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Trotz großer Verbesserungen bei der intensivmedizinischen Behandlung ist das Krankheitsbild Sepsis auch heute noch mit erschreckend hoher Morbidität und Letalität assoziiert. Ob B-Zellen in der Sepsis eine Rolle spielen und wie das adaptive humorale Immunsystem insgesamt durch Sepsis beeinflusst wird, wurde bisher wenig erforscht. Weil bei einer Sepsis viele Immunzellen in Apoptose gehen und die Immunantwort insgesamt supprimiert ist, wurde bisher angenommen, dass nach Sepsis auch die B-Zellantwort vermindert ist. Die Befunde dieser Arbeit zeigen, dass das adaptive Immunsystem bei polymikrobieller Sepsis entgegen den Erwartungen initial nicht supprimiert war. B-Zellen der Milz wurden sehr früh aktiviert. Es kam zur Keimzentrums- und Plasmazellbildung, infolgedessen die IgM- und IgG-Konzentrationen im Serum anstiegen. Darunter befanden sich selbstreaktive Antikörper, die allerdings keine Symptome einer Autoimmunerkrankung auslösten. Produzenten dieser Antikörper waren vermutlich B1-Zellen, die B-Zellrezeptorunabhängig, also polyklonal, aktiviert wurden. T-Zellen konnten sehr früh nach Sepsis antigenspezifisch aktiviert werden, und waren für einen Teil der B-Zellantwort nach Sepsis notwendig. Später war die antigenspezifische Primärantwort der T-Zellen eingeschränkt. Obwohl die Milz und die in der Maus dort ansässigen Marginalzonen-B-Zellen entscheidend an der Abwehr von Infektionen beteiligt sind, schienen sie für die Antikörperproduktion entbehrlich zu sein. Eine weitere wichtige Erkenntnis dieser Arbeit ist, dass Sepsis mit dem humoralen Immungedächtnis interferierte. Ob dies allerdings den Immunschutz beeinträchtigt, kann nicht abschließend geklärt werden. Klinische Studien konnten einen Einfluss einer Sepsis auf die humorale Immunität beim Menschen weder bestätigen noch ausschließen. Nach schwerer Operation allerdings schien das Immungedächtnis in Form antigenspezifischer Antikörper verstärkt.
Sepsis wird als eine lebensbedrohliche Organdysfunktion aufgrund einer fehlregulierten Reaktion des Organismus auf eine Infektion definiert (Sepsis-3) (23). Trotz der Fortschritte in der modernen Medizintechnik und der Entwicklung neuer Medikamente bleibt die Sepsis weiterhin eine der häufigsten Todesursachen auf Intensivstationen weltweit. Hinzu kommt, dass zukünftig von einer steigenden Letalität auszugehen ist. Gründe hierfür sind neben dem zunehmenden Anteil älterer und chronisch kranker Patienten die zunehmende Invasivität vieler diagnostischer und operativer Eingriffe und die steigende Antibiotikaresistenz der Erreger (35). Der rasante Anstieg resistenter Krankheitserreger weltweit stellt die Sepsisbehandlung vor neue Herausforderungen. Entscheidend für die Senkung der Letalität ist eine schnelle Diagnostik und eine zielgerichtete Therapie. Die auf kulturellen Verfahren basierte vorherrschende mikrobiologische Standarddiagnostik ist zu zeitintensiv, daher werden aktuell molekular-basierte Verfahren entwickelt die eine schnelle Diagnostik ermöglichen.
Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob sich der Organismus in einer Sepsis mit dem invasivem Krankheitserreger auseinandersetzt und eine humorale Immunantwort generiert und ob diese Immunantwort erregerspezifisch ist.
Zur Beantwortung dieser Fragen wurde in dieser Arbeit ein Verfahren entwickelt, um die Antikörper-Bindung an verschiedene bakterielle Proteine zu quantifizieren.
Dafür wurden humane Plasmen von Sepsispatienten aus einer prospektiven klinischen Studie (VYOO-Studie, Greifswald) mittels automatisiertem 1D-Western Blot Verfahren (Simple WesternTM assay) auf ihren erregerspezifischen Antikörper-Gehalt untersucht. Das Erregerspektrum wurde durch die extrazellulären Proteine häufiger Sepsiserreger
(Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens und Escherichia coli) bereitgestellt. Alle Bakterienisolate, mit Ausnahme von S. aureus (USA300 Δspa), stammen aus Wundabstrichen, Trachealsekreten und Blutkulturen der Sepsispatienten und wurden in der Medizinischen Mikrobiologie des Greifswalder Universitätsklinikums aufbewahrt und für die Kultivierung zur Verfügung gestellt. Mit Hilfe des automatisierten, eindimensionalen Western Blot (1D-WB) wurde die Bindung der extrahierten extrazellulären Proteine (ec-stat) verschiedener Sepsiserreger an humanen Serumantikörpern untersucht.
Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen heraus, dass immunkompetente Patienten während einer systemischen Infektion eine adaptive Immunantwort generieren. Um herauszufinden ob diese Immunantwort erregerspezifisch ist, wurden die Patientenplasmen nicht nur gegen extrazelluläre Proteine (ec-stat) des jeweiligen invasiven Erregers getestet, sondern auch gegen ec-stat anderer Bakterienspezies. Bei jedem der untersuchten Erreger konnten Patienten mit einem Antikörperanstieg identifiziert werden. Bei keinem Patienten stiegen Antikörper gegen alle untersuchten Erreger an. Schlussfolgernd beruht der Antikörperanstieg auf einer spezifischen Reaktion des Immunsystems auf bakterielle Invasion und ist demzufolge erregerspezifisch.
Es zeigte sich, dass v.a. bei Patienten mit einer abdominellen Sepsis die Antikörpertiter gegen mehrere Darmbakterienspezies ansteigen. Diese Befunde deuten darauf hin, dass sich das Immunsystem mit multiplen Erregern auseinandergesetzt hat, selbst wenn mikrobiologisch nur ein Erreger nachgewiesen wurde. Dies könnte relevant für die Antibiotikatherapie sein.
Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass trotz mikrobiologisch nachgewiesenem Erreger bei einigen Patienten keine Immunantwort gegen den Keim generiert wurde.
Insgesamt zeigen die Daten, dass viele Patienten bereits vor einer Infektion spezifische Antikörper gebildet haben. Schlussfolgernd hat sich das adaptive Immunsystem schon seit längerer Zeit (vor Infektion) mit dem Krankheitserreger auseinander gesetzt.
Mit Hilfe einer immunologischen Sepsisserologie, wie der Verwendung des in dieser Arbeit genutzten Simple WesternTM Assays, lassen sich wichtige Informationen über die Pathogenese der Sepsis und die Reaktion des Immunsystems gewinnen. Diese ergänzen die konventionelle mikrobiologische Diagnostik. Ein besseres Verständnis der Immunantwort bei Sepsis ist eine Voraussetzung für die Entwicklung neuer therapeutische Ansätze. In wie weit der Simple WesternTM Assay - jedoch das diagnostische Portfolio bei Sepsis erweitern kann, müssen weitere Untersuchungen zur Sensitivität und Reproduzierbarkeit adressieren.
Die Rolle der CD4+ T-Lymphozyten bei Sepsis - Untersuchungen in einem Peritonitismodell der Maus
(2007)
Generalisierte bakterielle Infektionen, auch Sepsis genannt, sind trotz intensivmedizinischer Behandlung mit einer sehr hohen Letalität verbunden. Um kausale Therapiestrategien zu entwickeln, ist ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Pathomechanismen, insbesondere der Reaktionen des Immunsystems, notwendig. Da die Sepsis ein hoch komplexer Vorgang ist, an dem der gesamte Organismus beteiligt ist, sind grundlegende Untersuchungen im Tiermodell dafür unverzichtbar. Nach aktuellen Modellvorstellungen verläuft die Immunreaktion bei einer Sepsis typischerweise in zwei Phasen: Auf eine überschießenden Entzündungsantwort folgt eine Phase der generalisierten Immunparalyse. Die Rolle des angeborenen Immunsystems bei diesen Reaktionen ist gut dokumentiert, jene des adaptiven Immunsystems in der Pathogenese der Sepsis ist dagegen wenig untersucht. Ihr wurde zwar eine wichtige Rolle in der späten Phase zugesprochen, denn die Lymphozytenapoptose trägt zur Entstehung einer Immunparalyse bei. Da adaptive Immunreaktionen jedoch einige Zeit in Anspruch nehmen, wurde eine wichtige Rolle in der frühen Phase des hoch akuten Krankheitsbildes Sepsis für unwahrscheinlich gehalten und deshalb bisher kaum betrachtet. Wir hatten jedoch aus Vorversuchen Hinweise auf eine sehr schnelle T-Zellbeteiligung bei der Sepsis. Deshalb lag der Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Aufklärung der Rolle von CD4+ T-Lymphozyten bei Sepsis. Diese wurde in einem