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Die Dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine häufige Herzmuskelerkrankung und ist durch eine eingeschränkte systolische Pumpfunktion mit Erweiterung des linken, des rechten oder beider Ventrikel gekennzeichnet. Es sind eine Vielzahl von Ursachen bekannt, u. a. genetische, infektiöse und toxische. Des Weiteren sind eine Vielzahl von kardiotropen Antikörpern nachgewiesen worden, die bei der Pathogenese der DCM eine Rolle spielen. In dieser Dissertationsschrift sollten die funktionellen Effekte kardiotroper Antikörper bei Patienten mit DCM untersucht werden und ein eventuell bestehender Zusammenhang zwischen der Häufigkeit der Antikörper mit einer begleitenden Virusinfektion, Inflammation oder dem Stadium der Krankheit hergestellt werden. Die Untersuchung des Bindungsmechanismus der Antikörper an kardiale Antigene, bzw. eventuell beteiligte Rezeptoren auf den Kardiomyozyten war ein weiteres Anliegen der vorliegenden Arbeit. Die therapeutischen Erfolge einer Entfernung von Antikörpern aus dem Plasma von DCM-Patienten (Immunadsorption) sollten mit den gewonnenen Ergebnissen korreliert werden. Die Wirkung der aufgereinigten IgG-Fraktion aus Plasma von Patienten mit DCM auf Kontraktilität und Ca2+-Ratio während eines Kontraktionszyklus wurde auf isolierten Rattenkardiomyozyten getestet. Dabei konnte festgestellt werden, dass das Plasma von 57 % der DCM-Patienten eine negativ inotrope Wirkung auf die isolierten Rattenkardiomyozyten hat. Die Subgruppenanalysen der untersuchten Patienten ergaben keine Hinweise auf eine Korrelation der negativen Inotropie mit einer bestehenden Virusinfektion oder Myokardinflammation. Allerdings konnte bei männlichen Patienten, bei Patienten mit nur leicht reduzierter Pumpfunktion und kürzerer Krankheitsdauer ein erhöhtes Auftreten negativ inotroper Antikörper festgestellt werden. Durch Pepsin-Spaltung negativ inotrop wirksamer Antikörper und der Vorinkubation von isolierten Rattenkardiomyozyten mit F(ab)2-Fragmenten und Fc-Fragmenten konnte gezeigt werden, dass für die negativ inotrope Wirkung sowohl die antigenbindenden Strukturen als auch der Fc-Teil des Antikörpers verantwortlich sind. In diesem Zusammenhang wurde auf Kardiomyozyten erstmals ein Fc-Rezeptor (Fc-Rezeptor IIa; CD32A) mittels Immunfluoreszenz, Westernblot und Elektronenmikroskopie detektiert. Die Therapieerfolge der Entfernung der Antikörper aus dem Plasma von Patienten mittels der Immunadsorptionstherapie konnten mit den in-vitro Untersuchungen korreliert werden. Patienten mit negativ inotrop wirksamen Antikörpern profitieren stärker von der Therapie. Auch der Genotyp des exprimierten Fc-Rezeptors beeinflusst die Verbesserung der kardialen Parameter der Patienten durch die Therapie. Patienten homozygot für Arginin an der Aminosäure 131 des Proteins besitzen den niedrigaffinen Rezeptor und profitieren stärker von einer Entfernung der Antikörper als Patienten mit dem hochaffinen Histidin-Genotyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass bei einem Teil der DCM-Patienten kardiodepressive Antikörper im Plasma vorhanden sind, welche sowohl über den antigenbindenden F(ab)-Teil als auch über den Fc-Teil die Funktion der Kardiomyozyten beeinflussen. Die Entfernung dieser Antikörper führt zu einer Besserung der kardialen Funktion. Die unterschiedliche Affinität der adsorbierten Antikörper zum Fc-Rezeptor IIa, welche beeinflusst wird durch den H/R-131 Genpolymorphismus, bestimmt hierbei das Ansprechen der Patienten auf die Therapie. Mit der vorliegenden Arbeit ist die aktive Rolle kardiotroper Antikörpern in der Pathogenese der Dilatativen Kardiomyopathie unterstrichen worden und mit der Entdeckung des Fc-Rezeptors IIa ein Mechanismus zum Verständnis der physiologischen Wirkungsweise der Antikörper mit verschiedensten Zielepitopen aufgezeigt worden.
