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Die extrazelluläre Matrix (ECM) umgibt in allen Geweben und Organen die Zellen. Aber die ECM ist mehr als nur ein einfaches Gerüst um die Zellen. Sie stellt nicht nur einen Schutz der Zellen vor mechanischen Einflüssen dar, sondern interagiert zudem über spezielle Rezeptoren mit den Zellen und gewährleistet so lebensnotwendige Prozesse, wie z.B. Adhäsion, Differenzierung, Proliferation und Signaltransduktion von Zellen. Auch an einer kontrollierten Wundheilung sind die ECM-Moleküle aktiv beteiligt. Die Matrixmoleküle Fibronektin und Kollagen IV sind beispielsweise in der Lage, die Migration von Keratinozyten während der Reepithelisierung in Wunden zu fördern. Bei Patienten mit Chronischer Venöser Insuffizienz (CVI) konnten verschiedene Studien in trophisch veränderten Hautarealen eine gesteigerte Produktion der Matrixmoleküle Tenascin, Fibronektin, Kollagen I und IV finden. Das Ziel unserer Arbeit war es zu untersuchen, ob die gut erforschte Mikroangiopathie bei Patienten mit CVI einen Einfluss auf die Expression der ECM-Moleküle Tenascin, Fibronektin, Kollagen I und IV hat oder ob die Hochregulierung dieser Moleküle möglicherweise nur das Ergebnis einer gesteigerten Entzündungsreaktion ist. In der vorliegenden Studie wurde dazu bei 23 Patienten mit chronischer venöser Insuffizienz unterschiedlicher Schweregrade (Widmer II, n=9; Widmer IIIb, n=14) die Mikrozirkulation der Haut mittels transkutaner Sauerstoffpartialdruckmessung (TcPO2) und Laser-Doppler-Fluxmetrie (LDF) am Oberschenkel, Unterschenkel und medialem Malleolus (im Widmer Stadium II) bzw. Ulkusrand (im Widmer Stadium III) des betroffenen Beines erfasst. An allen Messpunkten ist im Anschluss je eine Stanzbiopsie entnommen und immunhistochemisch auf die extrazellulären Matrixmoleküle Kollagen I, Kollagen IV, Fibronektin und Tenascin untersucht worden. Während die mikroangiologischen Messungen im Bereich der Oberschenkelhaut beider Patientengruppen Werte zeigten, wie sie auch in der Haut gesunder Probanden gemessen werden können, fanden wir stadienabhängig bereits erste Verschlechterungen der mikroangiologischen Situation in der Haut des Unterschenkels (sinkender TcPO2, steigender LDF). Die mikroangiopathischen Veränderungen verschlechterten sich in trophisch veränderter Haut des distalen Unterschenkels in Abhängigkeit von dem klinischen Schweregrad weiter. Für alle untersuchten ECM-Moleküle konnten wir eine Zunahme der Anfärbung beobachten, welche eng mit der Schwere der trophischen Veränderungen der Haut korrelierte. Gemeinsam war allen untersuchten Molekülen eine Zunahme der Anfärbung um die Gefäße. In der Haut des Oberschenkels beider Patientengruppen zeigten sich Anfärbemuster, wie sie auch in der Haut gesunder Probanden gefunden werden. Erste Veränderungen in der Anfärbung, vor allem für die Moleküle Tenascin und Kollagen IV, zeigten sich bereits in klinisch gesunder Haut im Unterschenkelbereich, wo wir auch mikroangiopathische Veränderungen nachweisen konnten. Die Ergebnisse dieser Arbeit und die in ihr diskutierten Studien bestätigen die These, dass der Mikroangiopathie primär eine mechanische Ursache zu Grunde liegt und sie der kutanen Manifestation der CVI vorausgeht. Des Weiteren scheint eine systemische Komponente bei der Genese dieser Krankheit keine Rolle zu spielen, da sowohl die mikroangiologische als auch die immunhistochemische Situation in der Oberschenkelhaut nicht pathologisch verändert erschienen. Mit zunehmender Verschlechterung der nutritiven Versorgung konnte eine immer stärker werdende Expression der untersuchten Matrixmoleküle aufgezeigt werden, was für einen Einfluss der Mikroangiopathie auf die Expression der ECM-Moleküle spricht. Bestärkt wurde diese Vermutung durch die Entdeckung in dieser Arbeit, dass bereits in klinisch gesunder, aber mikroangiologisch geschädigter Haut, eine verstärkte Expression einiger ECM-Moleküle zu finden war. In früheren Studien konnte in klinisch gesunden Hautarealen bei Patienten mit CVI, welche bereits mikroangiopathische Veränderungen zeigten, keine Anzeichen signifikant erhöhter Entzündungsaktivität nachgewiesen werden. Es ist daher unwahrscheinlich, dass Zytokine oder Wachstumsfaktoren, welche durch Entzündungszellen freigesetzt werden, für diese Hochregulierung verantwortlich sind. Die vermehrte Expression der Matrixmoleküle in Abhängigkeit von der Mikroangiopathie könnte für Prozesse wie Neoangiogenese oder Wundheilung verantwortlich sein, aber auch einen Schutz der Gefäße vor hohen Drücken darstellen bzw. eine Anpassung der ECM an die veränderte Mikroumgebung gewährleisten. Das es trotzdem zu einer progredienten Schädigung der Haut bis zum Ulcus cruris venosum im Verlaufe dieser Krankheit kommt, kann auf die erhöhte proteolytische Aktivität, insbesondere in lipodermatosklerotischer Haut und im Ulkusbereich, zurückgeführt werden („High turnover pathology“).
