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Lipoproteins of Staphylococcus aureus represent a major class of surface proteins, which are anchored to the outer leaflet of the cell membrane. Although they play a key role in the immune response and virulence, the majority of lipoproteins in this organism is still of unknown function. The aim of our study was to investigate the function of so far poorly or uncharacterized lipoproteins in S. aureus strain Newman. To this end, an integrated bioinformatical approach was applied to define the pan-lipoproteome of 123 completely sequenced S. aureus strains. In total, this analysis predicted 192 different potential lipoproteins, with a core lipoproteome of 39 and a variable lipoproteome of 153 lipoproteins. Out of those 192 lipoproteins, 141 are so far functionally uncharacterized. Primarily focusing on members of the core-lipoproteome with unknown or poorly characterized function, 24 lipoproteins or co-encoded neighbor proteins were selected for further characterization. Of those 24 proteins, 20 S. aureus markerless deletion mutants were constructed (S. aureus delta l01 - delta l20) and screened for an altered growth behavior under various conditions. Here, three mutants showed a temperature-sensitive phenotype, two mutants formed aggregates in the TSB of the manufacturer Merck (TSBMerck), and four mutants showed reduced growth under osmotic stress with 8% NaCl. An altered aggregation behavior was observed for four mutants in the presence of Triton X-100 and for eleven mutants in the presence of SDS. Furthermore, ten mutants revealed an impaired biofilm formation capacity as well as reduced hemolytic activity. Interestingly, S. aureus deletion mutants delta l14 (delta NWMN_1435) and delta l16 (delta NWMN_0646) showed an altered phenotype under nearly all tested growth and stress conditions. Most strikingly, both deletion mutants demonstrated dramatic defects in cell morphology and cell division during the transient growth phase in TSBMerck and were therefore selected for further detailed characterization. Electron microscopy imaging of the two mutants revealed an irregular cell shape, increased cell size, multiple displaced division septa, and incomplete separation of daughter cells resulting in the formation of cell aggregates in TSBMerck. Complementarily, microarray-based transcriptome analysis and whole-genome sequencing of S. aureus delta l14 and delta l16 suppressor mutants strongly point to a functional association of both lipoproteins with cell envelope- or cell division-related processes. Specifically, multiple hints suggest a functional connection of both lipoproteins with lipo- or wall teichoic acids. Of note, the phenotypes of S. aureus delta l14 and delta l16 are conditional and appear under some, but not all growth conditions. Thus, it is conceivable that the function of L14 and L16 is modulated by metabolic processes, or that the proteins might be part of a “backup system” becoming important only under certain conditions. Collectively, we propose that L14 and L16 fulfill a basic role in cell envelope- or cell division-related processes under specific growth conditions. Particularly, the activity of L14 and L16 might be necessary for the function or localization of lipo- or wall teichoic acids, and thus, might be linked to the regulation of autolysins. In conclusion, this study reveals important insights into the function of two so far uncharacterized but highly conserved lipoproteins in S. aureus.
Staphylococcus aureus(S. aureus) is a pathobiont of humans as well as a multitude of animalspecies. The high prevalence of multi-resistant and more virulent strains ofS. aureusnecessitatesthe development of new prevention and treatment strategies forS. aureusinfection. Major advancestowards understanding the pathogenesis ofS. aureusdiseases have been made using conventionalmouse models, i.e., by infecting naïve laboratory mice with human-adaptedS. aureusstrains. However,the failure to transfer certain results obtained in these murine systems to humans highlights thelimitations of such models. Indeed, numerousS. aureusvaccine candidates showed promising resultsin conventional mouse models but failed to offer protection in human clinical trials. These limitationsarise not only from the widely discussed physiological differences between mice and humans, but alsofrom the lack of attention that is paid to the specific interactions ofS. aureuswith its respectivehost. For instance, animal-derivedS. aureuslineages show a high degree of host tropism and carry arepertoire of host-specific virulence and immune evasion factors. Mouse-adaptedS. aureusstrains,humanized mice, and microbiome-optimized mice are promising approaches to overcome theselimitations and could improve transferability of animal experiments to human trials in the future.
Neue Antibiotika und Präventionsmaßnahmen gegen S. aureus sind aufgrund der starken Ausbreitung multiresistenter S. aureus-Stämme dringend erforderlich. Zur Entwicklung von Therapie- und Präventionsmaßnahmen werden geeignete Infektionsmodellen benötigt, die die klinische Situation möglichst exakt widerspiegeln. Da die Spezies S. aureus stark wirtsspezifisch ist, könnten wirtsadaptierte S. aureus-Stämme hierbei äußerst hilfreich sein. In der Infektionsforschung werden vor allem Mausmodelle verwendet. Da bisher jedoch angenommen wurde, dass Mäuse keine natürlichen Wirte von S. aureus sind, sind S. aureus-Forscher davon ausgegangen, dass Mäuse kein geeignetes Modell darstellen. Das wurde durch unsere und andere Arbeitsgruppen allerdings in den letzten Jahren widerlegt. Wir konnten zeigen, dass Labor- und Wildmäuse mit S. aureus besiedelt sind.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte geklärt werden, ob murine Infektionsmodelle durch die Verwendung von mausadaptierten S. aureus-Stämmen optimiert werden können. Aus über 250 S. aureus-Stämmen, die aus Labor und Wildmäusen isoliert wurden, wurden vier mausadaptierte S. aureus-Isolate ausgewählt und mit dem humanen S. aureus-Isolat Newman in einem Pneumonie- und Bakteriämiemodell vergleichen. Diese Stämme wiesen einen repräsentativen spa-Typ sowie typischen Phagenmuster und Virulenzgene auf. Zudem waren sie in der Lage, murines Plasma zu koagulieren und in murinem Vollblut zu replizieren.