Untersuchungen zum Einfluss des Endothelinsystemes auf die Doxorubicin-induzierte Kardiomyopathie
(2012)
Das Zytostatikum Doxorubicin besitzt nach wie vor einen hohen Stellenwert in der Therapie maligner Erkrankungen. Die schwerste und gleichzeitig dosislimitierende Nebenwirkung, die bei der Therapie mit Doxorubicin auftreten kann, ist eine Kardiomyopathie. Die Prävention dieser Doxorubicin-induzierten Kardiomyopathie könnte eine effektivere Gestaltung der zytostatischen Therapie ermöglichen, allerdings sind dafür detaillierte Kenntnisse über den Pathomechanismus der Entstehung dieser Herzschädigung unabdingbar. Basierend auf der kardioprotektiven Wirkung des dualen Endothelinrezeptorantagonisten (ETA) Bosentan gegenüber einer Doxorubicin-Kardiotoxizität im Mausmodell, war das primäre Ziel der vorliegenden Arbeit, die Wirkung von Bosentan vergleichend zu einer selektiven Endothelinrezeptor-A- bzw. -B-Blockade mittels Sitaxentan bzw. BQ-788 zu analysieren und zugrunde liegende Mechanismen der Kardioprotektion aufzuklären. Dazu wurde das Konduktanzkatheter-System zur Messung und Auswertung hämodynamischer Parameter von C57/BL6-Mäusen am Institut für Pharmakologie etabliert, mit Literaturdaten verglichen und mittels Magnetresonanztomographie verifiziert. Nach Herausarbeitung der zur Induktion einer Herzschädigung geeigneten Doxorubicin-Dosis von 20 mg/kg KG, wurde im folgenden Tierversuch der Einfluss einer Endothelinrezeptor-Blockade durch die ETAs Bosentan, Sitaxentan und BQ-788 auf hämodynamische Parameter vergleichend analysiert. Dabei konnte bei allen ETAs ein kardioprotektiver Effekt gegenüber der Doxorubicin-Kardiotoxizität nachgewiesen werden. Sitaxentan als hochselektiver Endothelinrezeptors-A-Blocker zeigte eine nur geringfügig schlechtere Wirkung auf die Hämodynamik der Versuchstiere. Interessanterweise konnte auch der Endothelinrezeptors-B-Antagonist BQ-788 die Herzfunktion der Doxorubicin-behandelten Mäuse in ähnlichem Ausmaß wie Bosentan und Sitaxentan verbessern, was auf der zusätzlichen Endothelin-A1-Rezeptorblockade beruhen könnte. In einem weiteren Schritt konnte der Doxorubicin- und Doxorubicinolgehalt verschiedener Organe der Maus mittels HPLC bestimmt werden. Dabei zeigte sich, dass der kardioprotektive Effekt der ETAs nicht auf einer verringerten Akkumulation von Doxorubicin oder Doxorubicinol im Myokard beruht, da deren kardiale Spiegel unter ETA-Co-Medikation keine signifikanten unterschiede zeigten. Lediglich BQ-788 beeinflusste den Doxorubicin- und Doxorubicinol-Gehalt in manchen Organen etwas stärker, was die geringfügig schlechtere Hämodynamik erklären könnte. Um der kardioprotektiven Wirkung der ETAs zugrunde liegende molekulare Prozesse aufzuklären, wurden ausgewählte Gene und Proteine hinsichtlich ihrer Expression und Lokalisation im Myokard bzw. in Kardiomyozyten untersucht. Für das mitochondriale Protein ANT1, welches sowohl physiologische als auch pathophysiologische Effekte vermittelt, konnte auf Proteinebene eine verringerte Expression nach Doxorubicingabe ermittelt werden, während die ETAs die ANT-Expression wieder normalisierten bzw. erhöhten, was in der Literatur als kardioprotektiv beschrieben wird. Die ebenfalls kardioprotektiv wirksamen Kinasen Pim-1 und AKT1 zeigten eine gegensätzliche Regulation unter Doxorubicin. Der kardiale Gehalt an phosphorylierten AKT1 (pAKT1) wurde durch Doxorubicin signifikant vermindert und durch Bosentan sowie BQ-788 wieder auf das Kontrollniveau angehoben, was bei Sitaxentan nicht zu verzeichnen war. Demnach könnte AKT1 in die kardioprotektive Wirkung von Bosentan und BQ-788 involviert sein. Pim-1 L (44 kDa-Isoform) wurde durch Doxorubicin im murinen Myokard signifikant hoch reguliert, was durch Co-Medikation mit ETAs nahezu vollständig revertiert wurde und durch den Transkriptionsfaktor STAT3 vermittelt sein