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From a biopharmaceutical point of view, poor oral bioavailability of a drug is one of the greatest challenges for formulation scientists. The majority of new chemical entities (NCEs) are weakly basic drugs. Consequently, these drugs exhibit pH-dependent solubility, being higher under acidic conditions in the fasted stomach and lower under neutral conditions in the small intestine, the main site of drug absorption. For theses compounds, pH-dependent precipitation testing represents a key parameter during early development stages. In this development phase, the amount of drug available is limited, and fast and detailed investigations of simulated drug solubility are desired. Therefore, an automated small-scale in vitro transfer model, simulating drug transfer from a donor (stomach; simulated gastric fluid, SGF pH 2.0) to an acceptor (small intestine; fasted state simulated intestinal fluid, FaSSIF-phosphate pH 6.5) compartment, has been developed. In contrast to the originally published transfer model, this model allowed a detailed investigation of drug supersaturation and precipitation in a small-scale, feasible for pre-formulation purposes, through miniaturization and automation in an in-line analytical set-up. In-line drug concentration analysis in turbid samples, due to pH-dependent drug precipitation, was achieved by a pre-filtration step, the use of flow-through cuvettes and the application of UV derivative spectroscopy. Compared to the common procedure of manual sampling followed by HPLC-UV analysis for concentration determination, the supersaturation and precipitation of the model drug ketoconazole was more accurately captured by the newly developed in-line analytical set-up. In addition, the newly developed small-scale model was compared to a USP II-based transfer model, representing an established scale of the transfer model. Using a physiologically relevant simulated gastric emptying rate of 5 min half-time, supersaturation and precipitation of the model drugs ketoconazole and a new chemical entity from the research laboratories of Merck Healthcare KGaA, MSC-A, were observed to be highly comparable. Following miniaturization and automation, the developed small-scale model was used to establish eight physiologically relevant test-sets. These test-sets were used to assess the impact of gastrointestinal (GI) variability, i.e. gastric pH, gastric emptying, and GI fluid volumes, on supersaturation and precipitation of two weakly basic model compounds, ketoconazole and MSC-A. The experiments revealed that variations in all GI parameters investigated affected the in vitro supersaturation and precipitation of ketoconazole. For example, faster gastric emptying yielded higher supersaturation and faster precipitation of ketoconazole. In contrast, MSC-A supersaturation and precipitation was only affected by variability in gastric pH. Consequently, the effect of varying GI parameters was found to be drug-specific. Elevated gastric pH, as it can result from co-medication with acid-reducing drugs, resulted in lower degrees of supersaturation for both substances. For ketoconazole, this result is in agreement with the observation that the oral bioavailability of ketoconazole is lowered when proton pump inhibitors are co-administered. In addition to the physiological considerations, the small-scale model developed herein was used to establish an in vitro screening assay for precipitation inhibitors (PIs). The use of PIs represents one option of reducing the process of pH-dependent drug precipitation during simulated GI transfer. For this purpose, ketoconazole and five orally administered kinase inhibitors (i.e. pazopanib, gefitinib, lapatinib, vemurafenib, and MSC-A) were analyzed with and without the polymeric PIs HPMC, HPMCAS, PVPK17 and K30, PEG6000, and Soluplus® in the small-scale transfer model. This screening revealed that at least one effective PI could be identified for each model drug. Moreover, HPMCAS and Soluplus® were the most effective PIs. Another outcome of these studies was that gefitinib expressed highly variable amorphous precipitation which was confirmed by powder X-ray diffraction (PXRD). During the transfer model experiments, the intermediate amorphous and supersaturated state of gefitinib was stabilized using HPMCAS and Soluplus®. After the polymer investigations, the impact of the buffer species in the simulated intestinal medium on drug supersaturation and precipitation was assessed. Since luminal fluids are mainly buffered by hydrogen carbonate ions, a USP II-based transfer model equipped with the pHysio-grad® device was proposed. This allowed the use of a complex bicarbonate buffer for the preparation of FaSSIF-bicarbonate in an in vitro transfer model. Results of transfer model experiments using standard phosphate-based FaSSIF and a more physiologically relevant bicarbonate-based FaSSIF were compared. Therefore, ketoconazole, pazopanib, and lapatinib were analyzed with and without the precipitation inhibitor HPMCAS. While HPMCAS was found to be an effective precipitation inhibitor for all drugs in FaSSIF-phosphate, the effect in FaSSIF-bicarbonate was much less pronounced. Additionally, performed rat PK studies revealed that HPMCAS did not increase the exposure of any of the model compounds significantly, indicating that the transfer model employing bicarbonate-buffered FaSSIF was more predictive compared to the model using phosphate-buffered FaSSIF. The in vitro and in vivo results of these studies demonstrated that the supersaturation precipitation of poorly soluble weakly basic drugs can be significantly affected by GI variability. Furthermore, the use of the automated small-scale transfer model enabled the identification of effective precipitation inhibitors for the model drugs involved in these studies. At the same time the buffer species has been observed to be especially important to reliably predict the in vivo solubility/dissolution behavior of HPMCAS and the weakly basic model drugs.
