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Die Pflanze Pittosporum angustifolium („GymbiGymbi“) wird von der indigenen Bevölkerung Australiens für verschiedene medizinische Indikationen verwendet. Anwendungsbeobachtungen und erste zellbiologische Untersuchungen geben Hinweise auf den potentiellen Nutzen dieser Pflanze für die Therapie maligner Neoplasien. Ziele dieser Arbeit: Erkenntnisse zu den zellbiologischen Interaktionen zwischen Pittosporum angustifolium und der Tumorzelllinie (U-5637). Material: vier alkoholische, ein wässriger und ein mit Amylase behandelter Extrakt, außerdem sieben isolierte Reinsubstanzen. Methoden: Neutralrottest, Durchflusszytometrie. Wichtige Ergebnisse: Neutralrottest: IC50-Werte zwischen 10 µg/ml (Hydrolysat des Aq.EtOH-Extraktes ) und 66 µg/ml (Amylase-Extrakt). Substanz 4 mit IC50 : 4 µg/ml, Substanz 6 mit IC501 µg/ml. Durchflusszytometrie: Keine Zellphasenarretierung durch die Extrakte. Als Wirkmechanismus zeigten sich sowohl Apoptose- als auch Nekroseinduktion sowohl durch die Extrakte als auch durch Substanz 4 [12 µg/ml] und Substanz 6 [1 µg/ml].
Der Einfluss der Nahrungsaufnahme auf die Wirkstofffreisetzung aus oral applizierten Darreichungsformen ist eine der zentralen Fragestellungen der Biopharmazie. In der vorliegenden Arbeit wurden die physiologischen Faktoren, die die Wirkstofffreisetzung aus festen oralen Darreichungsformen im postprandialen Magen beeinflussen können, näher charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde ein biorelevantes In vitro-Freisetzungsmodell (Fed Stomach Model, FSM) entwickelt, das die Simulation mechanischer Beanspruchungen bei der Passage des postprandialen Magens ermöglicht. In speziellen Durchflusszellen konnten die Bewegungen der Arzneiform im Magen, intragastral auftretende Drücke sowie der Mediendurchfluss individuell kontrolliert und in physiologischen Größenordnungen simuliert werden. Die Eignung des FSM wurde anhand einer Zweischicht-Retardtablette mit dem Wirkstoff Diclofenac-Natrium untersucht. Die regionalen Besonderheiten des Magens hinsichtlich der mechanischen Beanspruchungen wurden dabei in Testprogrammen für den Fundus, das Antrum und die Magenentleerung berücksichtigt. Diese wurden, basierend auf den Ergebnissen einer Magnetic Marker Monitoring-Studie, ferner in drei verschiedenen Testszenarien, die das gastrale Lokalisationsverhalten einer oralen Arzneiform im postprandialen Magen über eine Dauer von 4 h beschreiben, in unterschiedlicher Abfolge miteinander kombiniert. Es konnte in Abhängigkeit der simulierten Testszenarien ein verschiedenartiges Freisetzungsverhalten der untersuchten Arzneiform beobachtet werden. Dabei führte die Simulation der milden Beanspruchungen im Fundus zu relativ geringen Freisetzungsraten. Aus den starken mechanischen Beanspruchungen, die die physiologischen Bedingungen im Antrum und während der Magenentleerung abbildeten, resultierten hingegen höhere Wirkstofffreigaberaten. Der Physiologie des Magens entsprechend, vermag das FSM die mechanischen Beanspruchungen, die potentiell auf eine feste orale Arzneiform einwirken, mit geringen Scherraten, aber mit kurzzeitig hohen Scherkräften zu simulieren. Das FSM wurde erfolgreich als ein biorelevantes In vitro-Freisetzungsmodell etabliert, das speziell die mechanischen Besonderheiten der Magenpassage einer festen oralen Darreichungsform berücksichtigt. Es kann dementsprechend die Entwicklung robuster Arzneimittel mit minimiertem Nahrungsmitteleffekt unterstützen, indem ein ungewünschtes Wirkstofffreigabeverhalten einer Formulierung frühzeitig identifiziert werden kann. Eine Magnetresonanztomographie (MRT)-Studie mit 12 gesunden Probanden lieferte erstmals Erkenntnisse zu den Volumina und Fettgehalten des Mageninhaltes nach Einnahme der hochkalorischen und fettreichen FDA-Standardmahlzeit. Der Mageninhalt wird gemeinhin als Auflösungsmedium für den in der Arzneiform enthaltenen Wirkstoff betrachtet, weshalb das zur Verfügung stehende Volumen ein entscheidender Faktor bei der Wirkstofffreisetzung ist. Das Mageninhaltsvolumen (gastric content volume, GCV) betrug nüchtern 31 ± 19 mL. Die Einnahme der Standardmahlzeit führte zu einem Anstieg des GCV auf 580 ± 38 mL. Verbunden mit dem nach Nahrungsaufnahme ebenfalls hohen Fettgehalt des Mageninhaltes von durchschnittlich 9,5 ± 1,0 %, kann dies eine Erhöhung der oralen Bioverfügbarkeit schlecht wasserlöslicher Arzneistoffe im Vergleich zur Nüchternapplikation bedingen. Während das GCV aufgrund der sich initial ausgleichenden Sekretions- und Entleerungsraten über 50 - 90 min relativ konstant war, überwog im Anschluss die Magenentleerung. Das GCV nahm dabei mit einer Rate von 1,7 ± 0,3 mL/min ab. Die Gabe von 240 mL Wasser 30 min nach Beginn der Nahrungsaufnahme führte zu einer kurzzeitig veränderten Magenentleerungskinetik. Das zugeführte Wasser wurde jedoch innerhalb kurzer Zeit aus dem Magen entleert. Bei entsprechend schneller Freisetzung eines Wirkstoffes aus der Arzneiform besteht somit die Möglichkeit, dass der Arzneistoff den Magen zügig mit dem parallel eingenommenen Wasser verlässt. Es wurde ferner gezeigt, dass selbst mehr als 6 h nach Nahrungsaufnahme sowohl das GCV als auch der Fettgehalt des Mageninhaltes im Vergleich zum Nüchternzustand signifikant erhöht waren. In klinischen Studien, bei denen die hochkalorische und fettreiche Standardmahlzeit verwendet wird, kann dementsprechend für mindestens 5 - 6 h von postprandialen Bedingungen ausgegangen werden. Die sich daraus ergebenden mechanischen und physikochemischen Besonderheiten müssen bei der Beurteilung der Studienergebnisse unbedingt berücksichtigt werden. Darüber hinaus können diese Erkenntnisse zur Optimierung der Testbedingungen von biorelevanten In vitro-Freisetzungsmodellen beitragen. Die In vitro- und In vivo-Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegten, dass die Bedingungen innerhalb des postprandialen Magens kritisch für die Wirkstofffreisetzung aus festen oralen Darreichungsformen sind. Die genaue Charakterisierung der Magenpassage ist für die Beurteilung von Nahrungsmitteleffekten somit von großer Bedeutung.
Das Porphyrin-Derivat 5,10,15,20-tetra(m-Hydroxyphenyl)chlorin (mTHPC, Temoporfin), in Europa zugelassen unter dem Handelsnamen Foscan®, stellt einen der vielversprechendsten Photosensibilisatoren (PS) in der Photodynamischen Therapie (PDT) dar. Während einige Publikationen über die Aktivität von Temoporfin in einzelnen Krebszelllinien in der Fachliteratur erschienen sind, fehlen systematische Studien über die Temoporfin-basierte PDT, die mithilfe eines Sets aus mehreren Krebszelllinien durchgeführt wurden. In der vorliegenden Dissertation wurden fünf humane, adhärente Krebszelllinien aus dem Kopf-Hals-Bereich und weiteren PDT-relevanten Geweben eingesetzt, um die Auslösung von oxidativem Stress und die zugrundeliegenden Zelltodmechanismen der Temoporfin-basierten PDT in vitro zu untersuchen. Dafür wurde zunächst die Viabilität der Zellen nach Temoporfin-Behandlung (0,001–5,0 µmol/L) und Bestrahlung mit einer LED-basierter Apparatur (0,2–5,5 J/cm2) im MTT-Test ermittelt und Konzentrations-Wirkungskurven zur Bestimmung von IC50- und IC90-Werten aufgenommen. Zur Untersuchung und zum Vergleich der Zelltodmechanismen in den Zelllinien wurden diese anschließend mit äquitoxischen Konzentrationen des Temoporfins behandelt und mit vorrangig mit einer Lichtdosis von 1,8 J/cm2 (vereinzelt auch 3,5 oder 7,0 J/cm2) bestrahlt. Die Analytik der Zellen erfolgte direkt, 6, 24, oder 48 h nach der Bestrahlung. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation bestätigen die Auslösung von oxidativem Stress nach der Temoporfin-PDT durch die Detektion eines Totalverlustes des mitochondrialen Membranpotentials (Δψm) sowie einer erhöhten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Eine Lipidperoxidation (LPO) sowie die Beteiligung einer Nekrose am Zelltod spielen hingegen in den meisten Zelllinien eine untergeordnete Rolle. Vor allem die ausbleibende Nekrose nach einer hochdosierten PDT mit Temoporfin steht dabei in Kontrast zu den Resultaten vieler publizierter Studien. Als vorherrschender Zelltodmechanismus wurde nach Temoporfin-vermittelter PDT stattdessen über eine Phosphatidylserin-Externalisierung, eine Caspase 3-Aktivierung und eine PARP-Spaltung eine Auslösung von Apoptose identifiziert. Zudem kann parallel zur Apoptose eine Autophagie ausgelöst werden bzw. kann diese zunächst sogar dominieren, bevor sie zu einer Autophagie-assoziierten Apoptose führt. Als Anzeichen der späten Phase einer Apoptose ist zudem früher oder später eine DNA-Fragmentierung nachweisbar, und der Zelltod wird in einigen Fällen von einem Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase begleitet.
Neben der Auswertung der Zelltodmechanismen wurde ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Dissertation auf den Vergleich der Ergebnisse aus verschiedenen, identisch behandelten Zelllinien gelegt. Obwohl die Zellen unter äquitoxischen Bedingungen behandelt wurden und die PDT über eine vergleichsweise unspezifische Bildung von ROS wirkt, wurden sehr heterogene Resultate in den unterschiedlichen Zelllinien erhalten. Die vorliegende Untersuchung zeigt deshalb außerdem, dass generelle Schlussfolgerungen nach einer PDT eine Analytik in mehreren unterschiedlichen Zelllinien benötigt, um verlässlich zu sein. Dieser Umstand ist in der Vergangenheit in In-vitro-Studien zur PDT jedoch viel zu häufig ignoriert worden.
Die Pt(II)-Komplexe Carboplatin (CBDCA), Cisplatin (CDDP) und Oxaliplatin (1-OHP) werden als Zytostatika in einer Vielzahl chemotherapeutischer Verfahren eingesetzt. In der vorliegenden Dissertation wurden die Pt(II)-Komplexe CBDCA, CDDP, oder 1-OHP in fünf humanen, adhärenten Krebszelllinien mit einer Temoporfin-basierten PDT kombiniert. Die Zellviabilität wurde im MTT-Test bestimmt und synergistische Effekte der Kombination mithilfe der Berechnung von Combination Indices (CI) ermittelt. Synergismus wurde dabei nach einigen Kombinationen, z.B. mit 1-OHP in drei der fünf getesteten Zelllinien, beobachtet, aber auch antagonistische Effekte wurden für einige Kombinationen in bestimmten Zelllinien detektiert. Im Fall einer Synergie wurden erhöhte ROS-Level nachgewiesen, jedoch wurde die Auslösung von Apoptose im Vergleich zu einer Behandlung mit den Pt(II)-Komplexen bzw. der PDT allein dadurch nicht notwendigerweise verstärkt. Eine Analyse der Zellzyklusverteilung ergab, dass nach kombinierter Behandlung sub-G1-Populationen mit fragmentierter DNA, die für eine späte Phase der Apoptose charakteristisch sind, gebildet werden, und zudem S-Phase und G2/M-Arreste vorliegen.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass eine Behandlung mit einer Temoporfin-basierten PDT das Potential besitzt, einige Typen von Tumorzellen gegenüber Pt(II)-Komplexen, vor allem 1-OHP, zu sensibilisieren und so besser für die Tumortherapie zugänglich zu machen. Das Erreichen synergistischer Effekte hängt dabei jedoch in hohem Maße vom Ursprungsgewebe und tumorspezifischen Eigenschaften der Zellen ab und es können sogar antagonistische Effekte auftreten.
Die Glutathionperoxidase 1 (GPX1) kann bei einer Überexpression in Tumorzellen zu einer Inhibition von Apoptose führen, was zum Überleben der Tumorzellen beiträgt. Zudem kann eine erhöhte GPX-Aktivität zu einer Resistenzentwicklung gegenüber oxidativen Schäden beitragen, was den Tumor z.B. vor Chemotherapeutika schützen kann. Potential in der Tumortherapie besitzen deshalb GPX-Inhibitoren, die einer Überexpression der GPX1 durch Verringerung der Gesamtaktivität entgegen¬wirken. In Kombination mit Chemotherapeutika führten GPX-Inhibitoren so bereits zu einer Re-Sensibilisierung Zytostatika-resistenter Zelllinien. In der vorliegenden Dissertation wurde eine Kombination der GPX-Inhibitoren 9-Chlor-6-ethyl-6H-[1,2,3,4,5]pentathiepino[6,7-b]indol (CEPI), ein kürzlich synthetisiertes trizyklisches Pentathiepin, oder Mercaptobernsteinsäure (MBS), der klassische Inhibitor der GPX in vielen veröffentlichten Studien, mit einer Temoporfin-PDT eingesetzt, um durch die Blockierung eines effektiven Abbauweges für H2O2 eine vermehrte Akkumulation von ROS zu erzeugen und so den phototoxischen Effekt des Temoporfins zu verstärken. Synergismus wurde dabei nach Kombination mit beiden GPX-Inhibitoren, jedoch nicht in allen fünf Zelllinien, beobachtet. Auf der anderen Seite wurden mit beiden Inhibitoren auch antagonistische Effekte in bestimmten Zelllinien detektiert. Die ROS-Level konnten nach kombinierter Behandlung mit CEPI, nicht jedoch mit MBS, in einigen Zelllinien gesteigert werden, was darauf hindeutet, dass die Inhibition der GPX durch CEPI tatsächlich zu einer zusätzlichen Akkumulation von ROS führt. Beide Inhibitoren erzeugen allein keine Steigerung der ROS-Spiegel. Überraschenderweise wurde eine vermehrte Apoptoseauslösung anschließend jedoch nach Kombination mit beiden GPX-Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien erreicht, was darauf schließen lässt, dass weitere Faktoren die Induktion von Apoptose fördern, z.B. eine Autophagie-assoziierter Zelltodmechanismus oder eine Ferroptose, die durch LPO nach Verlust der GPX4-Aktivität eingeleitet wird. Die erhöhte Apoptoseauslösung wurde zudem in der Zellzyklusanalyse bestätigt, in der nach kombinierter Behandlung mit beiden GPX1-Inhibitoren erhöhte Anteile apoptotischer sub-G1-Frak¬tionen mit fragmentierter DNA nachweisbar waren. Zudem wurde die DNA-Fragmentierung nach Kombination mit MBS von einem gesteigerten G2/M-Arrest begleitet.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation zeigen, dass eine Kombination von Inhibitoren der GPX mit einer Temoporfin-basierten PDT zu synergistischen Effekten führen kann, wodurch eine Verstärkung der Phototoxizität möglich ist. Da die Inhibitoren in nicht-toxischen Konzentrationen eingesetzt werden, werden zudem keine zusätzlichen Nebenwirkungen erwartet. Der Erfolg des kombinierten Ansatzes hängt dabei jedoch in hohem Maße vom Ursprungsgewebe und tumorspezifischen Eigenschaften der Zellen ab, aber auch antagonistische Effekte können auftreten.
Untersuchungen zur Phytochemie und zur biologischen Aktivität von Pittosporum angustifolium Lodd.
(2014)
Pittosporum angustifolium Lodd. (Pittosporaceae) ist ein kleiner Baum, welcher ursprünglich in Australien beheimatet ist, wo er in den meisten inländischen Gebieten zwar zerstreut, aber lokal nie gehäuft vorkommt. Von dieser Spezies, welche oft auch mit der Trivialbezeichnung „Gumby Gumby” betitelt wird, werden im Bereich der Ethnomedizin Zubereitungen für verschiedenste Indikationsbereiche wie Schmerzen, Krämpfe, Erkältungen oder Hauterkrankungen verwendet. Auch in der Komplementärmedizin werden Präparationen dieser Pflanze als Additivum bei malignen Erkrankungen eingesetzt. Zielstellung der vorliegenden Dissertation war eine exakte Charakterisierung der Phytochemie von Pittosporum angustifolium sowie eine Untersuchung von Extrakten, Fraktionen und Isolaten auf deren biologische Aktivitäten. Neben zwei grundlegenden Diplomarbeiten [35,36] lagen zu Beginn dieser Arbeit (Januar 2010) keinerlei wissenschaftliche Publikationen diesbezüglich vor. Im Rahmen der Untersuchungen zur Phytochemie wurden aus australischem Drogenmaterial (Blätter und Samen) sowie aus selbstgezogenen Pflanzen (Blätter) insgesamt 55 Triterpensaponine isoliert. Von diesen konnten 33 vollständig und fünf teilweise strukturell aufgeklärt werden, wobei 29 Verbindungen, welche als Pittangretoside A-Z und A1-C1 bezeichnet wurden, erstmalig als Naturstoffe beschrieben werden konnten. Hierbei handelt es sich um Aglyka vom Oleanan-, 17,22 seco Oleanolsäure- und Taraxasterol-Typ, welche mono- oder bisdesmosidisch vorliegen. Zwischen den verwendeten Drogen-Chargen konnten sowohl quali- als auch quantitative Unterschiede hinsichtlich der Phytochemie festgestellt werden. In allen untersuchten Pflanzenteilen (Blatt, Samen, Spross, Wurzel) wurden Triterpensaponine nachgewiesen. Von weiteren 13 isolierten Polyphenolen konnten drei als glykosylierte Flavonole und weitere drei als Derivate von mit Kaffeesäure substituierter Chinasäure identifiziert werden. Es handelt sich hierbei um bekannte Verbindungen. Über weitere Bestimmungen konnten Fettsäuren sowie als Bestandteile des ätherischen Öls Mono- und Sesquiterpene sowie C13 Isoprenoide bestimmt werden. Über verschiedene Testsysteme und Assays wurden Überprüfungen hinsichtlich biologischer Aktivitäten der Polyphenole und insbesondere der Triterpensaponine durchgeführt. Für letztere konnten über Agardiffusionstests antimikrobielle Wirkungen gegen mehrere Candida Arten, hämolytische und gegen mehrere tumorigene Zelllinien zytotoxische Effekte nachgewiesen werden. Weiterhin wurde eine Hemmung der humanen Topoisomerase I belegt. Alle beobachteten Aktivitäten sind an strukturelle Voraussetzungen der Triterpensaponine wie das Acylierungsmuster und die Zuckerverknüpfung gebunden. Hierzu konnten interessante Struktur-Wirkungs-Beziehungen abgeleitet werden. So scheint für viele der gezeigten biologischen Effekte eine Acylierung mit hauptsächlich C5-Resten an Position C-22 bzw. C-21 und C-22 des Aglykons essentiell zu sein, während sich Verbindungen mit fehlender oder an C-28 vorhandener Acylierung in den durchgeführten Untersuchungen als vergleichsweise schwächer oder nicht aktiv erwiesen. Unterschiedliche Zuckerkompositionen zeigten hierbei einen abschwächenden oder verstärkenden Einfluss. Für die isolierten Polyphenole wurde eine antioxidative Aktivität nachgewiesen. Zusätzlich ergaben sich Hinweise auf eine mögliche Induktion von IL8 durch den Rohextrakt der australischen Blattdroge. Eine Überprüfung von Saponinen und Polyphenolen via NMDA-Rezeptor- und Cholinesterase-Inhibitionsassay erbrachte keinen Anhaltspunkt für eine antidementive Wirkung. Ebenso konnte kein Nachweis für eine antiphlogistische Wirkung (Bestimmung von TNFalpha) und für die Beeinflussung weiterer Zytokine (IL1beta und IL10) erbracht werden. Über einige dieser Ergebnisse lassen sich Anwendungsbebiete im Bereich der Komplementärmedizin wie z. B. bei malignen Erkrankungen erklären. Für andere ethnomedizinische Indikationen konnten aufgrund nicht zur Verfügung stehender oder nicht adequater Testsysteme keine abschließenden, beurteilenden Aussagen getroffen werden.
Das Hauptziel dieser Arbeit war die Ermittlung eines neuartigen Verfahrens zur Vorhersage des Langzeitklebverhaltens von Transdermalen Pflastern (TTS) auf Humanhaut. In einer In-vivo-Studie wurden zwölf verschiedene Polyacrylat-Haftkleber im Hinblick auf Klebkraft und Größe des dunklen Randes untersucht. In einer zweiten In-vivo-Studie wurde der Einfluss der Elastizität der Deckfolie sowie der Pflastergröße überprüft. Für die Entwicklung einer neuartigen In-vitro-Methode zur Charakterisierung von Haftklebern wurde der Probe-Tack-Test verwendet. Zur Auswertung wurden zwei neuartige Kurvenkennwerte definiert. Es ergab sich ein Zusammenhang zwischen den In-vitro-Ergebnissen und dem realen Langzeitklebverhalten der Pflaster. In einem zweiten Teil der Arbeit wurde die Wiederanheftbarkeit von TTS untersucht. Dafür sind rasterelektronische und lichtmikroskopische Aufnahmen von Pflastern eines viskosen, unvernetzten und eines hochkohäsiven, vernetzten Klebertyps nach wiederholtem Abstrippen vom Unterarm eines Probanden verglichen worden. Die Pflaster beider Klebertypen weisen eine generell schlechte Wiederanheftbarkeit auf. Die Vermutung, dass die Wiederanheftung eines TTS von der Viskosität der Klebermatrix abhängt, konnte nicht bestätigt werden.
In dieser Arbeit wurden die Eigenschaften von atmosphärendruckplasmaaktivierten Natriumchloridlösungen (NaCl-Lösungen), unter Anwendung von nass-chemischen und mikrobiologischen Analysenverfahren, untersucht. Es zeigte sich, dass plasmaaktivierte NaCl-Lösungen sowohl mit kurzzeitigen als auch mit langzeitigen antimikrobiellen Effekten generiert werden können. Diese Effekte korrelieren mit einer Änderung der chemischen Zusammensetzung der flüssigen Phase. Molekularbiologische Untersuchungen zeigten, dass die antimikrobiellen Effekte auf unterschiedlichen Wirkmechanismen, vor allem auf oxidativem und nitrosativem Stress, beruhen. Anwendungsorientierte Untersuchungen haben gezeigt, dass plasmaaktivierte NaCl-Lösungen über ein enges Wirkspektrum (grampositive und gramnegative Erreger) verfügen, sich keine schnellen Resistenzen gegen den Testorganismus ausbilden und eine Kombination mit handelsüblichen Antibiotika ein vielversprechender Ansatz für eine Wirkungssteigerung der verwendeten Antibiotika ist.
