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Die Mechanismen, die zur Adaption quergestreifter Muskulatur an extrinsische und intrinsische Bedingungen führen, sind heute zu großen Teilen ungeklärt.
In Muskeldystrophien sind die Bedingungen für Muskelentwicklung, Wachstum und Adaption verändert, was den Muskel einer progredienten Degeneration unterwirft. Die Rolle der Familie der TRP-Ionenkanäle für diese Veränderung der Bedingungen ist hier Gegenstand
der Forschung. Aktuell wird die Rolle der ubiquitär exprimierten Kanäle mit
der Sensorik von Geschmack, Temperatur, Osmolarität, Nozizeption sowie taktiler Reize angegeben. Mit dem Nachweis der Mechanosensitivität des TRPV4-Kanals wurde dessen
Bedeutung in Muskelfasern stärker erforscht.
In der vorliegenden Dissertation wurde in diesem Zusammenhang die Frage nach einer möglichen Rolle der Kanäle in der Pathophysiologie von Muskeldystrophien gestellt
und demgemäß sowohl Beobachtungen am TRPV4-defizienten, als auch am Dystrophin-defizienten Mausmodell durchgeführt. Dazu wurden Untersuchungen an repräsentativen
Unterschenkelmuskeln (m. soleus, m. tibialis anterior, m. extensor digitorum longus) und dem Haupt-Atemmuskel (Zwerchfell) am trpv4-knock-out-Mausmodell durchgeführt und mit
dem korrespondierenden Wildtyp verglichen. Dieselben Analysen wurden gleichermaßen
am allgemein akzeptierten Mausmodell für die Duchenne Muskeldystrophie umgesetzt
und ebenfalls dem korrespondierenden Wildtyp gegenübergestellt. Die im dystrophen mdx-Modell typischen Veränderungen der Skelettmuskulatur (Dissemination der Faserkaliber,
Bindegewebsvermehrung und Fasertypen-Shift) wurden erwartungsgemäß nachgewiesen.
Es ergab sich eine signifikante Abweichung der Varianz der Faserkaliber in
den HE-gefärbten Muskelquerschnitten. Diese Unterschiede konnten beim Vergleich der
TRPV4-defizienten Mutante mit ihrem Wildtyp nicht nachgewiesen werden. Die in der DMD typische Zunahme von Bindegewebe im Muskelquerschnitt stellte sich in unseren
Versuchen deutlich dar. Für alle vier untersuchten Muskeln zeigte sich nach Auswertung
Sirius-Red-gefärbter Muskelquerschnitte ein etwa doppelt so großer Anteil an Bindegewebe wie im Wildtyp. Im Vergleich der TRPV4-defizienten Mutante mit ihrem Wildtyp ergab sich kein signifikanter Unterschied in Bezug auf den Bindegewebsanteil. Der in der
DMD bekannte Untergang schnellerer Muskelfasern und die Neubildung langsamerer
Fasern (Fasertypen-Shift) deutete sich in unseren Untersuchungen zur immunhistochemischen
Fasertypisierung an. Bei geringer Größe der Stichprobe konnten jedoch kaum
statistisch signifikante Unterschiede nachgewiesen werden. Im Vergleich der Fasertypisierung
der TRPV4-defizienten Mutante mit ihrem korrespondierenden Wildtyp ergaben sich nahezu keine Unterschiede.
Zusammengefasst ergaben sich in unseren histologischen Untersuchungen im Wesentlichen
keine signifikanten Unterschiede zwischen der Skelettmuskelkonstitution der trpv4-knock-out-Mutante und ihrem Wildtyp. So kann geschlussfolgert werden, dass die Abwesenheit des
TRPV4-Kationenkanals keine Auswirkung auf das Wachstum und die Entwicklung der
untersuchten quergestreiften Muskulatur hat und insbesondere nicht zu den bei der DMD typischen Veränderung der Muskelkonstitution führt.