etablierten Sepsismodell der Maus untersucht, der Colon ascendens Stent-Peritonitis (CASP). Das Modell wurde entwickelt, um die klinische Situation von Patienten, bei denen es aufgrund der Insuffizienz einer chirurgischen Naht im Magen-Darm-Trakt zur Entwicklung einer diffusen Peritonitis kommt, möglichst genau abzubilden. Überraschend beobachteten wir bei CASP innerhalb weniger Stunden eine starke Induktion der Expression von CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4) auf den CD4+ T-Lymphozyten. Die Expression dieses Moleküls wird nach der Aktivierung von T-Zellen induziert. Dies lässt auf eine Beteiligung der CD4+ T-Zellen in einem frühen Stadium der Erkrankung schließen. Eine Depletion der CD4+ T-Zellen im Vorfeld der CASP-Operation mit dem monoklonalen Antikörper GK1.5 führte zu einer effektiveren Beseitigung der Bakterien aus dem Peritoneum, zu einer geringeren systemischen Verbreitung der Erreger und zu einem deutlich verbesserten Überleben der Tiere. Damit verbunden war eine verstärkte Einwanderung von Zellen des angeborenen Immunsystems in das Peritoneum. Dies impliziert, dass bei einer systemischen Dissemination kommensaler Bakterien die CD4+ T-Zellen die lokale Reaktion des angeborenen Immunsystems inhibieren, in diesem Tiermodell mit lebensbedrohlichen Konsequenzen. Die Blockade der T-Zellrezeptorvermittelten Signalgebung durch Tacrolimus (FK506) hatte dagegen keinen Einfluss auf das Überleben der Peritonitis. Dies zeigt, dass die Effekte der CD4+ T-Zellen zumindest teilweise unabhängig von der T-Zellrezeptorvermittelten Antigenerkennung sein müssen. Eine Blockade von des inhibititorischen T-Zelloberflächenmoleküls CTLA-4 bewirkte eine starke Induktion von ICOS (inducible co-stimulator) sowie eine deutliche Inhibition der Sekretion von IL-10. Die verstärkte T-Zellaktivierung und Hyperinflammation ging einher mit einem Überlebensnachteil. Zur Untersuchung der Langzeitkonsequenzen, die eine Sepsis nach sich zieht, wurden die Tiere bis zu drei Monate nach der Operation untersucht. Die Peritonitis war mit massivem Zelltod in Thymus, Milz und mesenterialen Lymphknoten assoziiert, jedoch mit unterschiedlicher Kinetik. Die systemische Infektion führte innerhalb kurzer Zeit zu einem fast vollständigen Verlust des Thymus, doch 14 Tage nach der Operation war das Organ wieder unauffällig. In der Milz hingegen setzte die Apoptose später ein und war nicht so ausgeprägt, hielt aber länger an. Eine sich anschließende Hyperplasie der Milz war drei Monate nach Induktion der Peritonitis am stärksten und ein Zeichen für eine noch nicht abgeschlossene Immunreaktion. Neben der Aktivierung von T-Zellen in der frühen Phase der Erkrankung wurde auch etwa eine Woche nach der Operation eine Reaktion von T-Zellen anhand der Änderung von Oberflächenmolekülen und der Sekretion von Zytokinen beobachtet. Diese Aktivierung erfolgte aufgrund der Kinetik vermutlich auf dem „klassischen“ Weg. Das Muster der Zytokinausschüttung lässt vermuten, dass nach CASP eine Th1-Antwort überwiegt. Ein weiteres wichtiges Ergebnis dieser Dissertation ist, dass nach diffuser Peritonitis ein Immungedächtnis aufgebaut wird. Es entwickelten sich funktionsfähige Keimzentren, und im Serum ließen sich ungewöhnlich hohe Konzentrationen von Antikörpern der Klassen IgM und IgG messen. Die Bildung von T-Gedächtniszellen ging damit einher. Erste Immunisierungsversuche mit TNP-KLH zu verschiedenen Zeitpunkten vor oder nach CASP deuten darauf hin, dass die Peritonitis weder die Entwicklung einer primären Immunantwort verhinderte noch ein bereits etabliertes Immungedächtnis störte. Im multifaktoriellen Prozess einer Sepsis spielen folglich auch die T-Lymphozyten eine wichtige Rolle. Dies sollte