Bis heute ist die Haupterblindungsursache in den westlichen Industrienationen, die altersbedingte Makuladegeneration, nicht heilbar und aufgrund der zunehmenden Lebenserwartung der Bevölkerung wird die Anzahl an Neuerkrankungen zukünftig weiter steigen. Die intravitreale operative Medikamentengabe gilt als aktuelle Standardtherapie um das Fortschreiten eines Visusverlusts zu verzögern und kann in manchen Fällen eine deutliche Sehverbesserung bewirken. Überwiegend werden antiinflammatorische und antineovaskuläre Wirkstoffe in Form von intravitrealen Injektionen verabreicht, deren Nachteil jedoch ein verhältnismäßig kurzer Therapieeffekt in Hinblick auf die chronische Erkrankung des hinteren Augenabschnitts ist. Für längerfristig erfolgreiche Therapien sind zahlreiche Innovationen im Bereich der periokularen und intravitrealen Arzneistofffreigabesysteme in unterschiedlichen Phasen der Forschung und Entwicklung, deren Wirksamkeit und Sicherheit jedoch erst belegt werden muss. Für möglichst prädiktive Ergebnisse über das Verhalten von Arzneiformen in vivo sollten ausgewählte physiologische Parameter in Modellen und Testmethoden simuliert und nach aktuellem Wissensstand berücksichtigt werden können. Da die reale Situation des Glaskörpers älterer Patienten in Tiermodellen nur unzureichend widergespiegelt wird und die Nutzung von Simulationsmodellen zur Abschätzung des pharmakokinetischen Profils von Arzneistoffen oder Darreichungsformen aufgrund der lückenhaften Datenlage über den Glaskörper als Applikationsort oft limitiert ist, sollen zuverlässige In vitro-Testsysteme dazu beitragen, die unvollständige Datenlage mit In vitro Ergebnissen zu ergänzen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, humane Glaskörper aus der postmortalen Spende zu gewinnen und zu charakterisieren. Somit konnten die lückenhaften Literaturdaten zum humanen Glaskörper durch ausgewählte physikochemische Eigenschaften (pH Wert, Brechungsindex, Osmolalität, Gesamtproteingehalt, Wassergehalt) ergänzt werden. Zudem wurden Untersuchungen zur Glaskörperverflüssigung durchgeführt und erstmals eine altersbedingt zunehmende Inhomogenität des humanen Glaskörpers im Gegensatz zum Jungtiermodell (Schwein) gezeigt.
Weiterhin wurden die von Loch et al. beschriebenen Prototypen des Glaskörper- (GK-) Modells und des Eye Movement Systems (EyeMoS) in weiterer Anlehnung an die Situation in vivo modifiziert und ausgewählte Darreichungsformen hinsichtlich ihres Freisetzungs- und Verteilungsverhaltens im simulierten Glaskörper charakterisiert. In Ergänzung zu den Modellen von Loch et. al wurde neben einem standardisierten Injektionsverfahren zudem die Körpertemperatur, vielfältige Augenbewegungsmuster und der Zustand nach einer Vitrektomie in den modifizierten In vitro Modellen berücksichtigt. Für Langzeituntersuchungen bis über Monate bietet die neuartige und kostengünstige Testapparatur die Möglichkeit, 6 GK-Modelle gleichzeitig bei simulierten Augenbewegungen zu integrieren. Am Beispiel von intravitrealen Modellimplantaten mit dem klinisch häufig eingesetzten Wirkstoff Dexamethason wurde der Einfluss ausgewählter In vitro-Testmethoden und -Parameter im Hinblick auf die Wirkstofffreisetzung aus Implantaten untersucht. Je nach verwendeter Testapparatur, Testmedium und einer Probenahme- oder Transfermethode wurden erhebliche Unterschiede in den Freisetzungsprofilen von Dexamethason oder Fluorescein-Natrium aus PCL- oder PLGA-Modellimplantaten beobachtet, wodurch die Notwendigkeit zum Verständnis der zugrundeliegenden und freisetzungsbestimmenden In vivo-Parameter sowie deren Transfer in zuverlässige In vitro-Testsysteme hervorgehoben wurde.
Weiterhin wurde gezeigt, dass die simulierte Glaskörperverflüssigung, wie sie für ältere Patienten beschrieben ist, im Vergleich zum homogen aufgebauten Glaskörper eine schnellere Verteilung der Injektionslösungen im GK-Modell zur Folge hat. Suspensionszubereitungen zeigten anstatt einer homogenen Verteilung im GK-Modell eine ausgeprägte Neigung zur Sedimentation, was am Beispiel des klinisch relevanten Triamcinolonacetonids verdeutlicht wurde. Der simulierte Zustand nach einer Vitrektomie mit anschließender Injektion der wirkstoffhaltigen Suspension resultierte ebenfalls in einer Sedimentation der Triamcinolonacetonid-Partikel, deren potentiell netzhautschädigende Effekte in klinischen Langzeitstudien untersucht werden sollte.
Zusammenfassend verdeutlichen die Ergebnisse dieser Arbeit kritische In vitro- und In vivo-Parameter, die die Wirkstofffreisetzung und -Verteilung aus intravitrealen Darreichungsformen beeinflussen und die von großer Bedeutung für die Abschätzung des pharmakokinetischen Profils einer Arzneiform sein können.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zu zellulären Abwehrmechanismen der Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) während einer Infektion mit dem wirtschaftlich bedeutsamen Virus der Viralen Hämorrhagischen Septikämie (VHSV) durchgeführt. Unter Verwendung eines in vitro-Testsystems zur Erfassung der zellvermittelten Zytotoxizität wurde festgestellt, dass Forellen ab dem 10. Tag nach Infektion antivirale zytotoxische Abwehrzellen generieren. Anfangs lysierten diese zytotoxischen Leukozyten ausschließlich virusinfizierte Targetzellen mit identischem MHC-Klasse-I und erst später nach Zweitinfektion MHC-Klasse-I-inkompatible Zellen. Ein mit dem Anstieg des Zytotoxizitätsvermögens einhergehender Anstieg der CD8α-mRNA-Expression im Verlauf der Infektion deutet auf die Beteiligung spezifischer zytotoxischer Zellen bei der antiviralen Abwehr hin. Eine erneute Infektion bereits infizierter Forellen mit homologem Virus führte bei erhöhter CD8α-mRNA-Expression zu einer gesteigerten zellvermittelten Zytotoxizität. Das deutet darauf hin, dass Forellen, ähnlich wie höhere Vertebraten, über spezifische zytotoxische T-Zellen sowie über ein immunologisches Gedächtnis verfügen. Im Unterschied zu Säugern konnte eine zytotoxische Aktivität gegen MHC-Klasse-I-inkompatible Targetzellen und damit eine Beteiligung von NK-ähnlichen Zellen zeitlich erst nach der T-Zell-ähnlichen Zytotoxizität gemessen werden, wobei ein Anstieg der mRNA-Expression des indirekten NK-Zellmarkers NKEF durch die Effektorzellen bereits zu einem früheren Zeitpunkt erfolgte. NKEF wird bei Säugern von hämatopoetischen Zellen gebildet. Deshalb ist die erhöhte Expression von NKEF als Folge einer kompensatorischen Reaktion bei der hämorrhagischen Erkrankung VHS zu werten. Zum Zeitpunkt der NK-ähnlichen Aktivität hatte das Niveau VHSV-spezifischer Antikörper ein Maximum erreicht, weshalb die Bewaffnung von NK-ähnlichen Zellen mit Antikörpern denkbar ist, die ihrerseits natives VHSV-Protein auf infizierten Targetzellen erkannt und letztere lysiert haben könnten. Gegenstand dieser Arbeit war es ferner, den Einfluss des Glyko(G)- beziehungsweise Nukleo(N)-proteins des VHSV auf das zelluläre Abwehrsystem der Forelle zu untersuchen. Dazu wurde die DNA-Immunisierungstechnologie eingesetzt. Nach Applikation von VHSV-Protein-kodierenden Plasmid-DNAs konnte als Voraussetzung für eine erfolgreiche Antigenpräsentation am Applikationsort die Expression viraler Proteine in den Forellenmuskelzellen gezeigt werden. Ebenso generierten Forellen nach Immunisierung antivirale zytotoxische Zellen gegen beide Proteine. Das Glykoprotein, welches nach der Virusreplikation auf der Virushülle und auch auf der Membran infizierter Wirtszellen exprimiert wird, regte die Bildung von virusspezifischen CTL-ähnlichen, aber auch NK-ähnlichen zytotoxischen Effektorzellen an, da zytotoxische Zellen aus DNA-immunisierten Forellen sowohl infizierte MHC-Klasse-I-identische als auch Zellen mit einem anderen MHC-Klasse-I lysierten. Das Nukleoprotein dagegen bewirkte lediglich die Bildung CTL-ähnlicher Zellen, da ausschließlich MHC-Klasse-I-kompatible Zellen lysiert wurden. Diese Aktivität erreichte nur in den Sommermonaten ein signifikantes Niveau. Solche, bei poikilothermen Vertebraten zu erwartenden saisonbedingten Schwankungen im Niveau und in der Qualität antiviraler zellvermittelter Zytotoxizität, sind bei Fischen bisher nicht beschrieben worden. Diese Unterschiede sind umso bemerkenswerter, als dass die Forellen ganzjährig einem konstanten Temperatur- und Lichtregime ausgesetzt waren. Die Kombination eines Testsystems für zellvermittelte Zytotoxizität mit Untersuchungen zur mRNA-Expression, zum Antikörperstatus und zur Expression von Leukozyten-Oberflächenmarkern lassen bei paralleler Analyse bereits veröffentlichter Daten wichtige Schlussfolgerungen zum allgemeinen Verständnis der Immunreaktionen bei Fischen zu. Es sind Parallelen aber auch Unterschiede (verspätete NK-zellähnliche Aktivität, Saisonabhängigkeit) zum Immunsystem höherer Vertebraten feststellbar. Ferner leisten diese Ergebnisse einen Beitrag zum Verständnis der Pathogenese der VHS und geben Anhaltspunkte für Vakzinationsstrategien insbesondere von DNA-Vakzinen.
Tricholoma populinum, der Pappel-Ritterling, ist ein einheimischer, eine Mykorrhiza mit Populus sp. ausbildender Speisepilz. Als in-vitro-Testmodell diente die Quantifizierung der Degranulation von RBL-2H3-Zellen nach Sensibilisierung mit einem IgE-Antikörper und Stimulierung mittels DNP-HSA. Anschließend wurde die Aktivität eines membranständigen Enzyms, der β-Hexosaminidase, im Überstand bestimmt. Es konnte beobachtet werden, dass der DCM-Extrakt aus Fruchtkörpern des Pappel-Ritterlings eine signifikante Inhibition der Degranulation aufwies. Nach Säulenchromatographie an offener Säule konnten aktive und nicht-aktive Fraktionen ausgemacht werden. Eine Aufreinigung des DCM-Extraktes geschah durch SPE, präparative TLC und Säulenchromatographie. Der letzte Aufreinigungsschritt geschah bei allen Substanzen durch semipräparative HPLC. Reinsubstanzen wurden mit MS- und NMR-Techniken charakterisiert. Die aus dem Pappel-Ritterling isolierten Reinsubstanzen aus den Klassen der aliphatischen Säuren und C28-Sterole wiesen einzeln keine Degranulationshemmung im in-vitro-Modell auf. Ein weiterer untersuchter Organismus war Armillaria ostoyae, der Dunkle Hallimasch. Auch der DCM-Extrakt aus Fruchtkörper und Myzel von A. ostoyae zeigte eine signifikante Reduktion der Degranulation. Dieser Effekt konnte erstmals für A. ostoyae festgestellt werden. Fruchtkörper wurden in Wildsammlung erhalten, das Myzel kultiviert und durch molekularbiologische Untersuchung identifiziert. Aus dem Myzel des Dunklen Hallimaschs konnten Sesquiterpen-Arylester isoliert werden. Hierbei handelte es sich um die Melleolide C, H und J, Melledonal C, 10‑Hydroxymelleolide, Armillarin und Armillaridin sowie einen bisher unbekannten Naturstoff, dessen Struktur durch weitere IR- und CD-spektroskopische Untersuchungen bestätigt werden sollte. Des Weiteren wurde auch das Fettsäure-Derivat Linolsäure-Methylester isoliert und mittels NMR identifiziert. Die Substanzen Melleolide H und J verminderten die Degranulation von RBL-2H3-Zellen, Linolsäure-Methylester wies diesen Effekt nicht auf. Eine Zytotoxizitäts-Untersuchung von Extrakten und Reinsubstanzen wurde mittels des Neutral-Red-Uptake-Assay durchgeführt. Die Extrakte von T. populinum und A. ostoyae zeigten zytotoxische Wirkungen. Nach 24 h Inkubationszeit war diese deutlich stärker als nach 1 h. Auch die isolierten Reinsubstanzen wiesen eine Zytotoxizität auf. Der zytotoxische Effekt kann nicht für die Verminderung der Degranulation verantwortlich gemacht werden. Schädigende Effekte wären bereits im Degranulationsassay sichtbar, konnten jedoch bei Konzentrationen um den IC50-Wert nicht beobachtet werden. Der DCM-Extrakt aus dem Fruchtkörper des Pappel-Ritterlings zeigte einen inhibierenden Einfluss auf die Interleukin-2-Freisetzung stimulierter Jurkat-T-Zellen. Die in der mykologischen Literatur als essbar deklarierten Arten T. populinum und A. ostoyae könnten mittel- bis langfristig zumindest unterstützend bei allergischen Reaktionen Anwendung finden. Bei den Untersuchungen zur Qualitätssicherung standen Methoden zur Gehaltsbestimmung von Polysacchariden, β-Glucanen und Agaritin im Mittelpunkt. Diese wurden etabliert, optimiert und validiert. Einen guten Überblick über allgemeine Kohlenhydratgehalte gibt die Anthron-Methode. Bei dieser werden Polysaccharide hydrolysiert und zu Furfuralen umgewandelt, welche mit Anthron zu einem photometrisch bestimmbaren Produkt reagieren. Validierung erwies die Methode als geeignet für die Bestimmung des Gehaltes von Polysacchariden in Pilzextrakten. Weitergehende Informationen über die dreidimensionale Struktur der in Extrakten enthaltenen β-Glucane können durch die Anilinblau-Fluoreszenz-Methode erhalten werden. Die Methode erwies sich als selektiv für β-1,3-d-Glucane und bewies auch bei Untersuchung anderer Validierungsparameter ihre Eignung für eine β-Glucan-Gehaltsbestimmung. Mit der Kongorot-Methode sollen verzweigte β-1,3;1,6-d-Glucane erfasst werden. Diesen Glucanen wird häufig eine immunologische Aktivität zugerechnet. Allerdings erwies sich die Kongorot-Methode für die Informationsgewinnung über eine 3D-Struktur als weniger geeignet, da ihre Sensitivität zu gering und ihre Selektivität zu schwach ausgeprägt ist. Agaritin als Substanz mit interessanten und widersprüchlichen biologischen Effekten. Es wurde eine Methode etabliert, bei der Agaritin aus pulverisierten Fruchtkörpern extrahiert, durch SPE aufgereinigt und mittels LC-MS/MS und MRM im positiven Ionisationsmodus bestimmt wurde. Die Quantifizierung geschah mithilfe der Extern-Standard-Kalibration mit Agaritin als Referenzsubstanz. Die untersuchte Methode ist dazu geeignet, Agaritin zu quantifizieren, was durch die durchgeführte Validierung belegt wurde.
In der Arzneimitteltherapie nehmen parenteral zu applizierende Arzneimittel einen immer größer werdenden Stellenwert ein. Diese Entwicklung beruht vor allem auf der steigenden Anzahl von Peptiden und Proteinen als Wirkstoffe, deren perorale Applikation aufgrund unzureichender Resorptionsraten aus dem Gastrointestinaltrakt unmöglich ist, aber auch auf der Möglichkeit Depotformulierungen anzuwenden, die Wirkstoffe nach subkutaner oder intramuskulärer Injektion über einen langen Zeitraum freisetzen können. Dennoch sind Arzneimitteltransportwege nach subkutaner oder intramuskulärer Applikation im Detail weitestgehend unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus auf die intramuskuläre Applikation gelegt. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine tierexperimentelle Studie an Ratten durchgeführt, die es zum Ziel hatte, ausgewählte physiologische Einflussparameter auf die Wirkstoffresorption nach intramuskulärer Injektion zu untersuchen. Die Tiere erhielten sowohl wässrige Lösungen als auch ölige Suspensionen von Paracetamol, Prednisolon und Diclofenac-Natrium in die rechte Oberschenkelmuskulatur und das jeweilige Placebo in den Muskel des linken Oberschenkels. Anschließend wurde das intramuskuläre Arzneistoffdepot erstmals mittels Magnetresonanztomographie (MRT) als bildgebendes Verfahren zeitabhängig untersucht und parallel die Anflutungskinetik der Wirkstoffe ins Blut bestimmt. Die Volumina und Oberflächen der Depots sowie die Zeit bis zu deren Abtransport aus dem Muskelgewebe wurden mit den Blutspiegelkurven verglichen. Allen Formulierungen war gemein, dass der Wirkstoff deutlich schneller resorbiert wurde als das Depot. Daraus lässt sich schließen, dass die Wirkstoffaufnahme nicht über die Resorption des Depots erfolgte. Ein schnelleres Verschwinden der Depots führte nicht zu höheren Blutspiegelmaxima oder zu einer beschleunigten systemischen Wirkstoffresorption. Es wurde keine Korrelation zwischen dem Volumen und der Oberfläche der Depots und den Blutspiegelkurven gefunden. Ein weiterer Aspekt, der während der durchgeführten Studie näher untersucht wurde, ist die Möglichkeit, mit Hilfe der MRT lokale Reaktionen in Folge der Injektion zu detektieren. Bei Diclofenac-Natrium wurde in allen Fällen eine Ansammlung interstitieller Flüssigkeit am Ort der Injektion beobachtet. Histopathologische Untersuchungen des Muskelgewebes konnten einen Zusammenhang zwischen der Größe des visualisierten Ödems und dem Ausmaß der Entzündung belegen. Im zweiten Teil dieser Arbeit galt es, mit den gewonnenen In vivo-Daten möglichst biorelevante Methoden für Freisetzungstests intramuskulärer Arzneiformen zu entwickeln. Dabei sollte sowohl die Simulation der Durchblutung des Muskelgewebes Berücksichtigung finden als auch die Simulation des Muskelgewebes oder der Depots im Muskelgewebe. Es wurden verschiedene Versuchsaufbauten entwickelt, adaptiert und modifiziert. Darunter zählen Gel-Schaum-Blöcke in der Durchflusszelle, die Keramikmembran und der Membranadapter in der Durchflusszelle. Während die Simulation der Durchblutung und der injizierten Depots in allen Testmethoden möglich war, konnte das Muskelgewebe nicht befriedigend nachgebildet werden. Die Anwendung verschiedener Freisetzungstest-Methoden hatte auf die Verteilung der Wirkstoffe aus den wässrigen Lösungen keinen nennenswerten Einfluss. Der größte Einfluss auf die Verteilungsgeschwindigkeit wurde bei der öligen Suspension von Prednisolon beobachtet. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte nicht abschließend geklärt werden, welche Parameter der Situation in vivo entscheidend für das Anflutungsverhalten der Wirkstoffe nach intramuskulärer Injektion sind. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Kombination aus pharmakokinetischen Untersuchungen mit MRT-Bildgebung eine vielversprechende Möglichkeit darstellt, Einblicke in die Biopharmazie intramuskulärer Depots zu erhalten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung der MRT zur Feststellung der lokalen Verträglichkeit, vor allem neu entwickelter Arzneiformen, eine sehr gut geeignete nicht-invasive Methode darstellt. Die Ergebnisse der In vitro-Untersuchungen verdeutlichen, dass die Freisetzungstestmethode vor allem bei langsam freisetzenden Arzneiformen einen erheblichen Einfluss ausüben kann. Eine universelle Testmethode, mit der zuverlässig das In vivo-Freisetzungsverhalten nach intramuskulärer Injektion vorhergesagt werden kann, ist derzeit nicht verfügbar. Die entwickelten Modelle stellen einen ersten Schritt zur Entwicklung biorelevanter Freisetzungstestmethoden für intramuskulär applizierte Darreichungsformen dar. Zur Verbesserung dieser Modelle sind ein umfassenderes Verständnis der Arzneimittelverteilungs- und -Transportmechanismen notwendig und weitere Studien, die bildgebende Verfahren mit der pharmakokinetischen Analyse kombinieren, wünschenswert.
Im Fokus dieser Arbeit standen die Wechselwirkungen zwischen nicht-thermischem Atmosphärendruck-Plasma und in-vitro kultivierten Keratinozyten (HaCaT-Keratinozyten) und Melanomzellen (MV3). Für die Untersuchungen wurden drei Plasmaquellen unterschiedlicher Bauart genutzt; ein Plasmajet (kINPen 09) und zwei Quellen, die das Plasma mittels der dielektrisch behinderten Entladung (Oberflächen-DBE, Volumen-DBE) generieren. Um grundlegende Effekte von Plasma auf Zellen analysieren zu können, wurde zunächst der Einfluss von physikalischem Plasma auf die Vitalität; die DNA und die Induktion von ROS untersucht. Folgende Methoden wurden verwendet: - Vitalität: - Neutralrotassay, Zellzählung (Zellzahl, Zellintegrität) - BrdU-Assay (Proliferation) - Annexin V und Propidiumiodid- Färbung, Durchflusszytometrie (Induktion von Apoptose) - DNA: - Alkalischer Comet Assay (Detektion von DNA-Schäden) - DNA-Färbung mit Propidiumiodid, Durchflusszytometrie (Zellzyklusanalyse) - ROS: - H2DCFDA-Assay, Durchflusszytometrie (Bestimmung der ROS-positiven Zellen) Neben den Folgen die die Plasmaquellen induzieren wurde weiterhin untersucht, welchen Einfluss das Behandlungsregime (direkt, indirekt, direkt mit Mediumwechsel), das Prozessgas (Argon, Luft) und die zellumgebenden Flüssigkeiten (Zellkulturmedien: IMDM, RPMI; Pufferlösungen: HBSS, PBS) auf das Ausmaß der Plasma-Zell-Effekte hatten. Die Verwendung aller Plasmaquellen führte in HaCaT-Keratinozyten und Melanomzellen (MV3) zu Behandlungszeit-abhängigen Effekten: - Verlust an vitalen Zellen und verminderte Proliferationsfähigkeit - Induktion von Apoptose nur nach den längsten Plasmabehandlungszeiten - DNA-Schäden 1 h nach Plasmabehandlung, nach 24 h deutlich weniger bzw. nicht mehr nachweisbar, Hinweise für DNA-Reparatur vorhanden - Zellzyklusarrest in der G2/M-Phase zulasten der G1-Phase 24 h nach Plasmabehandlung - Anstieg der ROS-positiven Zellen 1 h und 24 h nach Plasmabehandlung Es wurde gezeigt, dass in RPMI-Medium kultivierte Zellen sensitiver, in Form von verminderter Vitalität und vermehrten DNA-Schäden, reagierten als in IMDM-Medium gehaltene Zellen. Aber auch während der Plasmabehandlung in Pufferlösungen (HBSS, PBS) gehaltene HaCaT-Zellen wiesen DNA-Schäden auf. Die direkte und indirekte Plasmabehandlung führte zu nahezu gleichen Ergebnissen. Ein Wechsel des Zellkulturmediums direkt nach der Plasmabehandlung schwächte alle gemessenen Effekte ab. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass neben der Art der Flüssigkeit und Behandlungszeit auch der Inkubationszeitraum der Zellen mit der in Plasma in Kontakt gekommenen Flüssigkeit von essentieller Bedeutung ist. Die durch Plasma induzierten reaktiven Spezies gelangen in die Flüssigkeit und interagieren mit den Wassermolekülen und den organischen Molekülen der Zellkulturmedien, welche langlebige Radikale (z.B. H2O2) bilden, die dann ihrerseits mit zellulären Molekülen reagieren. Die anderen Plasmakomponenten wie UV-Licht und elektrische bzw. magnetische Feldern scheinen nur eine untergeordnete Rolle in der Plasma-Zell-Interaktion zu spielen, da diese nur bei der direkten Behandlung mit den Zellen in Berührung kommen und die starken Auswirkungen nach der indirekten Behandlung nicht verursachen können. Die in diesen Untersuchungen verwendete Oberflächen-DBE konnte mit Luft oder mit Argon als Prozessgas betrieben werden. Wurde Argon als Prozessgas genutzt, kam es zu milderen Auswirkungen im Vergleich zur Plasmabehandlung im Luftmodus. Mit Luft generiertes Plasma weist neben ROS auch RNS in der Gasphase auf, letztere lassen sich im Argon-Plasma nicht nachweisen und stehen für Plasma-Zell-Interaktionen nicht zur Verfügung. Zusätzlich zu den humanen Keratinozyten wurden auch humane Melanomzellen mit Plasma (Oberflächen-DBE/Luft) behandelt. Im Vergleich zu den HaCaT-Zellen sind bei den MV3-Zellen geringere Behandlungszeiten nötig, um biologisch gleichwertige Effekte zu bewirken. Die hier verwendeten Testmethoden eignen sich für die biologische Charakterisierung von neuen Plasmaquellen bzw. für die Analyse von Plasma-Zell-Wechselwirkungen weiterer Zelllinien. Tiefergehende Untersuchungen, z.B. bezüglich der genaueren Spezifizierung der durch Plasma hervorgerufenen oxidativen DNA-Schäden und den daraus resultierenden Reparaturmechanismen, sollten folgen.
