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Staphylococcus aureus ist ein Gram-positives pathogenes Bakterium, welches bei ca. 30 % der gesunden Bevölkerung zur kommensalen Flora der Nasenschleimhaut gehört. Jedoch zählt S. aureus auch zu den häufigsten Erregern bakterieller Infektionen beim Menschen. Aus diesem Grund wurden S. aureus-Stämme in zahlreichen Studien untersucht, um die Pathophysiologie und Virulenz der Bakterien sowie die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen zu verstehen. Die Expression von Virulenzfaktoren wird direkt oder indirekt durch verschiedene Regulatoren beeinflusst. Zu diesen zählen beispielsweise das Quorum-Sensing-System Agr, der alternative Sigma-Faktor SigB und das Zweikomponentensystem SaeRS. Bei der Regulation der Genexpression spielt neben Mechanismen, die die Transkriptionsinitiation beeinflussen, auch die Transkriptions-termination eine Rolle. Bei Bakterien unterscheidet man zwischen der Rho-unabhängigen und der Rho-abhängigen Transkriptionstermination. In bisherigen Studien wurde die Rolle des Transkriptionsterminationsfaktors Rho in Escherichia coli, Bacillus subtilis und Mycobacterium tuberculosis untersucht. Hierzu zählt unter anderem das Silencing von horizontal erworbenen Genen, die Verhinderung von DNA-Doppelstrangbrüchen und die Unterdrückung der persistierenden Antisense-Transkripten. Besonders die erhöhte Antisense-Transkription konnte auch in einer Tiling Array-Studie des S. aureus Wildtypstammes HG001 und einer isogenen Δrho-Mutante ST1258 festgestellt werden. In dieser Transkriptom-Analyse wurden die S. aureus-Stämme in RPMI- und TSB-Medium in der exponentiellen und stationären Wachstumsphase untersucht. Es konnten insgesamt 416 chromosomale Regionen identifiziert werden, deren Transkriptmenge in einer der vier Bedingungen in der Δrho-Mutante im Vergleich zum Wildtyp wenigstens 4-fach erhöht waren. Von diesen Regionen ließen sich nur 11 % annotierten Genen zuordnen, während eine massive Erhöhung der Menge solcher Transkripte festgestellt wurde, die vom Gegenstrang kodierender Gene stammen.
Ausgehend von diesen Befunden wurde in dieser Studie das zelluläre und extrazelluläre Proteom des S. aureus Wildtyps HG001 und der Δrho-Mutante ST1258 verglichen, um die Auswirkungen der Abwesenheit von Rho auf das Proteom zu untersuchen. Dabei lag die Mehrheit der relativ quantifizierten Proteine in erhöhten Mengen in der Δrho-Mutante im Vergleich zum Wildtyp vor. Viele dieser Proteine konnten dem SaeRS-Zweikomponentensystem von S. aureus zugeordnet werden. In der Proteomanalyse konnten 34 von 39 Proteinen, die durch SaeR reguliert werden, quantifiziert werden. Von diesen wiesen 29 erhöhte Proteinmengen in der Δrho-Mutante auf. Durch das Sae-System werden Gene reguliert, von denen die meisten für Virulenzfaktoren, wie Adhäsine, Toxine und immune evasion-Proteine, kodieren. Die Daten der Proteomanalyse zeigen, dass in S. aureus-Zellen, denen die Aktivität von Rho fehlt, das Sae-System aktiviert wird und dadurch die Induktion des SaeR-Regulons zu beobachten ist.
Die Relevanz dieser Ergebnisse wurde durch ein in vivo-Infektionsexperiment untersucht. In einem Bakteriämie-Modell führte die Inaktivierung von Rho zu einer signifikant erhöhten Virulenz von S. aureus, welche sich in einer signifikant reduzierten Überlebensrate der Mäuse äußerte. Zwischen dem Wildtyp und dem Komplementationsstamm konnte kein signifikanter Unterschied in der Überlebensrate der infizierten Mäuse gezeigt werden.
Es ist bekannt, dass SaeRS-abhängige Virulenzfaktoren auch für die Invasion in Epithel- und Endothelzellen entscheidend sind. Anhand der Zahl der internalisierten S. aureus-Bakterien nach Infektion von humanen Lungenepithelzellen konnten in dieser Arbeit keine Unterschiede zwischen dem Wildtyp HG001 und ∆rho-Mutante ST1258 im zeitlichen Verlauf festgestellt werden. Dabei konnten weder Unterschiede im Überleben in 16HBE14o- Zellen noch in der Internalisierungsrate in A549-Zellen zwischen den beiden Stämmen gezeigt werden.
