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In der vorliegenden Arbeit wurde das Proteom von Seminomen mit dem von nicht-neoplastischem Hodengewebe von 6 Patienten vergleichend analysiert. Ziel der Arbeit war die Ermittlung von Expressionsunterschieden zwischen Tumorgewebe und gesundem Gewebe auf Protein-Ebene. Zur Auftrennung der Proteine und Darstellung des Proteoms wurde die zweidimensionale Gelelektrophorese angewandt. Diese erlaubt eine Trennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht und ihrem isoelektrischen Punkt. Mit den hier verwendeten Gelen wurden Proteine im Molekulargewichtsbereich von ca. 10-200 kDa und einem isoelektrischen Punkt zwischen 4 und 7 erfasst. Die Darstellung der Proteine erfolgte durch Silber- und Fluoreszenzfärbung. Die Bearbeitung und Auswertung der Proteinmuster erfolgte mit der Software Delta 2D (Decodon). Bei 5 von 6 Patienten fand sich ein Protein, welches im Seminomgewebe geringer exprimiert war als im gesunden Hodengewebe. Das Protein wurde massenspektroskopisch mittels MALDI-MS analysiert und als GSTM3, Glutathion-S-Transferase der Mu-Klasse, identifiziert. Glutathion-S-Transferasen sind multifunktionelle Enzyme des Phase-Il-Stoffwechsels und spielen eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von Karzinogenen und Xenobiotika. Eine verminderte Expression von GST-Isoformen der Mu-Klasse in Seminomen wurde in der Literatur bereits beschrieben, jedoch ohne Angabe der GST-Isoformen. Diese Arbeit berichtet erstmalig von einer verminderten Expression der GSTM3-Isoform in Seminomgeweben. Auch die Menge an GSTM3-mRNA korrelierte mit den Proteindaten. Durch semiquantitative RT- PCR konnte das Ergebnis somit auf Transkriptionsebene bestätigt werden.
Die Afrikanische Schweinepest (ASP) ist eine Viruserkrankung, die Mitglieder der Suidae-Familie wie Buschschweine, Warzenschweine, Hausschweine und Wildschweine befällt. Das Virus wird durch direkten Kontakt zwischen infizierten und naiven Tieren, durch Zecken der Gattung Ornithodoros oder durch Kontakt mit kontaminiertem Material übertragen. Während die Krankheit bei Warzenschweinen und Buschschweinen im Allgemeinen asymptomatisch verläuft, verursacht die ASP eine hohe Mortalität bei Hausschweinen und Wildschweinen. Daher ist die jüngste Ausbreitung von ASP in Europa eine ernste Bedrohung für die Schweinehaltung in der EU. Bis heute ist keine wirksame Behandlung oder Impfung verfügbar. Und es liegen nur wenige Informationen über Virus-Wirt-Wechselwirkungen vor, die als Grundlage für die Etablierung antiviraler Strategien verwendet werden könnten.
Das Virus der afrikanischen Schweinepest (African swine fever virus, ASFV) ist der einzige bekannte Vertreter der Familie der Asfarviridae. Das DNA-Genom des ASFV kodiert für über 150 Gene. Über die Expressionsprodukte ist wenig bekannt, nur wenige virale Proteine sind bisher funktionell charakterisiert. Die Morphogenese von ASFV ist sehr komplex. So entstehen neben den zweifach umhüllten reifen extrazellulären Virionen auch einfach umhüllte intrazelluläre Partikel, die die die Präparation reiner extrazellulären Virionen erschweren.