Trotz aller Erfolge in der Chemotherapie mit platinhaltigen Antitumormitteln bestehen dennoch viele Nachteile. Ein Fortschritt brachte die Entwicklung von lichtempfindlichen Pt(IV)-Verbindungen, die sich selektiv in Tumorzellen aktivieren lassen. Durch die geringe Eindringtiefe von kurzwelligem Licht wäre das Anwendungsgebiet auf oberflächige Tumore limitiert. Durch die Kopplung von Pt(IV)-Prodrugs mit upconversion-lumineszierende Nanopartikel (UCNPs) könnte die aktivierte Pt(II)-Spezies durch Bestrahlung mit NIR-Licht, welches durch UCNPs aufwärtskonvertiert wird, freigesetzt werden. Daher wurden sechs Bistetrazolatoplatin(II)-Komplexverbindungen sowie zwölf Bistetrazolato-Pt(IV) Komplexe synthetisiert und charakterisiert. Die Bistetrazolato-Pt(II) Komplexe stellen die ersten Beispiele für mononukleare Diamminbistetrazolato-Pt(II) Komplexe dar. Untersuchungen der Synthese ließen vermuten, dass es während der Synthese zur cis/trans-Isomerie kommt. Durch die Röntgenkristallstruktur konnte eine N2-Koordination des Tetrazolatliganden nachgewiesen werden. Entgegen der Erwartung, konnte keine eine lichtinduzierte Aktivierung der hergestellten Bistetrazolato-Pt(IV) Komplexe nachgewiesen werden. Trotzdem wurden die Eigenschaften der synthetisierten Verbindungen im Hinblick auf eine potenzielle Anwendung als Pt-basierte Zytostatika weiter untersucht wurde. Es zeigte sich, dass cis/trans-[Pt(OH)2(5-phenyltetrazolato)2(NH3)2] durch Ascorbinsäure in eine Spezies, die irreversibel an DNA bindet, umgewandelt werden kann. Die Bistetrazolato-Pt(II) Komplexe waren gegen adhärente Zelllinien nicht sonderlich aktiv, wohingegen nahezu alle der getesteten Bistetrazolato-Pt(IV) diammine antiproliferierende Aktivität gegen humane adhärente Krebszelllinien zeigten und dabei (IC50-Werte < 20 µM) gefunden wurden. Auch wenn einige der vorgestellten Syntheserouten eine Optimierung bedürfen und die gefundene Zytotoxizität durch die Einführung anderer Tetrazolderivate in Pt(II)-Komplexverbindung sicherlich weiter gesteigert werden kann, konnten die Befunde einen relevanten Beitrag zum Verständnis der Komplexierung von Tetrazolatanionen an ein Pt-Zentrum leisten. Aufgrund dessen, dass die Lichtempfindlichkeit von Diiodido-Pt(IV) Komplexen bekannt war, wurden fünf neuartige Diiodido-Pt(IV) diamine (25, 26, 27, 28 und 29) synthetisiert. Daraufhin wurde sich mit der Herstellung von seltenerd-dotierten NaYF4/NaGdF4-UCNPs sowie mit der Kopplung dieser mit Diiodido-Pt(IV) Komplexen beschäftigt. Zunächst wurde überprüft, ob die Bestrahlung mit einem NIR-Laser (λ = 980 nm) in Gegenwart von UCNPs tatsächlich zu einem Abbau der Diiodido-Pt(IV) Komplexe sowie zu einer erhöhten DNA-Platinierung führt. Nachdem dies bestätigt war, wurden drei verschiedene Kopplungsmethoden angewandt. Für die kovalente Kopplung (Konjugatherstellung) wurden Diiodido-Pt(IV) Komplexe mit freier Carboxygruppe über eine Amidbindung mit amino-modifizierten NaGdF4:Yb,Er/Tm-UCNPs verknüpft. Der zweite Kopplungsansatz beinhaltet den Austausch der an der Nanopartikeloberfläche koordinierten Oleatliganden mit Diiodido-Pt(IV) Komplexen (Herstellung von Konstrukten). Durch die XPS-Analyse der Kopplungsprodukte kann gefolgert werden, dass beide Strategien eine Kopplung zwischen Pt Komplex und UCNPs ermöglichen, da Platin auf der Nanopartikeloberfläche nachgewiesen werden konnte. Allerdings liegt, unabhängig von der angewandten Kopplungsmethode, Pt zu 70–80 % im Oxidationszustand II vor. Die Verbindungen wiesen ohnehin eine gewisse Instabilität in Lösung auf. Die dritte Methode umfasst den Einschub des hydrophoben Pt(IV) Komplexes 29 in die Oleathülle. Der Nachweis von Pt auf diesem Konstrukt ist noch nicht gelungen, in vitro-Testungen ließen jedoch das Vorhandensein einer aktiven Pt-Spezies auf der Oberfläche vermuten. Für die Evaluierung der Zytotoxizität der NIR-Licht-vermittelten Antitumor-Aktivierungssysteme (Konjugate/Konstrukte) wurden diverse Methoden mit Variation im Bestrahlungsablauf vorgestellt. Hierbei stellte sich heraus, dass die Viabilität bei Bestrahlung der Konjugate/Konstrukte in Anwesenheit von Zellen im Vergleich zu Dunkelkontrollen signifikant herabgesenkt werden konnte. Allerdings besaß der NIR-Laser selbst einen toxischen Effekt gegenüber HL-60-Zellen. Die zunehmende Pt-Freisetzung der Konjugate mit der Bestrahlungsdauer und die geringe Pt-Freisetzung von Konstrukten, macht die Konjugate, insbesondere NaGdF4:Yb,Er-OA-SiO2-NH-28, zu besseren Kandidaten für die PACT. Dies wird bekräftigt durch die leicht höhere gefundene Toxizität der Konjugate im Vergleich zu den entsprechenden Konstrukten. Die dargestellten Konjugate/Konstrukte sind die ersten Beispiele für eine Kopplung von Diiodido-Pt(IV) Komplexen mit NaGdF4-UCNPs. Damit sich allerdings das vorgestellte Konzept der NIR-Aktivierung von lichtempfindlichen Diiodido-Pt(IV) Komplexen durchzusetzen kann, bedarf es noch Optimierungen hinsichtlich der Kopplungsstrategien.
In der vorliegenden Arbeit sollen bekannte und neuartige Inhibitoren der Glutathionperoxidasen sowohl in ihrer Eigenschaft als Inhibitor, als auch deren Effekte in Tumorzellen näher charakterisiert werden. Dabei standen zu Beginn die Mercaptobernsteinsäure sowie Tiopronin besonders im Fokus. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen effektiv bovine Glutathionperoxidase inhibieren, wobei die Effektivität sowohl in IC50-Werten als auch in Inhibitionskonstanten (Ki) ausgedrückt werden konnten. Durch Adaption des GPx-Assays auf humane GPx-Aktivität konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Mercaptobernsteinsäure in der Lage ist, humane GPx-Aktivität zu reduzieren, allerdings nicht Tiopronin. Kombinationen von Mercaptobernsteinsäure mit Wasserstoffperoxid auf Tumorzellen zeigten erhöhte Akkumulationen reaktiver Sauerstoffspezies in Relation zu Zellen, die nur mit Wasserstoffperoxid inkubiert wurden. Die Glutathionperoxidase könnte in zellulären Systemen durch Mercaptobernsteinsäure gehemmt sein. Entsprechende Kombinationen mit Tiopronin zeigten den gegenteiligen Effekt, Tiopronin scheint als Antioxidans zu fungieren. Auch Kombinationen von Tiopronin mit Cisplatin, Doxorubicin und Methotrexat zeigten teilweise Wirkungsverluste der Zytostatika. Weiterführend wurde im Rahmen der Arbeit eine neue Klasse von Inhibitoren der Glutathionperoxidase identifiziert, die Pentathiepine. Durch unterschiedliche heteroaromatische Grundkörper sowie verschiedenen Substituenten konnten interessante Struktur-Wirkungsbeziehungen detektiert werden. Bei der Charakterisierung der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Glutathionperoxidase stellte sich heraus, dass es sich offenbar um irreversible- sowie kompetitive Inhibitoren handelt. Die inhibitorischen Eigenschaften sind dabei in Bezug auf inhibitorische Potenz sowie Selektivität aller bisher bekannten Inhibitoren überlegen. Pentathiepine zeigen aber auch auf zellulärer Ebene interessante Eigenschaften, da sie in einer Vielzahl verschiedener Tumorzellen viabilitäts- bzw. proliferationsinhibierende Eigenschaften besitzen, mit IC50-Konzentrationen im unteren mikromolar-Bereich. Korrelationsanalysen zeigten, dass offenbar die Proliferationsinhibition der Pentathiepine mit der inhibitorischen Aktivität gegenüber der Glutathionperoxidase einhergeht. Weiterführend konnte gezeigt werden, dass Pentathiepine massiv reaktive Sauerstoffspezies in den Zellen induzieren und Apoptose auslösen. Die Apoptose-Einleitung wurde durch Annexin-V/Propidiumiodid-Markierung, Detektion von PARP-Spaltprodukten sowie durch die Bestimmung der Mitochondrien-Funktionalität durch Visualisierung des mitochondrialen Membranpotentials bestätigt. Zusammenfassend scheint eine Apoptoseauslösung über den intrinsischen Signalweg vorzuliegen. Durch die Zelllinie HAP-1 sowie deren Glutathionperoxidase-1 ausgeknockten Variante konnten Zytostatika identifiziert werden, auf die knockout-Zellen besonders sensitiv reagieren. Zu diesen gehören Cisplatin-Analoga, Lomustin und Temozolomid. In Kombinationsuntersuchungen mit diesen Zytostatika konnte gezeigt werden, dass für die Kombination von Cisplatin mit Pentathiepinen kein positiver Effekt resultiert. Die Zytotoxizität von Cisplatin wurde dabei in verschiedenen Tumorzellen durch die gleichzeitige Inkubation mit Pentathiepinen abgeschwächt. Kombinationen von Lomustin bzw. Temozolomid mit Pentathiepinen und Mercaptobernsteinsäure führten zu signifikanten Wirkverstärkungen in den untersuchten Zelllinien. Zusammenfassend lässt sich verfassen, dass die neuen Glutathionperoxidase-Inhibitoren ein nützliches Werkzeug zur Aufklärung biologischer Prozesse in Tumorzellen in Bezug auf den Umgang mit oxidativem Stress darstellen können. Gezeigt wurde, dass die kombinatorische Gabe von Inhibitoren der Glutathionperoxidase mit verschiedenen Tumortherapeutika durch eine verstärkte Toxizität aussichtsreich erscheint und in Hinblick auf die häufig sehr schlechten Prognosen verschiedener Tumorerkrankungen, die Tumortherapie durch Zusatz von Pentathiepinen verbessert werden könnte.
Die vorliegende kumulative Dissertation beschäftigt sich mit Anwendungstechniken und Strategien in der HPLC mit dem Ziel, die Möglichkeiten moderner pharmazeutischen Analytik aufzuzeigen und zu optimieren. Schwerpunkte der Untersuchungen liegen dabei einerseits auf dem Gebiet der Enantiomerenanalytik mittels Circulardichroismus-Spektroskopie (CD) sowie ferner auf dem wichtigen Aspekt der Charakterisierung und Auswahl stationärer Phasen, unter erstmaliger Einbeziehung neuartiger calixaren-gebundener Phasen. Ein weiterer Schwerpunkt in der Arbeit war es, Optimierungsstrategien für die Entwicklung von HPLC-Methoden zu erarbeiten, wozu chromatographische Modelling-Programme genutzt wurden. Auch hier wurden neue Erkenntnisse durch die Testung der Calixarenphasen im Vergleich mit einigen anderen kommerziellen Packungsmaterialien gewonnen. Die Bewertung der Fähigkeit von verschiedenen Calixarenen zur Bildung von Wirt-Gast-Komplexen mit chiralen pharmazeutischen Wirkstoffen in verschiedenen Lösungen (Acetonitril, Methanol und Wasser), einschließlich der Vergleiche von wasserlöslichen Calixarenen und drei pharmazeutisch relevanten Cyclodextrinen mittels CD-Spektroskopie wurde durchgeführt. Dabei konnte ein Beitrag zum Verständnis des Mechanismus der Komplexbildung, basierend auf den CD-Spektren der Wirkstoffe mit unterschiedlichen Wirtsmakrozyklen geleistet werden. Eine systematische Bewertung der Anwendbarkeit einer chromatographischen Modellierungssoftware für calixaren- und resorcinaren-gebundene stationäre Phasen und einiger anderer relativ neuer Umkehrphasensäulen im Vergleich mit konventionellen Alkyl-gebundenen Phasen wurde erstmals durchgeführt, um die Genauigkeit der Vorhersage der Retentionszeiten zu überprüfen und die Ergebnisse von zwanzig verschiedenen Säulen zu vergleichen. Als praktische Anwendung wurden HPLC-Methoden für die simultane Trennung von einigen der wichtigsten Lokalanästhetika auf der Grundlage QbD-Prinzipien mit einer systematischen Vorgehensweise und experimentellem Design entwickelt, wobei ein oder mehrere Faktoren gleichzeitig geändert wurden. Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Relevanz moderner Anwendungstechniken und Optimierungsstrategien in der HPLC für die erfolgreiche Entwicklung von analytischen Methoden dargestellt werden. Ein grundlegendes Instrument ist die Computersimulation, die das Verständnis und die Visualisierung von chromatographischen Verhalten in silico ermöglicht und damit die experimentelle Belastung deutlich reduziert, was aber in der Regel mit der Erreichung robuster Methoden verbunden ist.
Die Ziele der vorliegenden Arbeit bestanden in der 1. eigenen Beurteilung der Bedeutung der Hepatitis B-Infektion bei Hämodialysepatienten mittels einer retrospektiven Krankenblattanalyse im etablierten Dialysezentrum Stralsund, 2. Ermittlung der Serokonversionsraten von Hämodialysepatienten sowie präterminal niereninsuffizienten Patienten nach einer Immunisierung gegen Hepatitis B, 3. Untersuchung der SCN‾-Spiegel bei Hämodialysepatienten, Einfluß der Hämodialyse auf diese Spiegel und Eruierung der Möglichkeiten zur Erlangung physiologischer Verhältnisse, 4. Untersuchung des Einflusses einer oralen SCN‾-Supplementierung auf die Immunantwort bei Hämodialysepatienten im Rahmen einer Immunisierung gegen Hepatitis B, 5. Spiegelbestimmungen von Neopterin und Procalcitonin bei Hämodialysepatienten und mögliche Einflüsse einer Immunisierung gegen Hepatitis B auf deren Höhe. Mittels der eigenen retrospektiven Krankenblattanalyse konnte die deutlich höhere Prävalenz hinsichtlich des Auftretens der Virushepatitis B bei Hämodialysepatienten herausgearbeitet werden. Zudem waren nicht nur hohe Infektionszahlen sondern auch häufiger chronische Verläufe nachweisbar. Aufgrund der ebenfalls darstellbaren deutlich reduzierten Serokonversionsraten nach eingeführter Immunisierung gegen Hepatitis B bei den Hämodialysepatienten und präterminal niereninsuffizienten Patienten blieb die Prävalenz der Hepatitis B-Infektion im Dialysezentrum weiter hoch. Erst die Möglichkeit einer konsequenten Distanzierung von Patienten mit serologischen Zeichen einer Virushepatitis B gestaltete die Prävention neuer Infektionen erfolgreich. In der Untersuchung konnte gezeigt werden, dass sich die SCN‾-Spiegel der Dialysepatienten vor der Hämodialyse im unteren Bereich der physiologischen Norm und nach erfolgter Hämodialyse unter der physiologischen Norm befinden. Mittels oraler Substitution von SCN‾ gelingt ein vollständiger Ausgleich des hämodialysebedingten SCN‾-Verlustes und führt zu durchgängig physiologischen Spiegeln. Die Serokonversionsrate nach erfolgter Boosterung der Hepatitis BImmunisierung konnte bei den mit zusätzlich SCN‾ versorgten Patienten signifikant gesteigert werden. Bei 12 der 14 in den Versuch einbezogenen Hämodialysepatienten konnte ein stimulierender Effekt unabhängig von der Zahl der vorangegangenen Boosterimpfungen beobachtet werden. Eine Beziehung zwischen Impferfolg und Parametern des Dialysestatus der untersuchten Patienten konnte nicht hergestellt werden. Somit gelingt auch mittels dieser Untersuchung die wünschenswerte Unterscheidung zwischen Respondern und Nonrespondern nicht. In der vorliegenden Untersuchung konnte bestätigt werden, dass bei Hämodialysepatienten die Neopterinspiegel gegenüber der Norm erhöht sind. Dabei war die individuelle Streuung der Neopterinspiegel dieser Patienten hoch. So macht erst die Kenntnis der individuellen Neopterinspiegelverhältnisse der Hämodialysepatienten eine diagnostische Verwertung hinsichtlich Erkennung von Viruserkrankungen möglich. Die Neopterinspiegel stiegen nach Immunisierung gegen Hepatitis B an, das Maximum dieses Anstieges trat jedoch zu unterschiedlichen Zeiten nach der Impfung auf. Diese erhöhten Neopterinspiegel blieben noch mehrere Tage nach der Impfung nachweisbar. Zudem konnte eine Beziehung zwischen Anstieg des Neopterinspiegels nach erfolgter Immunisierung und Anstieg des Antikörpertiters nachgewiesen werden. Die in dieser Arbeit untersuchten Hämodialysepatienten wiesen überwiegend stabile, geringradig über der physiologischen Norm liegende Procalcitoninspiegel auf. Signifikante Unterschiede der Procalcitoninspiegel vor und nach Hämodialyse waren nicht nachweisbar. Berücksichtigt man die geringradige Erhöhung der stabil nachweisbaren Procalcitoninspiegel bei Hämodialysepatienten, kann das Procalcitonin als diagnostisches Merkmal bei bestimmten inflammatorischen Reaktionen genutzt werden. Beziehungen zwischen Höhe der Procalcitoninspiegel und der erfolgten Immunisierung gegen Hepatitis B bei den Hämodialysepatienten ergaben sich nicht.
Agglomerate Sprühgetrockneter Amorpher Fester Dispersionen (Englisch: Spray-dried Amorphous Solid Dispersions – SD-ASD) im Gastrointestinaltrakt können zu Beeinträchtigungen des Wohlergehens von Nagetieren in präklinischen Studien im Rahmen der Arzneimittelentwicklung führen. Das Auftreten solcher Agglomerate, nachfolgend Pharmakobezoare genannt, war dabei auf Studien an Nagetieren beschränkt bei welchen Hydroxypropylmethylcelluloseacetatsuccinat (HPMC-AS) als Trägerpolymer der als Suspension applizierten SD-ASDs eingesetzt wurde. In diesem Promotionsprojekt evaluierten wir basierend auf Berichten präklinischer Studien Faktoren, welche die Pharmakobezoarbildung in vivo beeinflussen. Weiterhin wurde ein In vitro-Modell entwickelt, mittels welchem das Agglomerationspotential verschiedener SD-ASDs vor Applikation untersucht werden konnte. Dieses Modell wurde ebenfalls genutzt um einen Ansatz zur Reduktion des Agglomerationspotentials zu finden, welcher in der letzten Phase des Promotionsprojektes in vivo verifiziert wurde. Dabei wurde der Effekt der Viskositätserhöhung der Suspensionen zur Reduktion der Pharmakobezoarbildung nicht nur anhand der Masse der bei Sektion gefundenen Pharmakobezoare bewertet, sondern auch die Inzidenz von Pharmakobezoaren an verschiedenen Zeitpunkten der 24-tägigen Studie auf Basis kontinuierlich durchgeführter MRT-Messungen verglichen. Die Visualisierung der intragastralen Pharmakobezoarbildung in vivo ermöglichte darüber hinaus ein detailliertes Verständnis des Prozesses der Pharmakobezoarbildung in Nagetieren unter Berücksichtigung anatomischer und physiologischer Faktoren.
In many industrial sectors biotechnological production processes have replaced pure chemical methods and allowed new, ecologically friendly and enzyme-based processes. Microorganisms, such as modified Bacillus strains are used in particular for the industrial enzyme synthesis. The two organisms Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus are of great industrial importance. B. licheniformis is able to secrete proteins in large amounts, while B. pumilus shows high resistance to oxidative stress. During production processes different conditions can occur that affect the physiology of the production hosts and may result in a quantitative, but also a qualitative impairment of the products. This influence is based on e.g. chemical processes, the setting of temperature, pH, or oxygen availability and can lead to various stress situations for the bacteria. Cells respond to changes in their environment by sensing stressors and initiate a response to the stress, which is usually implemented by an induction or derepression of various regulons. In order to conduct an optimal production process, the metabolism and stress responses of the utilized bacteria should be known exactly. The aim of this study was to analyze of the stress response of B. licheniformis to heat and salt stress, and the stress response of B. licheniformis and B. pumilus to oxidative stress. These analyses were performed at the level of transcriptomics using cDNA microarrays, which is the most direct and global method for the analysis of changes in the physiology of a cell. The identification of stress specific markers genes and their differentiation from the SigB regulated general stress response has been another purpose of this work. Knowledge of these marker genes enables a prompt analysis of the fermentation conditions and thus a possible optimization of the process. The transcriptome analyses of this work show that B. licheniformis responds to heat stress by the induction of heat shock genes belonging to different regulons. These include the htpG gene, the HrcA regulon or the CtsR regulon, encoding chaperones and proteases, which mainly contribute to the protein quality control. The heat stress response of B. licheniformis revealed no fundamental differences to the heat stress response of the Gram-positive model organism Bacillus subtilis. The general stress response (SigB regulon), which is activated by heat stress, could be analyzed in more detail by the study of a ΔsigB mutant of B. licheniformis. Salt stress also provokes a strong induction of the general stress response in B. licheniformis. Genes for the transport and synthesis of compatible solutes were strongly induced, as well as several genes for transport systems with more or less known functions. The synthesis of the osmoprotective metabolites proline and glycine betaine could be verified in more detail by a metabolomics approach. The response to oxidative stress showed differences between both B. licheniformis and B. pumilus, and also to the oxidative stress response of B. subtilis. In B. licheniformis, the genes of the glyoxylate cycle are induced during oxidative stress. An activation of the glyoxylate bypass under oxidative conditions could be confirmed by a metabolome analysis of B. licheniformis. In addition, the PerR regulon of B. licheniformis is extended to include another two genes compared to B. subtilis. In contrast, several genes of the PerR regulon lack in the genome of B. pumilus, such as katA (vegetative catalase) or ahpCF (alkyl hydroperoxide reductase). However, other genes were induced in B. pumilus that were upregulated under oxidative stress conditions neither in B. subtilis nor in B. licheniformis. In addition, known regulons, regulated by e.g. Spx, CtsR or SOS were induced in both organisms. In summary, this dissertation transcriptionally analyzes the stress responses of B. licheniformis to heat, salt and oxidative stress, and in addition the oxidative stress response of B. pumilus. Several stress-specific regulons were identified in both, B. pumilus and B. licheniformis, which also correspond to the stress response of B. subtilis. However, it was possible to additionally assign genes to the stress specific responses of both organisms and to find differences, such as the absence of parts of the PerR regulon of B. pumilus, or the activation of the glyoxylate pathway in B. licheniformis during oxidative stress.