bei der Entwicklung neuer Therapiestrategien berücksichtigt werden. Dabei ist jedoch zu beachten, dass die Population der CD4+ T-Lymphozyten sehr heterogen ist und verschiedene Funktionen bei der Abwehr bakterieller Infektionen ausübt. Deshalb ist die Elimination der Gesamtheit der CD4+ T-Zellen höchstwahrscheinlich keine Behandlungsoption bei der Sepsis, obwohl sie in dieser Arbeit beim Tiermodell einen deutlichen Überlebensvorteil bewirkte. Es ist jetzt notwendig, die Funktionen der verschiedenen T-Zellsubpopulationen bei generalisierten bakteriellen Infektionen im Detail zu untersuchen. Die Herausforderung liegt in der Identifikation von wichtigen Kontrollpunkten der T-Zellen, die therapeutischen Eingriffen zugänglich sind. Bei diesen Interventionen muss die Gefahr einer starken Dysbalance des Immunsystems vermieden werden. Es ist ebenso wichtig zu beachten, dass die Reaktion des Immunsystems nicht nach der akuten Phase einer Sepsis endet, sondern Monate - möglicherweise sogar Jahre - danach andauert, wie in dieser Arbeit gezeigt wird. Dies könnte erklären, warum sich bei Patienten, die diese Erkrankung überlebt haben, bis zu fünf Jahren später eine signifikant erhöhte Mortalität epidemiologisch nachweisen lässt. Eine besseres Verständnis der immunologischen Langzeitkonsequenzen einer Sepsis ist die Voraussetzung für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Senkung der Mortalität bei Überlebenden dieser schweren Erkrankung. In einer prospektiven klinischen Pilotstudie sollte überprüft werden, ob die aus den tierexperimentellen Versuchen gewonnenen Befunde auch für den Menschen Relevanz haben könnten. Hierzu wurde die Expression von CTLA-4 als Parameter einer Beteiligung von T-Zellen bei Patienten untersucht, die sich einem großen abdominalchirurgischen Eingriff unterzogen, welcher mit einem hohen Risiko für die Entwicklung einer Sepsis verbunden war. Bei allen Patienten zeigten sich eine teilweise dramatische Abnahme der CD3+ T- Zellen, bei dem überwiegenden Teil der Patienten war ein Anstieg der Expression von CTLA-4 zu beobachten. Mit der Induktion des Moleküls einhergehend waren Änderungen der klinischen Parameter, der Zusammensetzung der T-Zellpopulationen und deren Aktivierungszustand, so dass die Bestimmung der Expression von CTLA-4 für die Beurteilung des Immunstatus der Patienten nützlich sein könnte. Da die Messung jedoch sehr aufwändig, zeitintensiv und schwer standardisierbar ist, erscheint sie aktuell ungeeignet für die Routinediagnostik.
Regulatorische CD4+Foxp3+ T-Zellen (Tregs) beeinflussen die Immunabwehr gegen verschiedene Mikroorganismen. Jedoch ist ihre Rolle in der bakteriellen Sepsis kritisch zu sehen. Deshalb wurden in dieser Arbeit DEREG-Mäuse benutzt um die Rolle von CD4+Foxp3+ Tregs in der Colon Ascendens Stent Peritonitis, einem Modell der postoperativen abdominellen Sepsis, zu beleuchten. DEREG-Mäuse exprimieren einen Diphtherie-Toxinrezeptor und eGFP unter der Kontrolle des Foxp3-Lokus, so dass natürliche Tregs visualisiert und selektiv depletiert werden konnten. Sepsis führte zu einer raschen Aktivierung von Tregs und zu einer Verschiebung des Treg/Effektor-T-Zellen (Teff) Verhältnisses in der Milz. Unter nicht-septischen Bedingungen führte die Treg-Depletion zu einer verstärkten Aktivierung von Teff und zu erhöhten Zytokinkonzentrationen. Dies verstärkte die Krankheitsschwere nach Sepsisinduktion. 20 Stunden nach Sepsis zeigten jedoch depletierte und nicht-depletierte Mäuse eine gleich starke inflammatorische Reaktion. Auch der Influx von Immunzellen ins Peritoneum, die Begrenzung der bakteriellen Dissemination, sowie die Letalitätsraten waren durch die Abwesenheit von regulatorischen T-Zellen unverändert.