Diese Ergebnisse lassen den generellen therapeutischen Einsatz von spezifischen TRPV4-Blockern mannigfaltiger Erkrankungen (beispielsweise des Rechtsherz-Insuffizienz-bedingten Lungenödems) noch verheißungsvoller erscheinen, da zunächst von unerwünschten Wirkungen in Bezug auf die Skelettmuskelkonstitution nicht ausgegangen werden muss.
Im Falle eines noch zu erbringenden Nachweises einer bedeutsamen Rolle für die Pathophysiologie
in Muskeldystrophien könnte eine spezifische Hemmung womöglich zur Verbesserung der Kalzium-Homöostase beitragen, ohne dass schwere Fehlentwicklungen
befürchtet werden müssen.
Der TRPV4 ist Mitglied einer Gruppe nicht selektiver Kationenkanäle und gehört der Transient-Rezeptor-Potential-Vanilloid Familie an. Neben seiner Bedeutsamkeit für die zelluläre Calciumhomöostase besitzt der Kanal auch eine Permeabilität für Mg2+ und Na+. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentrationen in untransfizierten und in TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen mit dem Calcium-Imaging Verfahren gemessen.
Untersucht wurde der Unterschied der Fluoreszenzratio in Ruhe von untransfizierten und TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen, sowie der Einfluss von TRPV4-Agonisten, TRPV4-Antagonisten und des Spinnentoxins GsMTx4 auf die Calciumhomöostase von untransfizierten und TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen.
Es konnte nachgewiesen werden, dass ein Großteil der TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen durch eine Überexpression des Kanals, im Vergleich zu untransfizierten HEK293 Zellen, eine deutlich erhöhte Fura-2-Fluoreszenzratio im Sinne eines erhöhten intrazellulären Calciumspiegels [Ca2+]i aufwiesen. Dabei zeigten sich die transfizierten HEK293 Zellen in ihrer Fluoreszenzratio variabel. Sie reichte von nahezu physiologischen Werten, wie sie bei untransfizierten HEK293 Zellen (Fura-2-Fluoreszenzratio etwa 0,4) zu beobachten sind, bis hin zu deutlich erhöhten Werten (Fura-2-Fluoreszenzratio bis >2).
Mit den verwendeten selektiven TRPV4-Blockern GSK2193874 und HC067047 konnte die Fura-2-Fluoreszenzratio mit und ohne vorherige TRPV4-Aktivierung gesenkt werden. Auch in Zellen mit einem deutlich erhöhten Ca2+-Spiegel konnte dieser nahezu auf seinen physiologischen Ruhelevel gesenkt werden.
Die Fura-2-Fluoreszenzratio von TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen ohne vorherige Aktivierung konnte durch GsMTx4 konzentrationsabhängig gesenkt werden. Bei einer Konzentration von 1µM GsMTx4 war eine relativ geringe, bei 5µM GsMTx4 eine deutliche Absenkung zu beobachten.
Nach Aktivierung des TRPV4 durch einen Agonisten konnte das Spinnentoxin GsMTx4 in konzentrationsabhängiger Weise die zellulären Ca2+-Level reduzieren. Bedingt durch seine nicht selektive Wirkung, führt GsMTx4 bei untransfizierten HEK293 Zellen zu einem gewissen Anstieg der Fluoreszenzratio. Dieser Effekt konnte allerdings durch die Zellen kompensiert werden. Welche zelleigenen Mechanismen dies ermöglichten, könnte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Das Spinnentoxin GsMTx4 hat in TRPV4 transfizierten HEK293 Zellen, in Abhängigkeit seiner Konzentration und einer vorherigen Aktivierung, einen Einfluss auf den intrazellulären Calciumspiegel [Ca2+]i. Bei einer Überexpression des Kanals kommt es zu einer gestörten Calciumhomöostase. Im Hinblick auf den Pathomechanismus von Erkrankungen, welche mit einem erhöhten intrazellulären Calciumspiegel einhergehen, ist eine Beteiligung des TRPV4 durchaus vorstellbar.