Transition metal complexes play a crucial role in antitumor therapy. Complexes of platinum, ruthenium as well as lanthanum and gallium have been investigated in preclinical as well as in clinical studies. The best known platinum(II) agents approved worldwide, cisplatin or carboplatin, are used in nearly 50% of all cancer therapies. This work focused on the development of new metal-based drugs that could act against human cancer cells. It was motivated in part by previous work with Cu(II) complexes, reporting new coordination compounds of SOD mimicking and cytotoxic activities. On the basis of this work we chose several commercially available heterocyclic ligands to synthesize new metal ion complexes in search of their interesting biological activity. New as well as previously reported Cu(II), Co(II), Pt(II) and Zn(II) complexes were synthesized using various ligands (1-6). Almost all chelating 2:1 ligand-metal complexes were obtained generally in water at room temperature in the reaction of metal(II) chloride with corresponding aromatic nitrogen ligands bearing an O-carboxylate group ligand. The synthesized chelating complexes were characterized by the use of spectroscopic methods, elemental analyses and HPLC chromatography and some by X-ray crystallography. Such coordination compounds are easily formed by transition metals with free orbitals d that can accept the donor electron pairs. The coordination is through the heterocyclic nitrogen and carboxylate oxygen donor atoms, which was shown by analysis of the characteristic functional groups in the IR spectra. The d-d transitions and absorption of visible light in Cu(II) and Co(II) complexes make them highly colored, blue, green or green-blue, respectively. The configuration of the coordination center was established in some cases by X-ray crystallography. Most of the already published structures possess the trans configuration. This led to the assumption that other uncrystallized complexes were also trans configured. However, X-ray data of the Cu(II) complex of 5 showed quite unexpectedly the cis configuration. On the other hand, the LC/MS experiments with the Pt(II) complex of 5 indicated that this complex exists in two isomeric forms, i.e., cis and trans at the Pt(II) center. Through the use of density functional calculations we optimized the structures and calculated the energies and dipole moments. The differences in energy for all complexes were about 6 to 15-fold lower when compared to cis and transplatin. The DFT calculations confirmed that the trans-isomers are more stable than their cis-isomers. UV-Vis stability studies with most of the synthesized complexes as well as some other Cu(II) complexes were performed to study the spectral changes over 24 h in addition of glutathione, a tripeptide present in the cancer cells and ascorbate that were added to the incubations. The results indicated time-dependent changes and instability of the complexes in the cells and their possible decomposition to lose the ligand and release the metal ion. In the case of Cu(II) complexes, reduction of Cu(II) to Cu(I) may take place. New species such as GSSG could arise and the complexes may decarboxylate, but these structures were not elucidated. The synthesized coordination metal(II) complexes were tested for their potential antiproliferative activities by using the crystal violet staining method in a panel of human cancer cell lines. Out of all complexes, three Pt(II) complexes of 2, 5 and 6 showed satisfactory activity and for these complexes the IC50 values were additionally determined in new RT-4, DAN-G and MCF-7 cancer cell lines. Interestingly, the active complexes were the chelating trans complexes which is quite unexpected, based on the difference in activities between cis and transplatin. All of the complexes were tested for their potential antimicrobial activities in comparison to the standard antibiotics on such bacterial strains as Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and yeast Candida maltosa. Co(II) complexes have been especially known to act against bacterial strains. The activity of the Co(II) complexes was indeed the highest of all metal(II) complexes. The ligand 2 (a nicotinic acid isomer) was also found active. This fact could explain why some antibacterial activity was found in the MIC assay. In addition to the complexes synthesized in this work, several novel heterocyclic metal(II) complexes of copper, ruthenium, platinum, gallium, osmium and lanthanum from other research groups were screened for their antiproliferative activity, some of which exhibited very potent activity in the cancer cell lines. In conclusion, Pt(II) complexes with bis-chelating heterocyclic carboxylate ligands represent a particularly interesting new class of compounds from the view point of their structural and biological properties.
Synthesis and evaluation of pseudosaccharin amine derivatives as potential elastase inhibitions
(2006)
Elastase is a serine protease which by definition is able to solubilize elastin by hydrolytic cleavage.Human Leukocyte Elastase, HLE (EC 3.4.21.37), is involved in deseases such as adult respiatory distress syndrome, pulmonary emphysema, smoking related chronic bronchitits, ischemic-reperfusion injury and rheumatoid arthritis. Hence, the elastase inhibitors have clinical utility in these diseases. Heterocyclic compounds are one of the most important classes of the elastase inhibitiors. In the present work different pseudosaccharin amine derivatives were synthesized and tested against the elastase. The synthesis of pseudosaccharin amine dervatives was carried out from the amines and(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylsulfanyl)acetonitrile in different solvents. Futhermore, the pseudosaccharin amines were obtained by refluxing the thiosaccarinates in absolute acetic acid. The reaction of 3-ethoxybenzo[d]isothiazole 1,1-dioxide with different amines in dioxane under reflux resulted into the desired pseudosaccharin amine derivatives in higher yields. Pseudosaccharin chloride was also used in the synthesis of these derivatives.A detail study of the synthesis of pseudosaccharin amine dervatives from the above differnt routes is described. Peptides were also synthesized by using the mixed anhydride method. The ester, acid, amide and peptide derivatives were tested against the Porcine Pancreatic Elastase (PPE) and Human Leukocyte Elastase (HLE). The esters were found to be the reversible inhibitors of HLE. The process of the PPE inhibion by cyanomethyl(2S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylbutanoate was studied. Michaelis-Menten curve and Lineweaver-Burk double reciprocal plot were constructed in order to study the kinetic of this reaction. The compounds showing high inhibition of HLE were further stuied for determination of their inhibitory constant(Ki). The esters were found to be the higly active compounds against HLE. The cyanomethyl(2S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylbutanoate and cyanomethyl(2S,3S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylpentanoate showed the competitive reversible inhibition of HLE.The cyanomethyl(2S,3S)-2-(1,1-dioxobenzo[d]isothiazol-3-ylamino)-3-methylpentanoate is highly potent inhibitor of HLE. The possible mechanism of inhibition of elastase by these compounds is discussed. Molecular modelling of some of the ester derivatives is also discussed.
Einleitung: Ausgangspunkt dieser Dissertation war das hepatotoxische Analgetikum Flupirtin, dessen Wirkung auf einer Erhöhung der Öffnungswahrscheinlichkeit neuronaler KV7-Kaliumkanäle beruht. Ein Vergleich mit dem ebenfalls hepatotoxischen Arzneistoff Paracetamol warf die Frage auf, ob sich dessen Toxizitäts-Mechanismus, der auf der Bildung des aktiven Metaboliten NAPQI, welcher durch oxidativen Metabolismus entsteht, auf Flupirtin übertragen lässt. Durch Synthese von Flupirtin-Analoga mit veränderten oxidativen Eigenschaften sollten neue Erkenntnisse bezüglich der Oxidierbarkeit, Wirksamkeit und Toxizität des Arzneistoffs erhalten werden. Als zusätzliche Leitstruktur wurde die mit Flupirtin verwandte, wirksame Verbindung ICA-027243 verwendet. Synthesen: Im Fokus der Derivatisierungen standen die N-Atome von Flupirtin, da diese bei der Oxidation eine entscheidende Rolle spielen. So gelang es vor allem durch gezielte Neusynthese, alle drei N-Atome um den Pyridin-Ring unabhängig voneinander einzeln oder in Kombination zu alkylieren. Ausgangspunkt des hierfür benötigten Fluorbenzylamin-Bausteins war der entsprechende Benzaldehyd, welcher durch reduktive Aminierung umgesetzt wurde. Als Pyridin-Baustein wurde 2,6-Dichlorpyridin verwendet, an welchem nach der Nitrierung ein Chloratom durch Ammoniak oder Dimethylamin substituiert werden konnte. Nach der Kondensation beider Bausteine erfolgte die Reduktion der Nitrogruppe mit anschließender Acylierung zum entsprechenden Flupirtin-Derivat. Die Alkylierung des Carbamat-NH folgte gegebenenfalls als letzter Reaktionsschritt. Weitere Verbindungen wurden auf mehr oder weniger abgewandelten Syntheserouten hergestellt. Dabei wurde Flupirtin teilweise in Richtung ICA-027243 abgewandelt und Desamino-Flupirtin-Derivate hergestellt. Variiert wurde unter anderem die Position des Pyridin-N-Atoms und die Methylenamino-Brücke zwischen den aromatischen Ringen wurde teilweise durch eine Amid-Brücke ersetzt. Neben weiteren Derivaten wurden auch bizyklische Flupirtin-Derivate durch Pyrolyse von Flupirtin und Retigabin synthetisiert. Testungen: Getestet wurden die synthetisierten Verbindungen auf ihre Oxidierbarkeit mit Cyclovoltammetrie und einer Peroxidase, auf ihre Wirksamkeit mit einem kommerziellen Thallium-Flux-Assay (durchgeführt von der Firma ChanTest, USA) und auf ihre Toxizität mit einer Mäuseleber-Zelllinie (TAMH) in einem MTT-Assay. Im Rahmen einer Masterarbeit in Kooperation mit der Firma Hoffmann-La Roche in Basel sind einige Derivate weitergehend in vitro auf ihre Toxizität untersucht worden. Das zentrale Ergebnis der Testungen war, dass es eine Korrelation zwischen der Oxidierbarkeit der Verbindungen und ihrer Fähigkeit, eine bestimmte Öffnungswahrscheinlichkeit der KV7-Kaliumkanäle zu erhöhen (Thallium-Flux-Assay), zu geben schien. Hingegen konnte kein entsprechender Zusammenhang zwischen Wirksamkeit der getesteten Verbindungen und ihrer Toxizität im MTT-Assay festgestellt werden.
In der Arbeit wird die Synthese und Charakterisierung von trans-Platin(IV)-Diaziden beschrieben. Es wird gezeigt, dass sie durch die Verwendung von UV- und Weißlicht photoaktiviert werden können, wobei Photoreduktionen, Photosubstitutionen oder Photoisomerisierungen auftreten können. Ähnlich wie der bekannte Antitumorwirkstoff Cisplatin, sind die Verbindungen in der Lage irreversiblel an DNA zu binden. In Zellversuchen konnte zusätzlich eine antiproliferierende Aktivität festgestellt werden, wenn mit Licht bestrahlt wurde. Im Dunkeln zeigten die Verbindungen keine Wirkung. Durch Zellzyklusanalysen und der Beobachtung von morphologischen Veränderung nach der Behandlung mit Platin(IV)-Diaziden kann jedoch auf einen zu Cisplatin unterschiedlichen Wirkmechanismus geschlossen werden.
Die Arzneistoffe Flupirtin und Retigabin wurden über viele Jahre hinweg erfolgreich als Analgetikum bzw. Antiepileptikum eingesetzt. Vor allem aufgrund ihres einzigartigen Wirkmechanismus, welcher in der Öffnung spannungsabhängiger Kv7-Kaliumkanäle liegt, konnte eine weitgehend nebenwirkungsfreie Therapie ermöglicht werden. Innerhalb der letzten drei Jahre wurden allerdings sowohl Flupirtin als auch Retigabin aufgrund von seltenen, aber schwerwiegenden unerwünschten Arzneimittelwirkungen (UAWs) vom Markt genommen. Man geht davon aus, dass die Lebertoxizität von Flupirtin ebenso über eine oxidative Verstoffwechslung zu instabilen Metaboliten vermittelt wird, wie die reversiblen Blauverfärbungen von bestimmten Geweben unter Retigabin-Therapie. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden verschiedene Modifikationen am Triamino-Aromaten-Motiv der Arzneistoffe vorgenommen und deren Einfluss auf verschiedene Eigenschaften untersucht. So wurde die Oxidierbarkeit von 55 Verbindungen cyclovoltammetrisch bestimmt und der Aktivität und Toxizität gegenübergestellt. Die beste Substanz 3-(3,5-Difluorphenyl)-N-(6-[isobutylthio)-2-(pyrrolidin-1-yl)pyridin-3-yl]propanamid konnte dabei eine 918-fach höhere Aktivität als Flupirtin, bei gleichzeitig gesteigerter oxidativer Stabilität aufweisen. Zusätzlich wurden durch die schrittweise Derivatisierung von Flupirtin Struktur-Aktivitäts-Beziehungen für Kv7.2/3-Heterotetramere erhalten.
Die Kv7-Kaliumkanalöffner Flupirtin und Retigabin waren wertvolle Alternativen bei der Pharmakotherapie von Schmerzen und Epilepsie. Beide Wirkstoffe werden aufgrund von unerwünschten Arzneimittelwirkungen derzeit jedoch nicht mehr eingesetzt. Die Flupirtin-induzierte Hepatotoxizität und die durch Retigabin hervorgerufenen Gewebeverfärbungen scheinen dabei auf den ersten Blick nicht zusammenzuhängen. Gleichwohl lassen sich wahrscheinlich beide Nebenwirkungen auf das gemeinsame oxidationsempfindliche Triaminoaryl-Grundgerüst zurückführen, welches zur Bildung von reaktiven Chinondiimin-Metaboliten neigt. Da hingegen der Wirkungsmechanismus, d. h. die Öffnung der Kv7-Kanäle, nicht an der Toxizität beteiligt zu sein scheint, hatte diese Arbeit zum Ziel, sicherere Alternativen für Flupirtin und Retigabin zu entwickeln. In einem Liganden-basierten Ansatz wurde eine Umgestaltung des Triaminoaryl-Kerns, den beide Wirkstoffe gemeinsam haben, vorgenommen, was zu Carba-Analoga führte, die durch eine erhöhte Oxidationsbeständigkeit sowie ein vernachlässigbares Risiko für die Bildung von chinoiden Metaboliten charakterisiert sind. Zusätzlich zu diesen verbesserten Sicherheitsmerkmalen offenbarten einige der neuartigen Derivate eine überlegene Kv7.2/3-Kanalöffnungsaktivität. Im Vergleich zu Flupirtin konnte die Potenz der Verbindungen um den Faktor 150 gesteigert werden, während die intrinsische Aktivität auf bis zu 176 % verbessert werden konnte, was die betreffenden Carba-Analoga zu vielversprechenden Kandidaten für eine weitergehende Entwicklung macht. Andererseits ermöglichten einige inaktive Verbindungen sowie die insgesamt deutlich abgestuften Kv7.2/3-Aktivitätsdaten die Etablierung von validen Struktur-Wirkungs-Beziehungen und Hypothesen zum Bindungsmodus, die mit Dockingergebnissen und Molekulardynamik-Simulationen korrelierten.
Epigenetische Regulationsmechanismen spielen eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Gleichgewichtes zwischen dem Vorliegen von Eu- und Heterochromatin. Neben Acetylierungsprozessen kommt dabei vor allem Methylierungen von Histonen eine entscheidende Bedeutung zu. Die im Fokus der vorliegenden Dissertation stehenden Demethylierungen können dabei zum einen durch sogenannte Lysin-spezifische und zum anderen durch JumonjiC-Domäne enthaltende Histon-Demethylasen katalysiert werden. Bei der zweiten Gruppe handelt es sich um Fe(II)- sowie 2-Oxoglutarat-abhängige Enzyme, welche unter anderem die Oxidoreduktase KDM4A umfassen. In gesundem Gewebe übernimmt diese wichtige Aufgaben im Rahmen der Regulierung des Zellzyklus und der -differenzierung, während daneben jedoch eine Überexpression in diversen Tumorzellarten, wie z. B. Prostata-, Brust- oder Lungenkrebs detektiert wurde.
Aus diesem Grund bestand das Ziel jener Arbeit in der Auffindung eines potentiellen KDM4A-Inhibitors in Anlehnung an literaturbekannte Hemmstoffe wie Daminozid oder N-Oxalylglycin, welcher im Folgenden als Leitstruktur für die Erstellung einer Substanzbibliothek dienen sollte. Diese Aufgabe konnte durch die Synthese von drei Tetrazolylcarbonsäurehydraziden erfüllt werden, welche zu einer Inhibition von KDM4A mit IC50-Werten im zweistelligen mikromolaren Bereich in der Lage waren. Die kürzeste dieser drei Verbindungen, 2-(1H-Tetrazol-5-yl)essigsäurehydrazid, wurde aufgrund des kleinsten IC50-Wertes als Leitstruktur für folgende Derivatisierungen ausgewählt. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass es sich bei dieser fragmentartigen Verbindung um einen kompetitiven Inhibitor handelt, welcher zudem eine gewisse Subtypselektivität für KDM4A aufweist. Durch die Synthese und Charakterisierung des am Tetrazolring methylierten Derivates sowie des korrespondierenden Esters wurde die Notwendigkeit des Vorhandenseins eines Komplexbildners in definiertem Abstand zu einer sauren Funktion für eine Hemmwirkung gegenüber KDM4A belegt.
Aufgrund der in der Literatur beschriebenen komplexbildenden Eigenschaften von Acylhydrazonen wurde ausgehend von den drei Tetrazolylcarbonsäurehydraziden durch Umsetzung mit verschiedenen Aldehyden und Ketonen eine Substanzbibliothek bestehend aus 46 Verbindungen synthetisiert. Neben der Hydrazonbildung konnte die Leitstruktur durch das Einfügen von α-C-C- und α-C-N-verknüpften Seitenketten derivatisiert werden. Dadurch wurden insgesamt 14 Endverbindungen synthetisiert, wobei die beiden potentesten Substanzen, bei denen es sich um amidhaltige Strukturen handelt, IC50-Werte im Bereich der Leitstruktur aufweisen. Des Weiteren war eine Abwandlung der Leitstruktur infolge des Ersatzes der Methylengruppe durch einen Benzenring möglich.
Die biologische Testung der Substanzen erfolgte mithilfe von zwei verschiedenen Assays: Zum einen dem enzymgekoppelten Formaldehyd-Dehydrogenase- und zum anderen dem Antikörper-basierten LANCE-Assay. Des Weiteren wurden im Helmholtz-Zentrum Berlin zehn ausgewählte Verbindungen zusammen mit der zu KDM4A weitestgehend homologen KDM4D kristallisiert und röntgenkristallographisch vermessen. Durch Aufklärung der Bindungsmodi konnte die Grundlage für ein rationales Ligandendesign hinsichtlich der gezielten Synthese weiterer potentieller KDM4x-Inhibitoren gelegt werden.
Eine Auswahl von 88 Substanzen der synthetisierten Verbindungen wurde in der Screening Unit des FMP (Leibniz-Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie) in Berlin, welches Teil des EU-Openscreen-Netzwerkes ist, eingelagert und steht damit für Testungen gegen weitere Targets zur Verfügung. Da die betreffenden Substanzen in Arzneistoffen unterrepräsentierte Strukturen, wie z. B. Hydrazide und aliphatisch gebundene Tetrazole beinhalten, könnten dadurch interessante neue Leitstrukturen für andere Forschungsprojekte identifiziert werden.
Ein Teil der Ergebnisse der vorliegenden Dissertation wurde in zwei Publikationen veröffentlicht.
Sirtuine stellen eine Familie der Lysin-Deacetylasen dar, die sich durch Verwendung des Kofaktors NAD+ auszeichnen und an der Regulation zentraler zellulärer Prozesse, wie beispielsweise der Gentranskription, der Apoptose und des Energiestoffwechsels, beteiligt sind. Basierend auf einer mäßig aktiven, stilbenoiden Leitstruktur mit schwach ausgeprägter Isoenzym-Selektivität wurden verschiedene Strukturanaloga synthetisiert und deren Einfluss auf die Deacetylase-Aktivität der humanen Sirtuine Sirt1–3 ermittelt. Azologisierung der Leitstruktur führte weiterhin zu Phenylazopyridinen sowie Azobenzenen, deren Eignung als molekulare Sirtuin-Photoschalter anhand der photophysikalischen Eigenschaften und des photochemischen Verhaltens in wässriger Umgebung bestimmt wurde. Einige Verbindungen zeigten eine submikromolare inhibitorische Aktivität im thermischen Gleichgewicht, welche durch Bestrahlung mit UV-Licht um das Vierfache verringert werden konnte. Langkettige Fettsäure-Derivate führten hingegen zu hochselektiven Sirt2-Inhibitoren, deren biologische Aktivität sich durch eine lichtabhängige Steigerung der wässrigen Löslichkeit induzieren ließ.
Um zukünftige Untersuchungen des im bekannten chemical space unterrepräsentierten Strukturmotivs 3,4-disubstituierter bzw. 3,4-verbrückter 1H-Indol-Derivate zu ermöglichen sollte im Zuge der praktischen Arbeiten, welche dieser Dissertation zugrunde liegen, eine Reihe bisher nicht literaturbekannter Verbindungen dieser Substanzklasse, auch unter Verwendung von Multikomponentenreaktionen, dargestellt und charakterisiert werden. Weitere Untersuchungen zur Derivatisierung und Modifikation des Strukturmotivs sollten durchgeführt werden und im Idealfall zu einem weiteren Ringschluss an den tricyclischen Substraten führen. Relevante Verbindungen sollten anschließend in einer Reihe von (internationalen) Screening-Kampagnen und bei Kooperationspartnern hinterlegt werden, um langfristig eine nähere Charakterisierung ihrer physikochemischen und pharmakologischen Eigenschaften zu erreichen, welche gegebenenfalls zur weiteren Optimierung des Strukturmotivs für spezifischere Anwendungen führen kann.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen drei Substanzbibliotheken verschiedener Grundkörper darzustellen und zu charakterisieren. Dabei handelt es sich um 13 Derivate der cyclischen Bisamide vom 5-Oxo-1,3,4,5-tetrahydropyrrolo[4,3,2-gh]isochinolin-3-carboxamid-Typ, welche sich durch Ugi-MCR aus einem geeigneten bifunktionellen Reagenz, sowie verschiedenen primären Aminen und Isocyaniden in Anlehnung an die Arbeiten von Mironov et al. synthetisieren ließen. Weiterhin konnten, ausgehend von den tricyclischen Verbindungen vom 2-Methyl-5-oxo-1,3,4,5-tetrahydrobenzo[cd]indol-3-carbonsäure- und 2-Methyl-1,3,4,5-tetrahydrobenzo[cd]indol-3-carbonsäure-Typ, welche nach einer modifizierten Vorschrift nach Böshagen et al. erhalten werden konnten, zwei weitere Substanzbibliotheken mit 33 bzw. 24 individuellen Amid-Derivaten hergestellt werden. Dabei konnte durch Verwendung geeigneter Substrate nach der Amidkupplung die Freilegung eine basischen funktionellen Gruppe in einigen Verbindungen erreicht werden, welche die Bildung eines Hydrochlorid-Salzes ermöglichte und dadurch die Wasserlöslichkeit der neuen Verbindungen deutlich zu erhöhen vermag.
