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This thesis is about the establishment and the application of novel methods and tools that are re-lated to the most widely used enzyme class: hydrolases. It covers all fields from the identification to the application of these valuable enzymes with particular focus on lactonases, acylases and proteases. The activity assay introduced in Article I substantially extends the method toolbox for studies on lactonases and acylases that interfere with the bacterial cell-cell communication system. Article II describes a fully automatized robotic platform that represents the next-level tool for the high-throughput enzyme screening in the microtiter plate format. It was used, for instance, for the screening for improved porcine aminoacylase I variants. Diverse aspects of the protease-mediated hydrolysis of non-resistant proteins for the purification of resistant target proteins are highlighted in Article III.
Charakterisierung plasmamembrangebundener Proteasen von Nicotiana tabacum und Hordeum vulgare
(2012)
Es wurden erstmals zwei plasmamembrangebundene Proteaseformen in den Wurzeln der Gerste massenspektrometrisch identifiziert und den Metalloaminopeptidasen der Peptidasefamilien M17 und M24 zugeordnet. Ausgehend von Enzymaktivitätstests mit verschiedenen Substraten und gelelektrophoretischer Fraktionierungen existieren darüber hinaus weitere PM-Proteasen des Aminopeptidase-, Carboxypeptidase- und Endoproteasetyps an der pflanzlichen Plasmamembran (PM). Die untersuchten PM-Proteasen stellen Triton X-114-resistente Proteine dar, die erfolgreich mit Octylglucosid solubilisiert wurden und sowohl an der inneren als auch an der apoplastischen Seite der PM lokalisiert sein könnten. Durch endogene Proteolyse werden andere PM-Proteine wie Aquaporine und P-Typ-H+-ATPasen durch die PM-Proteasen reguliert. Dabei zeigen einige dieser Proteolyseprodukte Proteaseaktivität, die für vier Proteaseformen der Gerste erst nach der Abtrennung von der PM nachweisbar war.