Refine
Document Type
- Doctoral Thesis (10)
Has Fulltext
- yes (10)
Is part of the Bibliography
- no (10)
Keywords
- Biochemie (10) (remove)
Kunststoffähnliche Polymere wie Polyhydroxyalkanoate (PHA) fanden in den letzten Jahren immer größere Berücksichtigung zur Substitution von Kunststoffen. Die attraktivsten Vertreter dieser Biopolymere sind dabei das Poly-3-hydroxybutyrat (PHB),das Poly-3-hydroxyvalerat (PHV) und das Poly-3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat(PHBV). Für eine kostengünstige Herstellung von PHA sind allerdings biotechnologisch etablierte Erzeuger notwendig. Für eine umweltfreundliche Produktion bieten sich Hefen an. Viele Hefen sind im Gegensatz zu den PHA-synthetisierenden Prokaryoten weder virulent noch pathogen. Allerdings verfügen sie nicht über die notwendige genetische Ausstattung zur PHA-Synthese. In der vorliegenden Arbeit wurden die Gene der PHB- bzw. PHBV-Synthese aus Cupriavidus necator und Methylobacterium extorquens in das Hefegenom von Arxula adeninivorans integriert. Es wurden die Gene phbA (kodiert für eine ß-Ketothiolase), phbB (kodiert für eine Acetoacetyl-CoA-Reduktase) und phbC aus C. necator sowie phaC aus M. extorquens genutzt, wobei die beiden letzteren für PHA-Synthasen kodieren. Für die Integration dieser PHA-Gene wurden sog. YIEC (Yeast Integration Expression Cassettes) konstruiert, mit welchen die Gene in die 25S-rDNA von A. adeninivorans integriert werden konnten. Es wurden jeweils die PHA-Synthasegene phaC oder phbC mit phbA und phbB aus Cupriavidus necator integriert. Dadurch entstanden die sog. 3-fach-Transformanten (3-fach/phaC und 3-fach/phbC). Ebenso wurden die PHA-Synthasegene einzeln integriert, wodurch die sog. 1-fach-Transformanten (1-fach/phaC und 1-fach/phbC) entstanden. Im Mittelpunkt der durchgeführten Arbeiten standen die Bestimmungen der Enzymaktivitäten der rekombinanten PHA-Synthasen, die Determinierung von PHA sowie die Untersuchungen der Veränderungen der Stoffwechselintermediate durch die Integration der PHA-Gene. Bevor die vier PHA-Transformanten generiert worden waren, waren in einer Machbarkeitsstudie die PHA-Gene phbA und phbB integriert und die Expression der rekombinanten Enzyme mit Enzymaktivitätsassays nachgewiesen worden. In den vier verwendeten PHA-Transformanten (1-fach/phaC, 1-fach/phbC sowie 3-fach/phaC und 3-fach/phbC) wurden phbAp und phbBp mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen. Die Expression der PHA-Synthasegene wurde in den PHA-Transformanten durch Enzymaktivitätsassays vorgenommen. Die PHA-Transformanten wurden mit Glukose, Acetat, Ethanol, Propion- und Buttersäure alleinig und im Shift von Glukose auf eine andere Kohlenstoffquelle kultiviert. Dabei wurde festgestellt, dass Ethanol generell von den PHA-Transformanten nicht verwertet werden kann. Parallel zu den Analysen des Wachstumsverhaltens wurden die Enzymaktivitätsassays durchgeführt. Dabei konnten neben der Glukosekultivierung erstmals auch bei Acetatkultivierung Aktivitäten der rekombinanten PHA-Synthasen nachgewiesen werden. Sowohl bei der Glukose- als auch der Acetatkultivierung zeigten die vier PHA-Transformanten verschiedene Verläufe der Aktivitäten. Für die Transformante, in welche das PHA-Synthasegen phaC aus Methylobacterium extorquens integriert worden war (1-fach/phaC), wurden sowohl für die Glukose- als auch die Acetatkultivierung die Aktivitätswerte für die PHA-Synthasen bestimmt. Für die Transformante, welche das PHA-Synthasegen phbC aus Cupriavidus necator trägt (1-fach/phbC), konnten nur bei Glukosekultivierung PHA-Synthaseaktivitäten bestimmt werden. Diese wurden während der Kultivierung geringer. Für die 3-fach-Transformante 3-fach/phaC konnten PHA-Synthaseaktivitäten sowohl für die Glukose- als auch die Acetatkultivierung bestimmt werden, die während der beiden Kultivierungen geringer wurden. Für die Transformante, welche alle drei PHA-Gene inklusive des PHA-Synthasegens phbC (3-fach/phbC) trägt, wurden während der Glukosekultivierung gleich bleibende und während der Kultivierung mit Acetat stark steigende PHA-Synthaseaktivitäten ermittelt. Mit einer Färbemethode sollte in den 1-fach-Transformanten PHB nachgewiesen werden. Dazu wurden die Farbstoffe BODIPY 493/503 und Nilrot, die speziell