Auch gelang durch Einsatz des ökologisch äußerst vorteilhaften Lösungsmittels Dihydrolevoglucosenon die Entwicklung einer „grüneren“ Vorschrift zur Synthese dieser Substanzen, welche auf den Einsatz des, aus ökologischen und gesundheitlichen Gründen kritisch zu hinterfragenden, Lösungsmittels N,N-Dimethylformamid verzichtet.
Die Untersuchungen zur weiteren strukturellen Modifikation der erhaltenen 3,4-verbrückten 1HIndol- Derivate verlief nicht mit dem erhofften Erfolg, da viele Untersuchungen zu dieser Thematik unter anderem mittels Diels-Alder-Reaktion und Olefin-Metathese nicht zu isolierbaren Produkten führten. Allerdings konnte durch Diamin-vermittelte Ringschlussreaktion von 3-Formyl-1H-indol- 4-carbonsäuremethylester letztlich eine Synthesevorschrift zur Darstellung tetracyclischer Derivate erhalten werden. Die aus diesen Versuchen hervorgegangene Verbindung konnte ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit zur Kristallisation gebracht und am Institut für Biochemie der Universität Greifswald im Arbeitskreis für Synthetische und Strukturelle Biochemie röntgendiffraktometrisch untersucht werden, was zur Bestätigung der angenommenen Konstitution führte.
Erste Evaluationen der biologischen Aktivität der dargestellten Verbindungen konnten bereits im Arbeitskreis Pharmazeutische Bioanalytik der Universität Greifswald vorgenommen werden: Dabei wurden die relevanten Verbindungen mittels MTT-Assay auf eventuelle Zytotoxizität hin untersucht. Die Ergebnisse legen nahe, dass von den meisten untersuchten Verbindungen keine Zytotoxizität ausgeht, wobei dies allerdings, aufgrund der Limitationen des MTT-Assay im Bezug auf diese Aussage, in weiteren Untersuchungen abschließend geklärt werden sollte. Weiterhin konnte für einige der synthetisierten Verbindungen eine Inhibition der Arachidonat-5-Lipoxygenase (5-LOX) mit IC50-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich in vitro nachgewiesen werden. Der genaue Mechanismus der Inhibition, ebenso wie eine eventuell vorhandene Selektivität gegenüber anderen Arachidonat-Lipoxygenasen soll Gegenstand zukünftiger Untersuchungen, unter anderem am isolierten Enzym 5-LOX und in Homogenaten, sein. Darüber hinaus konnte ein großer Teil der synthetisierten Verbindungen im Molekülarchiv „Compound Platform“ (ComPlat) des Karlsruhe Institut für Technologie (KIT) hinterlegt werden, wo sie einer Vielzahl von potentiellen Kooperationspartnern zur Verfügung stehen. Erste Ergebnisse einer solchen Kooperation mit der Arbeitsgruppe Prof. Dr. Fahrer der Technischen Universität Kaiserslautern sollen zeitnah in einer gemeinsamen Publikation veröffentlicht werden. DesWeiteren konnten 40 Verbindungen in der „Testing4Ag“-Kampagne des Unternehmens Bayer Crop Science untergebracht werden, wo ihre Wirkung auf ein breites Spektrum von Schädlingen, Pilzen und Unkräutern evaluiert werden soll. Die Ergebnisse dieser Testungen stehen zum Zeitpunkt der Niederschrift dieser Arbeit noch aus. Eine Hinterlegung von 40 Substanzen in der EU-OPENSCREEN-Plattform, einer non-profit-Abteilung des European Research Infrastructure Consortium (ERIC) wird vorbereitet.
Abschnitt I: Die Klasse II-Adenylylcyclasen (AC) stellen eine Gruppe von löslichen Toxinen dar, welche die Pathogenität einer ganzen Reihe von Krankheitserregern vermitteln, darunter Bacillus anthracis (Milzbrand), Bordetella pertussis (Keuchhusten) und Pseudomonas aeroginosa (u. a. Pneumonien). Im Rahmen des ersten Abschnittes dieser Arbeit wurde der aus B. anthracis stammende, sogenannte "Ödemfaktor" als Modellenzym ausgewählt, um die biologische Aktivität eines experimentellen Nucleotidanalogons gegenüber Adenylylcyclasen zu testen. Die gestellten Anforderungen an diese Verbindung, sowie die entsprechenden Lösungsansätze waren: 1) Einführung einer sterisch anspruchslosen, fluoreszierenden Reporterfunktion für in vitro-Bindungsstudien (N-Methylanthranylsäure), 2) Verhinderung von Acylübertragungsreaktionen des Fluorophors (Amid- statt Esterbindung) und 3) Erhöhung der Hydrolysestabilität des Triphosphatrestes (bioisosterer Austausch der terminalen Phosphoranhydridbindung). Die Synthese des Nucleotides ging von 2'-Amino-2'-Desoxyadenosin aus und wurde in zwei Schritten vollzogen. Zunächst wurde mit Hilfe eines Festphasenreagenz-unterstützten Protokolls N-Methylanthranilsäure amidartig an die 2'-Position geknüpft. Anschließend wurde dann in einem Ein-Topf-Verfahren an die 5'-Position eine triphosphatanaloge Seitenkette angebracht, in der die beta- und gamma-Phosphoratome statt über eine Dichlormethylenbrücke verbunden waren. Der Ki-Wert der so erhaltenen Verbindung (2'-MANT-2'-dAppCCl2p) gegenüber der isolierten AC-Domäne des B. anthracis-Ödemfaktors wurde in einem alpha[32P]-ATP-basierten kinetischen Assay mit 8,8 mM ermittelt. Diese Untersuchungen wurden durch einen FRET-basierten Bindungsassay ergänzt. Obwohl die Aktivität der Zielverbindung damit um ein bis zwei Größenordnungen niedriger war, als die von unmittelbar verwandten Substanzen, konnten nichtsdestotrotz die gestellten strukturellen Anforderungen an ein molekulares Werkzeug realisiert werden. Abschnitt II: Die Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies, wie z. B. von Wasserstoffperoxid, ist ein unvermeidbarer Vorgang in allen anaerob lebenden Organismen. Daher entstanden im Laufe der Evolution eine ganze Reihe von biologischen Mechanismen, welche diese i. d. R. toxischen Verbindungen effektiv zu beseitigen vermögen. Ein Vertreter ist das selenhaltige Enzym Glutathionperoxidase (GPx), welches Wasserstoffperoxid und andere organische Hydroperoxide zu Wasser bzw. den korrespondierenden Alkoholen unter Verbrauch von Glutathion abbaut. Darüber hinaus wird aber auch zunehmend die Rolle von Wasserstoffperoxid als einem proapoptotischen Signalstoff diskutiert, was GPx zu einem interessanten pharmakologischen Ziel werden lässt. Durch Überexpression von GPx könnte die Apoptoseneigung eines Tumors gesenkt und somit dessen Vitalität erhöht werden, was sich unter anderem in einer gesteigerten Resistenz gegenüber bestimmten Zytostatika äußern kann. Auf dieser Arbeitshypothese aufbauend wurde die Synthese eines reversiblen GPx-Inhibitors angestrebt. Als Leitstruktur diente N'-(4-Hydroxybenzyliden)-2-(2-Methylimidazol-1-yl)essigsäurehydrazid, welches in einer Vorarbeit in einem in silico-Screening aufgedeckt worden war. In einem kombinatorischen Ansatz wurde sowohl die Arylessigsäure-Untereinheit (5 Varianten), als auch die Benzyliden-Komponente (7 Varianten) abgewandelt. Zur Darstellung der so projektierten Substanzbibliothek mussten zunächst die benötigten Arylessigsäurehydrazide synthetisiert werden. Diese wurden anschließend unter Einsatz eines Mikrowellen-gestützten Syntheseprotokolls mit den entsprechenden Benzaldehyden kombiniert. Von allen theoretisch möglichen Kombinationen konnten 30 Acylhydrazone in ausreichender Menge und Reinheit synthetisiert werden. Aufgrund technischer Probleme bei der Durchführung des Mikrotiterplatten-basierten GPx-Assays lagen zum Abschluss dieser Arbeit noch keine biologischen Daten vor.
Die Bekämpfung der „most neglected diseases“ stellt die Menschheit vor eine große Herausforderung. Besonders betroffen sind Menschen in den Ländern der Dritten Welt. Zur Behandlung vieler dieser Erkrankungen gibt es bis jetzt noch keine ausreichend aktiven Arzneistoffe. Außerdem stellt die Resistenzentwicklung der Erreger gegen vorhandene Antiinfektiva ein äußerst großes Problem dar. Gegenstand dieser Arbeit war die Synthese von Substanzen, die als Inhibitoren der tRNA-Guanin-Transglycosylase (TGT) untersucht werden sollten und solche, die auf ihre antiplasmodiale Aktivität in vivo getestet werden sollten. Das Target des TGT-Projekts, die tRNA-Guanin-Transglycosylase von Shigella-Spezies, ist ein bakterielles Enzym, das verantwortlich für Pathogenitätsmechanismus virulenter Shigellen ist. Die TGT hat eine Schlüsselfunktion bei der Expression von Virulenzfaktoren der Shigellen und spielt somit eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Bakterienruhr (Shigellose). Sie katalysiert den Austausch der Purinbase Guanin durch die modifizierte Base preQ1 in der Anticodon-Wobble-Position bakterieller tRNA. Bei Untersuchungen von Shigellen mit mutiertem TGT-Gen konnte eine signifikante Abnahme der Pathogenität dieser Erreger festgestellt werden. Dieses Enzym kann deshalb prinzipiell als mögliches Target für neuartige biologisch aktive Substanzen betrachtet werden, denn die Hemmung der TGT führt zum Verlust der Pathogenität der Erreger, allerdings nicht zu deren Tod. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Abkömmlinge der Leitstruktur 5-Nitro-1,3-dihydro-2H-imidazo[4,5-b]pyridin-2-on, die aus einem virtuellen In-silico-Screeningexperiment hervorgegangen ist, synthetisiert um diese in einem Radioligandenassay auf TGT-Inhibition zu untersuchen. In vorangegangenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der Austausch des Pyridinstickstoffatoms der Leitstruktur durch ein Kohlenstoffatom zu einer Verbindung mit vergleichbarer inhibitorischen Aktivität führt. Ausgehend von dieser veränderten Leitstruktur wurden Benzimidazol-2-one und -thione synthetisiert. Diese Verbindungen weisen unterschiedliche Gruppen in Position 5 auf und unterscheiden sich zudem durch die Substitution an Position 1. Die Synthese der Verbindungen mit Benzimidazol-Grundkörper erfolgte durch die initiale Einführung der Substituenten durch nukleophile Substitution an ortho-Nitro-Halogenbenzen-Derivaten. Für diesen Reaktionsschritt erwies sich die Synthese im Mikrowellenreaktor als besonders günstige Methode. Die Reduktion der entstandenen 2,4-Dinitroanilin-Derivate erfolgte selektiv unter Verwendung von Natriumsulfid als Reduktionsmittel, wobei die ortho-Nitrogruppe unverändert blieb. Die Anilinderivate mit Cyano- und Trifluormethylgruppe in para-Position wurden durch eine palladiumkatalysierte Hydrierung zu ortho-Phenylendiaminen reduziert, die anschließend ohne Isolierung dem Ringschluss unterzogen wurden. Die Ringschlussreaktionen erfolgten mit Triphosgen oder Kohlenstoffdisulfid zu Benzimidazol-2-onen beziehungsweise -thionen. Eine Auswahl an hergestellten Derivaten konnte hinsichtlich ihrer Aktivität als TGT-Inhibitoren untersucht werden. Einige Verbindungen wurden auf ihre Zytotoxizität an vier Krebszelllinien hin untersucht. Das zweite Teilgebiet der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit N-substituierten 7-Chlorchinolin-4-aminen, die auf ihre antiplasmodiale Aktivität hin untersucht werden konnten. Diese Verbindungen wurden in einer Zweistufensynthese mit abschließender säulenchromatographischer Reinigung synthetisiert. Verbindungen, die in vorangegangenen In-vitro-Untersuchungen eine Aktivität gegen chloroquinresistente Plasmodium-falciparum-Stämme zeigten, konnten in vivo an Mäusen getestet werden. Dabei zeigten einige Vertreter guten Aktivitäten gegen den eingesetzten Erreger.
In der heutigen Arzneimitteltherapie stellt die orale Verabreichung die bevorzugte Applikationsart dar, folglich ist die orale Bioverfügbarkeit der Wirkstoffe für den Therapieerfolg von großer Bedeutung. Eine Vielzahl der neuen Arzneistoffe ist lipophil und schlecht wasserlöslich, somit weisen sie oft schlechte Voraussetzungen für die orale Therapie auf. Gleichermaßen können intestinaler Metabolismus und Efflux-Transporter die systemische Verfügbarkeit von Arzneistoffen vermindern. Nichtionische Tenside beeinflussen die orale Bioverfügbarkeit von Arzneistoffen auf unterschiedliche Weise. Lange Zeit herrschte die Annahme, dass Hilfsstoffe wie Tenside pharmakologisch inert sind, und sie wurden hauptsächlich in klassisch technologischem Sinn als Solubilisatoren eingesetzt. Diese Annahme ist widerlegt, jedoch sind derzeit nur wenige Studien publiziert, in denen die Stabilität von nichtionischen Tensiden im Gastrointestinaltrakt oder Interaktionen mit Enzymen untersucht wurde. Ein Ziel dieser Arbeit war es, pharmazeutisch genutzte nichtionische Tenside unterschiedlicher Struktur hinsichtlich ihrer Stabilität unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Ausgewählt wurden die ethoxylierten Verbindungen Polysorbat 80 und D-α-Tocopherol Polyethylenglykol (1000) Succinat (TPGS) sowie der Saccharosefettsäureester Surfhope® SE D 1216 (Saccharoselaurat). Kapitel 1 und 2 beschreiben die Entwicklung analytischer Methoden für diese sehr heterogen zusammengesetzten Verbindungen, die auf chromatographischer Trennung mittels HPLC (High Performance Liquid Chromatography) und Detektion mit einem Charged Aerosol-Detektor (CAD), massenselektiven Detektor (MSD) und UV-Detektor basieren. Die Inkubation von Polysorbat 80 und TPGS in HCl-Lösung (pH 1,0) bei 37°C, wodurch die physiologischen Bedingungen im Magen dargestellt werden sollten, ergab einen geringfügigen Abbau von 9,5% (± 3,0%) bzw. 3,4% (± 0,4%) innerhalb von 8 h. Saccharoselaurat unterlag einem Abbau von über 50% innerhalb von 8 h, während sich alle drei Verbindungen in Wasser stabil zeigten. In den letzten Jahren erlangten neue Technologien, die schlecht wasserlösliche Wirkstoffe oral verfügbar machen sollen, immer mehr an Bedeutung. Umfassende Entwicklungsarbeit kommt dabei selbst-emulgierenden Lipidsystemen zu. SEDDS (Self-emulsifying Drug Delivery Systems) enthalten mitunter große Mengen an nichtionischen Tensiden. Da der Erfolg dieser Formulierungen maßgeblich vom Ausmaß des Triglyceridabbaus sowie Entstehung und Art der Abbauprodukte abhängt, wurde ein Einfluss durch diese amphiphilen Verbindungen getestet. In Kapitel 3 wird die inhibitorische Wirkung von nichtionischen Tensiden auf den Triglyceridabbau durch die Pankreaslipase untersucht. Als weitere Tenside wurden die Macrogolglycerolfettsäureester Cremophor® EL und Cremophor® RH 40 hinzugezogen. Alle Verbindugen hemmen den Triglyceridabbau konzentrationsabhängig bereits unterhalb der kritischen Mizellbildungskonzentration. Weiterhin wurde die Stabilität der Tenside selbst gegenüber Pankreasenzymen getestet, da ein Abbau ebenfalls die Solubilisierungskapazität der gastrointestinalen Flüssigkeit vermindern kann. Die Fettsäureester von Polysorbat 80 sind zu 14,0% (± 1,0%) hydrolysiert worden. Im Fall von Cremophor EL wurden 14,4% (± 3,3%) hydrolysiert, während sie bei Cremophor RH 40 zu einem geringeren Anteil von 6,1% (± 2,8%) abgebaut wurden. TPGS und Saccharoselaurat zeigten sich stabil gegenüber Pankreasenzymen. Gegenstand neuester Forschung ist ferner die Möglichkeit der Beeinflussung intestinaler arzneistoffmetabolisierender Enzyme durch nichtionische Tenside. In Kapitel 4 werden Wechselwirkungen mit dem Arzneistoffmetabolismus durch die Cytochrom P450 Isoenzyme CYP 3A4 und CYP 2C9, die beim intestinalen Metabolismus die bedeutendste Rolle spielen, untersucht. Bei allen Tensiden konnte eine konzentrationsabhängige Inhibition hinsichtlich des Metabolismus eines Modellsubstrats bereits unterhalb der kritischen Mizellbildungskonzentration festgestellt werden. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgern, dass das Kriterium der pharmakologischen Indifferenz von Hilfsstoffen in vielen Fällen nicht gegeben ist. Des Weiteren verdeutlichen sie die Notwendigkeit, im Rahmen der Entwicklung von komplex zusammengesetzten Formulierungen zunächst eine Untersuchung und quantitative Bewertung des Stabilitätsverhaltens durchzuführen. Insbesondere bei selbst-emulgierenden Lipidsystemen muss berücksichtigt werden, dass sowohl der Abbau der Tenside als auch die inhibitorische Aktivität dieser gegenüber der triglyceridabbauenden Pankreaslipase maßgeblichen Einfluss auf die Arzneistoffsolubilisierung haben. Die Fähigkeit, intestinale CYP450 Enzymen zu inhibieren, eröffnet die Möglichkeit, diese nichtionenschen Tenside zur gezielten Metabolismushemmung einzusetzen. Dadurch kann die Bioverfügbarkeit von „Problemarzneistoffen“, sofern sie Substrate dieser Enzyme darstellen, erhöht werden.
The poor aqueous solubility of many drug substances has been addressed using different solubility enhancement approaches in the pharmaceutical technology field over the last decades. In this context, advanced drug delivery systems based on lipids referred to as SNEDDS were used to overcome solubility limitations of drugs, that are often associated with a low bioavailability after oral administration. There are numerous examples in the literature for the development of L-SNEDDS, which have led to some pharmaceutical products available on the market. As L-SNEDDS development using conventional methods requires a lot of time and experimental effort, a streamlining of this procedure was aimed in the first part of the presented work.
Starting with the development of L-SNEDDS formulations for solubility enhancement of poorly-water soluble drugs, extensive solubility studies with different BCS Class II drugs were performed in various excipients to determine drugs with high solubilities in these excipients as well as to evaluate multiple excipients for their suitability to be used in L-SNEDDS formulations. Celecoxib, efavirenz and fenofibrate were selected as model drugs and a pre-selection of excipients for further development was made. In a next step, a novel screening approach for L-SNEDDS formulation development based on a customized mapping method in a special triangular mixture design was established. This customized tool for L-SNEDDS development comprised the systematic analysis of results obtained with different in vitro characterization methods such as droplet size analysis and distribution, transmittance measurement and emulsification performance assessment. Furthermore, the novel approach streamlined the procedure for L-SNEDDS development as a reduction of experimental effort and time compared to conventional methods was achieved. The most promising L-SNEDDS formulations determined via the customized screening tool approach showed high drug release of celecoxib, efavirenz as well as fenofibrate, and clearly indicated that this method was suitable for efficiently designing stable and rapidly releasing L-SNEDDS formulations incorporating poorly water-soluble drugs.
After the successful development of L-SNEDDS formulations with different drug substances using the novel screening approach, a further aspect of this work dealt with conversion of L-SNEDDS into S-SNEDDS, since a limited storage stability has been reported for many L-SNEDDS formulations. The conversion into S-SNEDDS required the determination of appropriate solid carriers with different material properties depending on the manufacturing process. As a first technological approach, adsorption to a solid carrier was investigated by adding a carrier to drug-loaded L-SNEDDS applying a defined mixing ratio resulting in a solid, particulate formulation. When performing drug release studies, S-SNEDDS based on different commercial
carrier materials revealed major limitations due to incomplete drug release. Thus, a tailor-made microparticulate carrier material based on cellulose was developed for the purpose of adsorbing L-SNEDDS and presented with superior performance compared to conventional adsorbents based on cellulose or silica. Based on the obtained results, this novel cellulose-based microparticle prepared with gum arabic as a binder was determined to be the most promising material amongst all adsorptive carriers that were investigated.
In addition to the technology approach of adsorption, another manufacturing process was considered in the course of the present work, which focused on the preparation of S-SNEDDS by means of HME. As a successful conversion of L-SNEDDS into S-SNEDDS using HME processing requires at least one additional polymeric component, a selection of marketed (co-)polymers that were frequently used in the field of solubility enhancement were evaluated for their suitability in this context. Critical process parameters and target properties of the (co-)polymers were determined, ultimately leading to the idea of developing a novel, customized polymer in order to perform the conversion step via HME in a more suitable and effective manner. In this context, a new copolymer referred to as ModE, as it disclosed a structural association with the commercially available copolymer EUDRAGIT® E PO, was developed. The novel copolymer ModE was evaluated for its suitability for different formulation technologies and showed promising results when used for S-SNEDDS and ASD formulations prepared by the HME process. Different variants of ModE in terms of Mw, Tg and PDI were synthesized via radical polymerization and it was found that the modification of Mw, Tg and PDI of the novel aminomethacrylate-based copolymer had significant effects on drug release as well as storage stability of S-SNEDDS and ASDs. The ModE copolymer type with a Mw of 173 kDa turned out to be the most suitable candidate for S-SNEDDS development using HME technology. In addition, drug-loaded S-SNEDDS based on the ModE variant 173 kDa were storage stable and presented with the highest drug release among all S-SNEDDS formulations tested.
In conclusion, a novel screening tool approach for efficient L-SNEDDS development was established in order to streamline the process for obtaining stable and rapidly releasing L-SNEDDS formulations which improved the solubility of poorly water-soluble drugs. Apart from the L-SNEDDS development process, the conversion from L-SNEDDS into S-SNEDDS was successfully performed using the technology approaches of adsorption to a solid carrier and HME processing. An improved storage stability compared to L-SNEDDS as well as high drug release were achieved for several S-SNEDDS formulations, especially for those prepared with tailor-made materials. Based on the results obtained for S-SNEDDS formulations produced via adsorption, especially in terms of drug release performance, the new cellulose-based
microparticle carriers (M-GA and M-MC) turned out to be the most suitable materials. S-SNEDDS that were manufactured via HME presented with a superior performance regardless of the incorporated drug when comparing the results of S-SNEDDS with those of the corresponding ASDs regarding drug release performance, amorphicity/crystallinity and storage stability. In this context, among all S-SNEDDS formulations prepared via HME, S-SNEDDS based on the ModE variant 173 kDa showed the best results, especially when using the drug substances celecoxib and efavirenz. Although the S-SNEDDS formulation approach is still largely unexplored, based on the research results generated in the present work, it represents a promising technology platform that should definitely be further developed in future experiments.
