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Infektionen durch Staphyloccocus aureus können aufgrund zunehmender Therapieresistenz (ca-MRSA, ha-MRSA, la-MRSA etc.) gravierende Verläufe nehmen und stellen nicht nur eine wachsende medizinische, sondern auch eine gesundheitsökonomische Herausforderung im Patientenmanagement dar. Für die Entwicklung innovativer Behandlungsstrategien ist die genaue Analyse der keimspezifischen Infektionsmechanismen eine wichtige Voraussetzung. S. aureus verwendet sogenannte Virulenzfaktoren um einen zunächst lokalen Infektionsherd zu etablieren. Wachstumsphasenabhängig werden z.B. Adhäsine, Kapselantigene oder Toxine exprimiert, um dann gezielt im Infektionsgeschehen eingesetzt zu werden. In den vergangenen Jahren konnten wichtige Fortschritte zur Ermittlung infektionsrelevanter stammspezifischer Regulationsmechanismen bei S. aureus gemacht werden. Ziel dieser Arbeit war zunächst eine Datengrundlage zur Untersuchung der Wirt-Erreger-Interaktion durch Proteomreferenzkarten von humanen S9-Epithelzellen zu schaffen. Zudem wurden die extrazellulären Expressionsmuster von S. aureus-Isolat NCTC8325-4 in verschiedenen Kulturmedien analysiert, um ein geeignetes Medium für die Kokultur der Wirts –wie auch der Erregerzellen entwickeln. Weiterhin sollte eine Proteomreferenzkarte der extrazellulären Proteinfraktion von S.aureus RN1HG erstellt werden, um eine anschließende Vergleichsanalyse der wachstumsphasenabhängigen Expressionsprofile zu ermöglichen. Zur Erstellung der Proteomreferenzkarten wurden die Proteingemische mit einer zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D PAGE) aufgetrennt. Zuerst wurden die Proteine einer isoelektrischen Fokussierung unterworfen (IPG – Streifen 24cm für pI 4-7; 11cm u. 18cm für pI 6-11) und dann in der zweiten Dimension nach ihrer Größe mit 12,5% SDS Polyacrylamidgelelektrophorese separiert (Trennbereich 20 -120 kD). Die Proteinspots wurden mit verschiedenen Färbemethoden (Silbernitrat, kolloidales Coomassie Brillantblau oder Flamingo Fluoreszenzfärbung) dargestellt. Mit MALDI-TOF wurden die Proteine sequenziert und quantifiziert. Die gefundenen Sequenzen wurden durch Datenbanksuche (Mascot 2.0; SwissProt 55.1_human/all) identifiziert. Auf Wirtsseite sollten die humanen S9-Epithelzellen (CFTR repaired IB3-1) als Modell einer bakteriellen Atemwegskolonisation dienen, dabei wurden sie in MEM (mit 4% FCS, 1% NEAA (non essential amino acids) und 4 mM L-Glutamin) kultiviert. Auf der Erregerseite wurden die S. aureus - Isolate NCTC8325-4 (11-bp deletion in rsbU, cured of three prophages) und RN1HG (rsbU restored) (HG001; Herbert S. et al, 2010) verwendet . Proteomreferenzkarten für den pI Bereich pI 4-7 und pI 6-11 wurden für das Proteom der S9-Epithelzellen angefertigt. Es wurden 668 Einzelproteine (508 mit Proteinscore >55) identifiziert und funktionell via Datenbanksuche (www.pantherdb.org) charakterisiert. Somit können infektionsassoziierte Veränderungen im Proteinmuster der S9-Wirtszellen erkannt und valide ausgewertet werden. Um eine Kokultur für Internalisierungsversuche von S.aureus und den S9-Epithelzellen zu ermöglichen, wurde eine methodenoptimierende Kultivierungsreihe (MEM mit und ohne 5%FCS, RPMI 1640, TSB) mit dem Laborstamm NCTC8325-4 durchgeführt. Der Datenvergleich der extrazellulären Expressionsmuster trug zur Entwicklung eines geeigneten Kulturmediums (MEM mit 2mM AS supplementiert) bei. S. aureus RN1HG wurde in diesem Medium kultiviert und von der extrazellulären Proteinfraktion wurde eine Proteomreferenzkarte im Bereich pI 4-7 angefertigt. Es konnten 91 Einzelproteine (48 mit Proteinscore >55) identifiziert werden. Durch eine vergleichende Analyse konnten Veränderungen der Proteinmuster innerhalb verschiedener Wachstumsphasen (exponentiell, transient, stationär und spät stationär) detektiert und ein optimaler Erntezeitpunkt festgelegt werden. Während der exponentiellen Wachstumsphase waren typischerweise kolonisationsrelevante Proteine (LytM, SAOUHSC_02979, SceD), in der stationären Phase vorrangig invasionsrelevante (SsaA, IsaA, SspB) angereichert. Somit konnten charakteristische Expressionsmerkmale bei S. aureus RN1HG nachgewiesen werden, welche den weiteren Einsatz gemeinsam mit den S9-Epithelzellen ermöglichen (Schmidt F. et al., 2010).