In früheren in vitro Studien wurde die Zusammensetzung der extrazellulären Viruspartikel mittels 2D-Gelelektrophorese analysiert. Die Reinigung erfolgte über ein im Jahre 1985 veröffentlichtes Reinigungsprotokoll, welches auf einer Percolldichtegradientenzentrifugation und einer Gelchromatographie basierte. Das Protokoll wurde für die Reinigung des auf Vero-zellen adaptierten Virusstamm Ba-71V etabliert. In einer frühen MS Studie wurden 54 Proteine in ASFV Partikeln detektiert, 15 davon Wirtsproteine. Der Einbau von Aktin, α-Tubulin und β-Tubulin ins Virion konnte ebenfalls bestätigt werden. Systematische massenspektrometrische Untersuchungen zur Charakterisierung des Proteoms der ASF Virionen lagen zu Beginn der vorliegenden Dissertation nicht vor, erst während der Anfertigung des Manuskripts wurde eine solche Studie durch Alejo et al. veröffentlicht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf einer Dichtegradientenzentrifugation ohne nachfolgende Gelchromatographie beruhendes Reinigungsprotokoll entwickelt und die Zusammensetzung reifer ASF Viruspartikel mittels MALDI-TOF/TOF Massenspektrometrie analysiert. Zur Anzucht einer GFP-positiven ASFV OUR T88/3 Mutante wurde die vom Wildschwein abstammende Zelllinie WSL-HP verwendet. Wesentliche Schritte der Reinigung waren eine niedertourige Zentrifugation zur Entfernung zellulärer Verunreinigungen, gefolgt von einer Sedimentation des Virus durch ein Saccharosekissen und einem Proteaseverdau. Final wurde die Präparation über einen selbstgenerierenden Optiprep™ Dichtegradienten gereinigt. Die Titerausbeute lag zwischen 30 und 70 %, die spezifische Infektiosität bei 2,4 x 109 TCID50/mg. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Präparation zwar Virionen enthielt, aber auch, dass die Fixierung mit Glutaraldehyd die Stabilität der Virionen beeinträchtigt.
In der massenspektrometrischen Analyse wurden 29 der 33 bekannten ASFV Strukturproteine bestätigt. Von den neu identifizierten Strukturproteinen konnten vier (pK145R, pC129R, pE146L und pI73R) in allen drei Replikaten und sechs in zwei von drei Replikaten (p5, CP123L, CP312R, E184L, M1249L und M2248R) bestätigt werden. Ein weiteres bis dato nicht charakterisiertes Protein, p285L, konnte als mögliches neues Strukturprotein identifiziert werden. 152 Wirtsproteine wurden im Virion detektiert, darunter hauptsächlich Membranproteine oder Proteine des Zytoskeletts. Daneben wurde eine Reihe an phospholipidbindenden Proteine gefunden. Unter den identifizierten Proteinen waren fünf aus dem glatten ER und einige Vertreter der Hitzeschockproteine.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte das intrazelluläre Proteom des ASFV identifiziert werden.
Für diese Untersuchungen wurden drei empfänglichen Zelllinien verwendet, die vom Wildschwein abstammenden Linie WSL-HP, Vero Zellen, die in der Vergangenheit für viele Studien herangezogen wurde und die menschliche Linie HEK-293, die aus einem weiteren nicht empfänglichen Wirt stammt.
Der in dieser Studie verwendete Virusstamm ASFV OUR T88/3 besitzt 157 ORFs. In früheren Studien konnte die Existenz eines Proteins für 44 ORFs bestätigt werden. Für weitere 69 ORFs wurden Transkripte, nicht aber die korrespondierenden Proteine, beschrieben, sodass für 44 ORFs kein Nachweis der Expression vorlag.
In der massenspektrometrischen Analyse wurden je Wirtszelle rund 1000 Proteine identifiziert. Insgesamt belief sich die Zahl der identifizierten ASFV Proteine auf 94, davon 88 in WSL-HP, 83 in Vero und 57 in HEK-293 Zellen. 54 ASFV Proteine wurden in allen drei Zelllinien detektiert. Für 34 der identifizierten ASFV Proteine war bisher nur die Existenz des Transkripts beschrieben, für 23 weitere weder die Existenz eines Proteins noch eines Transkripts. Für 44 der 94 identifizierten Proteine wurde das N-terminales Peptid detektiert. Bei fünf der MGF-110 Proteinen (1L, 2L, 4L, 5L und 14L) und den Proteinen pI329L und pCP123L wurde die Abspaltung der vorhergesagten Signalsequenz experimentell bestätigt.
Die MS Analysen wurden unter Verwendung des emPAI auch quantitativ ausgewertet.