intrazelluläres PHB bzw. Neutrallipide färben, verwendet. Es konnte mit BODIPY 493/503 kein intrazellulär eingelagertes PHB detektiert werden. Daher handelt es sich bei den Einlagerungen um Lipide. Für eine genauere Analyse der die durch die Integration der PHA-Gene entstehenden Stoffwechselprodukte wurde eine GC/MS-Methode entwickelt. In ersten Messungen zeigte sich für die PHA-Transformanten ein Peak, der die gleiche Retentionszeit wie 3-Hydroxyvalerat (3HV), das Monomer von PHV hatte. Dieser Peak wurde auch im Kontrollstamm G1212k detektiert. Da Cupriavidus necator mit der Kohlenstoffquelle Lävulinsäure (LäS) das PHA Poly-4-hydroxyvalerat produziert, wurde Lävulinsäure in der gaschromatographischen Methode als Referenzsubstanz eingesetzt. Dabei zeigte sich, dass LäS die gleiche Retentionszeit hat wie 3HV. Anschließend wurden die Massenspektren von 3-Hydroxybutyrat (3HB), dem Monomer von PHB, sowie 3HV und LäS verglichen. Dabei erwies sich, dass der Peak gleicher Retentionszeit nicht für 3HB oder 3HV steht, sondern für LäS. Es konnten somit in keiner der PHA-Transformanten 3HB oder 3HV nachgewiesen werden. Anhand der GC/MS-Daten wurde allerdings ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene den Stoffwechsel der Hefe A. adeninivorans stärker beeinflusst als die alleinige Integration der PHA-Synthasegene. Daher wurden Citrat, Succinat, Malat und Fumarat (als Summenparameter für Maleinsäure und Fumarsäure) sowie die Fettsäuren Palmitin-, Stearin- und Linolensäure als weitere Referenzsubstanzen eingesetzt. Es zeigten sich je nach Wahl der Kohlenstoffquelle und der Kultivierungsbedingungen Unterschiede zwischen 3-fach-Transformanten und Kontrollstamm G1212k. In der Glukosekultivierung als auch der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) konnten die meisten Unterschiede zwischen PHA-Transformanten und G1212k festgestellt werden. Es wurden z. B. für die Glukosekultivierung in den 3-fach-Transformanten höhere Gehalte an Fettsäuren detektiert. Daraus lässt sich eine unterstützende Wirkung der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese zur Fettsäurebiosynthese ableiten. Bei der Acetatkultivierung wird neben der PHA-Synthese und der Fettsäurebiosynthese das zentrale Zellintermediat Acetyl-CoA auch im Glyoxylatweg genutzt. Der Glyoxylatweg findet zwar in den Peroxisomen und nicht wie PHA- und Fettsäuresynthese im Zytosol statt, wird aber in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle und durch die Aktivitäten des Zitronensäurezyklus geregelt. Die höheren Gehalte an Citrat bei der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) geben daher einen Anhaltspunkt zur Nutzung des Glyoxylatweges. Aufgrund der erhöhten Fettsäuregehalte während der Glukosekultivierungen und der Nutzung des Glyoxylatweges bei Kultivierung mit Acetat wird ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene dazu führt, dass vermehrt Acetyl-CoA genutzt und Acetoacetyl-CoA, das erste Zwischenprodukt der PHA-Synthese, gebildet wird. Im Zytosol der Zellen findet aber auch der Mevalonatweg für die Isoprensynthese statt. Daher liegt sowohl eine Konkurrenz um Acetyl-CoA als auch um Acetoacetyl-CoA vor. Diese Konkurrenzen führen dazu, dass keine PHA-Synthese in den PHA-Transformanten stattfindet. Deswegen wird postuliert, dass stattdessen die Fettsäuresynthese, der Glyoxylatweg und der Mevalonatweg unterstützt werden. Intensivere Untersuchungen der Stoffwechselwege in A. adeninivorans müssen noch klären wie Zitronensäurezyklus und Glyoxylatweg sowie Fettsäure- und Isoprensynthese in dieser Hefe gesteuert werden können, um ein „metabolic engineering“ zur PHB-Synthese, wie es in S. cerevisiae bereits möglich ist, auch in A. adeninivorans zu realisieren. Dazu müssen nach der Expression der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese auch die Intermediate der Stoffwechselwege gezielter nutzbar und konkurrierende Enzymaktivitäten inhibiert werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Synthese von Fettsäureestern aus Pflanzenölen mit Methanol bzw. Ethanol in Gegenwart von Wasser durch die Lipase CAL-A zu optimieren, wobei insbesondere die Bildung von freien Fettsäuren minimiert werden sollte. Zunächst wurde ein Hochdurchsatztest zur Bestimmung der