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Staphylococcus (S.) aureus kann viele unterschiedliche Infektionstypen verursachen. Infektionen mit S. aureus können sowohl lokal, als auch systemisch auftreten, und dann zu Bakteriämien oder sogar Sepsis führen. S. aureus ist ein prominentes Beispiel für die aktuelle Antibiotika-Krise. Resistenzen gegenüber zahlreichen Antibiotika erfordern neue Präventions- und Therapieansätze gegen S. aureus-Infektionen. Ideal wäre eine Antikörper-induzierende anti-S. aureus-Vakzine. Bisher sind jedoch alle Vakzinekandidaten in der klinischen Prüfung gescheitert. Aktuell wird daher von einigen Experten bezweifelt, dass S. aureus-spezifische Antikörper überhaupt protektiv wirken können. Dagegen werden nun Th17-Zellen als entscheidende Komponente des Immunsystems bei der Abwehr von S. aureus angesehen. Um die Rolle von Antikörpern bei S. aureus-Infektionen zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit ein Verfahren entwickelt, um die IgG-Bindung an S. aureus-Proteine zu quantifizieren. Eigens für diesen Zweck wurde eine Protein A-negative Mutante des S. aureus-Stamms USA300 hergestellt. Die Bakterien wurden unter Eisenlimitation kultiviert, da sich herausgestellt hat, dass sich dadurch mehr Informationen über die IgG-Bindung an S. aureus-Proteine erhalten ließen. Es wurden Seren von gesunden Probanden und von verschiedenen Patientenkohorten getestet. Die Daten zeigen, dass Erreger-spezifische Antikörper bei S. aureus-Bakteriämie und Zystischer Fibrose zumindest als Marker für die Protektion vor einem schweren Verlauf angesehen werden können. Die Information über die IgG-Bindung an acht S. aureus-Proteine erlaubte die Stratifizierung von Patienten, die während der Bakteriämie eine Sepsis entwickelten von solchen, die keine Sepsis entwickelten. Hinweise, dass die spezifischen Antikörper sogar protektiv wirken, zeigten Untersuchungen der Seren von Hyper-IgE-Syndrom-Patienten. Diese Patienten leiden häufig unter schweren S. aureus-Infektionen. Neben ihrem angeborenen Th17-Zelldefekt mangelte es ihnen auch an S. aureus-spezifischen IgG-Antikörpern. Es konnte gezeigt werden, dass die Substitution spezifischer IgG-Antikörper bei diesen immunkompromittierten Patienten vor neuen S. aureus-Infektionen schützt. Das heißt, dass diese Patienten trotz ihres Th17-Zelldefekts S. aureus besser abwehren können. Diese Daten verdeutlichen das mögliche Potenzial von IgG bei der Protektion vor S. aureus-Infektionen. Neben den beiden Rollen als Kommensale und als Pathogen, wird über eine dritte Rolle von S. aureus diskutiert: S. aureus als Allergen. Die Empfänglichkeit für eine S. aureus-Besiedlung ist bei Th2-dominierten Erkrankungen erhöht. Jedoch ist unbekannt, ob S. aureus aufgrund von Überlebensvorteilen so häufig bei diesen Erkrankungen vorkommt, oder ob das Bakterium sogar selbst diese Th2-dominierte Ausrichtung der Immunantwort durch Allergene induzieren kann. Deshalb sollte in dieser Arbeit nach S. aureus-Allergenen gesucht werden, die diese Qualität der Immunantwort induzieren können. IgG4 diente dabei als Surrogatmarker für eine Th2-Immunantwort. Die IgG4-Bindung aus Seren gesunder Spender an S. aureus-Proteine wurde untersucht. S. aureus-Serinproteasen (SplA bis SplF) stellten sich dabei als die dominanten IgG4-bindenden Proteine heraus. Deshalb wurde die adaptive Immunantwort auf die Spls genauer untersucht. Die IgG-Antwort auf Spls ist in Richtung IgG4 verschoben und Spl-spezifische T-Zellen sezernierten Zytokine, die typisch für eine Th2-Immunantwort sind. Insgesamt zeigen die Daten, dass bereits bei gesunden Probanden die Immunantwort gegenüber Spls in Richtung einer Typ 2 Inflammation verschoben ist. Spls scheinen in der Lage zu sein, durch die Induktion eines entsprechenden Zytokinprofils die Qualität der Immunantwort auf S. aureus zu modulieren. Bei entsprechend prädisponierten Menschen könnte die Immunantwort durch Spls in Richtung Th2 entgleisen. Dann würde allergenspezifisches IgE synthetisiert und eine Allergie ausgelöst werden. Patienten, deren Lunge mit S. aureus besiedelt/infiziert war, besaßen besonders viel Spl-spezifisches IgE. Eine adäquate Immunreaktion gegen S. aureus ist essentiell für die Abwehr des Mikroorganismus. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen heraus, dass S. aureus-spezifische Antikörper – entgegen der Meinung einiger Experten – einen positiven Beitrag leisten können, indem sie vor schweren Infektionsverläufen schützen. Es werden Vorschläge für die Zusammensetzung einer auf Antikörpern basierenden anti-S. aureus-Vakzine aufgezeigt. Aber die Immunreaktion gegen S. aureus kann auch pathologische Folgen haben. Die Ergebnisse dieser Arbeit stützen die Hypothese, dass S. aureus Allergien verursachen kann. Sie liefern außerdem starke Hinweise darauf, dass Spls dabei als Allergene eine Schlüsselrolle einnehmen. Diese Erkenntnis ist neu und unerwartet. Angesichts der weltweiten Bedeutung von Allergien, besonders von Asthma, muss die mögliche Rolle der Spls bei deren Pathogenese mit hoher Priorität weiter aufgeklärt werden.
Tricholoma populinum, der Pappel-Ritterling, ist ein einheimischer, eine Mykorrhiza mit Populus sp. ausbildender Speisepilz. Als in-vitro-Testmodell diente die Quantifizierung der Degranulation von RBL-2H3-Zellen nach Sensibilisierung mit einem IgE-Antikörper und Stimulierung mittels DNP-HSA. Anschließend wurde die Aktivität eines membranständigen Enzyms, der β-Hexosaminidase, im Überstand bestimmt. Es konnte beobachtet werden, dass der DCM-Extrakt aus Fruchtkörpern des Pappel-Ritterlings eine signifikante Inhibition der Degranulation aufwies. Nach Säulenchromatographie an offener Säule konnten aktive und nicht-aktive Fraktionen ausgemacht werden. Eine Aufreinigung des DCM-Extraktes geschah durch SPE, präparative TLC und Säulenchromatographie. Der letzte Aufreinigungsschritt geschah bei allen Substanzen durch semipräparative HPLC. Reinsubstanzen wurden mit MS- und NMR-Techniken charakterisiert. Die aus dem Pappel-Ritterling isolierten Reinsubstanzen aus den Klassen der aliphatischen Säuren und C28-Sterole wiesen einzeln keine Degranulationshemmung im in-vitro-Modell auf. Ein weiterer untersuchter Organismus war Armillaria ostoyae, der Dunkle Hallimasch. Auch der DCM-Extrakt aus Fruchtkörper und Myzel von A. ostoyae zeigte eine signifikante Reduktion der Degranulation. Dieser Effekt konnte erstmals für A. ostoyae festgestellt werden. Fruchtkörper wurden in Wildsammlung erhalten, das Myzel kultiviert und durch molekularbiologische Untersuchung identifiziert. Aus dem Myzel des Dunklen Hallimaschs konnten Sesquiterpen-Arylester isoliert werden. Hierbei handelte es sich um die Melleolide C, H und J, Melledonal C, 10‑Hydroxymelleolide, Armillarin und Armillaridin sowie einen bisher unbekannten Naturstoff, dessen Struktur durch weitere IR- und CD-spektroskopische Untersuchungen bestätigt werden sollte. Des Weiteren wurde auch das Fettsäure-Derivat Linolsäure-Methylester isoliert und mittels NMR identifiziert. Die Substanzen Melleolide H und J verminderten die Degranulation von RBL-2H3-Zellen, Linolsäure-Methylester wies diesen Effekt nicht auf. Eine Zytotoxizitäts-Untersuchung von Extrakten und Reinsubstanzen wurde mittels des Neutral-Red-Uptake-Assay durchgeführt. Die Extrakte von T. populinum und A. ostoyae zeigten zytotoxische Wirkungen. Nach 24 h Inkubationszeit war diese deutlich stärker als nach 1 h. Auch die isolierten Reinsubstanzen wiesen eine Zytotoxizität auf. Der zytotoxische Effekt kann nicht für die Verminderung der Degranulation verantwortlich gemacht werden. Schädigende Effekte wären bereits im