Die geringe Zahl detektierter ASFV Proteine in HEK-293 Zellen korrelierte mit dem geringeren Anteil an ASFV Proteinen im Gesamtproteingehalt der Zelle (6,3 Mol%). Allerdings wurden einige Proteine in HEK-293 Zellen ähnlich stark oder sogar stärker exprimiert als in Vero bzw. WSL-HP Zellen. Die Abundanz einzelner ASFV Proteine variierte in den verschiedenen Zelllinien. Einige wurden jedoch durchgehend stark exprimiert wie z.B. das Strukturprotein p11.5. Einige bisher nicht charakterisierte Proteine, wie z.B. pK145R, pI73R und pC129R, wurden überraschenderweise ebenfalls in allen Zellen stark exprimiert und sind somit möglicherweise Träger wichtiger viraler Funktionen, die weiter untersucht werden sollten.
Humanity is plagued by many diseases. Beside environmental influences, many --- if not all --- diseases are also subject to genetic predisposition and then display molecular alterations such as proteomic or metabolic aberrations. The elucidation of the molecular principles underlying human diseases is one of the prime goals of biomedical research. To this end, there has been an advent of large-scale omics profiling studies. While the field of molecular biology has experienced tremendous development, data analysis remains a bottleneck. In the context of this thesis, we developed a number of analysis strategies for different types of omics data resulting from different experimental settings. These include approaches for associations studies for plasma miRNAs and time-resolved plasma omics data. Furthermore, we devised analyses of different RNA-Seq transcriptome profiling studies coping with problems such as lack of replicates or multifactorial experimental design. We also designed machine learning frameworks for the identification of discriminatory biomolecular signatures analysing case-control or time-to-event data. All of the strategies mentioned above were developed and applied in the contexts of multi-disciplinary endeavours. They aided in the identification of plasma miRNAs associated with age, sex, and BMI as well as plasma miRNAs bearing potential as diagnostic biomarkers for non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). This thesis significantly contributed to a study demonstrating the utility of plasma miRNAs as prognostic biomarkers for major cardiovascular events such as ST-elevation myocardial infarction. Our approaches for analysing RNA-Seq data aided in the characterisation of murine models for Alzheimers disease and the transcriptional response of human gingiva fibroblasts to ionizing radiation exposure. Furthermore, the developed approaches were applied for studying a human model for thyrotoxicosis and for the successful identification of a multi-omics plasma biomarker signature of thyroid status. We are only beginning to understand the molecular principles underlying human diseases. The approaches and results presented in this thesis will contribute to improved understanding of biomolecular processes involved in common diseases such as Alzheimers disease, NAFLD, and cardiovascular diseases.
Infektionen durch Staphyloccocus aureus können aufgrund zunehmender Therapieresistenz (ca-MRSA, ha-MRSA, la-MRSA etc.) gravierende Verläufe nehmen und stellen nicht nur eine wachsende medizinische, sondern auch eine gesundheitsökonomische Herausforderung im Patientenmanagement dar. Für die Entwicklung innovativer Behandlungsstrategien ist die genaue Analyse der keimspezifischen Infektionsmechanismen eine wichtige Voraussetzung. S. aureus verwendet sogenannte Virulenzfaktoren um einen zunächst lokalen Infektionsherd zu etablieren. Wachstumsphasenabhängig werden z.B. Adhäsine, Kapselantigene oder Toxine exprimiert, um dann gezielt im Infektionsgeschehen eingesetzt zu werden. In den vergangenen Jahren konnten wichtige Fortschritte zur Ermittlung infektionsrelevanter stammspezifischer Regulationsmechanismen bei S. aureus gemacht werden. Ziel dieser Arbeit war zunächst eine Datengrundlage zur Untersuchung der Wirt-Erreger-Interaktion durch Proteomreferenzkarten von humanen S9-Epithelzellen zu schaffen. Zudem wurden die extrazellulären Expressionsmuster von S. aureus-Isolat NCTC8325-4 in verschiedenen Kulturmedien analysiert, um ein