Acyltransferaseaktivität der CAL-A etabliert, welcher auf der Abnahme des Alkoholgehalts in Umesterungsreaktionen basiert. Dabei zeigte sich eine gute Übereinstimmung zwischen den Umsätzen, die mit GC und dem Oxidase-Assay ermittelt wurden, wobei die Umsätze nicht zu gering sein sollten da sonst größere Schwankungen im Oxidase-Assay möglich sind. Durch das rationale Design anhand der gelösten Struktur der CAL-A konnten vier Mutagenesepositionen identifiziert werden: Thr118, Asp122, Thr221 und Glu370. Durch den Austausch der Aminosäurereste an diesen Positionen gegen hydrophobere Aminosäuren wurden 28 CAL-A Varianten generiert. Diese wurden für eine initiales, qualitatives Screening eingesetzt, indem drei CAL-A Varianten eine ähnliche bzw. erhöhte Esterbildung im Vergleich zum Wildtyp zu haben schienen. Die drei Varianten Thr118Ile, Asp122Leu und Thr221Ala wurden daraufhin für weitere Untersuchungen in P. pastoris im Bioreaktor hergestellt und in Biokatalysen verwendet. Eine erhöhte Esterbildung für die Varianten Thr118Ile und Thr221Ala ließ sich jedoch nicht bestätigen, allerdings zeigte sich, dass die CAL-A Variante Asp122Leu deutlich weniger freie Säure bildete als der CAL-A WT. In der anschließenden Charakterisierung von CAL-A Asp122Leu zeigte sich, dass diese Variante wie CAL-A WT auch thermostabil ist und dass beide Enzyme das gleiche pH- und Temperaturoptimum haben. Des Weiteren wurden CAL-A WT und Asp122Leu adsorptiv auf Lewatit VP OC 1600 immobilisiert und in Biokatalysen eingesetzt, in denen CAL-A Asp122Leu erneut deutlich weniger freie Säure bildete. Darüber hinaus wurde auch der Einfluss der Reaktionsbedingungen auf die Acyltransferaseaktivität der CAL-A untersucht. Es wurden dazu Biokatalysen mit Ethanol oder Methanol durchgeführt, in denen der Wassergehalt (5% oder 10% bezogen auf die Einwaage an Öl) und die Reaktionstemperatur (30°C, 40°C oder 50°C) variiert wurden. Die Biokatalysen mit Methanol zeigten dabei generell einen hohen Umsatz zwischen 85-95%, während die Biokatalysen mit Ethanol nur zu geringeren Umsätzen führten (55-85%). Allerdings zeigte sich in einem Langzeitstabilitätstest mit einer Biokatalysedauer von 97 h auch, dass Methanol das verwendete CAL-A Immobilisat stärker inaktiviert als Ethanol. Ebenso musste bei einem Wassergehalt von nur 5% die Methanolzugabe schrittweise erfolgen, um eine Inaktivierung des CAL-A Immobilisats zu verhindern. Somit konnte eine Optimierung der CAL A katalysierten Umesterungsreaktionen sowohl durch das Protein-Engineering des Biokatalysators als auch durch die Anpassung der Prozessbedingngen erreicht werden. Dabei wurden Erkenntnisse gewonnen, die auch zur Beurteilung der industriellen Anwendbarkeit eines solchen Prozesses beitragen können.
Diese Arbeit widmet sich der funktionellen und strukturellen Untersuchung von SCO3201, einem Protein aus der Klasse der TetR-Repressoren, dessen Struktur bisher unbekannt war und das eine geringe sequenzielle Ähnlichkeit zu anderen Mitgliedern seiner Familie besitzt. SCO3201 wurde als Repressorprotein identifiziert, das durch Überexpression sowohl die Antibiotikaproduktion, als auch die morphologische Differenzierung von Streptomyces coelicolor unterdrückt. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass SCO3201 an mindestens 16 verschiedene Promotor-Sequenzen binden kann. Das Protein konnte in E. coli exprimiert und anschließend isoliert werden. Wegen des Fehlens geeigneter Strukturmodelle gelang eine Strukturlösung mittels Molekularem Ersatz nach erfolgreicher Kristallisation zunächst nicht. Mittels Single-Wavelength-Anomalous-Dispersion-Methode konnte die Struktur des teilweise induzierten Proteins jedoch aufgeklärt werden. Zudem wurde eine Apo-Form des Proteins kristallisiert und ebenfalls strukturell aufgeklärt. Dies erlaubte die Lokalisation der Ligandenbindungstasche und ließ Rückschlüsse auf die Domänenbewegungen zu, die durch den Prozess der Induktion ausgelöst werden. Daneben wurde mittels Röntgenkleinwinkelstreuung die Struktur von SCO3201 in Lösung untersucht, um eventuelle Kristallisationsartefakte auszuschließen. Durch den Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) wurde außerdem die Interaktion zwischen dem Regulator SCO3201 zu seinen Operatoren untersucht.