Degranulationsassay sichtbar, konnten jedoch bei Konzentrationen um den IC50-Wert nicht beobachtet werden. Der DCM-Extrakt aus dem Fruchtkörper des Pappel-Ritterlings zeigte einen inhibierenden Einfluss auf die Interleukin-2-Freisetzung stimulierter Jurkat-T-Zellen. Die in der mykologischen Literatur als essbar deklarierten Arten T. populinum und A. ostoyae könnten mittel- bis langfristig zumindest unterstützend bei allergischen Reaktionen Anwendung finden. Bei den Untersuchungen zur Qualitätssicherung standen Methoden zur Gehaltsbestimmung von Polysacchariden, β-Glucanen und Agaritin im Mittelpunkt. Diese wurden etabliert, optimiert und validiert. Einen guten Überblick über allgemeine Kohlenhydratgehalte gibt die Anthron-Methode. Bei dieser werden Polysaccharide hydrolysiert und zu Furfuralen umgewandelt, welche mit Anthron zu einem photometrisch bestimmbaren Produkt reagieren. Validierung erwies die Methode als geeignet für die Bestimmung des Gehaltes von Polysacchariden in Pilzextrakten. Weitergehende Informationen über die dreidimensionale Struktur der in Extrakten enthaltenen β-Glucane können durch die Anilinblau-Fluoreszenz-Methode erhalten werden. Die Methode erwies sich als selektiv für β-1,3-d-Glucane und bewies auch bei Untersuchung anderer Validierungsparameter ihre Eignung für eine β-Glucan-Gehaltsbestimmung. Mit der Kongorot-Methode sollen verzweigte β-1,3;1,6-d-Glucane erfasst werden. Diesen Glucanen wird häufig eine immunologische Aktivität zugerechnet. Allerdings erwies sich die Kongorot-Methode für die Informationsgewinnung über eine 3D-Struktur als weniger geeignet, da ihre Sensitivität zu gering und ihre Selektivität zu schwach ausgeprägt ist. Agaritin als Substanz mit interessanten und widersprüchlichen biologischen Effekten. Es wurde eine Methode etabliert, bei der Agaritin aus pulverisierten Fruchtkörpern extrahiert, durch SPE aufgereinigt und mittels LC-MS/MS und MRM im positiven Ionisationsmodus bestimmt wurde. Die Quantifizierung geschah mithilfe der Extern-Standard-Kalibration mit Agaritin als Referenzsubstanz. Die untersuchte Methode ist dazu geeignet, Agaritin zu quantifizieren, was durch die durchgeführte Validierung belegt wurde.
In summer 2017, the World Health Organization published 10 facts on asthma, which is known as a major non-communicable disease of high clinical and scientific importance with currently several hundred million people—with many children among them—suffering from air passages inflammation and narrowing. Importantly, the World Health Organization sees asthma as being underdiagnosed and undertreated. Consequently, much more efforts in clinical disease management and research need to be spent on reducing the asthma-related health burden. Particularly, for young approximately 6 months aged patients presenting recurrent bronchitic respiratory symptoms, many parents anxiously ask the doctors for risk prognosis for their children's future life. Therefore, we urgently need to reevaluate if the current diagnostic and treatment measures are in concordance with our yet incomplete knowledge of pathomechanisms on exacerbation. To contribute to this increasing concern worldwide, we established a multicentric pediatric exacerbation study network, still recruiting acute exacerbated asthmatics (children >6 years) and preschool asthmatics/wheezers (children <6 years) since winter 2018 in Germany. The current study that has a currently population comprising 176 study participants aims to discover novel holistic entry points for achieving a better understanding of the poorly understood plasticity of involved molecular pathways and to define biomarkers enabling improved diagnostics and therapeutics. With this study description, we want to present the study design, population, and few ongoing experiments for novel biomarker research.