geeignetes Medium für die Kokultur der Wirts –wie auch der Erregerzellen entwickeln. Weiterhin sollte eine Proteomreferenzkarte der extrazellulären Proteinfraktion von S.aureus RN1HG erstellt werden, um eine anschließende Vergleichsanalyse der wachstumsphasenabhängigen Expressionsprofile zu ermöglichen. Zur Erstellung der Proteomreferenzkarten wurden die Proteingemische mit einer zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D PAGE) aufgetrennt. Zuerst wurden die Proteine einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen (IPG – Streifen 24cm für pI 4-7; 11cm u. 18cm für pI 6-11) und dann in der zweiten Dimension nach ihrer Größe mit 12,5% SDS Polyacrylamidgelelektrophorese separiert (Trennbereich 20 -120 kD). Die Proteinspots wurden mit verschiedenen Färbemethoden (Silbernitrat, kolloidales Coomassie Brillantblau oder Flamingo Fluoreszenzfärbung) dargestellt. Mit MALDI-TOF wurden die Proteine sequenziert und quantifiziert. Die gefundenen Sequenzen wurden durch Datenbanksuche (Mascot 2.0; SwissProt 55.1_human/all) identifiziert. Auf Wirtsseite sollten die humanen S9-Epithelzellen (CFTR repaired IB3-1) als Modell einer bakteriellen Atemwegskolonisation dienen, dabei wurden sie in MEM (mit 4% FCS, 1% NEAA (non essential amino acids) und 4 mM L-Glutamin) kultiviert. Auf der Erregerseite wurden die S. aureus - Isolate NCTC8325-4 (11-bp deletion in rsbU, cured of three prophages) und RN1HG (rsbU restored) (HG001; Herbert S. et al, 2010) verwendet . Proteomreferenzkarten für den pI Bereich pI 4-7 und pI 6-11 wurden für das Proteom der S9-Epithelzellen angefertigt. Es wurden 668 Einzelproteine (508 mit Proteinscore >55) identifiziert und funktionell via Datenbanksuche (www.pantherdb.org) charakterisiert. Somit können infektionsassoziierte Veränderungen im Proteinmuster der S9-Wirtszellen erkannt und valide ausgewertet werden. Um eine Kokultur für Internalisierungsversuche von S.aureus und den S9-Epithelzellen zu ermöglichen, wurde eine methodenoptimierende Kultivierungsreihe (MEM mit und ohne 5%FCS, RPMI 1640, TSB) mit dem Laborstamm NCTC8325-4 durchgeführt. Der Datenvergleich der extrazellulären Expressionsmuster trug zur Entwicklung eines geeigneten Kulturmediums (MEM mit 2mM AS supplementiert) bei. S. aureus RN1HG wurde in diesem Medium kultiviert und von der extrazellulären Proteinfraktion wurde eine Proteomreferenzkarte im Bereich pI 4-7 angefertigt. Es konnten 91 Einzelproteine (48 mit Proteinscore >55) identifiziert werden. Durch eine vergleichende Analyse konnten Veränderungen der Proteinmuster innerhalb verschiedener Wachstumsphasen (exponentiell, transient, stationär und spät stationär) detektiert und ein optimaler Erntezeitpunkt festgelegt werden. Während der exponentiellen Wachstumsphase waren typischerweise kolonisationsrelevante Proteine (LytM, SAOUHSC_02979, SceD), in der stationären Phase vorrangig invasionsrelevante (SsaA, IsaA, SspB) angereichert. Somit konnten charakteristische Expressionsmerkmale bei S. aureus RN1HG nachgewiesen werden, welche den weiteren Einsatz gemeinsam mit den S9-Epithelzellen ermöglichen (Schmidt F. et al., 2010).
This thesis will discuss the different fields of application of the two soft ionization techniques ESI and MALDI in microbial proteomics and their importance for a better understanding of bacteria physiology. The general development in the past 25 years coming from 2D-gel analysis and protein identification by peptide mass fingerprint analysis via MALDI-TOF to genome wide quantitative LC-ESI-MS experiments with fast and sensitive ESI instruments is exemplary shown for the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis in article I. Even though 2D-PAGE in conjunction with MALDI-MS is still an important tool in proteomic research, the more recently established global quantitative LC-ESI-MS workflows gain more and more relevance as they overcome 2D-PAGE based protein restrictions and enable the acquisition of higher accurate protein quantities. In article II such a workflow was used to analyze the physiological adaptation of Staphylococcus aureus to vancomycin treatment on a global-scale. Also post-translational modifications of proteins, that are important for regulation