Der TRPM7-Kanal ist ubiquitär exprimiert (Montell et al., 2005) und an multiplen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt (Monteilh-Zoller et al., 2003). Durch TRPM7-Knockdown mittels siRNA wurde in dieser Arbeit versucht, die Bedeutung des Ionenkanals für die Differenzierungsfähigkeit von kultivierten Muskelzellen zu untersuchen. In Vorversuchen erfolgte die Etablierung der siRNA-Transfektionstechnik mit HEK293-Zellen nach zwei unterschiedlichen Protokollen. Zunächst konnte der TRPC6-Knockdown an TRPC6 überexprimierenden HEK293-Zellen gezeigt werden. Das Vorgehen wurde anschließend auf den zu untersuchenden Kanal TRPM7 in C57Bl-Zellen übertragen. Dazu musste die Methodik wiederholt abgewandelt werden, um möglichst viele vitale und transfizierte Zellen zu erhalten. Als Kontrollen dienten untransfizierte Zellen, mit unspezifischer siRNA-transfizierte Zellen und mit HiPerFect, dem Transfektionsreagenz, behandelte Zellen. Letztendlich konnte eine ausreichende Anzahl der transfizierten Zellen bezüglich ihrer Proliferation und Differenzierung anhand von zwei Differenzierungsmarkern, dem Ryanodinrezeptor 1 und dem SCN4A, untersucht werden. Dabei zeigten sich die folgenden Ergebnisse: Ein bis zwei Tage nach der Transfektion mit spezifischer siRNA zeigte sich eine verminderte Expression des TRPM7 in Muskelzellkulturen von ca. 50% im Vergleich zu den Kontrollen. Die Differenzierung der siRNA-transfizierten Zellen zeigte sich mikroskopisch deutlich eingeschränkt. Die Hemmung der TRPM7-Expression verlangsamte die Proliferation und Differenzierung der kultivierten Muskelzellen. Die beschriebenen Auswirkungen ließen sich aber nicht nur bei den siRNA-transfizierten Zellen, sondern teilweise auch bei Einsatz des HiPerFectes ohne zusätzliche siRNA erkennen. Die untransfizierten Zellen differenzierten – wie erwartet – am besten. Die Differenzierung der transfizierten Zellen war nicht abhängig von der Menge der siRNA. Die muskelspezifischen Marker, der Ryanodinrezeptor 1 und der spannungsgesteuerte Na+-Kanal SCN4A, waren nach siRNA-Anwendung gegen den TRPM7 tendenziell vermindert. Es zeigte sich jedoch auch eine Reduktion der Differenzierungsmarker in den transfizierten Kontrollgruppen. Zusammenfassend scheint der TRPM7 für Zellproliferation und Differenzierung von Muskelzellen relevant zu sein. Die C57Bl-Zellen reagierten allerdings recht sensitiv auf Transfektionen, so dass diesbezüglich nur eine eingeschränkte Aussage getroffen werden kann. Wegen seiner ubiquitären Expression, seiner Beteiligung an diversen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen und seiner bedeutenden Rolle für die Mg2+-Homöostase bleibt der TRPM7 ein höchst interessanter und relevanter Ionenkanal.
TRPC3 und TRPC6 sind Mitglieder der nicht selektiven Kationenkanäle aus der Superfamilie der „Transient Receptor Potential“-Kanäle (TRP-Kanäle). In der Erforschung der patho-physiologischen Abläufe der Duchenne Muskeldystrophie und des damit einhergehenden gestörten intrazellulären Kalziumhaushalts rückten besagte Kanäle als mögliche verursachende Kandidaten in den Fokus der Aufmerksamkeit. TRP-Kanäle weisen eine große Zahl unterschiedlichster Aktivierungsmechanismen auf, einer davon ist die Translokation. Diesen Mechanismus hat man für TRPC3 und TRPC6 bereits an verschiedenen Zellkulturen und Zelllinien feststellen können. Den Nachweis einer Translokation in ausdifferenzierten Skelettmuskelzellen gab es bisher nicht und war Gegenstand dieser Arbeit. An Skelettmuskelzellen von mdx-Mäusen sowie an solchen von Kontroll-Mäusen wurden geeignete Experimente zur Translokation der Kanäle durchgeführt. Dazu wurden die Zellen mit schon bekannten Stimulantien wie Gadolinium, EGF und Thapsigargin inkubiert. Immunfluoreszenzfärbungen der Kanalproteine ergaben interessante Neuigkeiten zur zellulären Lokalisation und Translokation von TRPC3 und TRPC6 in normalen und Dystrophin-defizienten (mdx) Muskelfasern.