Es zeigte sich, dass das murine Isolat S. aureus DIP sowohl im Pneumonie- als auch im Bakteriämiemodell deutlich virulenter war als das humane Isolat Newman und die anderen getesteten mausadaptierten Stämme. Nach kürzester Zeit starben alle Tiere, die mit S. aureus DIP infiziert wurden. Wurde die Infektionsdosis im Vergleich zu Newman um 90 % reduziert, waren die bakterielle Last, der Belastungsscore, sowie die Zytokin- und Chemokinkonzentrationen nach Infektion mit S. aureus DIP bzw. S. aureus Newman vergleichbar. Im Besiedlungsmodell konnte gezeigt werden, dass die mausadaptierten Stämme S. aureus JSNZ sowie S. aureus DIP in der Lage sind, Mäuse über einen Zeitraum von 7 Tagen stabil zu besiedeln. Mäuse, die mit S. aureus Newman besiedelt waren, konnten den Stamm innerhalb dieses Zeitraums eliminieren. Die Genomsequenzierung der in vivo verwendeten S. aureus Stämme zeigte, dass lediglich S. aureus DIP für das Leukozidin LukMF‘ kodiert. Das lässt vermuten, dass die Präsenz des Virulenzfaktors für die gesteigerte Virulenz von S. aureus DIP verantwortlich sein könnte.
Des Weiteren sollten in dieser Arbeit ein Besiedlungsmodell mit murinen S. aureus-Isolaten etabliert und die beteiligten Immunzellen quantifiziert werden. Es zeigte sich, dass Mäuse mit murinen S. aureus-Isolaten bis zu 7 Tage besiedelt werden können wohingegen S. aureus Newman zu diesem Zeitpunkt nur noch in 20 % der Tiere nachweisbar war. Zudem konnte bei der intranasalen Besiedlung mit einer hohen Dosis S. aureus DIP [1 × 10^8 CFU] gezeigt werden, dass sowohl Th17-Zellen als auch γδ-T-Zellen nach 7 Tagen IL-17A, IL-17F und IL-22 produzieren. Jedoch konnte die Zytokinproduktion nur in Tieren nachgewiesen werden, die einen hohen Belastungsscore aufwiesen. Da nach 24 Stunden bei Tieren mit hohem Belastungsscore auch Bakterien in der Lunge detektiert wurde, ist anzunehmen, dass S. aureus diese Tiere nicht nur besiedelt, sondern bei ihnen auch eine Atemwegsinfektion verursacht hatte. Durch den geringen prozentualen Anteil an ILCs in den zervikalen Lymphknoten war es nicht möglich Rückschlüsse auf deren Zytokinproduktion zu ziehen. Somit gelang es zwar ein murines S. aureus-Besiedlungsmodell zu etablieren, jedoch kann keine Aussage zu den beteiligten Zellen des Immunsystems getroffen werden.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Labormäuse mit mausadaptierten S. aureus-Stämmen länger besiedelt werden können als mit dem humanen Referenzstamm Newman. Zudem konnte mit Hilfe des mausadaptierten Stammes S. aureus DIP die Infektionsdosis im Pneumonie- und Bakteriämiemodell erheblich reduziert werden. Somit gelang es Mausmodelle durch die Verwendung von mausadaptierten S. aureus-Stämmen zu optimieren, auch wenn das nicht auf alle getesteten Isolate zutrifft. Durch die Anpassung an den murinen Wirt stellen mausadaptierte S. aureus-Stämme wie DIP und JSNZ ein physiologischeres Modell der Pathogen-Wirts-Interaktion dar. Die Verwendung eines solchen Stammes ermöglicht es ein besseres Verständnis für Infektionsprozesse und die Pathogen-Wirt-Interaktionen zu erlangen und dadurch eventuell neue Therapiemöglichkeiten zu entwickeln.
Es ist zu berücksichtigen, dass auch die Verwendung mausadaptierter S. aureus-Stämme in murinen Besiedlungs- und Infektionsmodellen lediglich ein Modell darstellt, welches Vor- und Nachteile hat. Daher ist es essenziell, dass Wissenschaftler die Grenzen jedes Modellsystems kennen und das richtige Infektionsmodell (oder eine Kombination davon) auswählen, um ihre Forschungsfragen zu beantworten.
Staphylococcus aureussuperantigens (SAgs) are among the most potent T cell mitogensknown.They stimulate large fractions of T cells by cross-linking their T cell receptor withmajor histocompatibility complex class-II molecules on antigen presenting cells, resulting in Tcell proliferation and massive cytokine release. To date, 26 different SAgs have been described in thespeciesS. aureus; they comprise the toxic shock syndrome toxin (TSST-1), as well as 25 staphylococcalenterotoxins (SEs) or enterotoxin-like proteins (SEls). SAgs can cause staphylococcal food poisoningand toxic shock syndrome and contribute to the clinical symptoms of staphylococcal infection. Inaddition, there is growing evidence that SAgs are involved in allergic diseases. This review providesan overview on recent epidemiological data on the involvement ofS. aureusSAgs and anti-SAg-IgEin allergy, demonstrating that being sensitized to SEs—in contrast to inhalant allergens—is associatedwith a severe disease course in patients with chronic airway inflammation. The mechanisms by whichSAgs trigger or amplify allergic immune responses, however, are not yet fully understood. Here, wediscuss known and hypothetical pathways by which SAgs can drive an atopic disease