of their activity and allow rapid adaption to changed environmental conditions, could be analyzed by LC-ESI-MS workflows using special enrichment strategies (article III and IV). Despite the mentioned discrimination and less accurate quantification of proteins, 2D-PAGE analyses are still advantageous when analyzing large-scale time series experiments. To gain highly time resolved data but also very accurate relative quantities on a global-scale, 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS techniques have been combined to investigate dynamic proteome adaptations of B. subtilis during nutrition shift as part of a global systems biology approach (article V). Also absolute quantities of proteins are of high interest for systems biology, but are still challenging to obtain on large-scale as well as with sufficient accuracy. In article VI a method that again combined 2D-PAGE-MALDI-MS and LC-ESI-MS was introduced to gain absolute protein quantities on global-scale. Utilizing the complementarity of 2D-PAGE and LC-ESI-MS this new workflow enabled fast and cost efficient data acquisition on absolute scale. In article VII we described for the first time a global quantitative LC-MALDI-MS workflow. Cross validation with an LTQ Orbitrap proofed that LC-MALDI-MS is able to process complex samples and obtain highly reliable quantities. The comparative analysis of data gained with both instrument types revealed biases for certain biochemical properties of MALDI as well as ESI instruments, resulting in a general complementarity of both ionization techniques. Article I Becher, D., Büttner, K., Moche, M., Hessling, B., Hecker, M., 2011. From the genome sequence to the protein inventory of Bacillus subtilis. Proteomics 11, 2971–2980. Article II Hessling,B., Bonn,F., Herbst,F.-A., Rappen,G.-M., Bernhardt,J., Hecker,M. and Becher,D. Global proteome analysis of vancomycin stress in Staphylococcus aureus. Submitted to Mol. Cell Proteomics. Article III Elsholz, A.K.W., Turgay, K., Michalik, S., Hessling, B., Gronau, K., Oertel, D., Mäder, U., Bernhardt, J., Becher, D., Hecker, M., Gerth, U., 2012. Global impact of protein arginine phosphorylation on the physiology of Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7451–7456. Article IV Chi, B.K., Gronau, K., Mäder, U., Hessling, B., Becher, D., Antelmann, H., 2011. S-bacillithiolation protects against hypochlorite stress in Bacillus subtilis as revealed by transcriptomics and redox proteomics. Mol. Cell Proteomics 10, M111.009506. Article V Buescher,J.M., Liebermeister,W., Jules,M., Uhr,M., Muntel,J., Botella,E., Hessling,B., Kleijn,R.J., Le Chat,L., Lecointe,F., et al. (2012) Global network reorganization during dynamic adaptations of Bacillus subtilis metabolism. Science, 335, 1099–1103. Article VI Maass, S., Sievers, S., Zühlke, D., Kuzinski, J., Sappa, P.K., Muntel, J., Hessling, B., Bernhardt, J., Sietmann, R., Völker, U., Hecker, M., Becher, D., 2011. Efficient, global-scale quantification of absolute protein amounts by integration of targeted mass spectrometry and two-dimensional gel-based proteomics. Anal. Chem. 83, 2677–2684. Article VII Hessling,B., Büttner,K., Hecker,M. and Becher,D. Global relative quantification with LC-MALDI – cross-validation with LTQ-Orbitrap proves reliability and reveals complementary ionization preferences. Submitted to Mol. Cell Proteomics.
Staphylococcus aureus ist ein ubiquitär verbreitetes Bakterium. Häufig als Kommensale des Menschen vorkommend, zählt das Bakterium jedoch zu einem der wichtigsten Infektionserreger des 21. Jahrhunderts. Neben lokalen Infektionen (z. B. Furunkel) kann der Erreger nach einer Besiedlung auch systemische Erkrankungen in seinem Wirt (z. B. Sepsis, Endokarditis, Pneumonie) hervorrufen. Die pathogene Wirkung von S. aureus ist auf die Produktion und Sekretion von Pathogenitäts- bzw. Virulenzfaktoren, unter anderem Superantigene, hämolytische Toxine, Gewebe-zerstörende Enzyme und Oberflächenproteine, welche ihrerseits mit dem Immunsystem des Wirtes interferieren, zurückzuführen. Ziel dieser Arbeit war unter anderem die Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG in pMEM, ein an das bakterielle Wachstum adaptierte Zellkulturmedium. Bei