Experimente, die sich mit der dynamischen und nahezu ganzheitlichen Betrachtung der Veränderung zellulärer Zustände und des Stoffwechsels von PhTAC125 beschäftigt haben. Darüber hinaus sind trotz der Fortschritte bei der Etablierung von PhTAC125 als alternativer Expressionswirt die bisher erzielten Biomassekonzentrationen gering. Aus diesem Grund wurden in dieser Dissertation zur Untersuchung des Stoffwechsels die exponentielle Wachstumsphase sowie vergleichende Untersuchungen verschiedener Wachstumsphasen und zellulärer Kompartimente auf Basis der Proteomanalytik durchgeführt. Zusätzlich konnte mit Hilfe der Fed-Batch-Kultivierungstechnik die Biomassekonzentration im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden deutlich gesteigert werden. Zur Untersuchung der Physiologie und des Stoffwechsels von PhTAC125 während des exponentiellen Wachstums wurde das Proteom analysiert. Neben den typischen stark exprimierten Kategorien der exponentiellen Wachstumsphase wie Protein- u. Nukleotidbiosynthese, Aminosäure- u. Kohlenstoffmetabolismus, stellten sich vor allem die Proteine des TonB abhängigen Transportsystems (TBDT), sowie der Kategorien Entgiftung und Coenzyme für PhTAC125 als wichtig heraus. Das TBDT ist wegen seiner hohen Abundanz im Proteom und seiner potentiellen Beteiligung am Transport von Proteinabbauprodukten für PhTAC125 ähnlich bedeutend wie die anderen Kategorien mit einer hohen Anzahl stark exprimierter Proteine. Auch die Proteine zum Schutz vor ROS (reactive oxygen species) und die der Biosynthesewege der Coenzyme sind besondere und bedeutende Merkmale von PhTAC125. Der ROS Schutz ist bei kälteangepassten Bakterien während des Wachstums bei geringen Temperaturen (≤ 20°C) mit erhöhter Sauerstofflöslichkeit und der damit verbundenen verstärkten ROS-Bildung essentiell. Die Verfügbarkeit der meisten Biosynthesewege der Coenzyme im Proteom von PhTAC125 ist ein besonderes Charakteristikum gegenüber vielen anderen Wasser- und Bodenmikroorganismen und kennzeichnet einen potentiellen Wachstumsvorteil. Zur vergleichenden Untersuchung der unterschiedlichen zellulären Kompartimente von PhTAC125 wurden 2D-Gelbilder des Cyto- und Periplasmas erstellt und gegenübergestellt. Das periplasmatische Kompartiment war wesentlich durch Signalpeptid-haltige Proteine des TBDT, Porine und periplasmatische Peptidasen und Chaperone charakterisiert. Die Untersuchung der Proteomsignaturen unter Nährstofflimitationsbedingungen basierte auf dem Vergleich der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase mit der exponentiellen Wachstumsphase. Beide Wachstumsphasen waren durch Kategorien mit hoher Anzahl an gering exprimierten Proteinen dominiert. Dabei handelte es sich vor allem um die Kategorien der Nukleotid-, Protein- und RNS-Biosynthese. Diese potentiell reprimierten Kategorien der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase waren in Verbindung mit der Limitation der meisten Aminosäuren ein deutlicher Hinweis auf die stringent response. In diesem Zusammenhang schienen die stärker exprimierten Proteine (TBDT, Porine, Peptidasen/Protease und PilQ) positiv durch die stringent response eguliert zu sein, um das Überleben unter Nährstofflimitationbedingungen zu garantieren. Bei der Bioprozessoptimierung zur Steigerung der Biomassekonzentration von PhTAC125 wurden zwei verschiedene FB-Strategien durchgeführt. Bei der ersten Strategie wurde eine komplexe Aminosäurequelle (Casamino Acids) als Substrat eingesetzt und über konstante oder exponentielle Substratzufütterungsprofile eine optische Dichte (OD) von 30 erreicht. Im Vergleich zu den bisherigen in der Literatur beschriebenen Bioprozessen von PhTAC125 wurde die finale Biomassekonzentration 3 fach erhöht. Bei der zweiten FB-Strategie wurde ein „definierteres“ Substrat bestehend aus Glycerol und Glutamat für die Fütterungslösung eingesetzt. Mit einer anfänglichen exponentiellen gefolgt von einer konstanten Fütterungsrate konnte die Biomassekonzentration (OD = 86) gegenüber den veröffentlichen Ergebnissen 8 fach gesteigert werden. Zusammenfassend konnten erste proteombasierte Aussagen zur Physiologie und zum Stoffwechsel von PhTAC125 getroffen und erste Bioprozessstrategien zur gezielten Biomassesteigerung entwickelt werden.