Viele Arzneistoffe haben eine sehr geringe orale Bioverfügbarkeit. Ein Lösungsansatz ist die Formulierung dieser Arzneistoffe mukoadhäsiven Darreichungsformen wie zum Beispiel Wafern. Diese können unter anderem auf vaginalen als auch auf intestinalen Schleimhäuten appliziert werden. Allerdings ist eine Herausforderung die Gewährleistung des vollständigen Schleimhautkontaktes nach der Applikation. Eine mögliche Lösung ist die Kombination von Wafern mit expandierbaren Systemen. Dafür müssen die Wafer jedoch bestimmte Anforderungen erfüllen. Sie müssen dünn und flexibel sein und außerdem durch einen unidirektionalen Wirkstofftransport gekennzeichnet sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ein- und zweischichtige Wafer hergestellt mittels Casting Solvent Technik. Die hergestellten Wafer wurden charakterisiert bezüglich ihrer äußeren Erscheinung, mechanischen Eigenschaften, Zerfallszeit und Wirkstofffreisetzung. Außerdem wurde bestimmt welche Faktoren einen Einfluss auf die Wirkstoffübertragung vom Wafer auf eine simulierte Schleimhaut haben und ob die ausgewählten Wafer die Fähigkeit zum unidirektionalen Wirkstofftransport aufweisen. Weiterhin wurde die Wirkstoffpermeation durch Schweinedünndarm nach Appplikation eines zweischichtigen Wafers und einer Referenzdarreichungsform untersucht sowie eine Stabilitätsstudie und eine Proof of Principle Studie durchgeführt. Die finale Waferformulierung war ein zweischichtiger Wafer bestehend aus einem wasserunlöslichen Backing Layer und einer wirkstoffhaltigen, mukoadhäsiven Schicht. Der Backing Layer bestand aus Ethylcellulose (500 µg/cm²) und die mukoadhäsive Schicht wurde hergestellt aus einer Mischung aus Hydroxypropylmethylcellulose, Polyvinylalkohol und Polyethylenglykol 400 im Verhältnis 1:2:4.
Acute pancreatitis is a common clinical inflammatory disease with variable severity from mild, self-limiting attacks to a severe lethal attack with a high mortality. In most of the cases, acute pancreatitis is either caused by gallstone obstruction or excessive alcohol consumption. Clinical symptoms include elevated levels (minimum 3 times than normal) of pancreatic enzymes such as amylase or lipase in serum. It is generally believed that earliest event in acute pancreatitis occur in acinar cells which includes premature protease activation and cytoplasmic vacuole formation. Premature trypsinogen activation has been considered as chief culprit as it can activate other proteases in a cascade like manner in acinar cells. Trypsin activity takes place in a biphasic curve with elevated levels at 1 h and 8 h in the initial stages up to 24 h in caerulein induced pancreatitis in mice. It has been shown that cytoplasmic vacuoles observed in pancreatitis are of autophagic nature. The role of autophagy for the disease onset and its role in trypsinogen is much of a debate. Hence, we studied the relation between autophagosome formation and trypsinogen activation in first 12h of pancreatitis. Although autophagosomes were found to be co-localised with trypsin in vivo, this was found to be a late event occuring only by 4 h. Substrate specific trypsin activity and western blotting from both sub-cellular fractions over the time course of pancreatitis and multiple fractions prepared from 1 h caerulein induced pancreatic tissue revealed that trypsin activity observed at 1 h occured in a zymogen enriched fraction. In line simultaneous confocal imaging of trypsin activity and autophagosome formation in hyperstimulated acini isolated from GFP-LC3 mice showed that both processes are independent and take place in parallel. Furthermore, protease inhibition by gabexate mesilate did not prevent autophagosome formation indicating that trypsinogen activation is not a prerequisite for vacuole formation. Even though, autophagosomes and active trypsin were found to be co-localised around 30 minutes to some degree upon cholecystokinin hyperstimulation, the earliest trypsin activation started to appear by 15 minutes and was independent of autophagosomes. The earliest active trypsin was found to be co-localised along with the cis-Golgi complex suggesting that the Golgi apparatus and its pre-condensed zymogen granules are the compartment responsible for the trypsinogen activation. 2) Protease activation in pancreatic acinar cells considered as the early hallmark event in the acute pancreatitis. However, the disease is aggravated by the infiltration of the leukocytes. Activated proteases mediate acinar cell injury and hereby cause the release of chemokines, which in turn attract inflammatory cells. Transmigrated inflammatory cells cause systemic damage that deteriorates the condition of the disease. Neutrophil elastase has been reported to be involved in the dissociation of cell-cell contact at adherens junctions by the extracellular cleavage of E-cadherin. This subsequently leads to transmigration of leukocytes into the epithelial tissue during the initial phase of experimental pancreatitis and aggravates the disease condition. On the other hand, pancreatic elastase substantially contributes to acinar cell necrosis. In this study, ZD0892, an orally bioavailable dual inhibitor against both elastases was tested for its efficacy to ameliorate severity in acute pancreatitis. ZD0892 orally fed mice showed increased survival compared to the control group in the taurocholate model of severe pancreatitis. In the initial stages of pancreatitis up to 24 h, the severity markers were found to be significantly lower in the inhibitor treated group. Treatment of mice with ZD0892 did not impede the defensive property of the leukocytes such as phagocytosis or oxidative burst. In caerulein induced pancreatitis, a mild form of acute pancreatitis, in rats, the local damage measured as serum amylase and lipase, wet dry ratio, and pancreatic myeloperoxidase levels were significantly lower in the inhibitor group. Systemic inflammatory parameters such as myeloperoxidase activity in lung was found to be significantly lower in the inhibitor fed rats. Inhibitor feeding resulted in lesser elastolytic activity compared to control group indicating that extracellular matrix was less damaged. Prophylactic treatment of pancreatitis with an orally available inhibitor with a dual specificity against pancreatic elastase and PMN-elastase was shown to ameliorate both local and systemic damage. Hence, in overall, ZD0892 treatment is proved to be beneficial to the mice and rats in experimental pancreatitis and should be considered for treatment in humans as the substance has been already studied in phase I and II trails for other indications.
Die Wirksamkeit und Sicherheit einer Arzneitherapie wird durch zahlreiche pharmakokinetische Prozesse beeinflusst. Neben den durch CYP-450-Enzym vermittelten Biotransformationsvorgängen sind zunehmend Transportprozesse durch Arzneimitteltransporter aus der ABC- sowie SLC-Familie in den Fokus getreten, welche unter anderem in den Membranen der Enterozyten, aber auch in weiteren Organen exprimiert sind. Die Expression und Funktion der Arzneimitteltransporter kann beispielsweise durch Arzneistoffe beeinflusst werden und somit in Arzneimittelwechselwirkungen resultieren. Dass diese Regulationsmechanismen eine hohe Komplexität aufweisen, ist aus einer Vielzahl von klinischen Interaktionsstudien ersichtlich. In diesen führte die Applikation von bekannten Induktoren des Arzneistoffmetabolismus und -transports zu organspezifischen Veränderungen in der Pharmakokinetik der gleichzeitig verabreichten Arzneistoffe.
Ziel dieser Arbeit war es, zu einem besseren Verständnis der Expression und Regulation intestinaler Arzneimitteltransporter beizutragen, um somit Auswirkungen auf die Pharmakokinetik besser vorhersagen zu können. Dies beinhaltete zum einen die Mitarbeit an der Entwicklung und Validierung einer LC-MS/MS-basierten Methode zur Proteinquantifizierung, mit welcher auch in limitierten Gewebemengen die am stärksten exprimierten Membrantransporter ABCB1 (P-gp), ABCC2 (MRP2), ABCG2 (BCRP) und SLC15A1 (PEPT1) quantifiziert werden konnten. Parallel dazu wurden die Prozesse zur mRNA-Isolierung und -Quantifizierung optimiert.
In der präklinischen Forschung wird weitverbreitet das Caco-2-Zellmodell zur Prädiktion der intestinalen Absorption genutzt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte das Caco-2-Zellmodell dahingehend untersucht werden, ob es ein geeignetes Modell zur Prädiktion der intestinalen Absorption darstellt, auch in Bezug auf Induktionsvorgänge. In bereits publizierten Arbeiten wurde häufig eine gute Korrelation des Transporterexpressionsmusters auf mRNA-Ebene zwischen Caco-2 und Jejunum gezeigt. Die vorliegenden vergleichenden Ergebnisse zur mRNA- und Proteinexpression von Arzneimitteltransportern zeigten, dass sowohl im Zellmodell als auch im jejunalen Gewebe in Teilen deutliche Diskrepanzen zwischen mRNA und Transporterexpression bestehen. Auf der für die Funktion der Arzneimitteltransporter relevanten Proteinebene zeigten sich für ABCB1, ABCC2 und ABCG2 relativ gute Übereinstimmungen, während die Proteinexpression anderer Transporter, insbesondere OATP2B1, im Zellmodell deutlich abwich. Dies verdeutlicht, dass insgesamt Vorsicht geboten ist in der Prädiktion der intestinalen Absorption mittels Caco-2-Zellmodell, da zudem bereits auf mRNA-Ebene gezeigt worden ist, dass die Expression der Transporter sowohl von dem Zellklon als auch von den Kulturbedingungen anhängig ist. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Expression der Transporter in dem Zellmodell sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene zeitlich variabel ist. Somit empfiehlt sich ein noch vorsichtiger Umgang mit Daten zur intestinalen Absorption, welche auf Basis eines Caco-2-Modells mit verkürzter Kultivierungszeit erhoben worden sind. Induktionsprozesse konnten weder auf Ebene der mRNA-Expression oder des Proteingehaltes noch auf Ebene der Funktion in dem Caco-2-Zellmodell durch Inkubation mit prototypischen Induktoren des Arzneistoffwechsels (Carbamazepin, Efavirenz, Johanniskrautextrakt, Rifampicin) simuliert werden.
Weiterhin wurde die Induktion von intestinalen Arzneimitteltransportern in vivo untersucht. Chronische Gabe von Rifampicin führte zu einem Anstieg von ABCB1 und ABCC2 auf mRNA Ebene, welches nur im Fall von ABCB1 (P-gp) auf Proteinebene umgesetzt wurde. Die chronische Applikation von Carbamazepin resultierte ausschließlich in einer Induktion auf mRNA Ebene. Im Vergleich zu Rifampicin war diese jedoch auch geringer ausgeprägt. Der PXR-Ligand Rifampicin kann aufgrund einer hohen intestinalen PXR-Expression eine stärkere Induktion hervorrufen als Carbamazepin, welches präferentiell den nukleären Rezeptor CAR aktiviert. Begünstigt wird dies darüber hinaus dadurch, dass Rifampicin, nicht aber Carbamazepin, einem enterohepatischen Kreislauf unterliegt und Rifampicin somit über einen längeren Zeitraum im Intestinum in einer Konzentration vorliegt, welche notwendig ist, um eine Aktivierung der nukleären Rezeptoren zu erreichen. Regulationsvorgänge durch miRNAs können dafür verantwortlich sein, dass eine erhöhte Expression der mRNA nicht parallel mit einem Anstieg des Proteingehaltes einhergeht. Durch Korrelationsanalysen, in silico-Prädiktion sowie Untersuchungen mittels Reportergen-Assays konnten in der vorliegenden in vivo-Studie drei Interaktionen zwischen miRNAs und mRNAs (ABCB1 - miR-485-3p; ABCC2 - miR-26a-5p; ABCG2 - miR-577) identifiziert werden, welche potentiell den Translationsprozess verhindert bzw. abgeschwächt haben. Korrelationsanalysen mit bereits zuvor erhobenen Daten zur Pharmakokinetik der applizierten probe drugs deuten darauf hin, dass die systemische Verfügbarkeit von Ezetimib und dessen Glukuronid durch intestinales ABCB1 (P-gp), nicht jedoch wie zuvor angenommen durch intestinales ABCC2 (MRP2) beeinflusst wird. Insgesamt konnten nach chronischer Gabe von Rifampicin Korrelationen entlang der Signalkaskade ausgehend von der mRNA-Expression von PXR, über die mRNA Expression von ABCB1, unter Berücksichtigung der Expression der miRNA 485-3p bis hin zum Gehalt und der Funktion von ABCB1 (P-gp) gezeigt werden. Veränderungen des Plasmaspiegels von Talinolol nach chronischer Gabe von Carbamazepin sind hingegen nicht auf Induktionsvorgänge intestinaler Transportprozesse zurückzuführen. Die Ursachen dafür sind u.a. in der Erhöhung der renalen Clearance zu suchen. Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass nukleäre Rezeptoren, miRNAs und die pharmakokinetischen Eigenschaften der Induktoren selbst maßgeblich an der differenziellen Regulation von Transportprozessen beteiligt sind.
Das aus antarktischem Meereis stammende und auch bei geringen Temperaturen schnell wachsende γ Proteobakterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 (PhTAC125) ist ein Modellorganismus für kälteangepasste Bakterien und Enzyme. Zusätzlich ist es ein alternativer Expressionswirt für die lösliche Überproduktion von heterologen Proteinen, die in etablierten Expressionswirten zur Bildung von inclusion bodies neigen. Bisher sind bei PhTAC125 im Rahmen der Erforschung von Kälteanpassungsmechanismen bzw. der Optimierung des kälteangepassten Expressionssystems nur Teilaspekte der Physiologie, des Stoffwechsels und der Bioprozessoptimierung untersucht worden. Bis zum Beginn dieser Dissertation gab es kaum Experimente, die sich mit der dynamischen und nahezu ganzheitlichen Betrachtung der Veränderung zellulärer Zustände und des Stoffwechsels von PhTAC125 beschäftigt haben. Darüber hinaus sind trotz der Fortschritte bei der Etablierung von PhTAC125 als alternativer Expressionswirt die bisher erzielten Biomassekonzentrationen gering. Aus diesem Grund wurden in dieser Dissertation zur Untersuchung des Stoffwechsels die exponentielle Wachstumsphase sowie vergleichende Untersuchungen verschiedener Wachstumsphasen und zellulärer Kompartimente auf Basis der Proteomanalytik durchgeführt. Zusätzlich konnte mit Hilfe der Fed-Batch-Kultivierungstechnik die Biomassekonzentration im Vergleich zu den herkömmlichen Methoden deutlich gesteigert werden. Zur Untersuchung der Physiologie und des Stoffwechsels von PhTAC125 während des exponentiellen Wachstums wurde das Proteom analysiert. Neben den typischen stark exprimierten Kategorien der exponentiellen Wachstumsphase wie Protein- u. Nukleotidbiosynthese, Aminosäure- u. Kohlenstoffmetabolismus, stellten sich vor allem die Proteine des TonB abhängigen Transportsystems (TBDT), sowie der Kategorien Entgiftung und Coenzyme für PhTAC125 als wichtig heraus. Das TBDT ist wegen seiner hohen Abundanz im Proteom und seiner potentiellen Beteiligung am Transport von Proteinabbauprodukten für PhTAC125 ähnlich bedeutend wie die anderen Kategorien mit einer hohen Anzahl stark exprimierter Proteine. Auch die Proteine zum Schutz vor ROS (reactive oxygen species) und die der Biosynthesewege der Coenzyme sind besondere und bedeutende Merkmale von PhTAC125. Der ROS Schutz ist bei kälteangepassten Bakterien während des Wachstums bei geringen Temperaturen (≤ 20°C) mit erhöhter Sauerstofflöslichkeit und der damit verbundenen verstärkten ROS-Bildung essentiell. Die Verfügbarkeit der meisten Biosynthesewege der Coenzyme im Proteom von PhTAC125 ist ein besonderes Charakteristikum gegenüber vielen anderen Wasser- und Bodenmikroorganismen und kennzeichnet einen potentiellen Wachstumsvorteil. Zur vergleichenden Untersuchung der unterschiedlichen zellulären Kompartimente von PhTAC125 wurden 2D-Gelbilder des Cyto- und Periplasmas erstellt und gegenübergestellt. Das periplasmatische Kompartiment war wesentlich durch Signalpeptid-haltige Proteine des TBDT, Porine und periplasmatische Peptidasen und Chaperone charakterisiert. Die Untersuchung der Proteomsignaturen unter Nährstofflimitationsbedingungen basierte auf dem Vergleich der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase mit der exponentiellen Wachstumsphase. Beide Wachstumsphasen waren durch Kategorien mit hoher Anzahl an gering exprimierten Proteinen dominiert. Dabei handelte es sich vor allem um die Kategorien der Nukleotid-, Protein- und RNS-Biosynthese. Diese potentiell reprimierten Kategorien der späten exponentiellen und stationären Wachstumsphase waren in Verbindung mit der Limitation der meisten Aminosäuren ein deutlicher Hinweis auf die stringent response. In diesem Zusammenhang schienen die stärker exprimierten Proteine (TBDT, Porine, Peptidasen/Protease und PilQ) positiv durch die stringent response eguliert zu sein, um das Überleben unter Nährstofflimitationbedingungen zu garantieren. Bei der Bioprozessoptimierung zur Steigerung der Biomassekonzentration von PhTAC125 wurden zwei verschiedene FB-Strategien durchgeführt. Bei der ersten Strategie wurde eine komplexe Aminosäurequelle (Casamino Acids) als Substrat eingesetzt und über konstante oder exponentielle Substratzufütterungsprofile eine optische Dichte (OD) von 30 erreicht. Im Vergleich zu den bisherigen in der Literatur beschriebenen Bioprozessen von PhTAC125 wurde die finale Biomassekonzentration 3 fach erhöht. Bei der zweiten FB-Strategie wurde ein „definierteres“ Substrat bestehend aus Glycerol und Glutamat für die Fütterungslösung eingesetzt. Mit einer anfänglichen exponentiellen gefolgt von einer konstanten Fütterungsrate konnte die Biomassekonzentration (OD = 86) gegenüber den veröffentlichen Ergebnissen 8 fach gesteigert werden. Zusammenfassend konnten erste proteombasierte Aussagen zur Physiologie und zum Stoffwechsel von PhTAC125 getroffen und erste Bioprozessstrategien zur gezielten Biomassesteigerung entwickelt werden.
Proteom- und Transkriptom-Analysen zur Bestimmung der Immuntoxizität ausgewählter Naturstoffe
(2017)
Der Einsatz von Tierversuchen in Forschung und Entwicklung nimmt trotz fortschreitender Optimierung von Testmethoden und –verfahren weiter zu. Zeitgleich werden fortwährend neue Substanzen isoliert oder synthetisiert, deren Wirkungen auf den humanen Organismus und speziell das Immunsystem nicht bekannt sind. In vitro Methoden stellen deshalb sowohl eine günstige und schnelle als auch eine ethisch unbedenkliche Alternative zu Tierversuchen dar. In der vorliegenden Arbeit sollten proteom- und transkriptombasierte Methoden dazu dienen, immuntoxische Eigenschaften von Naturstoffen zu identifizieren und diese Verfahren als Alternative zu Tierversuchen zu etablieren. Dazu wurden zwei humane Immunzelllinien mit Naturstoffen behandelt und das intrazelluläre Proteom sowie das Transkriptom spezifischer Biomarker-Gene analysiert. Zusätzlich dienten weitere Methoden wie Metaboliten-, Zellzyklus- und Apoptoseanalysen sowie die Identifizierung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies dazu, Ergebnisse zu verifizieren oder zusätzliche Informationen zu erhalten. Wie zu erwarten war, zeigten die Proteomanalysen, dass sowohl immuntoxische als auch nicht-immuntoxische Substanzen eine breite Wirkung auf das intrazelluläre Proteom haben. Vor allem Proteine, die in den allgemeinen Metabolismus, zelluläre Prozesse und Prozesse der Informationsverarbeitung involviert sind, wurden durch die Behandlung mit den Substanzen in ihrer relativen Menge auf den 2D-Gelen verändert. Allein durch die Zuordnung von Proteinen zu Stoffwechselwegen war eine Abgrenzung immuntoxischer und nicht immuntoxischer Substanzen nicht möglich. Dennoch gibt die Methode einen Einblick in die Wirkungsweise der Substanzen, wodurch Wirkmechanismen entschlüsselt und Reaktionen auf das Immunsystem abgeleitet werden können. Dies wird vor allem nach der Behandlung der Zellen mit Tulipalin A und Helenalin deutlich, da auch allgemeine Stoffwechselwege wie die Purinsynthese und die anaerobe Glykolyse einen Einfluss auf das Immunsystem haben. Zusätzlich zu den allgemeinen Stoffwechselwegen wurden einzelne Proteine in ihrer Abundanz verändert, die in Reaktionen des Immunsystems wie der Zytokinbildung oder der Bildung von MHC-Molekülen involviert sind. Außerdem konnten Biomarker für Immuntoxizität auf Proteomebene entwickelt werden. Mit Hilfe dieser Daten war eine Klassifizierung der Substanzen nach ihrer Immuntoxizität möglich. Anhand dieser Analysen wurden die Testsubstanzen Tulipalin A, Helenalin, Vincristin und Cannabidiol als immuntoxisch klassifiziert. Die Klassifizierung der Substanzen als immuntoxisch aufgrund der Biomarker-Proteine und Stoffwechselwege konnte durch die Anwendung von Transkriptom-Biomarkern bestätigt werden. Neben den über 2D-Gelelektrophorese-basierten Proteomanalysen getesteten Substanzen wurden auch Bisphenol A und Ergosterolperoxid aufgrund der Transkriptombiomarker als immuntoxisch klassifiziert. Agaritin und p-Tolylhydrazin sowie der Bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether haben keine immuntoxische Wirkung. Neben den Proteom-basierten Methoden dient der entwickelte Entscheidungsbaum basierend auf verschiedenen Methoden als Grundlage für die Immuntoxiztätsklassifizierung. Mit dem erstellten Entscheidungsbaum konnten beispielsweise Cyclosporin A, Helenalin und Tulipalin A durch die Anwendung gezielter Tests als immuntoxisch eingestuft werden, während Mannitol als nicht-immuntoxisch bestätigt wurde. Zusammenfassend war es mittels in vitro Methoden möglich, die Immuntoxizität verschiedener Naturstoffe zu identifizieren. Neben Proteom-basierten Methoden wurden auch Transkriptom- sowie funktionelle und Metabolomanalysen genutzt. Eine Validierung der Ergebnisse mit weiteren bekannten immuntoxischen und nicht-immuntoxischen Substanzen würde eine Anwendung als Alternative zu Tierversuchen für eine erstes Screening Testung neuer Substanzen ermöglichen und so sowohl Zeit und Kosten sparen als auch ethische Bedenken minimieren.
Polysaccharide is a major constituent of the total organic carbon that is generated by photosynthetic eukaryotes. In the marine realm, where approximately half of annual global carbon fixation occurs, algae can produce large amounts of polysaccharide during bloom events. Phytoplankton blooms are frequently seasonal phenomena, and spring blooms in particular have been a focus of study as they are predictable in space and time. This makes them much more amenable model systems in which to explore the processes that occur as organic carbon is recycled.
It is assumed that the bulk of the polysaccharides algae produce serve one of two primary functions - namely acting as an energy storage molecule, or they serve as structural polymers in the cell walls. Other polysaccharides may also have protective functions as exudates. Regardless of function in algae, the polysaccharides are a valuable energy source for heterotrophic bacteria. The combination of abundance and predictable or semi-predictable structure of the polysaccharides has led to proliferation of variations on a particular sequestration and degradation strategy among the Bacteroidetes and Gammaproteobacteria that is frequently characterised as being ‘selfish’. The strategy is based on uptake of poly- and especially oligosaccharides into the periplasm via the use of TonB-dependent transporters. Once in the periplasmic space, oligomers can be further degraded to monomers that can then be transported into the cytosol. This mechanism is beneficial to the cell as it needn’t then lose the nutritive benefit of the polysaccharide to other cells, which may or may not have manufactured their own degradative carbohydrate active enzymes (CAZymes).