den extrazellulären Proteomanalysen von S. aureus RN1HG konnten 39 Proteine identifiziert werden, welche dem Bakterium eine Interaktion mit dem Wirt (Clumping-Faktoren) ermöglichen, die Phagozytose (Protein A) verhindern oder die Ausbreitung im Gewebe (alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase) erleichtern. Da die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms durch diverse Regulons (z. B. agr-System, sarA, sigB) bestimmt wird, stellte sich die Frage, inwiefern diese einen Einfluss auf die Virulenz des Stammes RN1HG-Stamm haben. Ein vielfach in der Literatur diskutierter Regulator ist SigB. Die vergleichende gelfreie LC-MS/MS-Analyse des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG mit einer sigB Deletion (RN1HG delta sigB) zeigte, dass sich im Vergleich zum Wildtyp die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms nicht grundsätzlich ändert. Jedoch konnte durch eine „labelfreie“ Quantifizierung eine verstärkte Akkumulation zahlreicher Virulenzfaktoren (z. B. Aureolysin, 1-Phosphatidylinositol- Phosphodiesterase, alpha-Hämolysin, gamma-Hämolysin, Lipase, Thermonuklease) in der delta sigB Mutante nachgewiesen werden. Die Serin-Proteasen A, C und E konnten nur für die delta sigB Mutante identifiziert werden. Adhäsine, darunter Clumping-Faktoren oder Elastin-Bindeprotein, wurden lediglich während der exponentiellen Wachstumsphase für die delta sigB Mutante nachgewiesen. Dies konnte für clf auch durch Transkriptomanalysen belegt werden. Die gelfreien Analysen wurden durch gelbasierte Verfahren (2D-Gelelektrophorese) ergänzt. Neben der Erstellung einer Referenzkarte des extrazellulären Proteoms von S. aureus RN1HG (Wildtyp und delta sigB Mutante) wurden quantitative gelbasierte Daten erhoben, die einerseits die Ergebnisse der gelfreien Analysen bestätigten, andererseits aber auch zeigten, dass SigB nur wenig Einfluss auf die Prozessierung und posttranslationale Modifikation extrazellulärer Proteine in S. aureus RN1HG hat. Die Zusammensetzung des extrazellulären Proteoms ist vor allem bei pathogenen Bakterien bedeutsam, da z. B. durch extrazelluläre Enzyme die Erschließung von Nährstoffquellen in extremen Habitaten begünstigt und durch Virulenzfaktoren sowohl die Kolonisierung als auch die Überlebensfähigkeit im Wirtsorganismus gesichert wird. Um die Erreger-Wirt Interaktion näher zu charakterisieren, wurde die Reaktion von humanen bronchialen Epithelzellen (S9-Zellen) auf eine Infektion mit S. aureus RN1GH pMV158 untersucht. Die Durchführung der Infektionsstudien mit einem GFP-markierten RN1HG-Stamm ermöglichte die Sortierung der infizierten S9-Zellen durch die Durchflusszytometrie. Da im Epithelverband nicht jede Zelle mit S. aureus infiziert ist, lag der Vorteil der Sortierung darin, dass Proteomanalysen spezifisch für die S9-Zellen mit internalisierten Staphylokokken durchgeführt werden konnten. Infolge einer Internalisierung von S. aureus durch die S9-Epithelzellen kam es zunächst zu einer Integrin-vermittelten Adhäsion. Eine zunehmende Inkubation mit S. aureus führte zu inflammatorischen Prozessen. Die Invasion pathogener Bakterien in Wirtzellen führt somit zum Remodelling biologischer Prozesse, die dem Wirt die Auseinandersetzung mit dem Pathogen ermöglichen.
Die klassischen Schilddrüsenhormone (TH) Triiodthyronin (T3) und Thyroxin (T4) sind für die Regulation zahlreicher Stoffwechselprozesse von Bedeutung. Dabei beeinflussen sie unter anderem maßgeblich den hepatischen Energie- und Lipidstoffwechsel. In den letzten Jahren haben die beiden Schilddrüsenhormon-Metaboliten 3-Iodthyronamin (3-T1AM) und 3,5-Diiodthyronin (3,5-T2) an Aufmerksamkeit gewonnen, da sie in diversen Studien als endogene, biologisch aktive Substanzen beschrieben wurden.
Die durch 3-T1AM-vermittelten metabolischen Effekte sind dabei denen der klassischen TH teilweise entgegengesetzt. Zudem konnte eine Interferenz mit der Hypothalamus-Hypophysen-Schilddrüsen (HPT)-Achse demonstriert werden. In dieser Arbeit sollte die Hypothese einer direkten 3-T1AM-Wirkung auf die Schilddrüse überprüft werden. Dazu wurden in einem in vitro-Modell 3-T1AM-behandelte Thyreozyten der Zelllinie PCCL3 mittels Transkriptomanalysen untersucht.
