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Organic anion transporters 1 and 3 (OAT1 and OAT3) play a crucial role in kidney function by regulating the secretion of multiple renally cleared small molecules and toxic metabolic by-products. Assessing the activity of these transporters is essential for drug development purposes as they can significantly impact drug disposition and safety. OAT1 and OAT3 are amongst the most abundant drug transporters expressed in human renal proximal tubules. However, their expression is lost when cells are isolated and cultured in vitro, which is a persistent issue across all human and animal renal proximal tubule cell models, including primary cells and cell lines. Although it is well known that the overall expression of drug transporters is affected in vitro, the underlying reasons for the loss of OAT1 and OAT3 are still not fully understood. Nonetheless, research into the regulatory mechanisms of these transporters has provided insights into the molecular pathways underlying their expression and activity. In this review, we explore the regulatory mechanisms that govern the expression and activity of OAT1 and OAT3 and investigate the physiological changes that proximal tubule cells undergo and that potentially result in the loss of these transporters. A better understanding of the regulation of these transporters could aid in the development of strategies, such as introducing microfluidic conditions or epigenetic modification inhibitors, to improve their expression and activity in vitro and to create more physiologically relevant models. Consequently, this will enable more accurate assessment for drug development and safety applications.
Identification and Regulation of Tomato Serine/Arginine-Rich Proteins Under High Temperatures
(2021)
Alternative splicing is an important mechanism for the regulation of gene expression in eukaryotes during development, cell differentiation or stress response. Alterations in the splicing profiles of genes under high temperatures that cause heat stress (HS) can impact the maintenance of cellular homeostasis and thermotolerance. Consequently, information on factors involved in HS-sensitive alternative splicing is required to formulate the principles of HS response. Serine/arginine-rich (SR) proteins have a central role in alternative splicing. We aimed for the identification and characterization of SR-coding genes in tomato (Solanum lycopersicum), a plant extensively used in HS studies. We identified 17 canonical SR and two SR-like genes. Several SR-coding genes show differential expression and altered splicing profiles in different organs as well as in response to HS. The transcriptional induction of five SR and one SR-like genes is partially dependent on the master regulator of HS response, HS transcription factor HsfA1a. Cis-elements in the promoters of these SR genes were predicted, which can be putatively recognized by HS-induced transcription factors. Further, transiently expressed SRs show reduced or steady-state protein levels in response to HS. Thus, the levels of SRs under HS are regulated by changes in transcription, alternative splicing and protein stability. We propose that the accumulation or reduction of SRs under HS can impact temperature-sensitive alternative splicing.
Das MRP4(ABCC4)-Protein gehört zur ABC-Transporter-Familie und ist neben einem vielfältigen Expressionsmuster durch ein sehr breites Substratspektrum charakterisiert. Es wird in zahlreichen Geweben, beispielsweise in der Niere, im Gehirn, in Blutzellen und in vaskulären glatten Muskelzellen exprimiert. Das MRP4-Protein vermittelt den Efflux und damit auch Resistenz gegenüber einer großen Anzahl exogener Substanzen, wie z.B. Nukleosid-basierten Standardtherapeutika der antiviralen und zytostatischen Krebstherapie, aber auch den zellulären Export verschiedener endogener Signalmoleküle insbesondere von zyklischen Nukleotiden. Der Export zyklischer Nukleotide durch MRP4 gewann hinsichtlich der Beeinflussung intrazellulärer cAMP-Spiegel in jüngster Vergangenheit immer mehr an Beachtung. Während die Daten zur Expression und zum Substratspektrum von MRP4 schon recht umfangreich sind, ist bislang sehr wenig über die Regulationsmechanismen des Transporters bekannt. Im Hinblick darauf war es das zentrale Thema der vorliegenden Arbeit neue Erkenntnisse bezüglich der Regulation von MRP4 zu gewinnen. Dabei wurden insbesondere zwei Aspekte untersucht, die den Einfluss des zyklischen Nukleotids cAMP auf transkriptioneller und der Proteinkinase C (PKC) auf posttranslationaler Ebene in den Fokus stellen. Mithilfe von Reportergen-Analysen, quantitativer Real-Time PCR sowie proteinanalytischen Methoden konnte gezeigt werden, dass die MRP4-Expression durch eine langanhaltende Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentrationen signifikant erhöht wird. Untersuchungen zu den involvierten Signalwegen dieser Regulation deuten auf eine Beteiligung der direkt durch cAMP aktivierten EPAC-Proteine hin, die über die MEK/ERK Proteinkinasen-Kaskade zur Aktivierung der MRP4/ABCC4-Transkription führt. In der Folge resultiert ein erhöhter Efflux von cAMP und möglicherweise weiterer MRP4-Substrate. Bei dieser Art der Regulation könnte es sich um einen autoregulatorischen feedback-Mechanismus handeln. Pharmakologisch bedeutend könnte dies hinsichtlich einer Langzeittherapie mit cAMP-steigernden Arzneistoffen, beispielsweise Phosphodiesterase-Hemmstoffen oder β-Adrenozeptor-Agonisten, sein, da dieser Rückkopplungsmechanismus zu einer Toleranzentwicklung mit einer Abnahme der Wirkung beitragen kann. Ein weiterer Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf den Einfluss der PKC auf die MRP4Expression und -Lokalisation. Anhand von Transportstudien und Immunfluoreszenzanalysen konnte eine PKC-vermittelte MRP4-Regulation gezeigt werden. Es wurde ein signifikant verringerter Substratexport mit einhergehender Abnahme des MRP4-Anteils in der Plasmamembran in verschiedenen Zellsystemen beobachtet. Dabei wurde nach Aktivierung der PKC eine vermehrte Lokalisation von MRP4 in intrazellulären Vesikeln beobachtet, deren Herkunft aufgrund von Versuchen mit einer Biotin-Markierung der Zelloberfläche der Plasmamembran zugeordnet werden konnte. Im Anschluss an die Internalisierung kam es zur Verschmelzung mit frühen Endosomen, über die durch Recycling-Prozesse der erneute Protein-Einbau in die Membran realisiert werden kann. Untersuchungen mit einer CFP-getaggten MRP4Deletionsvariante ohne die carboxy-terminale PDZ-Bindedomäne ließen auf eine Beteiligung des PDZ-Interaktionsmotivs im Rahmen der PKC-modulierten MRP4Regulation schließen. Möglicherweise kommt es über dieses Bindungsmotiv zu einer Interaktion zwischen MRP4 und möglichen Adapterproteinen, die für diesen regulatorischen Mechanismus notwendig sein könnten. Da keine Zelltyp-abhängigen Unterschiede festgestellt wurden, könnte es sich bei dieser posttranslationalen Art der MRP4-Regulation um einen ubiquitär verbreiteten Mechanismus handeln, der mittlerweile auch für bestimmte andere Transporter beobachtet wurde und in vivo auch die Aufnahme bzw. Elimination von Pharmaka beeinflussen könnte. Diese Arbeit lieferte neue Erkenntnisse zur Regulation von MRP4 auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Durch weitere Untersuchungen sollte die pharmakologische und physiologische Relevanz dieser Regulationsmechanismen noch intensiver charakterisiert werden.