Teil 1: Pathogeninaktivierung: Es wurde ein neues Verfahren zur Pathogeninaktivierung mittels Proteomanalysen untersucht. Bei diesem wurden Proben von Kaninchenthrombozyten mit Riboflavin bzw. Psoralen inkubiert und mit UV-A Licht bestrahlt. Dadurch werden die in Pathogenen enthaltenen Nukleinsäuren unbrauchbar gemacht, wohingegen gezeigt werden konnte, dass die Plättchen kaum in ihrem Proteom und damit vermutlich in ihrer Funktionalität beeinflusst wurden. Teil 2: Thrombozytenalterung: Durch Apherese wurde an drei auf einander folgenden Tagen die in einem humanen Spender zirkulierenden Plättchen auf 80000/µl depletiert und anschließend Plättchen aus dem Vollblut mittels differentieller Zentrifugation gewonnen. Während der einsetzenden Nachbildung von Thrombozyten wurde das Proteom der Zellen mit den Ausgangswerten verglichen und so versucht, Alterungsmarker im Thrombozytenproteom zu finden.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Proteom von Seminomen mit dem von nicht-neoplastischem Hodengewebe von 6 Patienten vergleichend analysiert. Ziel der Arbeit war die Ermittlung von Expressionsunterschieden zwischen Tumorgewebe und gesundem Gewebe auf Protein-Ebene. Zur Auftrennung der Proteine und Darstellung des Proteoms wurde die zweidimensionale Gelelektrophorese angewandt. Diese erlaubt eine Trennung der Proteine nach ihrem Molekulargewicht und ihrem isoelektrischen Punkt. Mit den hier verwendeten Gelen wurden Proteine im Molekulargewichtsbereich von ca. 10-200 kDa und einem isoelektrischen Punkt zwischen 4 und 7 erfasst. Die Darstellung der Proteine erfolgte durch Silber- und Fluoreszenzfärbung. Die Bearbeitung und Auswertung der Proteinmuster erfolgte mit der Software Delta 2D (Decodon). Bei 5 von 6 Patienten fand sich ein Protein, welches im Seminomgewebe geringer exprimiert war als im gesunden Hodengewebe. Das Protein wurde massenspektroskopisch mittels MALDI-MS analysiert und als GSTM3, Glutathion-S-Transferase der Mu-Klasse, identifiziert. Glutathion-S-Transferasen sind multifunktionelle Enzyme des Phase-Il-Stoffwechsels und spielen eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von Karzinogenen und Xenobiotika. Eine verminderte Expression von GST-Isoformen der Mu-Klasse in Seminomen wurde in der Literatur bereits beschrieben, jedoch ohne Angabe der GST-Isoformen. Diese Arbeit berichtet erstmalig von einer verminderten Expression der GSTM3-Isoform in Seminomgeweben. Auch die Menge an GSTM3-mRNA korrelierte mit den Proteindaten. Durch semiquantitative RT- PCR konnte das Ergebnis somit auf Transkriptionsebene bestätigt werden.