Staphylococcus aureus ist einer der bedeutendsten Erreger von Infektionen der Milchdrüse (Mastitis). In dieser Arbeit wurden 16 S. aureus-Isolate aus bovinen Mastitisinfektionen unterschiedlicher geografischer Herkunft umfassend charakterisiert, um tiefere Einblicke in die Wirtsspezifität von S. aureus zu erlangen. Das bovine Mastitisisolat S. aureus RF122, dessen Genomsequenz seit kurzem verfügbar ist, wurde zum Vergleich in die Studien einbezogen. Mittels Multilocus Sequence Typing wurde die klonale Verwandtschaft der Stämme analysiert und ihre Zugehörigkeit zu bestimmten Sequenztypen bzw. klonalen Komplexen ermittelt, von denen einige unter bovinen S. aureus-Isolaten weltweit sehr verbreitet sind.Zum Nachweis von virulenz- und resistenzassoziierten Genen, sowie regulatorischen und speziesspezifischen Markergenen wurde ein diagnostischer DNA-Microarray eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass das individuelle Profil der Isolate sehr stark variierte und sich selbst Stämme mit dem gleichen Sequenztyp in ihrem variablen Genom teilweise erheblich unterschieden. Nur 43 Gene, die u.a. für Hämolysine, Proteasen, Leukocidine kodieren, waren in allen Stämmen konserviert. Es wurde auch die Existenz einiger als bovin-spezifisch angesehener Gene, bzw. die Abwesenheit humanspezifischer Gene nachgewiesen. Zusätzlich wurde die Expression von Virulenzfaktoren mittels 2D-Gelelektrophorese und massenspektrometrischer Identifizierung analysiert. Wie erwartet unterschieden sich die extrazellulären Proteommuster der einzelnen Stämme stark. Nur zwölf sekretierte Proteine wurden (in unterschiedlicher Menge) von mindestens 80 % der bovinen Isolate gebildet, und bilden das sogenannte „Core-Exoproteom“. Auch Isolate mit nahezu identischer genetischer Zusammensetzung unterschieden sich z.T. erheblich in ihrem Exoproteom, was sehr gut mit der Transkription des Virulenzgenregulators RNAIII korrelierte. Weiterhin wurde die mitogene Wirkung der Kulturüberstände auf humane und bovine PBMC (mononukleäre Zellen aus peripherem Blut) untersucht. Dabei fiel auf, dass zwei Isolate, welche Gene der bovinen Pathogenitätsinsel SaPIbov trugen, bovine T-Zellen stärker als humane stimulierten, was auf wirtsspezifische Unterschiede in der Aktivität dieser Superantigene hindeutet. Schließlich konnten durch den Vergleich mit S. aureus-Isolaten aus humanen Infektionen bestimmte Proteine ermittelt werden, die häufiger mit einem bestimmten Wirt assoziiert sind. Die Variabilität in der Expressionshäufigkeit dieser Proteine könnte mit der Wirtsspezifität von S. aureus im Zusammenhang stehen. Als pathogener Mikroorganismus ist S. aureus hohen Konzentrationen an reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies (ROS und RNS) ausgesetzt, die im Rahmen der unspezifischen Wirts-Immunantwort gebildet werden. Um das Verständnis über seine Anpassungsstrategien zu erweitern, wurden vier Substanzen, die oxidativen bzw. nitrosativen Stress verursachen, eingesetzt: Wasserstoffperoxid (H2O2), eine Vorstufe des stark toxischen Hydroxylradikals; Diamid, ein spezifisches Thiol-Oxidationsmittel, die Superoxidanion-generierende Substanz Paraquat, sowie der NO-Donor MAHMA NONOate. Für jeden Stressor wurden Proteomsignaturen durch Auftrennung der cytoplasmatischen Proteine mittels 2D-Proteingelelektrophorese und anschließender massenspektrometrischer Identifizierung erstellt. Die zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stressauslösung neu synthetisierten Proteine wurden mittels L-[35S]-Methionin radioaktiv markiert und quantifiziert. Mindestens zweifach induzierte Proteine wurden als Markerproteine für einen bestimmten Stressor definiert. Durch Zugabe von 10 mM H2O2 wurden verstärkt Proteine synthetisiert, die an Synthese, Reparatur oder Schutz von Nukleinsäuren oder DNA beteiligt sind, was bestätigt, dass die DNA ein Hauptziel H2O2-induzierter Schädigung ist. Unter Einfluss von 10 nM Paraquat wurden Proteine mit sehr unterschiedlichen biologischen Funktionen, wie z.B. Aminosäuresyntheseenzyme und Cofaktoren, induziert. Der durch 1 mM Diamid induzierte Thiolstress führte wie erwartet zur verstärkten Neusynthese CtsR und HrcA-kontrollierter Chaperone und Proteasen, was auf die Akkumulation fehlgefalteter Proteine hindeutet, die höchstwahrscheinlich durch nichtnative Disulfidbrücken an den Thiolgruppen der Cysteinreste entstanden sind. Die Induktion von Peroxiredoxinen und einer Thioredoxinreduktase lassen auf ein gestörtes Redoxgleichgewicht in der Zelle schließen. Die Effekte von NO ähnelten denen, die auch unter Sauerstofflimitation beobachteten wurden. Viele Markerproteine sind in Glykolyse und Fermentation involviert und durch Nachweis der entsprechenden Fermentationsprodukte konnte eine höhere Aktivität fermentativer Stoffwechselwege bestätigt werden. Die Fähigkeit, unter Einfluss von NO auf anaeroben Metabolismus umzuschalten, könnte ein entscheidender Vorteil von S. aureus und essentiell für seine höhere Resistenz gegenüber NO sein.