Die Rolle von Foxp3-positiven regulatorischen T-Zellen in der polymikrobiellen murinen Sepsis
(2011)
Trotz moderner intensivmedizinischer Behandlung bleibt die Sepsis eine bedrohliche Komplikation operativer Eingriffe. Welche Rolle regulatorische T-Zellen (Tregs) bei ihrer Pathogenese spielen, wird kontrovers diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wurden DEREG-Mäuse verwendet, um die Funktion von Foxp3+ Tregs im murinen Sepsismodell der cecal ligation and puncture (CLP) zu untersuchen. Der Transkriptionsfaktor Foxp3 ist aktuell der beste Marker für Tregs. DEREG-Mäuse exprimieren unter der Kontrolle des foxp3-Lokus ein enhanced green fluorescent protein und Diphtherietoxin-Rezeptoren, sodass endogene Tregs ex vivo einfach visualisiert und in vivo selektiv depletiert werden können. Sepsis führte zu einer schnellen systemischen Aktivierung von Foxp3+ Tregs. 24 h nach CLP waren ihr suppressorisches Potential und die Expression von Aktivierungsmarkern stark erhöht. Zudem wurde das Verhältnis zwischen Tregs und T-Effektorzellen (Teffs) zu Gunsten der Tregs verschoben. Die Depletion endogener Foxp3+ Tregs vor Sepsisinduktion zeigte, dass diese Zellen das Überleben verbessern: Drei Tage nach CLP lebten noch 25 % der Treg-kompetenten Tiere, jedoch nur 5 % der Treg-depletierten Tiere. Dieser Effekt der Treg-Depletion war statistisch signifikant, wurde aber erst mit einer Latenz von 30 h nach CLP sichtbar. Vorher erschien der Verlauf der Überlebenskurve unabhängig von der Kontrolle durch Tregs. Durch einen adoptiven Transfer von präaktivierten Tregs konnte der protektive Effekt von endogenen Tregs bei einer Sepsis nicht vergrößert werden.
Die Sepsis ist trotz zahlreicher Fortschritte in der intensivmedizinischen Versorgung auch heute noch schwer zu beherrschen und mit einer hohen Letalität verbunden. Infolge einer immer schneller einsetzenden Antibiotikatherapie und supportiven Maßnahmen verstirbt nur ein kleiner Teil der Patienten in der Phase der Hyperinflammation. Im weiteren Verlauf kommt es jedoch zur Ausprägung einer Immunsuppression. Ein Großteil der Patienten verstirbt hier aufgrund nicht eradizierter primärer oder zusätzlicher sekundärer Infektionen. In dieser Arbeit wurde ein murines in vivo-Modell zur Untersuchung der Sepsis-bedingten Immunsuppression etabliert und diese umfassend charakterisiert. Überraschend war, dass das adaptive Immunsystem zu Beginn einer Sepsis voll kompetent auf Antigen reagiert. Eine Suppression des adaptiven Immunsystems entwickelte sich dann innerhalb einiger Tage. Neben Immundefekten durch Apoptose und/oder Funktionsverlust der T- und B-Zellen spielte die aktive Suppression durch regulatorische T-Zellen dabei eine große Rolle. Sie könnte Angriffsmöglichkeiten für die Behandlung in der Klinik bieten. In einem Immunisierungsmodell wurde darüber hinaus untersucht, ob die Immunsuppression bei Sepsis vom operativen Trauma abgetrennt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass es auch infolge einer „einfachen“ Impfung zur transienten Suppression des adaptiven Immunsystems kommt. Die untersuchten Aspekte der „Sepsis-induzierten“ Immunsuppression lassen sich somit vom operativen Trauma und von der systemischen bakteriellen Infektion – d. h. von der Sepsis – trennen.
Sepsis ist die dritthäufigste Todesursache in Deutschland und verursacht jährliche Krankenhauskosten von mehr als 8 Mrd. €. Über die Pathophysiologie ist noch immer vieles unbekannt. Bei der Bekämpfung von extrazellulären Infektionserregern spielt vor allem das humorale Immunsystem eine wichtige Rolle, da die von B-Zellen/ Plasmazellen gebildeten Antikörper wichtige antiinfektive Agenzien darstellen. Dennoch ist die Rolle der B-Zellen bei einer Sepsis nicht gut verstanden. Ergebnisse aus Mausmodellen, aber auch aus klinischen Studien mit Sepsispatienten zeigen einerseits die vermehrte Apoptose von B-Zellen, anderseits wurde auch eine polyklonale B-Zellaktivierung beschrieben, die mit einem unspezifischen Anstieg der Antikörperkonzentrationen im Blut einhergeht.
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob während einer systemischen bakteriellen Infektion, wie der Sepsis, auch eine Erreger-spezifische Antikörperantwort ausgebildet wird. Mit Hilfe von zwei serologischen Assays wurde die Antikörperantwort von Sepsispatienten gegen extrazelluläre Proteine von 16 typischen Sepsiserregern bestimmt. Anhand von Plasmaproben aus zwei prospektiven Studien konnte die Antikörperkinetik von einem Zeitpunkt vor der klinischen Diagnose bis maximal 16 Tage nach Diagnose ermittelt werden.