Die Wirksamkeit und Sicherheit einer Arzneitherapie wird durch zahlreiche pharmakokinetische Prozesse beeinflusst. Neben den durch CYP-450-Enzym vermittelten Biotransformationsvorgängen sind zunehmend Transportprozesse durch Arzneimitteltransporter aus der ABC- sowie SLC-Familie in den Fokus getreten, welche unter anderem in den Membranen der Enterozyten, aber auch in weiteren Organen exprimiert sind. Die Expression und Funktion der Arzneimitteltransporter kann beispielsweise durch Arzneistoffe beeinflusst werden und somit in Arzneimittelwechselwirkungen resultieren. Dass diese Regulationsmechanismen eine hohe Komplexität aufweisen, ist aus einer Vielzahl von klinischen Interaktionsstudien ersichtlich. In diesen führte die Applikation von bekannten Induktoren des Arzneistoffmetabolismus und -transports zu organspezifischen Veränderungen in der Pharmakokinetik der gleichzeitig verabreichten Arzneistoffe.
Ziel dieser Arbeit war es, zu einem besseren Verständnis der Expression und Regulation intestinaler Arzneimitteltransporter beizutragen, um somit Auswirkungen auf die Pharmakokinetik besser vorhersagen zu können. Dies beinhaltete zum einen die Mitarbeit an der Entwicklung und Validierung einer LC-MS/MS-basierten Methode zur Proteinquantifizierung, mit welcher auch in limitierten Gewebemengen die am stärksten exprimierten Membrantransporter ABCB1 (P-gp), ABCC2 (MRP2), ABCG2 (BCRP) und SLC15A1 (PEPT1) quantifiziert werden konnten. Parallel dazu wurden die Prozesse zur mRNA-Isolierung und -Quantifizierung optimiert.
In der präklinischen Forschung wird weitverbreitet das Caco-2-Zellmodell zur Prädiktion der intestinalen Absorption genutzt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Caco-2-Zellmodell dahingehend untersucht werden, ob es ein geeignetes Modell zur Prädiktion der intestinalen Absorption darstellt, auch in Bezug auf Induktionsvorgänge. In bereits publizierten Arbeiten wurde häufig eine gute Korrelation des Transporterexpressionsmusters auf mRNA-Ebene zwischen Caco-2 und Jejunum gezeigt. Die vorliegenden vergleichenden Ergebnisse zur mRNA- und Proteinexpression von Arzneimitteltransportern zeigten, dass sowohl im Zellmodell als auch im jejunalen Gewebe in Teilen deutliche Diskrepanzen zwischen mRNA und Transporterexpression bestehen. Auf der für die Funktion der Arzneimitteltransporter relevanten Proteinebene zeigten sich für ABCB1, ABCC2 und ABCG2 relativ gute Übereinstimmungen, während die Proteinexpression anderer Transporter, insbesondere OATP2B1, im Zellmodell deutlich abwich. Dies verdeutlicht, dass insgesamt Vorsicht geboten ist in der Prädiktion der intestinalen Absorption mittels Caco-2-Zellmodell, da zudem bereits auf mRNA-Ebene gezeigt worden ist, dass die Expression der Transporter sowohl von dem Zellklon als auch von den Kulturbedingungen anhängig ist. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Expression der Transporter in dem Zellmodell sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene zeitlich variabel ist. Somit empfiehlt sich ein noch vorsichtiger Umgang mit Daten zur intestinalen Absorption, welche auf Basis eines Caco-2-Modells mit verkürzter Kultivierungszeit erhoben worden sind. Induktionsprozesse konnten weder auf Ebene der mRNA-Expression oder des Proteingehaltes noch auf Ebene der Funktion in dem Caco-2-Zellmodell durch Inkubation mit prototypischen Induktoren des Arzneistoffwechsels (Carbamazepin, Efavirenz, Johanniskrautextrakt, Rifampicin) simuliert werden.