Hintergrund: Die Körperlänge wird maßgeblich vom Wachstum der Wirbelsäule bestimmt. Bei Untersuchungen an der Wirbelsäule von BB.4Sd1- und BB.4Sd2- Ratten wurden Körperlängenunterschiede festgestellt, obwohl phänotypische Differenzen der Stämme nicht zu erwarten sind, da beide Rattenstämme kongen sind. Hypothese: Es sind Größendifferenzen der Wirbelparameter zwischen den Stämmen BB.4Sd1 und BB.4Sd2 vorhanden, die durch das Knochenwachstum beeinflusst werden. Methoden und Material: Es wurden 28 Tiere untersucht: 10 Tiere des Stammes BB.4Sd1 (D1) (5f/5m), 7 Tiere des Stammes BB.4Sd2 (D2) (3f/4m) sowie 11 Tiere des Stammes BB/OK (6f/5m) als Kontrollgruppe. Die Tiere wurden am Ende ihrer 32. Lebenswoche nach Bestimmung metabolischer Blutparameter (Insulin, Leptin, Triglyzeride, Gesamtcholesterin) getötet. Nach dem Wiegen erfolgte die Entnahme der Wirbelsäulen in toto und nach der Mazeration die Messung von je 12 Parametern an 6 Lendenwirbeln jedes Tieres. Ergebnisse: Die Lendenwirbel L1-L6 zeigten innerhalb des Stammes und des Geschlechts ähnliche Größenverhältnisse zueinander. Zwischen den Stämmen wurden signifikante Größenunterschiede (p < 0,05) ermittelt. Für die Mittelwerte aller Parameter gilt mit Ausnahme der Spinalkanalmaße (keine signifikanten Unterschiede zwischen den Stämmen) BB.4Sd2 > BB.4Sd1 > BB/OK. Diskussion: Für die festgestellten phänotypischen Unterschiede können genetische Varianten oder Mutationen in dem Genabschnitt verantwortlich sein, der beide Stämme vom Ursprungsstamm BB/OK unterscheidet. In der Arbeit wird der Einfluss der in diesem Abschnitt vorhandenen Gene Crhr2 und Ghrhr und der das Körperfett beeinflussenden Gene Npy oder Repin1 auf das Wachstum, insbesondere vermittelt durch das Wachstumshormon GH, diskutiert. Fazit: Die Hypothese eines Wirbelgrößenunterschieds zwischen den kongenen Rattenstämmen BB.4Sd1 und BB.4Sd2 wurde bestätigt. Da genetische Ursachen wahrscheinlich sind, ist eine Sequenzierung und Expressionsanalyse der Gene des übertragenen Abschnittes beider Stämme im nächsten Schritt notwendig. Die Analyse der Mechanismen hat wegen der Analogie der Wachstumssteuerung bei Mensch und Ratte klinische Bedeutung.