Eukaryotische Mikroalgen werden seit einigen Jahrzehnten hinsichtlich ihrer Eignung als Wirkstoffproduzenten intensiv untersucht, wobei bisher nur wenige potentiell nutzbare Verbindungen identifiziert wurden. Trotzdem lässt alleine die riesige Artenvielfalt die Vermutung zu, dass es Produzenten interessanter Sekundärstoffe geben muss. In den letzten Jahren zeigte sich außerdem, dass Mikroalgen Lieferanten von Wertstoffen, beispielsweise im Bereich der regenerativen Energien, sein können. Hier sind vor allem die hohen Kultivierungskosten und die geringe Produktausbeute noch zu überwindende Hürden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden 70 eukaryotische Mikroalgenstämme auf ihre Eignung als Produzenten neuartiger Wirk- und Wertstoffe untersucht. Außerdem wurde durch Variation der Kultivierungsbedingungen ermittelt, ob die Kultivierungskosten gesenkt und die Ausbeuten an relevanten Produkten aus Mikroalgen gesteigert werden können. Die untersuchten Mikroalgen stammten aus der Stammsammlung der Pharmazeutischen Biologie der Universität Greifswald, aus kommerziellen Stammsammlungen oder wurden aus Gewässerproben der Greifswalder Umgebung isoliert. Neue Isolate wurden mit molekulargenetischen Methoden identifiziert. Alle Mikroalgen wurden zunächst unter Standardbedingungen kultiviert, die Biomasse-Raum-Zeit-Ausbeute bestimmt und bewertet. Anschließend wurde die biochemische Zusammensetzung der Biomasse analysiert. Dazu wurden im Rahmen der Arbeit sechs Methoden zur Gesamtlipid-, Gesamtkohlenhydrat- und Gesamtproteingehaltsbestimmung sowie zur Analytik der Lipid- und Kohlenhydratzusammensetzung etabliert.
Die Algen zeigten bei Kultivierung unter Standardbedingungen Biomasseausbeuten bis 90 mg L-1 d-1. Die höchsten Wachstumsraten erreichten verschiedene Scenedesmus spp. Die biochemische Zusammensetzung der Algenbiomasse war sehr variabel. Häufig war jedoch der Proteinanteil mit ca. 50 % am höchsten, gefolgt von Kohlenhydraten mit etwa 30 % und einem Lipidanteil von ca. 10 %. Anhand der Modellalge Scenedesmus obtusiusculus konnte gezeigt werden, dass die Biomassezusammensetzung durch Variation der Kultivierungsbedingungen beeinflusst werden kann. So führten erhöhte Beleuchtung sowie Nitrat- und Eisenmangel zu vermehrter Lipid- und Kohlenhydratakkumulation. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde ein neues Kulturmedium entwickelt, in dem die Modellalge lipid- und kohlenhydratreiche Biomasse ohne Wachstumseinbußen im Vergleich zum Standardmedium produziert. Durch Verwendung natürlicher Wasserquellen als Basis für das Kulturmedium konnten darüber hinaus die Kultivierungskosten deutlich reduziert werden. Durch die gleichzeitige Steigerung der Produktausbeute und Senkung der Kultivierungskosten konnte gezeigt werden, dass auch eine großtechnische Produktion von Wertstoffen aus Mikroalgen wirtschaftlich sein kann.