The research articles that make up this thesis are thus based around attempts to find and elucidate the polysaccharide preferences of heterotrophic bacteria that become abundant following phytoplankton blooms.The first article is a study into the abundance of TonB-dependent transporter proteins in metaproteomes and metagenomes across a single spring phytoplankton bloom at the long term research station at Helgoland. This investigation identifies transporters for laminarin and alpha-glucans, the two most abundant glucose-based storage polysaccharides, are the most abundant predicted polysaccharide transporting TonB-dependent transporters during the bloom. However, as the bloom progressed, and particularly following a doubling of bacterial cell numbers, the proportion of predicted polysaccharide transporters dedicated to laminarin and alpha-glucan transport declined relative to transporters for less readily degraded mannose-, xylose-, and fucose-containing polysaccharides. The inference is that this change is an active response to the availability of the different polysaccharides, or their relative attractiveness as growth substrates during the period.
The second article is an in-depth look at one of the most abundant Bacteroidetes clades, which was previously unnamed, and has not to date been cultivated. The most abundant species in this clade grows rapidly and often peaks earlier than other heterotrophic clades. It was found to be limited in predicted polysaccharide consumption capability, having only PULs for predicted laminarin degradation. It is also detectable in many locations at higher latitudes where phytoplankton blooms are expected to occur, indicating this is a globally successful consumer of algal organic matter, and may have an outsize significance for global laminarin degradation given its high abundance.
The third article is a more holistic study of phytoplankton bloom associated Gammaproteobacteria, which have otherwise been rather ignored compared to the Bacteroidetes. Gammaproteobacteria overlap with Bacteroidetes to some extent in being clear consumers of laminarin, but fewer of them are clearly capable of consuming the more complex cell-wall derived polysaccharides. Some may, however, be producers of alginate, an otherwise mysteriously popular polysaccharide with Bacteroidetes, given that it is not known to be produced by bloom forming microalgae.
The fourth article then goes into detail on the PUL content of Bacteroidetes, based on metagenomic data. It finds five substrates, alpha- and beta-glucans, xylose and mannose rich polysaccharides, and alginate, are the most frequent predicted polysaccharide substrates for Bacteroidetes PULs among populations responding to the Helgoland spring blooms.
This thesis thus summarises multiple metagenomic and metaproteomic investigations into the polysaccharide consumption capabilities of marine heterotrophic bacteria. These bacteria have a profound impact on the overall carbon cycle in coastal regions, and are critical for understanding how changes in atmospheric carbon concentrations impact carbon turnover and storage in the world's oceans.
Profiling the activity and hepatotoxicity of flupirtine through medicinal chemistry approaches
(2019)
Drug induced liver injury (DILI) and tissue discoloration led to the recent discontinuation of the therapeutic use of the closely related drugs flupirtine and retigabine, respectively. Experience gained with these drugs strongly suggests that heterodimer, voltage‐gated potassium channels 2 and 3 (KV2/3) are valid targets for effective treatment of pain and epilepsy. Because the adverse effects are not related to the mechanism of action, it appears promising to investigate chemical modifications of these clinically validated, drug‐like leads. In the present retro metabolic drug design study, a series of 44 compounds were
synthesized and characterized with regards to KV7.2/3 opening activity and efficacy. The most active compounds displays excellent potency (EC50 = 4 nM) and efficacy (154%) as an Kv7.2/3 opener. Limited aqeous solubility hampered toxicity testing at concentrations higher than 63 μM, but this concentration was nontoxic to two hepatocellular cell ilnes (HEP‐G2 and TAMH) in culture.
Pharmaceutical residues are found in increasing concentrations in the environment and in potable water where they have verifiable effects on aquatic life. Conventional methods for water treatment are not able to sufficiently abate these generally stable compounds. It was found that physical plasma generated directly in water can degrade several of these recalcitrant organic pollutants. Studies on the basic plasma chemical processes for the model system of phenol showed that the degradation is primarily caused by hydroxyl radicals. This was confirmed by reaction chemistry and spin trap enhanced electron paramagnetic resonance spectroscopy (EPR). The degradation of diclofenac and its by-products were investigated in detail to perform a first risk-assessment of the new technology. Findings are not limited to the application of plasma but applicable to other advanced oxidation processes (AOP) that are based on the generation of hydroxyl radicals as well. Additionally, pulsed corona plasma and pulsed electric fields were assessed for their capacity to kill Legionella pneumophila in water. Whereas it was possible to kill L. Pneumophila with both methods, plasma treatment resulted in an enhanced bacterial killing. Therefore, advanced oxidation processes (AOP) and plasma treatment in particular are some of the few feasible approaches to decompose recalcitrant compounds in water.
Marine bacteria represent the most diverse organisms in the marine environment. The majority of these microbes is unknown and unculturable. Algae represent the main nutrient source for bacteria. Macro- and microalgae can consist to 70% of polysaccharides. The metabolic degradation of marine polysaccharides is underexplored and thus these mechanisms have to be investigated. These mechanisms are of high importance to generate defined oligosaccharides for the medical and pharmaceutical applications. The specific structure of marine poly- and oligosaccharides show antiviral activities, e.g. carrageenans from red algae are used for the inhibition of human papillomavirus. Another alginate derived marine polysaccharide show inhibition of the replication of the human immunodeficiency virus (HIV). The degradation mechanisms of marine CAZymes and the structure of marine polysaccharides should be further investigated for their high potential of antiviral activities and the creation of new marine drugs.
Many marine bacteria produce membrane extension like membrane vesicles or appendages but the function of these is poorly understood. In order to investigate their function, especially concerning polysaccharide utilization, proteomic analyses of subcellular compartments were performed. Microscopy analyses revealed that, beside MV, P. distincta forms different appendages, vesicle chains (VC) and thin filaments which were dedicated to extracellular polymeric substance. The formation of MV and VC was independent of growth phase or carbon source. The proteomic data showed that transporters end enzymes for the initial degradation of pectin and alginate were highly abundant in these membrane extensions and that there could be a kind of sorting for proteins in the membrane extensions. Additionally, two PUL encoded alkaline phosphatases and other phosphate acquiring enzymes were abundant in the MV and VC fractions. This indicates, that P. distincta constitutively produces enzymes for phosphate uptake, which would be necessary in the phosphate-limiting environment of the Southern Ocean. On the one hand marine bacteria produce membrane extensions in order to create a larger surface in the nutrient limiting marine environment for an increased chance to get in contact to nutrients and on the other hand the results indicate an accumulation of enzymes responsible for uptake and degradation of carbohydrates and phosphates in the MV and VC. Therefore, the membrane extensions act as nutrient traps and this might be beneficial for the bacteria in the diffuse aquatic environment.
The microbial community structure and the metabolism of bacteria in the Southern Ocean are very poorly investigated. The SO is a harsh environment for all organism but nevertheless, the SO is of high importance for the climate in the world due to the high carbon dioxide uptake. In this study water samples from two different sampling sites (S1 and S2) in the SO were investigated. With a metagenomic and metaproteomic approach the key players and the metabolic activity were analyzed. Additionally, the surface water was inoculated with pectin and incubated for several days in order to analyze polysaccharide utilization loci for pectin degradation and to isolate new pectin degraders. 16S-rDNA analyses revealed the bacterial community from the genomic data. Bacteria were separated in particle-associated and free-living bacteria. The overall particle associated bacterial community at both sampling sites was comparable, with Bacteroidetes and Gammaproteobacteria as the abundant phylum. Within the Gammaproteobacteria the Alteromonadaceae and Colwelliaceae were more abundant at S2 than at S1. The free-living bacteria at S1 were dominated by the Alphaproteobacteria, especially the SAR11 clade I. Metagenomic analyses showed that both sampling sites had comparable PUL composition, but taxonomical classification of PULs was differently. The metaproteome data revealed that PUL encoded enzymes were not highly abundant. Only few CAZymes were found, mostly TonB-dependent transporters belonged to the detected PUL proteins. Taxonomical classification of proteins showed differences between the sampling sites. At S2 the genus Colwellia and Arcobacter were highly increased compared to S1. At this location Candidatus Pelagibacter, Planktomarina and Polaribacter were the abundant taxa. The functional classification at both sampling sites was comparable. The only difference was the high abundance of Epsilonproteobacteria at S2 referable to the Arcobacter species. Nevertheless, the notably taxonomical differences could not be explained by the proteomic data and the functional classification, because no specific metabolic function could be highly addressed to these bacteria. These results assumed that different abundance of the key players could be explained by different environmental conditions. The pectin enriched cultured at both sampling sites were investigated for the functional potential of pectin degrading enzymes. No metaproteomic approach could be performed due to less sampling material. Only one PUL for the degradation of rhamnogalacturonan, a component of pectin, was found at S1. In contrast, bacteria grown on pectin could be isolated from these samples. Genome sequencing of five isolates showed that functional potential of pectin degradation is available. Due to the limitations of sequence alignments, it was not possible to detect a PUL responsible for pectin utilization in the metagenomic data. The results show that the polysaccharide degradation mechanism in the Southern Ocean has to be more investigated to get knowledge about the bacterial activity in the ocean’s surface and the carbon turnover in this underexplored environment.
In den Weltmeeren findet rund die Hälfte der jährlichen globalen Kohlenstofffixierung statt, davon ein großer Anteil in küstennahen Regionen. Hier kommt es zu wiederkehrenden saisonalen Algenblüten, die durch eine zeitlich begrenzte explosionsartige Vermehrung von Mikroalgen (hauptsächlich Diatomeen und Coccolithophoren) charakterisiert sind. Vor allem Frühjahrsblüten (März-Mai) haben aufgrund ihrer zeitlichen und räumlichen Vorhersagbarkeit einen hohen Stellenwert als Modellsysteme, anhand deren sich der Kohlenstoffkreislauf der Meere untersuchen lässt.
Mikroalgen produzieren eine große Vielfalt an Makromolekülen, die für die mit ihnen vergesellschafteten Bakterien als Nahrungsgrundlage dienen. Besonders im Fokus stehen hier die für den Kohlenstoffkreislauf relevanten Polysaccharide. Im Gegensatz zu anderen natürlichen Makromolekülen wie DNA oder Proteinen können Polysaccharide aus vielen verschiedenen Monomeren mit unterschiedlichsten Bindungen bestehen. Zusätzlich finden sich an diesen Zuckermonomeren viele Modifikationen wie Acetylierungen, Methylierungen oder Sulfatierungen, die die Komplexität weiter erhöhen. Diese Variabilität bedingt eine hohe strukturelle und funktionale Diversität. So können Polysaccharide Speicherstoffe, Zellwandbestandteile oder Teile der extrazellulären Matrix darstellen.
Komplementär hierzu besitzen Polysaccharid-verwertende Bakterien entsprechend komplexe, enzymatische Abbaumechanismen. Besonders hervorzuheben sind hier die Bakterien des Phylums Bacteroidota, die sich in verschiedensten Nischen auf den Abbau von Polysacchariden spezialisiert haben. Sie finden sich in Bodenproben, als Teil der menschlichen Darmflora, oder eben auch als bedeutende Begleiter von Algenblüten.
Bacteroidota (und in marinen Systemen hauptsächlich die zu ihnen gehörenden Flavobakterien) besitzen zum Abbau diverser Polysaccharide sogenannte Polysaccharide utilization loci (PULs), genomische Inseln, die alle notwendigen Proteine zur Aufnahme und Abbau eines bestimmten Polysaccharids codieren. Hierzu gehören hochspezifische Enzyme (Carbohydrate-active enzymes, CAZymes), transkriptionelle Regulatoren sowie Transportersysteme, die initial gespaltene Oligosaccharide über die Membran in das Bakterium transportieren, wo sie von weiteren Enzymen vollständig abgebaut werden. Diese Co-Lokalisation der benötigten Gene und deren gemeinsame Regulation stellt einen enormen Selektionsvorteil der Bacteroidota dar und ist der Grund, warum sie, ähnlich wie Algen, einer jährlich wiederkehrenden Sukzession folgen, die sich gut untersuchen lässt.Die Forschungsartikel, die Teil dieser Doktorarbeit sind, untersuchen das Zusammenspiel von Polysaccharid-produzierenden Algen mit den Bakterien, die sie abbauen, aber auch darauf basierende Beziehungen der Bakterien untereinander. Die erste Publikation beschäftigt sich mit dem weit verbreiteten Speicherpolysaccharid α-Glucan, für das der Großteil der blütenbegleitenden Bakterien einen spezifischen aktiven PUL besitzt. Eine Untersuchung der in der Blüte vorhandenen Algenarten bestätigte, dass die Blüte von β-Glucan-produzierenden Algen dominiert wird. Da Bakterien aber selbst α-Glucane als Speicherpolysaccharide verwenden, konnte gezeigt werden, dass nicht die Algen selbst, sondern die Bakterien Hauptproduzent dieser Polysaccharide während einer Phytoplanktonblüte sind. Bakterielle Proteine, die dem Abbau von Algen-β-Glucan und dem daraus folgenden Aufbau von bakteriellem α-Glucan dienen, waren in Umweltproben und in Laborkulturen unter ähnlichen Bedingungen abundant. Die Untersuchung von extrahiertem bakteriellem Polysaccharid bewies, dass dieses nicht nur α-Glucan enthält, sondern dass dieses Polysaccharid auch in der Lage war, α-Glucan PULs mariner Bakterien zu induzieren. Hier zeigte sich ein innerhalb des marinen Kohlenstoffkreislaufs bisher wenig berücksichtigter Kreislauf, indem Bakterien Polysaccharide anderer Bakterien nutzen, die z.B. durch Viren lysiert wurden.
Die anderen zwei Artikel dieser Arbeit befassen sich mit dem Abbau von Zellwandpolysacchariden durch blütenassoziierte Modellbakterien. In einer der Studien wird detailliert der Abbau eines β-Mannans (ein Polysaccharid das hauptsächlich aus dem Monosaccharid Mannose besteht) durch ein Bakterium des Genus Muricauda beschrieben. Die PUL-Struktur dieses Bakteriums kam in mehreren anderen Phytoplanktonblüten-assoziierten Bakterien vor. Diese Beobachtung wies darauf hin, dass es sich hier um ein Mannan mit zusätzlichen Galactose- und Glucose-Substitutionen handelte. Proteom-Untersuchungen bestätigten, dass das Bakterium derartige Substrate unter Induktion des β-Mannan-PULs nutzen können. β-Mannan konnte durch Antikörpermarkierung in Blütenproben sowie spezifischen Mikroalgenarten (Chaetoceros, Coscinodiscus) nachgewiesen werden. Die in dieser Publikation charakterisieren β-Mannan-PUL-codierten Enzyme waren in der Lage, dieses Signal zu löschen, was bewies, dass Muricauda sp. Mannan-basierte Zellwandpolysaccharide bestimmter Arten von Mikroalgen abbauen kann.
Die dritte Studie geht näher auf den Abbau von Xylanen (bestehend aus Xylose) durch ein blütenassoziiertes Bakterium des Genus Flavimarina ein. In diesem Bakterium wurden anhand der enthaltenen Xylanasen zwei putative Xylan-PULs annotiert. Wachstumsexperimente und Proteom-Untersuchungen zeigten, dass einer dieser PULs hauptsächlich bei Wachstum auf Glucoronoxylan induziert wird, während der andere PUL aufArabinoxylane stärker reagierte. Untersuchung der PUL-CAZymes bestätigte diese Ergebnisse durch Charakterisierung mehrerer Xylanasen sowie Glucoronidasen und Arabinofuranosidasen. Zusätzlich codierten beide PULs für Esterasen, die eine Modifikation der natürlichen Substrate durch Acetylierungen oder Methylierungen nahelegen. Da all diese Merkmale von terrestrischen Xylanen geteilt werden und in Blütenproben aus Küstennahen Regionen Xylane nachgewiesen wurden, ist es möglich, dass Bakterien aus solchen Regionen sowohl Xylane terrestrischen Ursprungs (z.B. durch Flusseinspeisung) sowie marinen Ursprungs abbauen können.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden erstmalig systematische Untersuchungen zum Thema „Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen“ dargestellt. Es gelang mit Hilfe einer geeigneten kalten Atmosphärendruckplasmaquelle in Form einer dielektrisch behinderten Oberflächenentladung (DBE) ein Plasma in verschiedenen Arbeitsgasen zu zünden und Flüssigkeiten ohne direkten Plasmakontakt zu behandeln. Um einen Einblick in die komplexen Mechanismen zu bekommen, wurde im analytischen Teil dieser Arbeit das Plasma mittels OES untersucht, die angrenzende Gas-Phase mittels FT-IR-Spektroskopie und MS, und anschließend die Flüssigkeit unter Nutzung photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen. Auf der Basis dieser Untersuchungen folgten theoretische Ausführungen zu möglichen Wechselwirkungen der detektierten Komponenten mit der Flüssigkeit. Theoretisch entstehen bei der Luftplasmabehandlung von Wasser, über Zwischenprodukte (ROS und RNS) wie z. B. HO•, HOO•, NO•, NO2•, schlussendlich H+, NO3-, NO2- und H2O2. Bei der Argon- und Argon-Sauerstoff-Plasmabehandlung von Wasser dürften aufgrund des Stickstoffmangels nur ROS entstehen, die in der Entstehung von H+ und H2O2 enden. Diese Hypothesen zur Bildung der Spezies NO3-, NO2- und H2O2, sowie die Ansäuerung der Flüssigkeit wurden mittels photometrischer Methoden und pH-Wert-Messungen überprüft und bestätigt. Im anschließenden biologischen Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Plasmabehandlungen in den verschiedenen Arbeitsgasen auf in physiologischer NaCl-Lösung und PBS suspendierte Mikroorganismen (E. coli, S. aureus und B. atrophaeus Sporen) untersucht. In ungepuffertem Medium wurden die vegetativen Mikroorganismen innerhalb weniger Minuten Plasmabehandlung inaktiviert. In PBS hingegen wurden längere Behandlungszeiten benötigt. Das Plasma hatte auf die suspendierten Sporen wie erwartet kaum eine inaktivierende Wirkung. Die zwei vermutlichen Hauptwege laufen einerseits über reaktive Stickstoffspezies (RNS) und andererseits über reaktive Sauerstoffspezies (ROS). RNS können in Wechselwirkung mit Wasser über diverse zelltoxische Zwischenprodukte wie z. B. NO•, NO2•, N2O3, ONOOH, ONOO- zu NO3- und NO2- umgesetzt werden. ROS in Interaktion mit Wasser resultieren in Bildung von H+ und H2O2. Auch hier wird angenommen, dass eine Vielzahl an antimikrobiellen Komponenten entsteht, z. B. HO•, HOO•, O2•-. Es gibt folglich sehr viele Reaktionen und Interaktionen zwischen plasmagenerierten reaktiven Spezies und Wasser, welche in zelltoxischen Komponenten enden und die inaktivierende Wirkung des Plasmas auf suspendierte Mikroorganismen erklären. Um die Interaktionen zwischen den Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit besser zu verstehen und Hypothesen zu prüfen, wurden einerseits die Mikroorganismen-Suspensionen und destilliertes Wasser nur mit plasmabehandeltem Gas behandelt und andererseits die Mikroorganismen plasmabehandelter Flüssigkeit ausgesetzt. Die Untersuchungen zeigten deutlich, dass die plasmainitiierte Chemie und damit die biologischen Effekte des Plasmas auf das Gas bzw. in Flüssigkeit übertragen werden. Folglich werden biologische Effekte des Plasmas über die Gas- und Flüssigkeits-Phase vermittelt und Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen müssen immer im zusammenhängenden chemischen System Plasma-Gas-Flüssigkeit(-Zelle) betrachtet werden. Weiterhin wurden chemische und mikrobiologische Effekte durch den Einfluss von gasförmigem NO• und O3 auf Wasser bzw. suspendierte Mikroorganismen untersucht und mit der Luftplasmabehandlung verglichen. Hierbei zeigten beide Begasung deutlich geringere inaktivierende Effekte als die Luftplasmabehandlung. Die Begasung von Mikroorganismen mit NO• und O3 und die Analytik von begastem Wasser geben einen detaillierten Einblick in die Chemie und Mechanismen der RNS und ROS. Die Behandlung mit der dielektrisch behinderten Oberflächenentladung in Luft vereint diese zwei Hauptwege über RNS und ROS und resultierte somit in effektiveren antimikrobiellen Wirkungen. Durch die Experimente der vorliegenden Arbeit wurde ein geeignetes biologisches Modell gefunden und validiert, um den Einfluss von Plasma auf lebende Zellen zu untersuchen und Mechanismen von Plasmabehandlungen aufzudecken. Anhand des Modells „Mikroorganismen-Suspension“ konnte gezeigt werden, dass die Gas-Phase (Behandlungen mit DBE-Abgas) und die extrazelluläre Flüssigkeit (Behandlungen mit plasmabehandelter Flüssigkeit) eine bedeutende Rolle bei der Vermittlung der Plasmaeffekte spielen. Die Spezies aus dem Plasma gelangten über die Gas-Phase durch Diffusion/Penetration/ Interaktion in die Flüssigkeits-Phase, reagierten teilweise zu anderen reaktiven Spezies weiter und erreichten so die Zellen. Die verschiedenen analytischen Methoden und anschließende theoretische Betrachtungen der Phasen Plasma-Gas-Flüssigkeit gaben einen detaillierten Einblick in die chemischen Mechanismen von Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen und zeigten biologisch wirksame Komponenten auf.