Mittels eines Simple Western Assays - einem semi-quantitativen Immunoblot-Assay - wurde zunächst die Erreger-spezifische Antikörperantwort von Patienten mit einer vorliegenden mikrobiologischen Erregerdiagnose untersucht. 54 % der Patienten zeigten eine spezifische humorale Immunantwort gegen den mikrobiologisch diagnostizierten Erreger, wohingegen die Antikörperspiegel für das Kontrollantigen TT unverändert blieben.
Zur Untersuchung der zweiten Patientenkohorte wurde ein Bead-basierter Suspensions-Array auf Grundlage der xMAP-Technologie (Luminex®) entwickelt. Der Infection Array ermöglichte die gleichzeitige Quantifizierung der spezifischen Antikörperantwort gegen 16 verschiedene Erreger. Bei 64 der 76 untersuchten Patienten wurden Anstiege der IgG-Antikörper gegen einen oder mehrere dieser Erreger beobachtet. In 62,5 % der Fälle stimmten diese Anstiege mit der mikrobiologischen Diagnose überein. Bei 20/64 Patienten wurden signifikante Anstiege der IgG-Spiegel spezifisch für einen oder zwei Erreger nachgewiesen, in 44/64 Fällen wurden Anstiege gegen mehr als zwei Erreger beobachtet. Bei Letzteren richtete sich die Antikörperantwort hauptsächlich gegen Enterokokken und Enterobacteriaceae, was primär auf zwei Ursachen zurückgeführt werden kann: (i) Ein Großteil dieser Patienten hatte einen intraabdominellen Infektionsfokus. Polymikrobielle Infektionen durch endogene Darmbakterien, typischerweise verursacht durch eine Darmruptur oder die Insuffizienz einer chirurgischen Darmnaht, sind hierbei ein plausibler Befund, der der mikrobiologischen Diagnostik offenbar häufig entgeht. (ii) Außerdem können Sepsis-bedingte Organstörungen zu einer gesteigerten Darmpermeabilität führen, die wiederum die Translokation intestinaler Bakterien erleichtert.
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass die beobachteten Antikörperreaktionen auf eine Antigen-spezifische Memoryantwort zurückzuführen sind. In etwa 2/3 der Fälle wird eine Sepsis endogen durch Bakterien des eigenen Mikrobioms verursacht. Entsprechend war es nicht überraschend, dass gegen alle untersuchten Erreger bereits vor der Infektion und auch bei gesunden Kontrollpersonen basale antibakterielle IgG-Spiegel gemessen wurden. Zudem waren die IgG-Anstiege oft bereits zwischen Tag 0 und Tag 8 zu beobachten. Bei einer Primärantwort mit dem Erreger würde die Aktivierung der Zellen und der Klassenwechsel der Antikörper deutlich mehr Zeit erfordern.
Die Untersuchung der Erreger-spezifischen Antikörperantwort hat gezeigt, dass ein serologischer Assay Rückschlüsse auf den Infektionserreger zulässt. Außerdem zeigen die Daten, dass auch Kommensale wie Darmbakterien das Immunsystem prägen, was wiederum Einfluss auf die humorale Immunantwort während einer Infektion haben kann. Dieser Aspekt wird bei Mausmodellen oft vernachlässigt, kann aber entscheidend für die Translation der Ergebnisse aus Tierversuchen auf den Menschen sein. Aber auch diagnostisch bietet der Infection Array Einsatzmöglichkeiten. Im Gegensatz zur konventionellen Erregerdiagnostik ist die Serologie robust gegenüber einer bereits begonnenen Antibiotikagabe, und sie könnte dabei helfen, zwischen einer Kontamination und dem Infektionserreger zu unterscheiden, z. B. im Fall von KNS wie S. epidermidis. Ebenso wäre der Einsatz bei Biofilm-assoziierten Infektionen wie z. B. Protheseninfektionen oder Endokarditis denkbar. Hier besteht die Infektion oft bereits lange asymptomatisch, bevor sie klinisch diagnostiziert wird. Bei Diagnose bestehen meist bereits erhöhte Antikörperspiegel, die sich von denen gesunder Individuen unterscheiden. Ein serologischer Test könnte hier invasive Eingriffe, um an Material für die mikrobiologische Diagnose heranzukommen, reduzieren und die Sensitivität der Erregerdiagnostik erhöhen. Durch den Einsatz rekombinanter Proteine kann die Spezifität des Assays in der Zukunft erhöht werden. Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit bereits erste immunogene Proteine identifiziert. Durch die Verwendung rekombinanter Proteine wäre zudem zukünftig die Erweiterung des Erregerpanels um typische, aber womöglich schwerkultivierbare Erreger möglich. Damit könnte die Sepsisforschung Neuland betreten.