Zur Bewertung des Potenzials der Mikroalgen als Produzenten von interessanten Sekundärstoffen wurde beispielhaft die antimikrobielle Aktivität von Extrakten der Algenbiomasse untersucht. Es zeigte sich, dass vor allem lipophile Extrakte gegen grampositive Bakterien wirksam waren, wofür wahrscheinlich die in den Extrakten nachgewiesenen mehrfach ungesättigten FS verantwortlich sind. Einige Mikroalgenarten wiesen zudem einen hohen Betaglucangehalt auf. Diesen Polysacchariden werden, wenn bestimmte Strukturvoraussetzungen erfüllt sind, diverse gesundheitsfördernde Effekte zugeschrieben. Durch Optimierung der Kultivierungsbedingungen konnten bei einigen Algenarten mit einem Gehalt von bis zu 35 % deutlich höhere Werte im Vergleich mit anderen betaglucanreichen Lebensmitteln wie Getreide (bis 10 %) oder Pilzen (bis 25 %) erreicht werden. Damit konnte gezeigt werden, dass Mikroalgen neben ihrer Eignung als Wertstoffproduzenten auch interessante Wirkstoffe liefern können.
Chiral amines represent high-value fine chemicals serving as key intermediate products in pharmaceutical, chemical and agrochemical industries. In the past decades, application of amine transaminases (ATAs) for stereoselective amination of prochiral ketones emerged to an environmentally benign and economically attractive alternative to transition metal-catalyzed asymmetric synthesis to afford optically pure amines at industrial scale. However, the restricted substrate scope of wild-type transaminases prohibited the conversion of particularly sterically demanding substrates, making protein engineering indispensable. The following thesis covers elaboration of a novel assay for transaminases (Article I) and identification and development of transaminase variants in order to achieve biocatalytic preparation of a set of pharmaceutically relevant model amines, ideally in optically pure form for both stereoisomers, preferentially using asymmetric synthesis and most preferably using isopropylamine as cost-efficient amine donor co-substrate (Article II-IV). The aforementioned target amines and the corresponding precursor ketones (see Scheme 4.1) were conceived and provided by the company F. Hoffmann-La Roche to attain suitable biocatalysts for a variety of potential intermediates for active pharmaceutical ingredients. Protein engineering of the transaminase scaffolds investigated in this thesis comprised: Initial screening for suitable starting enzyme scaffolds, structure-guided rational design of these scaffolds to enable bulky planar substrate acceptance, elaboration of a sequence motif, verification of the motif and preparative-scale asymmetric synthesis reactions (Article II). For non-planar and structurally different target substrates, namely spatially bulky or bi-cyclic bridged substrates, the transaminase variants were specifically refined and a different evolutionary route had to be pursued (Article III and Article IV). These results (Article II) represent not only the first successful endeavor to engineer a PLP-fold type I amine transaminase (commonly denoted as (S)-selective) for the conversion of highly sterically demanding substrates, but also generally expanded the scope of available fold type I amine transaminases by enzymes having a novel and exceptionally broad substrate spectrum. Aside from structure-guided rational protein engineering, as well non-rational methods, such as site-specific saturation mutagenesis or directed evolution, were applied for protein-engineering. In order to do so for all of the target compounds, a novel high-throughput solid phase activity assay for transaminases that was actually developed during the master thesis, was refined and published (Article I). In the context of this thesis, the same assay principle was as well adapted for quantification of specific activities in liquid phase (Article III). A comparison of different methodologies for developing agar plate assays and a detailed step by step protocol of our transaminase assay are illustrated in a book chapter.
Class I and class II glutaredoxins (Grxs) are glutathione (GSH)-dependent proteins, that function as oxidoreductases (class I) or mediate cellular iron trafficking (class II). Some members of class I Grxs like human Grx2 are able to complex a [2Fe-2S] cluster and form a dimeric holo complex, which renders them catalytically inactive and is the basis for their function as redox sensors. Class II Grxs like human Grx5 also complex [2Fe-2S] clusters, however these proteins transfer the clusters to other proteins. Both functionally distinct classes share a similar thioredoxin fold and conserved interaction sites for the non-covalently binding of GSH, which is required to complex the [2Fe-2S] cluster. Furthermore, the proteins from both classes contain a highly nucleophilic active site cysteine that would allow both classes to catalyze GSH-dependent oxidoreduction reactions. Despite of these similar features, only class I Grxs are able to form a mixed disulfide with GSH and to reversibly transfer it to protein thiols (de-/glutathionylation). Interestingly, neither class I Grxs nor class II Grxs can effectively compensate the loss of an essential member of the other class. Even though some structural differences were described earlier, the basis for their different functions remained unknown. In particular, the lack of catalytic activity of class II Grxs as oxidoreductases could not be explained. Here, we demonstrate that the different conformations of a conserved lysyl side chain are the molecular determinant of the oxidoreductase or Fe-S transfer activity of class I and II Grxs, respectively. A specific loop structure that is conserved in all class II Grxs determines one lysyl conformation that prevents the formation of a mixed disulfide of the active site cysteinyl thiol with GSH. Using engineered mutants of hGrx2 and hGrx5, we demonstrated that the exchange of the distinct loop between the classes results in a loss of oxidoreductase function of class I hGrx2 and the gain of oxidoreductase activity of class II hGrx5. The altered GSH binding mode also profoundly changes the [2Fe-2S] cluster binding of the engineered mutants and thereby also influences stability of the holo complexes, a pre-determinant for [Fe-S] cluster transfer activity. With the minor shift of 2 Å in a conserved lysyl side chain orientation we were not only able to modify the catalytic activity of two small human mitochondrial proteins, but on a much larger scale also provided evidence for the previously unknown structural basis that determines the function of all class I and class II Grxs.