Die Muskeldystrophie Duchenne wird X-chromosomal vererbt und ist die häufigste Muskelerkrankung im Kindesalter. Ursächlich ist eine Mutation im Dystrophin-Gen auf der Position Xp21. Einer der Hauptfaktoren für die Krankheitsentstehung ist die intrazelluläre Ca2+-Überladung der Dystrophin-defizienten Muskelzellen. Diese resultiert vermutlich aus einem gesteigerten Ca2+-Einstrom in die Dystrophin-defiziente Muskelzelle über spezifische Kationenkanäle. Zunehmend in Betracht gezogen werden hier die TRP- (transient receptor potential) Kanäle. Ziel dieser Arbeit war es, mittels molekularbiologischer Methoden, ausgewählte TRP-Kanäle zu untersuchen. Es sollten diejenigen Ca2+-Kanäle identifiziert werden, denen bei der Muskeldystrophie Duchenne eine pathogenetische Bedeutung zukommt. Dies soll zukünftig eine gezielte pharmakologische Interventionsmöglichkeit zur Behandlung der Muskeldystrophie Duchenne eröffnen. Zu diesem Zweck wurden Myozyten (immortalisierte Dystrophin-positive IMO-Zellen und Dystrophin-negative IMORTO-MDX- oder SC-5 Zellen) während der Muskelzellproliferation und -differenzierung betrachtet. Die mRNA-Expressionen der TRP-Kanäle TRPC3, TRPC6, TRPM4, TRPM7 und TRPV4, die intrazellulären Lokalisationen von TRPC3, TRPC6, TRPM7 und TRPV4 sowie die Protein- Expression von TRPC3 wurden bestimmt. Ferner wurde die Abhängigkeit der Expression von TRPC3, TRPM4 und TRPV4 von unterschiedlichen externen Ca2+- Konzentrationen in beiden Zelllinien untersucht. Während der Muskelzelldifferenzierung stiegen die mRNA-Expressionen von TRPC3 und TRPM4 sowohl in den SC5- als auch in den IMO-Zellen an. TRPC3 wurde darüber hinaus in den IMO-Zellen am Ende des Differenzierungszeitraumes im Myotubenstadium signifikant mehr exprimiert als in den SC-5-Zellen. TRPC3 war vornehmlich intrazellulär lokalisiert, eine Plasmamembranständigkeit in den SC-5 Zellen ist nicht auszuschließen. Für TRPC6 konnte auf mRNA-Ebene in beiden Zelllinien eine vergleichbare Expression während der Proliferation detektiert werden. Während der Differenzierung stieg die Expression von TRPC6 in den SC-5-Zellen an, fiel jedoch in den IMO-Zellen ab. TRPC6 könnte somit als Marker der Muskeldystrophie fungieren. Die Lokalisation von TRPC6 scheint in den SC-5-Zellen sowohl perinukleär als auch sarkolemmal vorzuliegen. Die Expression von TRPM7 stieg in den IMO-Zellen während der Differenzierung, blieb hingegen in den SC-5-Zellen aus. Für TRPV4 konnten keine Expressionsunterschiede det ektiert werden. Die Ergebnisse sprechen für eine Beteiligung der Kanäle TRPC3, TRPC6 und TRPM7 an der Pathogenese der Muskeldystrophie Duchenne. Sie könnten als pharmakologische Angriffspunkte in der Therapie der Duchenne-Muskeldystrophie in Betracht kommen und sollten daher weiter untersucht werden.
Als Teil der TRP-Ionenkanalfamilie handelt es sich bei dem TRPV4 um einen nicht selektiven Kationenkanal mit einer höheren Spezifität gegenüber Kalziumionen im Ver-gleich zu anderen Kationen. Dieser Kanal ist bereits in einer Vielzahl von Geweben mit unterschiedlichen Funktionen beschrieben worden, über seine genaue Funktion in der quergestreiften Muskulatur ist jedoch bisher wenig bekannt. Untersuchungen an Dystrophin-defizienten-Mausmuskelfasern – einem Modell für die Muskeldystrophie vom Typ Duchenne – zeigten einen erhöhten intrazellulären Kalzi-umgehalt auf, der für die pathogenetischen Veränderungen wie Muskelzellnekrosen und verstärkter Fibrosierung im Rahmen dieser Erkrankung verantwortlich gemacht wird. Durch seine hohe Ionenselektivität und dadurch bedingte Einflussnahme auf die Kalzi-umhomöostase ist eine Beteiligung des TRPV4 in diesem Zusammenhang denkbar. Pritshow et. al. konnten zudem zeigen, dass der TRPV4 Kanal in quergestreifter Musku-latur eines Wildtyp-Mausmodells unter gezielter Stimulation