Expression of the T cell regulatory molecule ICOS (CD278) and LICOS (CD275) on human blood cells
(2006)
Expression of the T cell regulatory molecule ICOS (CD278) and LICOS (CD275) on human blood cells Summary General bacterial infections, which can lead to the clinical picture of sepsis, are a major concern in intensive care units (ICU) and mortality remains high. Recent data have shown that, besides an overreaction of the immune system, also immunosuppression also plays a role in the pathogenesis of sepsis. Immunosuppression has been documented in patients with polytrauma, stroke and burn wounds, which all confer a high risk of severe bacterial infection. Moreover, it has been shown that T cells have an important role in sepsis. A shift of a Th1 dominated T cell response towards a Th2 response has been described as a potential mechanism of immune suppression in patients with sepsis. One of the molecules on the surface of T cells that is involved in the Th2-mediated immune response is the Inducible Costimulator of T cells (ICOS). Its ligand, LICOS, is expressed on the surface of B cells and monocytes. ICOS ligation induces the production of anti-inflammatory cytokines, especially of IL-10. However, nothing is known about the expression of ICOS on T cells and that of LICOS on APCs in patients with severe trauma and stroke. Therefore, in the present study, in a first step, a recombinant human LICOS-Ig fusion protein was generated, which was then used as an antigen for the generation of anti-LICOS monoclonal antibodies. In three fusion experiments, 5,000 primay clones were screened and a single hybridoma was obtained, which produced monoclonal antibodies that specifically reacted with recombinant LICOS, both in form of the LICOS-Ig fusion protein and on the surface of a cell line transfected with a full-length LICOS transgene. Since, it turned out that the antibodies did not bind with high affinity to wild type LICOS, as it is expressed on primary human blood cells, phenotypic analyses were carried out with another anti-LICOS monoclonal antibody, which had become commercially available. Next, the expression of HLA-DR, CD86, LICOS, and ICOS, on the surface of monocytes (CD14+), B cells (CD19+) and T cells (CD3+, CD4+) in whole blood was measured by flow cytometry. Six patients with severe trauma and nine stroke patients were compared with 32 healthy donors. On CD14+ monocytes from healthy donors, the expression levels of HLA-DR and CD86 were over 90%, while the expression of LICOS was much lower (7,5%). In critically ill patients, HLA-DR, CD86 and LICOS expression were strongly reduced. CD86 and HLA-DR were co-regulated, while HLA-DR and LICOS were not. In healthy donors, virtually all B cells expressed HLA-DR and the majority of them co-expressed LICOS (72%), while only a small fraction were CD86+ (14%). After trauma and stroke, HLA-DR, as well as LICOS expression on these cells remained normal; CD86 had a tendency towards being downregulated in most of the trauma patients, while most of the stroke patients exhibited normal CD86+ levels. The levels of HLA-DR and LICOS on T cells in trauma and stroke patients were low and very similar to those of healthy donors. The fraction of CD3+ T lymphocytes or their CD4+ subpopulation, which expressed measurable levels of ICOS (64% and 48%, respectively), did not change after stoke or trauma. However, within the ICOS+ T cell population two subpopulations could be distinguished: ICOSbright and ICOSdim T cells. Interestingly, the ICOSbright subpopulation, but not the ICOSdim and ICOSnegative subpopulations, was markedly increased in all trauma patients and in most of the stroke patients. Given that CD86 was co-regulated with HLA-DR on monocytes it appears that, similar to HLA-DR, CD86 expression could discriminate between patients with a low and high risk of sepsis. In contrast, because of its low basal expression on monocytes and its low signal-noise ratio, LICOS expression levels are not informative. Since ICOS expression on T cells is tightly connected to IL-10 secretion, the high proportion of ICOS bright cells in critically ill patients might contribute to the high IL-10 serum concentrations, which have been reported to be linked to immunosuppression in these patients.