The oxidoreductase activity of hGrx2 was also analyzed in vivo in a model of doxorubicin cell toxicity. Applying a mass spectrometrical approach, we identified various mitochondrial proteins as targets for redox regulation. Furthermore, our results gave reason to reconsider some common assumptions regarding doxorubicin-induced apoptosis and the protective function of mitochondrial Grx2.
β-chirale Amine, wie zum Beispiel Pregabalin und Baclofen, sind Verbindungen von großem Interesse insbesondere für die pharmazeutische Industrie. Biokatalytische Herstellungsverfahren, vor allem Aminierungsreaktionen, sind bisher nur geringfügig untersucht worden und werden nach aktuellem Wissenstand bis auf die Synthese von Niraparib noch nicht in großtechnischem Maßstab eingesetzt. Wünschenswert ist die Etablierung einer Synthese, welche (S)-Pregabalin bzw. (R)-Baclofen in hohen Ausbeuten liefert, da diese beiden Enantiomere jeweils die höhere biologische Wirksamkeit aufweisen.
Ziel dieser Arbeit war die Synthese von Pregabalin und Baclofen als Modellverbindungen für β-chirale Amine mit Hilfe einer selektiven Amintransaminase oder Amindehydrogenase.
Zunächst wurde erfolgreich mit Hilfe der Gaschromatographie bzw. HPLC jeweils eine chirale Analytik für die beiden Reaktionsprodukte sowie die Baclofen-Derivate etabliert, die stabil reproduzierbar und auch zur Quantifizierung geeignet war. Auch für 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-buttersäure-t-butylester konnte eine GC-Methode entwickelt werden, die Aufschluss über die Konzentration und den Enantiomerenüberschuss gab.
Die vier zur Verfügung gestellten Amindehydrogenasen konnten erfolgreich exprimiert und mittels IMAC-Methode gereinigt werden. Trotz geringer Aktivitäten in einem photometrischen NADH-Assay konnte jedoch keine Produktbildung nachgewiesen werden. Eine Kollektion von ca. 150 Amintransaminasen wurde bezüglich der Desaminierung von Pregabalin und Baclofen mittels Dünnschichtchromatographie untersucht. In Richtung der Aminierung wurde ein photometrischer Acetophenon-Assay verwendet. Dabei wurden für Pregabalin sechs und für Baclofen 17 potenzielle Kandidaten ermittelt. Besonders vielversprechend war die Variante 3FCR 59W 87L 231A 382M 429A (3FCR_5M), welche 3-(4-Chlorphenyl)-4-oxo-buttersäure-t-butylester als Substrat akzeptierte. Nach der Ermittlung eines geeigneten Aminodonors und Optimierung der Reaktionsbedingungen konnten Umsätze bis zu 90% bei 99%ee (R) mit IMAC-gereinigter 3FCR_5M erzielt werden.
Um Kosten für ein späteres großtechnisches Verfahren einzusparen, sollte die Reaktion ebenfalls für den Einsatz von Zellextrakt optimiert werden. Dabei wurde beobachtet, dass geringere Enantiomerenüberschüsse erzielt wurden als mit dem gereinigten Enzym und der Substratverbrauch höher als die Produktbildung war. Als mögliche Ursachen wurden der Umsatz des Substrats durch ein E. coli eigenes Enzym, beispielsweise eine Aldehydreduktase oder Aldehyddehydrogenase, sowie eine Beeinflussung der Enantioselektivität durch die veränderte chemische Umgebung oder den selektiven Entzug des gewünschten Substrat-Enantiomers durch eine selektive Nebenreaktion hypothetisiert. Dieses Phänomen konnte durch eine vorgeschaltete Reinigung mittels fraktionierender Ammoniumsulfat-Fällung jedoch erfolgreich umgangen werden. Mit dieser Methode konnten vergleichbar hohe Umsätze und Enantiomerenüberschüsse wie mit dem IMAC-gereinigten Enzym erreicht werden.