Für den TH-Metaboliten 3,5-T2 konnten in früheren Arbeiten anti-steatotische, anti-lipidemische und kalorigene Effekte demonstriert werden. Aufgrund fehlender thyreotoxischer Nebenwirkungen, wie sie für die klassischen TH typisch sind, liegt ein therapeutisches Potenzial von 3,5-T2 zur Behandlung der mit steigender Inzidenz auftretenden Adipositas und der damit assoziierten Fettleber (Steatosis hepatis) nahe. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 3,5-T2-vermittelten Effekte auf die hepatischen Transkriptions- und Proteinmuster von Mäusen unter Standard- (SD) und Hochfettdiät (HFD) in komplementären Analysen charakterisiert.
Die TH-Homöostase wird durch den negativen Rückkopplungsmechanismus der HPT-Achse reguliert. Im klinischen Alltag wird jedoch häufig eine Störung dieses Gleichgewichts in Form einer Hypo- oder Hyperthyreose beobachtet. Um die physiologischen Auswirkungen dieser Erkrankungen zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit Proteomanalysen der Lebern von Mäusen mit induzierter Hypo- und Hyperthyreose durchgeführt, um bereits vorliegende korrespondierende Transkriptomdaten zu ergänzen.
In den Transkriptomanalysen der 3-T1AM-behandelten Thyreozyten konnten keine Genexpressionsänderungen nachgewiesen werden. Um diese Diskrepanz zu den in anderen Studien demonstrierten metabolischen Effekten zu beheben, könnte eine Optimierung des experimentellen Designs sinnvoll sein. Alternativ könnte gefolgert werden, dass vor allem post-transkriptionelle Prozesse die Wirkungen von 3-T1AM vermitteln.
Die komplementären Transkriptom- und Proteomdaten der 3,5-T2-behandelten Mäuse deuteten auf eine Stimulation der hepatischen Cholesterol-, Gallensäure- und lokalen Sexualhormon-Biosynthese in Tieren unter HFD hin. Außerdem konnten in Mäusen unter HFD erhöhte hepatische Spiegel von Sexualhormonen nachgewiesen werden. Weiterhin zeigten zahlreiche Transkripte und Proteine, welche in den Lipidstoffwechsel und Citratzyklus involviert sind, signifikante Mengenveränderungen nach 3,5-T2-Behandlung unter SD und HFD. Die in dieser Arbeit unter beiden Diäten beobachteten 3,5-T2-vermittelten Effekte auf Xenobiotika-metabolisierende Proteine könnten dabei unter anderem auf unerwünschte thyreomimetische Nebeneffekte hindeuten. Daher sollte der therapeutische Einsatz von 3,5-T2 als ein potenzielles anti-steatotisches Agens, wie es diverse vorangegangene Studien propagiert haben, kritisch betrachtet werden.
Die ersten Ergebnisse der hepatischen Proteomanalysen hyperthyreoter Mäuse deuteten auf eine Reduktion von oxidativem Stress und eine Induktion der Proteinbiosynthese hin, während unter hypothyreoten Bedingungen entgegengesetzte Effekte beobachtet wurden.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten umfangreiche globale und komplementäre Datensätze mit Hilfe der Omics-Technologien Transkriptomics und Proteomics, für die Microarray- und Massenspektrometrie-basierte Analysen zum Einsatz kamen, generiert werden. Diese ermöglichten die Gewinnung neuer Erkenntnisse über die physiologischen Effekte und Wirkungsweisen der TH-Metabolite 3-T1AM und 3,5-T2 sowie die Krankheitsbilder Hypo- und Hyperthyreose.