positiven Einfluss auf die maximale Kraftentwicklung und Ermüdungserscheinungen nimmt. Auf Basis dieser Erkenntnisse sind in der vorliegenden Arbeit elektrophysiologische Untersuchungen des TRPV4 Kanals mit den spezifischen Kanalaktivatoren 4α-PDD und GSK1016790A an isolierten TRPV4 Wildtyp-und Knockout-Skelettmuskelfasern der Maus durchgeführt worden. Untersuchungsgegenstand waren dabei mittels Kalium-chlorid induzierte Kalziumtransienten, die sich unter dem Einfluss der TRPV4 Kanalak-tivität veränderten. Die Ergebnisse zeigten, dass 4α-PDD in Wildtyp-Skelettmuskelfasern zu einer höheren Offenheitswahrscheinlichkeit des TRPV4 und damit auch zu einem vermehrten Ein-strom an Kalziumionen, erkennbar am langsameren Abklingen des Transienten, führt. Im Gegensatz dazu führte die Stimulation mit 4α-PDD in TRPV4 Knockout-Skelettmuskelfasern zu einem schnelleren Abklingen des Transienten im Vergleich zur Kontrolle – ein Effekt, der bis dato in der Literatur nicht erklärt werden kann. Des Wei-teren erreichten die induzierten Kalziumtransienten schneller das Maximum, Grund hierfür könnte eine mögliche Gegenregulation anderer TRP-Kanäle sein. Die Anwendung des selektiven TRPV4 Kanalaktivators GSK1016790A ergab keine signifikanten Veränderungen im Vergleich zur unstimulierten Situation. Da es bisher keine Daten zur Verwendung von GSK1016790A im Zusammenhang mit Skelettmus-kelfasern gibt, die zum Vergleich herangezogen werden konnten, sind Aussage-und Interpretationsmöglichkeiten bezüglich Validität und Reliabilität begrenzt. Die Einflussnahme des TRPV4 auf die gemessenen Kalziumtransienten und der dadurch erzielten Modulation der Kalziumhomöostase in isolierten Skelettmuskelfasern ist durch die Ergebnisse belegt. Welche Interventionsmöglichkeiten sich damit bezüglich der Duchenne Muskeldystrophie ergeben, sollte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der genetischen Grundlage der essentiellen Hypertonie. Viele Experimente konnten Genorte finden, die an der Blutdruckregulation beteiligt sind und bei Mutation zu Anstiegen des Blutdruckes führen. Bisher wurden jedoch keine Gene gefunden, die eine essentielle Hypertonie verursachen. Mittels der phänotypischen Selektion auf Bluthochdruck wurden Rückkreuzungshybriden aus normotensiven BB/OK Ratten und spontanhypertensiven SHR/Mol Ratten gezüchtet und im Anschluss mit Mikrosatellitenmarkern auf Veränderungen im Genom untersucht. Der Tierexperimentelle Teil dieser Arbeit und eine erste Untersuchung des Genoms mit 259 Mikrosatellitenmarkern wurde bereits 1997 durchgeführt [Klöting I. et al. 1997]. Die genaue Beschreibung des Rattengenoms und daraus resultierend die Vervielfachung der Mikrosatellitenmarker zur Analyse des Genoms machten eine Weiterführung der Arbeit sinnvoll. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Genom der Rückkreuzungshybriden mithilfe von weiteren 509 Mikrosatellitenmarkern auf Unterschiede im Vergleich zu normotensiven BB/OK Ratten untersucht. Wie bereits 1998 konnten auf Chromosom 14 Genorte ausgemacht werden, die nicht ausschließlich BB/OK zuzuordnen waren, sondern stattdessen Eigenschaften der spontanhypertensiven SHR-Mol Rattenlinie zeigten. Mithilfe der DNA-Sequenzierung konnten auf Chromosom 3 Mutationen entdeckt werden, die im kodierenden Bereich für das Gen Rnd3 liegen. Dieses Gen spielt eine Rolle bei der Hemmung der Ausbildung von Stressfasern. Diese Proteine verankern Zellen über Fokalkontakte an der Plasmamembran und sind unter anderem in den großen Gefäßen und dem Myokard zu finden. Hieraus lässt sich eine Relevanz für die Ausprägung von Hypertonie ableiten. Weitere Veränderungen im Genom der Rückkreuzungstiere konnten nicht gefunden werden. Hieraus kann man schlussfolgern, dass bei guter Abdeckung des Genoms der Ratten nur wenige bestimmende