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Die reverse Genetik ist ein wichtiges Werkzeug in der Grundlagenforschung und Impfstoffentwicklung der Influenza-A- und -B-Viren. Oft ist der limitierende Schritt für die Erstellung eines solchen Systems der reversen Genetik, bestehend aus mehreren Plasmiden für die einzelnen Gensegmente, die Klonierung der Virusgene in den Expressionsvektor. Für eine schnellere und einfachere Klonierung wurde in dieser Arbeit das LacZa-Fragment mittels modifizierter QuikChange-Reaktion in den Klonierungsvektor pHWSccdB inseriert. Mit dem so entstandenen Vektor pHWSccdBLacZa ist es nun möglich, zusätzlich eine Blau/Weiß-Selektion durchzuführen. Beider target-primed plasmid amplification zur Insertion des viralen Gensegmentes werden hierbei die beiden Selektionsmarker ccdB und LacZa durch das virale Gen ersetzt. Bakterienkolonien mit kloniertem Gensegment können von denen ohne komplettes Insert nun leichter und frühzeitiger durch eine nicht vorhandene Blaufärbung unterschieden werden. Schweine spielen in der Influenzavirus-Transmission eine besondere Rolle, da sie als sog. „mixing vessel“ gelten. Sie können z. B. Reassortanten aus aviären und porzinen Influenzaviren auf den Menschen übertragen, die sich bei einer zeitgleichen Infektion mit beiden Viren im Schwein bilden können. In dieser Arbeit wurden die seit 1979 in Europa zirkulierenden aviären H1N1- Schweineviren betrachtet. Sie sind Schweinestämme, deren Gene von einem aviären Vorläufervirus abstammen. Unter dem Ziel der Untersuchung der molekularen Determinanten des Wirts-Tropismus dieser aviären H1N1-Schweineviren wurden Reassortanten und Zufallsressortanten hergestellt unter Verwendung des aviären Virus A/Duck/Bavaria/1/77 (H1N1) (DkBav) und des aviären Schweinevirus A/Swine/Belgium/1/79 (H1N1) (SwBelg). Zunächst wurde die Replikationseffizienz von DkBav, SwBelg und den hergestellten Reassortanten auf einer aviären und einer porzinen Zelllinie untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass für das aviäre Virus DkBav das HA von SwBelg ausreicht, um in porzinen Zellen das Wachstumsniveau von SwBelg zu erreichen. Das HA-Segment ist also entscheidend für den Wirtstropismus von DkBav in einer porzinen Zelllinie. Experimente im Schwein zeigten jedoch, dass DkBav nicht alleine durch das HA von SwBelg zu einem Schweinevirus wird. Für diese Experimente wurden Schweine intranasal mit den hergestellten Viren, SwBelg und DkBav infiziert. Um die Replikation im Schwein zu steigern, benötigt DkBav zusätzlich zum HA noch das NA von SwBelg und für die Transmission von Schwein zu Schwein das NP sowie eines oder mehrere der anderen Gensegmente von SwBelg. Für eine starke Virusvermehrung in der Lunge benötigt DkBav den Polymerasekomplex, HA und NA von SwBelg. Für die Transformation in ein Schweinevirus benötigt DkBav also kein bestimmtes Gensegment, sondern eine Kombination mehrerer Gensegmente. Für hochpathogene aviäre Influenzaviren ist die polybasische Spaltstelle des Oberflächenproteins HA der wichtigste Virulenzfaktor. Das HA ist u. a. für die Bindung und die Fusion der Endosomenmembran von Influenzaviren mit der Wirtszelle zuständig. Da eine polybasische HA-Spaltstelle alleine jedoch nicht ausreicht, um die Virulenz eines LPAIV deutlich zu erhöhen, wurde in dieser Arbeit nach weiteren Virulenzdeterminanten im HA des hochpathogenen Influenzavirus A/Swan/Germany/R65/2006 (H5N1) (R65wt) zusätzlich zur polybasischen Spaltstelle gesucht. Hierzu wurden von den Viren R65wt und A/Teal/Germany/Wv632/2005 (H5N1) mit eingesetzter polybasischer Spaltstelle (TG05poly) verschiedene HA-Chimären und -Mutanten hergestellt und diese in vitro und in vivo untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass die eingefügten Mutationen nicht ausreichten, um TG05poly zu einem hochpathogenen Virus zu machen. Für das hochpathogene Virus R65wt wurden die Aminosäuren HA-R123 und HAI124 als weitere Virulenzdeterminanten identifiziert. Bei HA-Sequenz- und HAStrukturanalysen wurde festgestellt, dass die Aminosäuren HA-123 und HA-124 innerhalb des niedrigpathogenen bzw. des hochpathogenen Phänotyps hoch konserviert vorliegen. Mutationen an diesen Positionen verringern nicht nur HA-Aktivierungs-pH und Virus-Inaktivierungs-pH deutlich, sondern auch die Letalität des Virus um fast 50 % (HA-I124T) oder das Virus wurde sogar avirulent (HA-R123S). Im Falle einer polybasischen Spaltstelle ist also eine erhöhte pH-Stabilität des HA vermittelt durch die Aminosäure R123 essentiell für die Entstehung eines hochpathogenen aviären H5N1-Virus aus einem niedrigpathogenen Vorläufer.