Granulosazellen sind involviert in die Steuerung einer Vielzahl von hormonabhängigen Prozessen wie Follikulogenese, Ovulation und Luteinisierung. Die adäquate Funktion der Granulosazellen hängt u.a. ab von der extrazellulären Matrix, Adhäsionsmolekülen und dem Vorkommen von Matrix-Metalloproteinasen. Komponenten der extrazellulären Matrix wie z.B. Laminin und Fibronektin spielen eine wichtige Rolle bei der Follikulogenese und interagieren mit Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Integrinen. Integrine sind transmembrane, heterodimere Rezeptoren, die die Übertragung von Informationen der extrazellulären Matrix in die Zelle vermitteln. Sie bestehen aus einer kleinen beta- und einer größeren alpha-Untereinheit, die nicht-kovalent miteinander verknüpft sind. Auch sie spielen eine wichtige Rolle bei der Follikulogenese. Matrix-Metalloproteinasen sind zink- und calciumabhängige Proteine, die eine Bedeutung haben für Zellproliferation, Migration, den programmierten Zelltod (Apoptose), Angiogenese und Tumorprogression. Sie sind involviert in Follikulogenese, Ovulation und Regression des Corpus luteum. Eine Möglichkeit zur weiteren Erforschung dieser Faktoren besteht in der Etablierung permanenter Zelllinien. Vor diesem Hintergrund wurden in der vorliegenden Arbeit immortalisierte Granulosazellen kultiviert und immunhistochemisch auf das Vorkommen von Matrixkomponenten (Laminin, Fibronektin, Tenascin, Kollagen I und IV), Integrinuntereinheiten (alpha 1, 2, 3, 4, 5, 6, beta 1, 4) und Matrix-Metalloproteinasen (1 – 3, 7 - 15) untersucht. Darüber hinaus wurde die Lokalisation der verschiedenen Faktoren an Kulturen niedriger und hoher Passagen ohne sowie nach Stimulation mit 8-bromo-cAMP durchgeführt. Die verwendeten Zellen wurden bereits in einer früheren Arbeit generiert und stammen aus Ovarien von Weissbüschelaffen, deren ovarieller Zyklus viele Gemeinsamkeiten mit dem des Menschen aufweist. Das Wachstumsmuster der Zellen veränderte sich auch nach höherer Passagenanzahl nicht. Immunhistochemisch wurden die Integrinuntereinheiten alpha 1, 3, 4, 5, beta 1, 4, die Matrixkomponenten Kollagen I, Fibronektin und Laminin sowie die Metalloproteinasen 13, 14 und 15 nachgewiesen. Diese Befunde waren in niedrigen und höheren Passagen identisch. Nach Stimulation der Granulosazellen mit 8-bromo-cAMP wurde für die Metalloproteinasen 13 und 15 eine veränderte Immunreaktion im Vergleich zu nicht stimulierten Zellen festgestellt. Bisher liegen Untersuchungen zur Expression von Integrinen, Matrixkomponenten und Metalloproteinasen in Granulosazellen des Weissbüschelaffen in der Literatur nicht vor. Verglichen mit früheren Untersuchungen am Ovar des Weissbüschelaffen fand sich eine Übereinstimmung bezüglich des Vorkommens der Integrinuntereinheit alpha 1 und alpha 3. Im Gegensatz zu den in-vivo-Befunden wurden die Integrinuntereinheiten alpha 1, 4 und auch 5 gefunden, während die Integrinuntereinheiten alpha 2 und 6 nicht in immortalisierten Granulosazellen, aber in vivo vorkamen. Die Unterschiede bezüglich des Nachweises einiger Integrinuntereinheiten könnte auf eine Veränderung der Zellen durch die Immortalisierung oder die Kulturbedingungen zurückzuführen sein. Die Befunde, dass Matrixkomponenten wie Kollagen I, Laminin und Fibronektin in den immortalisierten Granulosazellen vorkamen, stehen in Einklang mit Untersuchungen an Granulosazellen anderer Spezies (Rind, Maus). Ebenso wurden bereits in kultivierten Zellen Metalloproteinasen aus der Gruppe der Gelatinasen (Metalloproteinasen 2 und 9) nachgewiesen. Die Tatsache, dass nach Stimulierung mit 8-bromo-cAMP ein verändertes Reaktionsmuster für die Metalloproteinase 13 und eine deutlich stärkere Immunreaktion bei der Metalloproteinase 15 vorlag, könnte auf eine wichtige Rolle in der Funktion der Granulosazellen hindeuten. Die vorliegende Arbeit zeigt erstmals, dass immortalisierte Granulosazellen des Weissbüschelaffen Matrixkomponenten, Matrixrezeptoren sowie Metalloproteinasen auch noch nach höheren Passagen bilden. Diese Zellen scheinen in der Expression dieser Faktoren stabil zu sein und sich für weitere Methoden wie PCR, Western-Blot und Transfektionsexperimente zu eignen und somit ein Modell zur Untersuchung der Funktionsweise von Granulosazellen darzustellen.