Gene eine Rolle bei der Ausprägung der Hypertonie spielen. Die Annahme, dass die essentielle Hypertonie über eine Vielzahl von Genen vererbt wird, erscheint anhand der gefundenen Ergebnisse unwahrscheinlich und bestätigt Ergebnisse der Entwicklung einer hypertonen Wistarratte von Okamato et al. 1966 [Udenfriend S. Et al. 1976]. Ob es sich bei den Veränderungen, die entdeckt wurden, um hauptursächliche Gene der essentiellen Hypertonie handelt, kann mit dieser Arbeit nicht geklärt werden. Klöting I. et al 1997: Klöting I, Kovacs P, Kuttler B, Phenotypic consequences after restoration of lymphopenia in the diabetes-prone BB/OK rat, Biochem Biophys Res Commun, 1997, Vol. 239 No. 1, 106-110 Udenfriend S. et al 1976: Udenfriend S., Bumpus F.M., Foster H.L., Freis E.D., Hansen C.T., Lovenberg W.M., Yamori Y., Spontaneously hypertensive (SHR) rats: Guidelines for breeding, care, and Use, ILAR
Die Duchenne Muskeldystrophie stellt eine X-chromosomal rezessiv vererbte, schwere Form der Muskeldystrophie dar. Die Ursache ist eine Mutation im Dystrophingen und die Folgen äußern sich in Muskelschwäche, Muskelfasernekrosen und einer verstärkten Fibrosierung. Der genaue Pathomechanismus ist noch nicht abschließend geklärt. Durch Muskelbiopsien von DMD Patienten und mit Hilfe des homologen Tiermodells, der mdx-Maus, konnte herausgefunden werden, dass der intrazelluläre Kalziumgehalt der Dystrophin-defizienten Muskelfasern erhöht ist. Einen möglichen Therapieansatz könnte die Blockierung von Kationenkanälen der Muskelfasermembran, die den pathologischen Kalziumeinstrom ermöglichen, darstellen. In vorangegangenen Arbeiten werden die TRP-Kanäle (Transient Receptor Potential channels) für den pathologischen Kalziumeinstrom mitverantwortlich gemacht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus in erster Linie auf einen Vertreter der TRP-Kanal-Superfamilie, den TRPV4, gelegt. Zu diesem Zweck wurde die TRPV4-Knock out Maus näher untersucht. Zunächst führte man eine Standardhistologie mit Hilfe von HE, Sirius RED und ATPase-Färbung durch. Sowohl die Faserkaliberbestimmung als auch die Messung des Bindegewebsanteils zeigten keine Unterschiede zum Wildtypen. Eine anschließende Genstudie mittels RT-PCR ermöglichte die Quantifizierung der mRNA Expression von 22 TRP-Kanälen in der murinen Skelettmuskulatur. Dabei sollte in dieser Arbeit unter anderem die Frage einer möglichen Gegenregulation anderer-Kanäle auf Grund des TRPV4-Mangels in der TRPV4-KO Maus geklärt werden. Des Weiteren wurde auch ein Vergleich der mRNA Kanal-Expression zwischen schnellen (EDL) und langsamen (SOL) Muskel vorgenommen. Die Untersuchungen zeigten, dass von den 22 analysierten TRP-Kanälen 16 auf mRNA Ebene exprimiert werden. Dabei wiesen TRPV2 und TRPV3 eine erhöhte mRNA Expression in der TRPV4-KO Mutante im Vergleich zum Wildtyp auf. Signifikant war dieser Unterschied für TRPV2 im M. soleus und für TRPV3 in allen drei untersuchten Skelettmuskeln (TA, EDL, SOL). Dies könnte für eine Gegenregulation dieser 2 TRP-Kanäle in TRPV4-defizienten Muskelfasern sprechen. Des Weiteren wurde eine signifikant verstärkte mRNA Expression von TRPM3, M4, M6, M8, V2, V4, und V6 im langsam zuckenden M. soleus im Vergleich zum schnell zuckenden EDL beobachtet. Dies trifft sowohl für die TRPV4-KO als auch für die WT Mäuse zu und könnte für eine stärkere Expression dieser TRP-Kanäle in den langsamen TYP 1 Fasern des M. soleus sprechen. Aus den vorliegenden Ergebnissen geht hervor, dass im Falle des Verlustes eines TRP-Kanals höchstwahrscheinlich andere Vertreter dieser Kanalfamilie in der Lage sind durch eine verstärkte Expression den Mangel zu kompensieren. Dies gilt es im Rahmen einer möglichen Therapie der Duchenne Muskeldystrophie, zum Beispiel mit Hilfe von TRP-Kanalblockern, zu beachten.