Die vorliegende Arbeit adressiert die Nutzbarkeit des humanen Speichelproteoms als diagnostisches Instrument im Kontext einer oralen Mukositis bei Kopf- und Halskarzinoms. Als häufigste Nebenwirkung einer Radio(chemo)therapie kann die Mukositis therapielimitierend sein und hat für betroffene Patienten meist eine Einschränkung ihrer Lebensqualität zur Folge. Trotz der guten Verfügbarkeit von Speichel existieren wenige Studien, welche zeigen, dass das Speichelproteom für die Diagnostik einer Krankheit oder zur Therapieentscheidung nutzbar ist. Das hat unter anderem seinen Grund in der Komplexität der massenspektrometrischen Methode. Die erste Veröffentlichung (Golatowski et al. 2013) erarbeitete deshalb einen Standard in der Probengewinnung von Speichel. Als Ergebnis steht die Empfehlung zur Nutzung eines Paraffin-Kaugummis, aufgrund des hohen Speichelvolumens und der guten Vergleichbarkeit mit der nichtstimulierten Salivation beim identifizierten Proteom. In einer zweiten Veröffentlichung (Jehmlich & Golatowski et al. 2014) wurden C18 Mikrosäulen verschiedener Hersteller bezüglich ihres Einflusses auf die Proteinidentifizierung verglichen. Die Säulen sind notwendig für die Entsalzung und Aufreinigung eines Peptidgemisches. Mit allen verwendeten Säulen konnten ähnliche Ergebnisse erzielt werden, wobei die ZipTip® µC18 sowie C18 Systeme der OASIS® HLB μElution 96er Well Platte und TopTip® C18 Pipettenspitzen leicht überlegen sind. In der letzten Arbeit (Jehmlich et al. 2015) wurden die gewonnenen Erkenntnisse genutzt, um die Speichelproben von Patienten mit Kopf- und Halskarzinom zu untersuchen. Insgesamt zeigten wir die Möglichkeit, alterierte Proteine zwischen zwei Patientengruppen massenspektrometrisch zu detektieren. Mit den gefundenen Daten konnte demonstrieren werden, dass massenspektrometrische Techniken geeignet sind, um schon vor Behandlungsbeginn Patienten zu identifizieren, die für die Entwicklung einer oralen Mukositis prädisponiert sind. Es ist hierbei die Proteinklasse der Metalloproteinasen hervorzuheben, da diese für einen therapeutischen Ansatz gegen Mukositis interessant sind. In Zukunft werden jedoch größere und voraussichtlich multizentrische Studien erforderlich sein, um ausreichend große Patientenkohorten zusammenzustellen und die Klassifikation speziell für Patienten ohne Mukositisrisiko sensitiver zu gestalten.
Non-thermal atmospheric pressure plasma has recently been shown to have broad application potential for medical as well as industrial purposes. Improved wound healing and tissue decontamination have been described as consequences of non- thermal plasma treatment. However, thus far the underlying molecular mechanisms in human tissues have only been partially characterized. In this work a two-dimensional difference in-gel electrophoresis (2D-DIGE) approach was used and an analysis-workflow to study the response of human cells to atmospheric pressure non-thermal plasma was established. Human S9 bronchial epithelial cells were used as a model for airway epithelial cells. They were treated with atmospheric pressure plasma jet (APPJ) for different periods of time. Subsequently, time-resolved comparative proteome analysis was used to study the complex cellular adaptation reactions after a 120 sec plasma treatment, which accelerated wound healing in a clinically relevant model. The results indicate, that intracellular oxidative stress due to the non-thermal plasma treatment either leads to cell death or to proliferation. The oxidative stress response, mediated by Nrf2, appears to play a pivotal role in molecular signalling and might be a key pathway determining the fate of stressed cells. This thesis demonstrates changes in Nrf2-expression after non-thermal plasma treatment. Furthermore, potential protein biomarker candidates for evaluation of oxidative stress after non-thermal plasma treatment were identified. Finally, it is shown, that the cytosolic concentrations of IL-1beta and IL-33 were decreased following non-thermal plasma treatment. Thus, modulation of innate immune response by non-thermal plasma treatment of epithelial cells (ENTplas treatment) is concluded.
Macrophages are cells of immune system and distributed throughout the body. They provide the first line of defense against microbial pathogen infections. Using bone marrow macrophages (BMMs) which derived from mice of strain BALB/c and strain C57BL/6, this study aimed to identify the changes in proteome of the macrophages due to IFN gamma stimulation and S. aureus infection. Two quantitative proteomic techniques, two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) were applied in this study. The analysis results indicated that many proteins which play important roles in immunological functions of macrophages were changed due to IFN gamma stimulation and S. aureus infection. This study also identified the differences in proteome of macrophages derived from mice of strain BALB/c in comparing to macrophages of strain C57BL/6.