Weiterhin wurde die Induktion von intestinalen Arzneimitteltransportern in vivo untersucht. Chronische Gabe von Rifampicin führte zu einem Anstieg von ABCB1 und ABCC2 auf mRNA Ebene, welches nur im Fall von ABCB1 (P-gp) auf Proteinebene umgesetzt wurde. Die chronische Applikation von Carbamazepin resultierte ausschließlich in einer Induktion auf mRNA Ebene. Im Vergleich zu Rifampicin war diese jedoch auch geringer ausgeprägt. Der PXR-Ligand Rifampicin kann aufgrund einer hohen intestinalen PXR-Expression eine stärkere Induktion hervorrufen als Carbamazepin, welches präferentiell den nukleären Rezeptor CAR aktiviert. Begünstigt wird dies darüber hinaus dadurch, dass Rifampicin, nicht aber Carbamazepin, einem enterohepatischen Kreislauf unterliegt und Rifampicin somit über einen längeren Zeitraum im Intestinum in einer Konzentration vorliegt, welche notwendig ist, um eine Aktivierung der nukleären Rezeptoren zu erreichen. Regulationsvorgänge durch miRNAs können dafür verantwortlich sein, dass eine erhöhte Expression der mRNA nicht parallel mit einem Anstieg des Proteingehaltes einhergeht. Durch Korrelationsanalysen, in silico-Prädiktion sowie Untersuchungen mittels Reportergen-Assays konnten in der vorliegenden in vivo-Studie drei Interaktionen zwischen miRNAs und mRNAs (ABCB1 - miR-485-3p; ABCC2 - miR-26a-5p; ABCG2 - miR-577) identifiziert werden, welche potentiell den Translationsprozess verhindert bzw. abgeschwächt haben. Korrelationsanalysen mit bereits zuvor erhobenen Daten zur Pharmakokinetik der applizierten probe drugs deuten darauf hin, dass die systemische Verfügbarkeit von Ezetimib und dessen Glukuronid durch intestinales ABCB1 (P-gp), nicht jedoch wie zuvor angenommen durch intestinales ABCC2 (MRP2) beeinflusst wird. Insgesamt konnten nach chronischer Gabe von Rifampicin Korrelationen entlang der Signalkaskade ausgehend von der mRNA-Expression von PXR, über die mRNA Expression von ABCB1, unter Berücksichtigung der Expression der miRNA 485-3p bis hin zum Gehalt und der Funktion von ABCB1 (P-gp) gezeigt werden. Veränderungen des Plasmaspiegels von Talinolol nach chronischer Gabe von Carbamazepin sind hingegen nicht auf Induktionsvorgänge intestinaler Transportprozesse zurückzuführen. Die Ursachen dafür sind u.a. in der Erhöhung der renalen Clearance zu suchen. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass nukleäre Rezeptoren, miRNAs und die pharmakokinetischen Eigenschaften der Induktoren selbst maßgeblich an der differenziellen Regulation von Transportprozessen beteiligt sind.