Der TRPC6 Kanal ist Teil einer Familie nicht selektiver Kationenkanäle, den Transient-Receptor-Potential-Canonical Kanälen. Der TRPC6 Kanal ist durch Diacylglycerol (DAG), ein Spaltprodukt der Phospholipase C, aktivierbar. Durch den Kinaseinhibitor ML-9 kann er inaktiviert werden. In der Skelettmuskulatur von Wildtyp-Mäusen und Dystrophin-defizienten mdx-Mäusen wird der TRPC6 Kanal stark exprimiert. Eine Beteiligung des TRPC6-Kanals am Store-Operated-Calcium-Entry (SOCE) wurde ebenso diskutiert wie ein Vorliegen als Rezeptor-gesteuerter Ionenkanal (ROC). In dieser Arbeit wurde der Kalziumeinstrom des Sarkolemms mit Hilfe der Mangan-Quench-Technik an Mäuseskelettmuskelzellen untersucht. Der TRPC6 Kanal wurde mittels ML-9 inhibiert mit dem Ziel einen möglichen Einfluss auf den Kalziumeinstrom in die Skelettmuskelzellen der Mäuse zu untersuchen. Dies geschah sowohl in Ruhe als auch nach Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher. Es konnte nachgewiesen werden, dass der TRPC6 Kanal nicht zum Ruhekalziumeinstrom in der Skelettmuskulatur beiträgt. Er ist dort zwar hoch exprimiert, jedoch unter Ruhebedingungen nicht aktiv. Da der Kanal durch DAG und auch Hyperforin aktivierbar ist, spricht dies für ein Vorliegen als Rezeptor-gesteuerter Kanal in Skelettmuskelzellen. Durch die Anwendung des SERCA-Inhibitors Thapsigargin konnte der SOCE sowohl in Wildtyp- als auch mdx-Skelettmuskelzellen dargestellt werden. Nach Vorinkubation mit Thapsigargin zeigte sich jeweils ca. eine Verdoppelung der Quenchraten im Vergleich zu den Ruhebedingungen. Auch nach Entleerung der Kalziumspeicher blieb der TRPC6 Kanal inaktiv. Der TRPC6-Kanal ist am SOCE-Mechanismus, zumindest in Mäuseskelettmuskelzellen, nicht beteiligt. Eine Beteiligung anderer Mitglieder der TRPC-Familie bleibt jedoch denkbar. Für eine mögliche Beteiligung des Kanals am pathologisch erhöhten Kalziumeinstrom des Sarkolemms, wie sie im Rahmen der Pathogenese der Duchenne-Muskeldystrophie diskutiert wird, konnten in dieser Arbeit keine Hinweise gefunden werden. Hinsichtlich der getesteten Parameter unterschieden sich die Muskelfasern von Wildtyp-Mäusen nicht von den Zellen Dystrophin-defizienter mdx-Mäuse.