Das Antibiotikum Bicyclomycin ist ein spezifischer Inhibitor des Transkriptionsterminationsfaktors Rho und wird in Studien zur Rho-abhängigen Transkriptionstermination in Gram-negativen Bakterien eingesetzt, da in diesen Rho ein essentielles Protein ist. In Transkriptom- und Proteomanalysen konnten vergleichbare Effekte durch die Behandlung des Wildtyps mit Bicyclomycin wie in der ∆rho-Mutante hervorgerufen werden. Die Antisense-Transkription und die Expression SaeRS-abhängigen Gene waren im Wildtyp nach Gabe von Bicyclomycin deutlich erhöht. Es konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung des Sae-Systems unter Rho-defizienten Bedingungen direkt mit der Transkriptionsterminationsaktivität von Rho verbunden ist und eine neue Verbindung zwischen antibiotischer Wirkung und schädlicher Virulenzgenexpression in S. aureus herstellt werden konnte. In anderen Studien konnten Effekte von Antibiotika auf die Expression von Virulenzfaktoren in S. aureus gezeigt werden, jedoch wurden in diesen Studien die Effekte von Anti-Staphylokokken-Wirkstoffen untersucht. Im Gegensatz dazu ist im Fall von Bicyclomycin ein Antibiotikum verwendet worden, das gegen Gram-negative Bakterien wirksam ist und dennoch die Expression von Virulenzfaktoren in S. aureus beeinflusst. Diese Untersuchungen haben damit auch klinische Relevanz, nicht nur für Patienten, die an gemischten Infektionen mit verschiedenen Bakterienarten leiden, sondern auch für Patienten mit einer Gram-negativen bakteriellen Infektion, die jedoch Träger von S. aureus sind.
Staphylococcus aureus (S. aureus) endocarditis is still one of the most fatal heart diseases, with a mortality rate of 20-45%. In recent years, the importance of endothelial cells (ECs) in the context of endocarditis has become more evident. The vascular endothelium forms a selective barrier between blood and the adjacent tissue by maintaining an anti-inflammatory and anti-thrombogenic phenotype. However, in case of insertion of cardiac implants, an injury of the endothelium can occur which promotes platelet aggregation followed by S. aureus adherence to the platelets, especially in areas with low hemodynamic shear stress. This process is considered as a key event in the development of infective endocarditis (IE) and allows bacteria to colonize the heart valves. Despite extensive research, the pathogenesis of IE is still not completely understood. Therefore, further investigations are needed to enable an effective prevention of this life-threatening disease.
In order to study the infection process of S. aureus, internalization experiments with two different S. aureus strains, one control strain (HG001) and one strain isolated from an endocarditis patient (T-72949) were performed in human coronary artery endothelial cells (HCAEC). Subsequently, an extensive proteome analysis of the host cells was carried out. More specific analyses were performed using peptidoglycan (PGN), a cell wall component of Gram-positive bacteria, which causes a pro-inflammatory response in ECs. In this context, the focus remained on the analysis of cellular changes in terms of cell stiffness, wound healing, and additionally platelet aggregation.
The analysis of the HCAEC host proteome revealed a time-related difference depending on the infecting bacterial strain. Several proteins involved in host cell signaling pathways exhibited a higher abundance at earlier time points in host cells infected with endocarditis strain T-72949 compared to those infected with HG001. Further proteome analysis uncovered several adaptations on the cellular side that enable internalization and replication of both S. aureus strains as well as the activation of pathways that promote cellular recovery. Furthermore, it could be shown that PGN reduced cellular stiffness which could lead to an increased bacterial uptake and would thereby promote the development of a chronic S. aureus infection. Additionally, PGN prevented effective wound healing which promotes a pro-thrombotic and pro-inflammatory condition. This status could facilitate the bacterial infection of further cells. Apart from that, PGN induced platelet aggregation which could ease bacterial adhesion to thrombotic surfaces (e.g., dysfunctional endothelium). The following formation of a mature vegetation might protect the bacteria from the immune system and antibiotics.
The results of the present work emphasize the central role of ECs in the context of IE. It could be demonstrated that a healthy monolayer of ECs enables a beneficial cell response and may prevent the development of vascular diseases. Moreover, the comprehensive proteome dataset which was generated in this project provides a valuable source of information for future studies to unravel further molecular mechanisms of endocarditis and possible therapeutic approaches.