könnte. Auch die Lokalisation von Pim-1 unterlag in einem in vitro Kardiomyozyten-Modell (H9c2) einer Regulation durch Doxorubicin mit nukleärer Akkumulation der Kinase, was durch die ETAs in unterschiedlichem Ausmaß moduliert wurde. Die Pim-1-Regulation unter Doxorubicin-Gabe könnte dabei einen Schutzmechanismus der Zellen gegen die kardiotoxische Wirkung des Zytostatikums darstellen, welcher unter Co-Medikation mit ETAs nicht mehr nötig war, da diese die kardiale Pumpfunktion wieder herstellten. Zusätzliche in vitro Untersuchungen zur Viabilität von H9c2-Kardiomyozyten unter Doxorubicin, ETAs und Hemmung von AKT1 und Pim-1 bestätigten die in vivo Ergebnisse im Mausmodell jedoch nicht. Die vorliegende Arbeit bietet interessante Ansätze zur pharmakologischen Prävention der Doxorubicin-induzierten Kardiotoxizität. In einem in vivo murinen Kardiomyopathie-Modell konnte der therapeutische Nutzen von ETAs zur Prophylaxe einer Herzschädigung unter Doxorubicin deutlich herausgestellt sowie mögliche zugrunde liegende Mechanismen aufgeklärt werden. Damit bietet diese Arbeit vielversprechende Ansätze für weiterführende Untersuchungen zum Einsatz von ETAs als Kardioprotektiva.
Bei der Aufnahme von Arzneimitteln in Zellen spielen Transportprozesse eine große Rolle. Das ATP-abhängige Transportprotein P-Glykoprotein vermittelt häufig Resistenzen gegenüber Arzneimitteln. Zunächst wurde dieser Effekt in P-Glykoprotein-überexprimierenden Tumoren entdeckt. Auch viele gesunde Gewebe enthalten P-Glykoprotein. Einige der Substanzen, die von P-Glykoprotein transportiert werden, sind vielverwendete Medikamente bei der Therapie von Herzerkrankungen. Die individuelle Expressionhöhe von P-Glykoprotein im Herzen könnte für das unterschiedliche Ansprechen von Patienten auf von P-Glykoprotein transportierte Medikamente verantwortlich sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression von P-Glykoprotein an 15 humanen Herzgewebeproben untersucht. Verwendet wurde die Methode der RT-PCR und die immunhistochemische Darstellung des Proteins. Die Expression von P-Glykoprotein in humanem Herzmuskelgewebe konnte an allen Proben gezeigt werden. Immunhistochemisch ist P-Glykoprotein in den Endothelzellen der Arteriolen und Kapillaren lokalisiert worden. Hinsichtlich der Expression bei verschiedenen Krankheiten konnte bei Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie eine signifikante Verminderung (p = 0,05) beobachtet werden. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen eine Beteiligung des Herzens an Transportprozessen. Intrakardiale Konzentrationen vieler Substanzen können abhängig von der individuellen P-Glykoprotein-Expression beeinflusst werden
Myokardiale Erkrankungen gehören zu den häufigsten Todesursachen. Das Verständnis der molekularen, patho-physiologischen Ereignisse ist somit entscheidend für die Suche nach geeigneten Therapien. Um einen Einblick in zelluläre Ereignisse der kardialen Erkrankungen zu erhalten, sollten in der hier vorgelegten Arbeit Genexpressionsanalysen unter Verwendung von DNA-Mikroarrays durchgeführt werden. Den Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Charakterisierung der Immunadsorptionstherapie (IA/IgG-Therapie), die eine Therapieoption der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) darstellt. Anhand von Genexpressionsanalysen immunadsorbierter Patienten sollte der Therapieeffekt analysiert werden. Dafür wurde zunächst die Etablierung eines Protokolls zur Isolation von Protein und RNA aus humanen endomyokardialen Biopsien von DCM-Patienten nötig. Um die mit der Therapie verbundenen Genexpressionsänderungen einordnen zu können, sollte zunächst das Genexpressionsmuster von 47 DCM-Patienten mit Patienten ohne Einschränkung der Pumpfunktion (Kontrollen) verglichen und mittels Real-time PCR validiert werden. Die Betrachtung dieser DCM-Patienten