Bei ersten Vorversuchen zum Up-Scaling der Reaktion wurde festgestellt, dass eine höhere Substratkonzentration nicht einen proportional höheren Umsatz zur Folge hatte, jedoch konnte der Umsatz durch eine versetzte Zugabe der Enzymlösung gesteigert werden, sodass ein Prozess mit diesem Biokatalysator in seiner aktuellen Form eine kontinuierliche Zugabe erfordern würde. Praktikabel wäre einer Verminderung der Substrat-Inhibierung und Erhöhung der Enzymstabilität durch weiteres Protein-Engineering. Auch zur Produktion von 3FCR_5M im größeren Maßstab wurden Experimente vorgenommen. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine vielversprechende Expression im Bioreaktor bei einer kontinuierlichen Temperatur von 30°C und einer Expressionsdauer von sieben Stunden. Nach einigen Optimierungsschritten konnte im Bioreaktor die zwanzigfache volumetrische Aktivität im Vergleich zur Expression im Schüttelkolben erzeugt werden.
Zusammenfassend ist zu sagen, dass in der vorliegenden Arbeit, trotz weiterem Optimierungsbedarf, eine sehr gute Grundlage für die Transaminase-vermittelte Synthese von (R)-Baclofen geschaffen wurde. In zukünftigen Arbeiten sollte die Optimierung der Reaktion in großem Maßstab im Fokus stehen.
Using validated analytical tools and optimized sampling procedures, it was possible to detect a vast number of metabolites from the extracellular space but also from the cytosol of B. subtilis. The results indicate that the complement of the analytical methods was suitable in the monitoring of the metabolome since it allowed a great coverage of physicochemical diverse metabolites. However, a wide number of unknown metabolites/features were also detected. Although broad databases exist that can help in the annotation of metabolites, further investigation is needed in their identification. In unpredictable changing conditions, bacterial cells possess appropriate adaptation strategies for a successful bacterial growth. These rely on sensing mechanisms that globally adjust gene expression via transcription and feedback regulations. The metabolic sensing mechanisms have emerged as key roles in the nutritional information and regulation of cell cycle processes. In this work, a new quality of information regarding the metabolism and adaptation to the absence of key signal mechanisms in B. subtilis was provided. Investigations of cells lacking Pyk uncovered alterations in the import of glucose and pyruvate from the nutritional media. These results gives insights to the pyruvate homeostasis mechanism but also brought new questions concerning the regulation of the CCR. Pyruvate wasn't susceptible to the glucose dependent CCR in Δpyk. The earlier in ux of pyruvate in these cells is in accordance to the newly discovered pyruvate transport mechanism. Also, it was speculated that the lower consumption of external glucose could be a consequence of the impairment of the PTS system in the mutant cells due to the accumulation of glycolytic metabolite FBP. In future studies, insights of the PTS system mechanism should be done in these conditions, that could comprise the determination of HPr phosphorylation and the HPrK activity. This study also arose new questions that should be address, that include the higher secretion of acetoin and 2,3-butanediol, and the lower accumulation of shikimate 3-phosphate by the mutant cells. In an untargeted metabolomic analysis, a vast number of altered features were suggested to be fatty acids metabolites, precursors of phospholipids and LTA. Complementary approaches should be done for the confirmation of these metabolites and the inspection of possible alterations in the membrane structure. In the study of LTA mutants, the accumulation of PG precursors provided a hint of altered cell wall assembly. Although by uorescence microscopy no clear changes were detected, the metabolic results emphasized the previous assumption of the affected hydrolytic activity occurring in the PG. For comprehensive knowledge of the cell wall it would be important to detect and identify more metabolites of the LTA anchor using optimized cromatographic method. These results could be complemented with other omics data sets studies which would help in the elucidation of these key regulatory systems mechanisms.