Influenza A Virus (IAV), Staphylococcus aureus (staphylococci), and Streptococcus pneumoniae (pneumococci) are leading viral and bacterial causes of pneumonia. Dendritic cells (DCs) are present in the lower respiratory tract. They are characterized by low expression of co-stimulatory molecules, including CD80 and CD86 and high capacity of antigen uptake. Subsequently, DCs upregulate co-stimulatory signals and cytokine secretion to effectively induce T-cell priming. Here, we investigated these processes in response to bacterial and viral single as well as coinfections using human monocyte-derived (mo)DCs. Irrespective of single or coinfections, moDCs matured in response to IAV and/or staphylococcal infections, secreted a wide range of cytokines, and activated CD4+, CD8+ as well as double-negative T cells. In contrast, pneumococcal single and coinfections impaired moDC maturation, which was characterized by low expression of CD80 and CD86, downregulated expression of CD40, and a mild cytokine release resulting in abrogated CD4+ T-cell activation. These actions were attributed to the cholesterol-dependent cytotoxin pneumolysin (Ply). Infections with a ply-deficient mutant resulted in restored moDC maturation and exclusive CD4+ T-cell activation. These findings show that Ply has important immunomodulatory functions, supporting further investigations in specific modalities of Ply-DC interplay.
During infections, innate immune cells are crucial for initiating a pro-inflammatory immune response and clearing the invading pathogen. Delay in pathogen clearance or initiation of an immune response due to impaired functionality of immune cells can result in devastating consequences. The cellular compartment of the innate immune system comprises an array of specialized cell types: Macrophages are tissue-resident professional phagocytes that clear cellular debris, pathogens, and foreign objects. Dendritic cells (DCs) are immune sentinels specialized in antigen uptake and subsequent T cell priming. They are primary sources of cytokines in response to infection. Neutrophils are efficient effector cells that respond rapidly to infection and clear bacteria by different mechanisms. If effector mechanisms of these cells are affected by either bacterial or other factors, infections might not be resolved and can spread throughout the host. Cobalt-chromium-molybdenum biomaterial is widely used in arthroplasty. Implant-derived wear particles and ions lead to macrophage-driven adverse local tissue reactions: Such reactions have been linked to an increased risk of periprosthetic joint infection after revision arthroplasty. While metal-induced cytotoxicity is well characterized in human macrophages, direct effects on their functionality remain elusive. In Paper I, we show that local peri-implant tissue is exposed to Co and Cr in situ. Influx of macrophages is also evident. Exposure of isolated human monocytes/macrophages to Cr3+ in vitro had only minor effects. However, exposure of monocytes/macrophages to pathologic concentrations of Co2+ significantly impaired both phenotype and functionality. High concentrations of Co2+ induced loss of surface markers, including CD14 and CD16. Both Co2+ and Cr3+ impaired macrophage responses to Staphylococcus aureus infection. Co2+ -exposed macrophages, in particular, showed decreased phagocytic activity. These findings demonstrate the immunosuppressive effects of locally elevated metal ions on the innate immune response. Streptococcus pyogenes (group A streptococcus, GAS) causes a variety of diseases ranging from mild to severe necrotizing soft tissue infections (NSTIs). In the host environment hypervirulent GAS variants carrying mutations within the genes encoding for control of virulence (Cov)R/S two component system are enriched. This adaptation is associated with loss of SpeB secretion. In Paper II, we show that in vitro infections with hyper-virulent GAS variants harboring dysfunctional CovR/S suppress secretion of IL-8 and IL-18 by human monocytic cells. This phenotype was mediated by a caspase-8 dependent mechanism. Knockout of streptococcal SLO in a GAS strain carrying functional CovR/S even increased secretion of IL1β and IL-18 by moDCs. Of 67 fully sequenced GAS NSTI isolates, 28 contained covS or covR mutations that rendered the TCS dysfunctional. However, no differences in systemic IL-8 and IL-18 were detected in these patients. GAS isolates recovered from patients often display a mixed phenotype, consisting of SpeB positive (SpeB+ ) and SpeB negative (SpeB- ) clones. Irreversible loss of SpeB expression is often caused by loss of function mutations in regulatory components (CovR/S, RopB). Loss of SpeB is often associated with hyper-virulence. In Paper III, we show that the host environment induces transiently abrogated secretion of SpeB by GAS. Tissue inflammation, neutrophil influx, and degranulation correlated with increased frequencies of SpeB- GAS clones. Isolates recovered from tissue expressed but did not secrete SpeB, which was reversible. Neutrophilderived ROS were identified as the main factor responsible for abrogated SpeB secretion. Hyper-virulent SpeB- clones also exhibit better survival within and induce excessive degranulation of neutrophils.