Rekombinante Vektorvakzinen, basierend auf Viren der Newcastle-Krankheit (NDV) haben sich als kostengünstig, schnell herstellbar und sicher für die Applikation bei Geflügel und Säugetieren erwiesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei rekombinante Vakzineviren, die das lentogene NDV Clone 30 als Vektor nutzen, für die Prävention der hochpathogenen aviären Influenza (HPAI) bei Hühnerküken, die maternale aviäre Influenzavirus-spezifische Antikörper (AIV-MDA) aufweisen, und die Pest der kleinen Wiederkäuer (PPR) bei Ziegen evaluiert.
Während bekannt ist, dass rekombinante NDV/AIV-H5-Vakzineviren in spezifisch pathogenfreien Eintagsküken eine protektive Immunantwort induzieren, ist diese bei Küken in HPAI-Endemiegebieten meist durch vorhandene AIV-MDA negativ beeinflusst. Durch die Generierung einer NDV-Rekombinanten (rNDVsolH5_H5), die das HA des HPAIV H5N1 von zwei individuellen Fremdgenen exprimiert, konnte eine Überexpression des H5 und in Folge der okulonasalen Immunisierung von zwei- und drei-Wochen-alten AIV-MDA+-Küken die Überwindung der AIV-MDA und die Bildung von wirtseigenen AIV-H5-spezifischen Antikörpern erreicht werden. Die in Folge einer HPAIV H5N1-Belastungsinfektion vermittelten Protektionsraten beliefen sich auf 85 % bei zwei-Wochen-alten und auf 100 % bei drei-Wochen-alten Hühnern, deren Ausscheidung des virulenten Wildtypvirus im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant reduziert war. Auch wenn das rekombinante Impfvirus in ein-Wochen-alten AIV-MDA+-Küken replizieren konnte, weist die Schutzrate von 40 % darauf hin, dass die Immunisierung sehr junger AIV-MDA+-Küken nicht zu empfehlen ist.
Die subkutane Immunisierung von Ziegen mit dem rekombinanten Vektorvirus rNDV_HKur, das das Hämagglutinin des Morbillivirus der kleinen Wiederkäuer (small ruminant morbillivirus, PPRV) exprimiert, schützte diese vor einer virulenten Wildtypvirus-Infektion. Nach zweimaliger Applikation wurden, wie nach der Impfung mit einer atttenuierten PPRV-Lebendvakzine, weder Erkrankungszeichen beobachtet noch eine hämatogene Streuung und nur geringgradige Replikation bzw. Ausscheidung des PPR-Wildtypvirus nachgewiesen, was auf die Bildung PPRV-neutralisierender Antikörper nach der Immunisierung zurückzuführen ist. Somit konnte gezeigt werden, dass sich das rekombinante NDV/PPRV-H für die Prävention der PPR bei Ziegen eignet. Mit NDV als Vektorvirus konnten nachweislich die Anforderungen sowohl bezüglich der DIVA-Applikation als auch einer hohen Thermostabilität erreicht werden.
Um NDV als Vektorvirus gezielt zu verändern bzw. für dessen unterschiedliche Anwendungen zu verbessern, ist es von Vorteil die Funktion der einzelnen viralen Proteine zu kennen. Mit dem erstmaligen Nachweis der Expression des W-Proteins können nun mit Hilfe des generierten W-spezifischen Peptidantiserums weitere in-vitro- und in-vivo-Analysen erfolgen, um dessen Funktion im viralen Replikationszyklus näher zu untersuchen.