In contrast to its terrestrial counterpart, the metabolic degradation of marine polysaccharides is underexplored. This work aimed to functionally characterize ulvan- and xylan-degrading enzymes from marine Bacteroidetes in order to clarify the metabolic degradation pathway. For the provision of a broad polysaccharide substrate spectrum, ulvan from several different algal sources was extracted to be used in further characterization experiments. The structural differences of these ulvans could be demonstrated by enzymatic degradation with ulvan-active enzymes. In order to clarify the synergistic catalytic effects of polysaccharide sulfatases with GHs in the degradation process of ulvan, several putative sulfatases from F. agariphila were produced recombinantly in E. coli. For that, a coexpression with an FGE encoding gene was required. It could be demonstrated that several glycoside hydrolases are inhibited, if their
substrate is sulfated at the cleavage position and that a previous desulfation using one of the sulfatases enabled the further degradation. Some of the sulfatases showed an endolytic or exolytic cleavage behavior like reported for several GHs. With the combined catalytic activities, it was possible to successfully elucidate the complex ulvan degradation mechanism for the first time, which enables the use of ulvan as a biotechnological source for the production of fine chemicals and pharmaceuticals. This degradation mechanism was shown to be complemented by an alternative pathway that helps with the degradation of uronic acid-containing oligosaccharides. Here, the synergistic effects of a multimodular enzyme containing a sulfatase and rhamnosidase domain were demonstrated. Furthermore, the first dehydratase participating in the degradation of oligosaccharides was revealed. The functional characterization of putative xylan-targeting PULs from two Flavobacteriia revealed the existence of marine endolytic and exolytic xylanases. The enzymes of these PULs were produced recombinantly in E. coli and were used in biocatalysis reactions on xylan from beechwood, xylan from P. palmata or commercial xylooligosaccharide standards. Further side chain-active GHs were found to exclusively be active on either standards or xylan. The great variation of genetic equipment was demonstrated by comparing the enzyme activities of these PUL structures assuming different ecological adaptations of these organisms especially, because these PULs do not code for any putative sulfatases, which is uncommon for PULs targeting xylan. A different degradation behavior of the investigated enzymes suggested a preferred conversion of β-1,4-linked xylan, potentially present in some microalgae. The acquired insight of the metabolic ulvan and xylan utilization greatly expands the scientific knowledge about the ecologic interplays in marine environments concerning the polysaccharide utilization. It indicates the necessity of backup mechanisms for metabolic processes in order to get access to complex marine carbon sources in nature. Several small degradation cascades complement each other to break down substrate compounds to monomeric level for the use of structurally diverse polysaccharides. This expands the insights into the metabolic processes in the degradation of marine polysaccharides, which are an important part of the understanding of the ecological interactions in aquatic habitats and the ocean’s carbon cycle.
The characterization of ulvan- and xylan-active enzymes and the clarification of their substrate scopes allow to use these enzymes in future production of carbohydrate-derived chemical products for many industrial applications, making it possible to use algal waste for recycling to high value materials with even beneficial effect for the environment.
Blood platelets are primary major players in the coagulation cascade, that act upon damage in blood vessels at the subendothelial surface. During this process, platelets change their shape, release granules and aggregate by cross-linking of integrin αIIbβ3 via fibrinogen. The heterodimeric transmembrane receptor integrin αIIbβ3 is highly expressed on platelets and its regulation is bidirectional. Inside-out signaling leads to increased affinity for ligands due to dramatic rearrangements in the integrin conformation changing from an inactive bent conformation to an extended, high-affinity conformation. The swing-out motion of the integrin head domain enables binding of ligands, e.g. fibrinogen, resulting in outside-in signaling guiding kinase activation, shape change, platelet aggregation and spreading, subsequently.
Agonists (e.g. thrombin) and other triggers (e.g. shear stress) promote the activity of platelets, making the study of specific proteins delicate. Therefore, this PhD thesis describes a biomimetic system used to study αIIbβ3 membrane receptors. Integrin αIIbβ3 was successfully reconstituted into liposomes and characterized by biophysical and molecular biological methods (e.g. dynamic light scattering, transmission electron microscopy, circular dichroism spectroscopy and flow cytometry). The fusion of liposomes to a solid substrate allows the analysis of potential activation triggers and interaction partners concerning their role in integrin αIIbβ3 activation in a lipid bilayer. Among others, quartz-crystal microbalance measurements show that divalent ions and clinically relevant drugs (e.g. unfractionated heparin and quinine), known to be involved in immune thrombocytopenia (ITP), are certainly candidates which induce integrin activation and minor changes in protein secondary structure. In addition, protein corona formation during contact of nanoparticles with blood components, such as fibrinogen, as well as their interaction with artificial platelet model membranes containing integrins were studied. Moreover, lipid environment can be strongly controlled as integrin activation is dependent on the ratio of liquid-ordered and disordered phases within the membrane. Eventually, by exclusion of disturbances of complex external and internal factors, the established system enables the interaction analysis of various substances with receptors under physiological conditions. In contrast, these disturbances are required to understand the complex machinery of cellular processes in vivo. Hence, an expression platform, on the basis of HEK293 cells, was established to study not only the interaction of integrin αIIbβ3 with cytoskeletal networks, but also the impact of mutations on integrin resulting in a disease-like phenotype. Mutations known to induce Glanzmann thrombasthenia (GT) symptoms, were introduced and led to different mechanical properties of integrin-expressing cells, especially during cell adhesion cells. Thereby, generation of biological and medically-relevant processes combined with the biophysical setup contribute to understand disease mechanisms as well as the action of therapeutic agents in diseases such as GT and ITP.