und Patienten, die eine normale Pumpfunktion aufwiesen, ergab 649 Gene mit krankheitsbedingt veränderter Expression. Zu diesen gehören neben bekannten Herzinsuffizienz-Markern (BNP, ANP, MYH6) Gene, die Proteine des Protein-Ubiquitinylierungssystem kodieren oder an der Ausprägung von Hypoxie und Fibrose (Connective tissue growth factor) beteiligt sind und auf eine Dysregulation des Proteinabbaus, erhöhten oxidativen Stress und Matrix-Remodeling hinweisen. Darüber hinaus ist aufgrund der geringeren Expression von Genen, die der oxidativen Phosphorylierung und Glykolyse zuzuordnen sind, von einer Energielimitation in DCM-Patienten auszugehen. Unter Berücksichtigung von verschiedenen klinischen Parametern bestand weiterhin die Aufgabe, den Einfluss dieser Parameter auf die Genexpression zu klären. Während wenig Korrelationen zu Body-Mass-Index (BMI), Alter und Krankheitszeitraum auftrat, wurde eine Häufung von Genen festgestellt, deren Expression zur LVEF und LVIDd korreliert. Gene, die Regulatoren mit myokardialer Funktion kodieren (ADRA1A, ADRB2, PLN, RYR2), zeigten gleichzeitig Korrelationen zur LVEF und dem LVIDd (p<0,05). Darüber hinaus sollte das Genexpressionsprofil von Patienten, die von der IA/IgG-Therapie profitieren (Responder) mit den Patienten ohne Therapieerfolg (Nonresponder) vor und 6 Monate nach der IA/IgG-Therapie verglichen werden. In der Subgruppe der Responder wurde für 171 Gene eine signifikant unterschiedliche Expression bestimmt, während die Zahl der durch die Therapie in ihrer Expressionshöhe betroffenen Gene in Nonrespondern mit 72 wesentlich geringer ausfiel. Gene, die sowohl in Respondern nach Therapie als auch krankheitsbedingt verändert waren, konnten kaum beobachtet werden, so dass andere Mechanismen für den Therapieeffekt verantwortlich sein müssen. Neben einer geringeren Expression des ACE2 wurde auch eine Abnahme Fibrose-assoziierter Gene wie CTGF, Fibronectin und Collagen 1A2 in Respondern nach IA/IgG-Therapie beobachtet. Zudem war eine signifikante LVIDd-Abnahme in Respondern zu verzeichnen, die in Nonrespondern nicht zu erkennen war. In Nonrespondern wurde nach IA/IgG-Therapie dagegen die verminderte Expression einiger Komplementfaktoren beobachtet. Zudem bestand die Aufgabe in der Suche nach Genexpressionsänderungen immunadsorbierter DCM-Patienten, die mit der Änderung klinischer Parameter korrelieren. Weiterhin sollte im Rahmen dieser Arbeit eine beschreibende Signatur definiert werden, die eine Vorhersage des Therapieerfolges für den individuellen DCM-Patienten vor Durchführung der IA/IgG-Therapie ermöglicht. Unter Verwendung des Resamplings (Crossvalidierung) wurde mit Hilfe einer Support Vector Machine eine Signatur von 25 Genen definiert, die eine Klassifizierung der Subgruppen mit einer Fehlerrate von 3,7% erlaubt. Die in Abhängigkeit verschiedener, myokardialer Parameter gezeigten Genexpressionsunterschiede in DCM-Patienten spiegeln die Dynamik der Erkrankung wider. Der Einfluss der IA/IgG-Therapie auf die Genexpression von Patienten, die an der DCM erkrankt sind, betrifft eine Vielzahl von Genen verschiedener Kategorien. Korrelationsanalysen zeigen, dass ein Zusammenhang zwischen Genexpressionsänderung und den Änderungen der Parameter LVEF, LVIDd und Inflammation bestehen. Mit der Definition von Patienten, die von der IA/IgG-Therapie profitieren, wurden auch Unterschiede bezüglich klinischer Parameter (LVIDd, Zeitraum der Erkrankung) deutlich, die zum Verständnis der hier dargestellten Genexpressionsunterschiede beitragen. Die generierten Daten bieten neben dem besseren Verständnis der im Myokard ablaufenden Prozesse eine Reihe von Ansatzpunkten für weitere Untersuchungen, wie zum Beispiel zur Rolle des IGF-1-Signalweges oder des Protein-Ubiquitinylierungssystems bei der Ausprägung der DCM, die auch zu neuen Therapieansätzen beitragen können.