Als ein hochwirksamer Mechanismus zur Generierung und Aufrechterhaltung einer lokalen Toleranz des adaptiven Immunsystems wurde die durch inflammatorische Stimuli, wie IFN-gamma, TNF-alpha oder Lipopolysaccharide, induzierbare Enzymaktivität der Indoleamin 2,3- Dioxygenase (IDO) erkannt, welche durch den Abbau der essentiellen Aminosäure Tryptophan die Bildung toxischer/immunregulativer Metabolite (Kynurenine) initiiert, und dadurch adaptive Immunreaktionen durch Bildung eines tolerogenen Milieus am Ort ihrer Expression wirkungsvoll unterdrückt. Das in der Sepsis beobachtete Versagen des Immunsystems wird als Immunparalyse bezeichnet. Darunter wird die anhaltende Hypoinflammation bei persistierender Infektion im septischen Syndrom verstanden. Der funktionelle Immunzelldefekt, durch den die septische Immunparalyse gekennzeichnet ist, scheint maßgeblich für die Mortalität in der hypoimmunen Phase des septischen Syndroms verantwortlich zu sein. Die zuvor genannten Beobachtungen führen zu der Frage, inwieweit eine Steigerung des durch IDO eingeleiteten Kynureninabbauweges im septischen Syndrom beobachtet werden kann, und ob ein Zusammenhang mit dem Schweregrad des Syndroms und damit mit der Pathophysiologie der Sepsis besteht. Die frühzeitigere und richtige Erkennung einer Sepsis bei gefährdeten Patienten würde einen bedeutenden Vorteil bei der erfolgreichen Behandlung gewähren. Ein besseres Verständnis der immunregulativen Mechanismen in der Sepsis könnte von entscheidender Relevanz für die Beeinflussung der mortalitätsdeterminierenden Immunparalyse und damit für die erfolgreiche Behandlung der Sepsis sein. Aus diesem Verständnis ließen sich immunmodulatorische / immunrekonstitutive Therapieansätze ableiten. Zur Bestimmung der Kynureninstoffwechselaktivität bei septischen Patienten wurde eine Methode zur simultanen Messung von Schlüsselmetaboliten dieses Stoffwechsels mittels quantitativer Tandem Massenspektrometrie etabliert. Diese ermöglichte die näherungsweise Bestimmung der IDO Aktivität sowie der Aktivität des durch sie eingeleiteten Stoffwechselweges aus humanen Plasmaproben. Im Rahmen einer klinischen Studie an 100 intensivtherapierten chirurgischen Patienten wurde der Verlauf der Plasmakonzentrationen der Schlüsselmetabolite während des Intensivaufenthaltes gemessen und mit intensivmedizinischen Routinelaborparametern, immunologischen Laborparametern sowie klinischen Parametern und Scores verglichen. In septischen Patienten ist der durch IDO eingeleitete Kynureninabbauweg deutlich aktiviert. Die Aktivierung des Abbauweges erfolgt sehr früh im septischen Syndrom und differenziert in dem untersuchten Patientengut septische von nicht septischen Patienten besser als Procalcitonin (PCT). In einer multivariaten Varianzanalyse konnte ein Zusammenhang besonders hoher Plasmakonzentrationen der Kynurenine mit dem Zustand des septischen Schocks sowie mit dem septischen Nierenversagen nachgewiesen werden. Die plasmatische Akkumulation der Kynurenine in der Niereninsuffizienz wurde im Rahmen einer weiteren Studie an Patienten in verschiedenen Stadien einer Niereninsuffizienz näher untersucht. Ein Anstieg der Plasmakonzentrationen der Kynurenine in Abhängigkeit von der Schwere der Niereninsuffizienz konnte in dieser Studie auch unabhängig von dem Vorliegen einer Sepsis gezeigt werden. Niedrige Tryptophanspiegel im Plasma von kritisch kranken und septischen Patienten sprechen für eine verminderte Verfügbarkeit von Tryptophan für abhängige Stoffwechselwege, wie die Synthese von Indoleaminen und als Substratquelle für den zellulären Energie- stoffwechsel. Die beobachteten Konzentrationen der Kynurenine erreichen Werte, welche in vitro und in vivo im Mausmodell durch eine zytotoxische Wirkung auf natürliche Killerzellen, B-Lymphozyten und insbesondere T-Lymphozyten als immunregulatorisch wirksam nachgewiesen wurden. Es kann somit festgehalten werden, dass bei septischen Patienten ein immunsuppressiver Mechanismus zu einem sehr frühen Zeitpunkt aktiviert wird und eine systemische Ausprägung erfährt, die sich experimentell als hoch wirksam erwiesen hat. Die Beobachtung der erhöhten Konzentrationen der Kynurenine und deren Korrelation mit Indikatoren chronischer Entzündungsprozesse hsCRP (High Sensitivity C Reactive Protein) und sTNFR-1 (Soluble Tumor Necrose Factor Receptor-1) bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz stützen die These sowie neuere Erkenntnisse einer chronischen Inflammation als zugrundeliegenden Pathomechanismus des Nierenversagens. Die vorliegenden Ergebnisse liefern neue Erkenntnisse über einen immunsuppressiven Mechanismus, welcher in der Sepsis bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt des Syndroms aktiviert wird und eine mögliche Bedeutung für die Entstehung der septischen Immunparalyse sowie des akuten Nierenversagens im septischen Multiorganversagen haben könnte.