Clinical Trial Registration: German Clinical Trials Register (Deutsches Register für Klinische Studien, DRKS): DRKS00015738.
Staphylococcus aureus (S. aureus) can secrete a broad range of virulence factors, among which staphylococcal serine protease-like proteins (Spls) have been identified as bacterial allergens. The S. aureus allergen serine protease-like protein D (SplD) induces allergic asthma in C57BL/6J mice through the IL-33/ST2 signaling axis. Analysis of C57BL/6J, C57BL/6N, CBA, DBA/2, and BALB/c mice treated with intratracheal applications of SplD allowed us to identify a frameshift mutation in the serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade A, and member 3I (Serpina3i) causing a truncated form of SERPINA3I in BALB/c, CBA, and DBA/2 mice. IL-33 is a key mediator of SplD-induced immunity and can be processed by proteases leading to its activation or degradation. Full-length SERPINA3I inhibits IL-33 degradation in vivo in the lungs of SplD-treated BALB/c mice and in vitro by direct inhibition of mMCP-4. Collectively, our results establish SERPINA3I as a regulator of IL-33 in the lungs following exposure to the bacterial allergen SplD, and that the asthma phenotypes of mouse strains may be strongly influenced by the observed frameshift mutation in Serpina3i. The analysis of this protease-serpin interaction network might help to identify predictive biomarkers for type-2 biased airway disease in individuals colonized by S. aureus.
Staphylococcus aureussuperantigens (SAgs) are among the most potent T cell mitogensknown.They stimulate large fractions of T cells by cross-linking their T cell receptor withmajor histocompatibility complex class-II molecules on antigen presenting cells, resulting in Tcell proliferation and massive cytokine release. To date, 26 different SAgs have been described in thespeciesS. aureus; they comprise the toxic shock syndrome toxin (TSST-1), as well as 25 staphylococcalenterotoxins (SEs) or enterotoxin-like proteins (SEls). SAgs can cause staphylococcal food poisoningand toxic shock syndrome and contribute to the clinical symptoms of staphylococcal infection. Inaddition, there is growing evidence that SAgs are involved in allergic diseases. This review providesan overview on recent epidemiological data on the involvement ofS. aureusSAgs and anti-SAg-IgEin allergy, demonstrating that being sensitized to SEs—in contrast to inhalant allergens—is associatedwith a severe disease course in patients with chronic airway inflammation. The mechanisms by whichSAgs trigger or amplify allergic immune responses, however, are not yet fully understood. Here, wediscuss known and hypothetical pathways by which SAgs can drive an atopic disease
In cystic fibrosis (CF) infectious and allergic airway inflammation cause pulmonary exacerbations that destroy the lungs. Staphylococcus aureus is a common long-term colonizer and cause of recurrent airway infections in CF. The pathogen is also associated with respiratory allergy; especially the staphylococcal serine protease-like proteins (Spls) can induce type 2 immune responses in humans and mice. We measured the serum IgE levels specific to 7 proteases of S. aureus by ELISA, targeting 5 Spls (76 CF patients and 46 controls) and the staphopains A and B (16 CF patients and 46 controls). Then we compared cytokine release and phenotype of T cells that had been stimulated with Spls between 5 CF patients and 5 controls. CF patients had strongly increased serum IgE binding to all Spls but not to the staphopains. Compared to healthy controls, their Spl-stimulated T cells released more type 2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13) and more IL-6 with no difference in the secretion of type 1- or type 3 cytokines (IFNγ, IL-17A, IL-17F). IL-10 production was low in CF T cells. The phenotype of the Spl-exposed T cells shifted towards a Th2 or Th17 profile in CF but to a Th1 profile in controls. Sensitization to S. aureus Spls is common in CF. This discovery could explain episodes of allergic inflammation of hitherto unknown causation in CF and extend the diagnostic and therapeutic portfolio.