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Die Therapie des Melanoms sowie die Erforschung neuer Behandlungsmöglichkeiten stehen im Fokus zahlreicher Forschungsgruppen. Um der Komplexität dieser Erkrankung gerecht zu werden, müssen möglichst genaue Modelle gefunden werden. Tumor-Sphäroide als dreidimensionale Tumorzellkulturen schließen dabei teilweise die Lücke zwischen den herkömmlichen zweidimensionalen Zellmonolayern und den Tiermodellen. Hierdurch lassen sich die zelluläre Heterogenität, die Nährstoffverteilung, der Sauerstoffgradient, die Zell-Zell-Interaktionen sowie die Genexpression genauer abbilden und dadurch untersuchen. Arbeiten von Vinci sowie Howes et al. haben gezeigt, dass adäquate In-vitro-Bedingungen notwendig sind, um die Wirkungen von Medikamenten nicht zu über- beziehungsweise unterschätzen (Vinci et al. 2012, Howes et al. 2007). Ziel dieser Arbeit war, ein Verfahren zu etablieren, welches Sphäroide in einen tissue microarray zur Testung von potenziellen neuen Therapeutika zur Verfügung stellt, wobei in dieser Arbeit die Anwendung von kaltem Atmosphärendruckplasma und gepulsten elektrischen Feldern im Mittelpunkt des Interesses stand. Diese Methode von Ivanov und Grabowska (Ivanov & Grabowska 2017) wurde dazu in leicht modifizierter Form angewandt. Verwendet wurden zwei Melanomzelllinien (SK-Mel-28 MNT-1), für die zunächst optimale Wachstumsparameter festgelegt werden mussten, um stets vergleichbare und reproduzierbare Sphäroide mit einer Größe von 300-500 µm zu erhalten. Das etablierte Verfahren ist zeitsparender und ermöglicht eine automatische Bildaufnahme im Hochdurchsatz (high throughput screening) von bis zu 60 Sphäroiden pro Präparat. Die Immunfluoreszenzfärbung stellt aufgrund ihrer hohen Sensitivität und der dadurch möglichen Verkleinerung der Proben eine der wichtigsten Detektionsmethoden der Zukunft dar (Hertzberg et al. 2000). Es wurden parallel vier verschiedene Farbstoffe (DAPI, AlexaFluor 488, Alexafluor 594, AlexaFluor 647) mit zu testenden Targets markiert und mittels des CLS-Gerätes aufgenommen sowie quantitativ ausgewertet. Exemplarisch wurden 21 Fluorophore, innerhalb von sieben thematischen Sets und vier verschiedenen Behandlungsformen (direkte, indirekte Plasmabehandlung, H2O2-Behandlung, µsPEF-Behandlung) betrachtet. Hierdurch wurden unterschiedliche Plasma-induzierende Effekte auf die Zellmorphologie sowie ansatzweise auf die Verteilung innerhalb der Sphäroide untersucht. Bereits lichtmikroskopisch ließen sich eine Auflockerung der Peripherie sowie eine Verdichtung der zentralen Regionen der Sphäroide nach einer direkten Plasmabehandlung beobachten. Mittels der Immunfluoreszenz wurden sowohl bekannte Plasmaeffekte, wie die Apoptoseinduktion plasmabehandelter SK-Mel-28-Sphäroide mit hohen Plasmabehandlungsintensitäten, als auch verschiedene Signalwege, wie die antioxidative Zellantwort, beobachtet. Teilweise wurden kontroverse Ergebnisse gemessen, die die Notwendigkeit der Heterogenitätsanalyse innerhalb der Sphäroidschnitte aufzeigen. Beispielsweise weist die aufgelockerte Peripherie eine besonders hohe Apoptoserate auf, die mittels der TUNEL-IF-Färbung detektiert wurde (Abb. 38; Abb. 39). Zu der gesteigerten Apoptoserate lässt sich eine verstärkte Expression von HMOX1 bei den SK-Mel-28-Sphäroiden nach einer direkten sowie indirekten Plasmabehandlung nachweisen (Abb. 44). Hierraus lassen sich grundsätzliche Plasmaeffekte ableiten, wie die Einbringung von ROS und RNS. Zudem konnte die Größenreduktion der Sphäroiddurchmesser mittels µsPEF-Behandlung sowohl lichtmikroskopisch (Abb. 33) als auch am CLS-Gerät über die Gesamtfläche (Abb. 37) gezeigt werden. Diese Ergebnisse entsprechen denen von Nuccitelli et al. am Mausmodell (Nuccitelli et al. 2006, Nuccitelli et al. 2009). Des Weiteren wurden alternative Methoden angewandt, durch die die Antikörperverteilungen in ganzen Sphäroiden untersucht werden könnte (vgl. Kapitel 3.4.4).
Insgesamt liefert diese Methode, aufgrund der schnelleren sowie kostengünstigeren Durchführbarkeit und der potenziellen Automatisierung am CLS-Gerät, ein ausgesprochen mächtiges Verfahren zur Erforschung neuer Krebstherapien im Labor.
Für den zukünftigen Einsatz von Niedertemperaturplasma in Bereichen der Medizin müssen potentielle genotoxische Risiken von Plasma ausgeschlossen werden. Bisherige Risikoanalysen sind durch die unterschiedlich existierenden Plasmaquellen erschwert, die in den energetischen Einstellungen und Konzentrationen der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) variieren können. Zur Untersuchung des mutagenen Risikopotentials von Argonplasma, erzeugt mit den Plasma-Jets kINPen MED und kINPen 09, wurde auf dem Micronucleustest am angebrüteten Hühnerei (HET-MN), der eine Alternativmethode zwischen in-vitro und in-vivo Tests ist, zurückgegriffen. Die Plasmabehandlung mit Argongas erfolgte in unterschiedlichen Behandlungszeiten am 8. Bebrütungstag auf der inneren Membran des Hühnerembryos. Nach der Blutentnahme am 11. Tag, wurde das Blut im Blutausstrich auf das Vorhandensein von Micronuclei (MN) untersucht. Die gezählten MN der definitiven Erythrozyten (E II) dienten zur Bestimmung der Genotoxizität (MNE II). Die Ergebnisse der Plasmabehandlung mit dem kINPen MED ergaben in der Höchstdosis von einer Behandlungszeit von 10 min keine erhöhten MNE II Werte, obwohl die akute Toxizität bei > 40 % lag. Mit dem kINPen 09 konnten bei einer maximalen Behandlungsdauer von 2,5 min ebenfalls keine erhöhten MNE II Häufigkeiten ermittelt werden. Möglicherweise haben die im Hühnerembryo vorkommenden Abwehr- und Reparatursysteme gegenüber ROS das negative Ergebnis beeinflusst.