Hintergrund der Studie ist der demografische Wandel in ländlichen Regionen Mecklenburg-Vorpommerns. Dieser Wandel ist mit Konsequenzen für das Gesundheitswesen verbunden, etwa einer Nachfrage nach Gesundheitsdienstleistungen, die durch das jetzige Gesundheitssystem nicht mehr vollständig abgedeckt werden können. Insbesondere im medizinischen Versorgungssektor Mecklenburg-Vorpommerns sind strukturelle Umwandlungen notwendig, da dies durch Abwanderungen von Einwohnern im erwerbstätigen und gebärfähigen Alter im Gesundheitssektor gekennzeichnet ist. Mangelnde Infrastrukturen sind insbesondere bei Älteren risikobehaftet, da diese neben einer Vielzahl an Erkrankungen häufig Einschränkungen in der Mobilität unterliegen. Da viele von ihnen zudem über ein lückenhaftes familiäres Netzwerk im direkten Umfeld verfügen und sie häufig nicht mehr in der Lage sind, ihre Arzneimittel selbständig in der Apotheke abzuholen, erfahren sie oft weder eine direkte Beratung noch eine pharmazeutische Betreuung durch einen Apotheker. Dies bedeutet, dass sie hinsichtlich ihrer Arzneimitteltherapie häufig auf sich allein gestellt sind, was eine erhöhte Prävalenz an Arzneimittel-bezogenen Problemen (ABP) nach sich zieht. Dies verlangt nach Strukturen zur pharmazeutischen Betreuung im häuslichen Umfeld. Diese Strukturen wurden im Rahmen der Vorarbeiten zu einer Pilotstudie in mehreren Teilprojekten entwickelt. Sie umschlossen eine Querschnittserhebung zur Arzt-Apotheker-Kooperation in Mecklenburg-Vorpommern, ein Experten-gestütztes Delphi-Verfahren zur Konsensfindung hinsichtlich der Erhebungs- und Analyseverfahren, vier Patientenfokusgruppen sowie Probandeninterviews zur Gewährleistung der Inter-Rater- und Test-Retest-Reliabilität der Instrumente. Auch Fallvignetten wurden generiert, anhand derer die Detektionsleistung des Analyseleitfadens getestet wurde. Als Hilfsmittel für Lösungsstrategien wurden patientenzentrierte Instruktionen, zusammengefasst unter dem Begriff „Memory Tool“, konstruiert und in aufwändigem, multizentrischem Verfahren einer Überprüfung auf Validität unterzogen. In einer Pilotstudie wurde dann untersucht, ob eine pharmazeutische Betreuung eingeschränkt mobiler Patienten zu einer signifikanten Abnahme an ABP führt. Dazu wurden Apotheken in Mecklenburg-Vorpommern rekrutiert, die auf Kontroll- oder Interventionsgruppe randomisiert wurden. Es folgte die Rekrutierung von Patienten nach definierten Ein- und Ausschlusskriterien, welche daraufhin im Abstand von 6 Monaten je zweimal durch einen Apotheker in der Häuslichkeit einem Anamnesegespräch unterzogen wurden. Anhand des Analyseleitfadens ermittelte der Apotheker auf Basis der in den Medikationsanamnesen erhaltenen Daten die ABP des Patienten. In der Interventionsgruppe wurden zusammen mit dem Arzt Lösungsstrategien für die ABP entwickelt. Nach dem Follow-up-Interview wurde analysiert, ob die pharmazeutische Betreuung zu einer hypothetisch angenommenen Reduktion an ABP um 37,5% führte. Die Umfrage zur Arzt-Apotheker-Kooperation ergab, dass Interaktionen zwischen beiden Mitgliedern des Gesundheitssystems zum Zeitpunkt der Umfrage zwar niedrig frequentiert erfolgten, aber, hatten sie einmal stattgefunden, von beiden Seiten als nützlich eingestuft wurden. Ebenso wurde dem Apotheker ein vergleichsweise geringerer Anteil bezüglich der Förderung der Adhärenz durch den Arzt zugesprochen, welches sich in dem mehrheitlichen ärztlichen Wunsch nach einem Ausmaß von 25 (Apotheker) zu 75 Prozent (Arzt) in der Verantwortung niederspiegelte. Durch die sich anschließenden vielfältigen Verfahren zur Generierung und Validierung konnten verständliche, zuverlässige und valide Mess- und Analyseinstrumente für häusliche Medikationsanamnesen erhalten werden. So wurden nach der abschließenden Runde des mehrstufigen Delphi-Verfahrens 92% der Items des Interviewbogens und 72% der des Analyseleitfadens von den 6 beteiligten Experten akzeptiert. Die Überprüfung der Test-Retest- und der Inter-Rater-Reliabilität des Interviewbogens mittels doppelt durchgeführter Interviews mit demselben Patienten aber unterschiedlichen Interviewern ergab, dass unterschiedlich beantwortete Fragen zu 40% Interviewer-induziert, zu 60% Patienten-induziert, zu keinem Anteil jedoch Fragebogen-induziert waren.Die konstruierten und realen Fallvignetten ergaben eine hohe Test-Retest- und Inter-Rater-Reliabilität (Cohens κ>0,7). In der Interventionsgruppe (N=29) erfolgte eine durchschnittliche Abnahme der Anzahl an ABP um 4,6 (52,0%). In der Kontrollgruppe (N=18) nahm die Anzahl der ABP hingegen um 0,4 (2,9%) zu. Es war somit eine signifikante Abnahme (p<0,0001, 95% CI; Mann-Whitney-U-Test) an ABP in der Interventions- gegenüber der Kontrollgruppe zu beobachten, sodass die Alternativhypothese angenommen werden kann. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass eine pharmazeutische Betreuung zur signifikanten Abnahme an ABP bei älteren Patienten führt.
Introduction: Ketamine (KET) is widely used as anaesthetic drug. Beside its pronounced an-aesthetic effects as caused by antagonism of NMDA receptors, ketamine also causes potent analgesia. Moreover, There are ample new evidences, firstly, that 2R,6R/2S,6S-enantiomers of hydroxynorketamine (HNK), exert neuro-modulating effects by AMPA-receptor activation and, secondly, that the plasma levels of norketamine (n-KET) after oral dosing are higher than after intravenous administration. From the physicochemical point of view ketamine is expected to be a substrate of drug transporters. Thus, it was the aim of this study to separate and quantify KET and its metabolites in human serum, urine and feces; investigate the role of transporter proteins in the intestinal absorption, distribution and elimination of ketamine; and evaluate pharmacokinetics and metabolism of a newly developed prolonged-release keta-mine dosage form to confirm its suitability for chronic treatment of CNS-diseases (e.g. de-pression) according to the new “ketamine metabolite paradigm”. Materials and methods: Quantification of ketamine was done by a LC-MS/MS-based quantifi-cation method on the QTRAP4000 instrument. Samples were extracted by methyl tert-butyl ether after addition of sodium carbonate to liberate the free base; Single transfected MDCKII cells overexpressing OCT1, OCT2, OCT3, and MATE1 or MATE2K, and HEK293 cells over-expressing OATP2B1 were used to study the cellular uptake of ketamine. Inside-out lipovesi-cles were used to determine the affinity of ketamine to the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp). Uptake into cells or vesicles was determined by liquid scintillation counting. Func-tionality of all in vitro systems was assured by using in each case appropriate probe sub-strates; The dose-escalation study was performed in five consecutive periods (7 days wash-out) in 15 healthy subjects (5 females and 10 males. 20-35 years, BMI 19.4-27.6 kg/m2). Results: We introduce for the first time the separation and quantification of the active me-tabolites 2R,6R/2S,6S-HNK; Ketamine was shown to be taken up significantly in a time- and concentration-dependent manner by OCT1-3. The affinity to OCT transporters at pH=6.5 was several fold higher than that at pH=7.4. ), ketamine showed a significant but low affinity to P-gp. In contrast to this, we could not detect any transport of ketamine by MATE1 / 2K or OACPT2B1; and PR-KET was safe and well tolerated with higher metabolites productivity, different pharmacokinetic properties and longer T1/2 when compared to IV-KET or IR-KET. Conclusion: the uptake transporters OCT1 & 3 and the efflux transporter P-gp may play a role in the intestinal absorption of the drug. On the other side, P-gp, MATE1 / 2K and OCT are not expected to contribute significantly to tissue (brain) distribution or renal excretion of ketamine; Moreover, the prolonged-release ketamine undergoes dose-dependent “first-pass” metabolism which generates substantially increased plasma exposure of downstream me-tabolites with potential neuro-modulating effects compared to ketamine after intravenous administration.
Bacteria are an integral part of modern biotechnology. They are used to make a variety of products, such as foods, drugs, as well as a multitude of chemicals. In order to increase their production rates molecular biotechnology offers many tuning points, starting from the selection of an applicable host, over its geno- and phenotypical characterization, followed by genetic manipulations for an optimized metabolism and stabilisation of production processes. This work comprises the optimization of Bacillus subtilis as an expression system. It describes the steps taken for selection and genomic characterization of the B. subtilis wild type strain ATCC 6051, the subsequent optimizations of the strain in respect to growth and productivity, as well as the characterization of its behaviour in a variety of cultivation conditions. The B. subtilis strain most commonly found in laboratories around the world is the first sequenced Gram-positive organism B. subtilis 168. Zeigler et al. showed that strain 168 is not a real wild type. Instead it was created through random mutagenesis with X-rays and selected for transformability. This strain has been used as the basis for popular B. subtilis strains in heterologous gene expression such as the extracellular protease deficient WB strains. Growth experiments showed the real wild type strain ATCC 6051 to be superior to its mutated ancestor 168, making it a solid basis for the construction of an optimized B. subtilis expression system. In order to gain a full understanding of the genomic and corresponding physiological differences between the two systems, B. subtilis ATCC 6051 was sequenced and compared to the genome of B. Subtilis 168. Several variations on geno- and phenotypic level could be revealed, that resulted in particular from genes involved in natural competency, the metabolism of amino acids and chemotaxis. This genomically well characterized B. subtilis ATCC 6051 was improved in respect to its application as an expression host. Improvements were achieved through the inactivation of both sporulation and reduction of autolysis, leading to a more robust behaviour during the overproduction and secretion of a reporter enzyme. A positive effect on the activity of an acetoin induced promoter by the addition of second copies for its transcription factors SigmaL and AcoR could be observed. Anaerobic zones and areas with excess glucose caused by insufficient mixing are common conditions in large scale bioprocesses and lead to oscillating conditions for the cells. In turn, this oscillation provokes an excretion of so called overflow metabolites, which can negatively affect the bacterial productivity. Detailed scientific characterizations of industrial scale processes under such oscillating conditions are scarce due to the high costs and logistics involved. A B. Subtilis sporulation mutant was thus examined in respect to its extra- and intracellular metabolites in a scale-down, two-compartment reactor giving hints about conditions the host is exposed to and how it reacts. To improve tolerance thresholds and utilization capacity for such metabolites in B. subtilis, the glyoxylate cycle was transferred from its close relative Bacillus licheniformis into the genome of B. subtilis. This feature enabled our B. subtilis ACE mutant to grow on acetate. The improved strain showed higher tolerance towards excess glucose in a fed-batch as well as higher productivity during the expression of a reporter enzyme in comparison to the wild type. The ACE strain and B. licheniformis showed an increased formation of glycolate during growth with the glyoxylate cycle. This with regard to bacteria undescribed metabolite seems to play a role as a by-product of the glyoxylate cycle. Summarizing, this thesis deals with the characterization and optimization of B. subtilis for growth on overflow metabolites, enhancements of the acoA-expression system and the influence of sporulation and lysis mutants on its activity. Complementary, the host was begun to be characterized in respect to its behaviour in industrial scale processes.
Vertreter der Gattung Bacillus werden nicht zuletzt wegen ihrer guten Sekretionsleistung als Expressionswirte in der pharmazeutischen und chemischen Industrie genutzt und stellen eine Alternative zum gramnegativen Bakterium Escherichia coli, Hefepilzen und anderen Organismen dar. Die Art B. licheniformis ist besonders für die Proteaseproduktion geeignet, während B. subtilis zusätzlich als Produktionswirt für die industrielle Herstellung von Wirk- und Zusatzstoffen wie Bacitracin und Riboflavin verwendet wird.
Das Genom beider Arten wurde vollständig sequenziert und ermöglicht die Analyse einzelner Gene und deren Funktionen. Um die Effizienz von industriellen Fermentationsprozessen zu erhöhen, können verschiedene genetische Modifikationen hilfreich sein. So kann beispielsweise die Deletion einzelner Gene bzw. Gencluster als auch die heterologe Expression bestimmter Gene zu einer Weiterentwicklung eines Produktionsstammes beitragen und die Vorteile mehrerer Stämme in einem vereinen. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit beinhaltet u. a. die Erstellung eines optimierten Wirtssystems.
Im Mittelpunkt der dazu durchgeführten Untersuchungen zu B. subtilis standen verschiedene Enzyme des Acetoinstoffwechsels. Es konnte anhand der Überexpression der homologen Xylanase XynA gezeigt werden, dass die Deletion des Operons acoABCL in B. subtilis
6051HGW zu einer verbesserten Autoinduktion des acoA-Promotors führt. Durch einen alsDS-knock out hingegen wird diese verringert. Eine verbesserte Acetoinproduktion des Stammes B. subtilis 6051HGW konnte durch die Expression einer zweiten Kopie der Gene der beiden Untereinheiten einer Acetolactat-Synthase (IlvBH) erreicht werden. Zudem wurde während der stationären Phase ein verbessertes Wachstumsverhalten dieser Mutante auf Minimalmedium beobachtet.
Weiterhin wurde das Gen einer putativen Diacetyl-Reduktase aus dem Stamm B. subtilis TU-B-10 untersucht. Dieses Enzym könnte für die Reduktion des nichtenzymatisch entstandenen
Metaboliten Diacetyl zu Acetoin verantwortlich sein. Nach Integration des entsprechenden Gens in B. subtilis 6051HGW war jedoch keine erhöhte Acetoinkonzentration im Kulturüber-
stand zu messen.
B. subtilis 6051HGW LS8PD zeichnet sich u. a. durch seine 8-fache Proteasedefizienz aus. Anhand zweier Modellenzyme wurde die Eignung des Stammes als Expressionswirt heterologer Proteine untersucht. Mit Hilfe eines simulierten fed-batch-Verfahrens konnte das aus dem eukaryotischen Wirt S. cerevisiae stammende Gen sOx in B. subtilis 6051HGW LS8PD erfolgreich exprimiert und in den Überstand sekretiert werden. Nach Expression des Gens einer DnaseI aus Bos taurus konnte das entsprechende Protein extrazellulär dagegen nicht nachgewiesen werden.
Andere Untersuchungen, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführt wurden, beschäftigten sich mit dem Glyoxylatstoffwechsel von B. subtilis 6051HGW. Die Gene des
Glyoxylatzyklus sind nicht im Genom von B. subtilis enthalten. Werden sie aus B. licheniformis in B. subtilis6051HGW transferiert, kann der generierte Stamm B. subtilis ACE Überflussmetabolite wie Acetoin oder Acetat für das Wachstum nutzen. Dabei reichert sich jedoch extrazellulär der Metabolit Glycolat an, was möglicherweise zu einer Beeinträchtigung des Glyoxylatzyklus führen kann. Da die Akkumulation von Glycolat in B. licheniformis nicht erfolgt, wurde vermutet, dass die Aktivität der putativen Glyoxylat-Reduktase GyaR dafür verantwortlich ist.
Für weitere genetische Modifikationen von B. subtilis ACE war eine Neukonstruktion des Stammes erforderlich. Ein anschließender Transfer des Gens gyaR in B. subtilis konnte die extrazelluläre Glycolatkonzentration jedoch nicht senken. Auch die Deletion von gyaR in B. licheniformis
führte nicht zu höheren Konzentrationen dieses Metaboliten. Es kann geschlussfolgert werden, dass das untersuchte Gen gyaR nicht für eine Glyoxylat-Reduktase codiert.
Weitere Untersuchungen beschäftigten sich mit der Zellheterogenität von B. licheniformis P300. Das Auftreten von Subpopulationen in einer Bakterienkultur kann zu einem unterschiedlichen Verhalten der einzelnen Zellen und einer verringerten Gesamteffizienz in Produktions-
prozessen führen. In Zellkulturen des Stammes B. licheniformis P300 konnten verschiedene Subpopulationen identifiziert werden.
Um die genetische Zugänglichkeit zu optimieren, wurden verschiedene Untersuchungen zur natürlichen Kompetenz von B. licheniformis P300 durchgeführt. Zur Vereinheitlichung der
während der Kultivierung des Stammes auftretenden Subpopulationen wurden sigD- und sipW-tasA-yqxM-Deletionsmutanten erstellt. Zur Stammkonstruktion kam ein Verfahren zur Anwendung, das clean deletions im Genom erzeugte. Das Protokoll der Kolonie-PCR zur Identifizierung von potentiellen Deletanten wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit optimiert.
Die generierten Mutanten zeigten im Gegensatz zum Wildtypstamm keine sigD-vermittelte Motilität und Chemotaxis sowie keine tasA-vermittelte Biofilmbildung. Nach Auftrennung der Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation wurden die auftretenden Banden mit denen des Wildtyps verglichen. Dabei zeigte sich, dass eine Deletion von sigD zur Vereinheitlichung der Subpopulationen führt. Die generierte Mutante wies weiterhin ein verbessertes Wachstum
als der Wildtyp und einen veränderten Phänotyp auf, zeigte aber eine verringerte Effizienz bei der Transformation von DNA durch Elektroporation.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Arzneiformen mit neuartigen, auf der Mechanik des GIT basierenden Freisetzungsmechanismen. Für die Herstellung dieser Arzneiformen sollten additive Fertigungsprozesse entwickelt und etabliert werden. Für die Herstellung von Arzneiformen wurden 3D-Drucker modifiziert, sodass es möglich war, pharmazeutische Polymere als Ausgangsstoff nutzen zu können. Die Polymere wurden mittels eines eigens zu diesem Zweck entworfenen und gebauten Extruders in Filamente überführt. Die Mechanik der verwendeten 3D-Drucker wurde an die Materialeigenschaften der Polymere angepasst. Insbesondere die geringe Flexibilität und erhöhte Sprödigkeit machten Modifikationen notwendig. Mit Eudragit® RS konnte ein Prozess etabliert werden, der die Herstellung von drucksensitiven Arzneiformen ermöglicht. Eine speziell für den Druck dieser Objekte entwickelte Software wurde angewendet, um den Steuercode für den 3D-Drucker zu erzeugen und die Freisetzungsparameter der Arzneiform einstellen zu können. Vorversuche mit technischem PLA Filament dienten der Entwicklung der Herstel- lungsmethode. Aus Eudragit® RS wurden anschließend Arzneiformen hergestellt und auf ihr Bruchverhalten untersucht. Drei Chargen wurden in der Stresstest- apparatur für orale Arzneiformen einer Freisetzungprüfung unterzogen. Es konnte gezeigt werden, dass der entwickelte Prozess Arzneiformen mit verschiedenen Bruchdrücken produzieren kann. Alle Chargen wiesen allerdings geringere Belastbarkeiten auf, als für eine Anwendung am Menschen notwendig wäre. Freisetzungssysteme dieser Art könnten auch verwendet werden, um wirkstoffhaltige Filme gezielt auf die Dünndarmschleimhaut aufzubringen. Die Geometrie von Objekten, die mittels additiver Verfahren gefertigt werden, ist in weiten Bereichen variabel. Der Einfluss der äußeren Form auf die Freisetzungsrate ist bereits Gegenstand der Forschung. Wie sich von bekannten Arzneiformen abweichende Geometrien auf die Schluckbarkeit auswirken, war ein weiterer Bestandteil der Untersuchungen
dieser Arbeit. Zur Beurteilung der Schluckbarkeit wurde eine Humanstudie durcheführt, in der gesunde Probanden Schluckvorgänge von verschiedenen Objekten bewerteten. Die untersuchten Geometrien orientierten sich zum Teil an bekannten Arzneiformen. Zusätzlich wurden neuartige Geometrien untersucht, die aufgrund ihrer Eigenschaften interessant für die Entwicklung von Arzneiformen erschienen und durch additive Fertigungsverfahren zugänglich sind. Die Herstellung der Arzneiformen aus Isomalt erfolgte mittels eines modifizierten 3D-Druckers. Dieser als Lebensmittelzusatzstoff zugelassene Stoff eignet sich zum Einsatz in Fused Deposition Modelling Prozessen aufgrund der hohen Viskosität bei Temperaturen im Schmelzbereich. Das 3D-Drucksystem zur Verarbeitung spröder Filamente wurde im Rahmen dieser Arbeit entwickelt und bot die Möglichkeit, vier identische Objekte zur gleichen Zeit zu produzieren. Auf diese Weise konnte der Herstellungsprozess der für die Studie benötigten Testkörper verkürzt werden. Neben einem mechanisch stark überarbeiteten Düsensystem kam an diesem Drucker auch eine modifizierte elektronische Steuereinheit zum Einsatz, die den Einsatz der höheren Düsenanzahl zuließ und Funktionen für die komfortable Einrichtung und Reinigung des Druckers bereitstellte.
In der Humanstudie wurde gezeigt, dass die Geometrie einen starken Einfluss auf die Schluckbarkeit der Testkörper und das Empfinden während des Schluckvorgangs hat. Als negativ haben sich Geometrien erwiesen, deren Kanten in spitzen Winkeln zulaufen und keine längliche Form aufweisen, die eine parallele Orientierung im Rachenbereich zulässt. Vorteilhaft hingegen sind Formen, die sich in Schluckrichtung ausrichten können und in einer Schnittebene einen deutlich kleineren Querschnitt aufweisen, als in den rechtwinklig dazu angeordneten Schnittebenen. Neben der Einwirkung von Druck durch den GIT wurde auch die Bewegung einer oralen Arzneiform in Relation zur Oberfläche des Lumens des GIT für das drug targeting genutzt. Die entwickelte Arzneiform sollte die gezielte Arzneistoffapplikation auf der Mukosa des Ösophagus ermöglichen. Erkrankungen in diesem Bereich des GIT können bislang lokal kaum behandelt werden, da die Kontaktzeit eines oral verabreichten Arzneistoffes sehr kurz ist. Die aus diesem Grund notwendige systemische Behandlung ist mit einer hohen Arzneistoffbelastung des Organismus und damit einhergehenden unerwünschten Wirkungen verbunden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein schluckbares mechanisches System entwickelt, welches die gesteuerte Applikation eines Films über die gesamte Länge des Ösophagus auf dessen Schleimhaut ermöglicht. Die mukoadhäsiven Eigenschaften des Films können zu einer erhöhten Kontaktzeit führen, wodurch lokale Erkrankungen des Ösophagus einer topischen Therapie zugänglich gemacht werden könnten. Die entwickelte Arzneiform besteht aus einem Film, der mit Wirkstoff beladen werden kann und einer Hülle, die gleichzeitig das orale Applikationssystem dar- stellt. Mittels eines speziellen Applikators wird die Arzneiform geschluckt. Der Film ist in seiner Hülle so gelagert, dass er durch den Transport durch Mund- und Rachenraum sowie den Ösophagus aus dem Applikationssystem gezogen wird. Bei Kontakt mit dem kollabierenden Ösophagus verweilt der Film aufgrund seiner mu- koadhäsiven Eigenschaften auf der Schleimhaut, während das Applikationssystem den Magen erreicht und rasch disintegriert. Der Film quillt auf der Schleimhaut und kann den Arzneistoff über längere Zeit freisetzen. Es konnte gezeigt werden, dass neben den etablierten Freisetzungsmechanismen zur Steuerung oraler arznei- stoffbeladener Systeme auch die Mechanik des GIT für das drug targeting genutzt werden kann. In Verbindung mit additiven Fertigungsverfahren lassen sich orale Arzneiformen entwickeln, deren Freisetzungsparameter ausschließlich mittels digitaler Informationen variiert werden können.
Bacillus licheniformis is one of the most important hosts used in the biotechnological industry for the production of technical enzymes, antibiotics and a number of biochemicals. Although this bacterium has been used for a long time as an expression host, only little information on expression systems of this host is available. An expression system could be controlled by a cell density signal, a specific chemical inducer or a thermal shift. A limiting substrate such as glucose or phosphate limitation is suggested to use as the signal for the induction of an expression system. When B. licheniformis cells are subjected to nutrient limitation conditions, numerous genes involved in the metabolism of alternative nutrient sources are induced in order to keep cell survival. Therefore, the main topic of this study was to identify and investigate the regulation of genes or operons which are strongly induced in B. licheniformis cells grown under nutrient limitation conditions in order to apply for the construction of potential new expression systems. The research includes studies on the regulation of genes which are responsible for the acetoin and 2,3-butanediol utilization in B. licheniformis cells grown under glucose limitation conditions. Furthermore, we also analyzed the regulation of phytase gene expression as well as investigated the function of a putative ribonuclease expressed in B. licheniformis under phosphate limitation conditions. From this study, it was shown that in B. licheniformis, the utilization of acetoin and 2,3-butanediol was mainly mediated by enzymes encoded by the acoABCL operon. The transcription of this operon was regulated by sigma L transcription factor and was induced by acetoin. The acuABC operon was suggested to play as an indirect regulatory role for the acetoin utilization in B. licheniformis. This operon was controlled by a typical sigma A dependent promoter, however, acetoin was not an inducer for its expression. Furthermore, the regulation of phytase gene expression was suggested to be controlled by PhoPR-two component systems. The results showed that phytate, which is the substrate of phytase enzyme, was not an inducer for the expression of phy gene. However, growth experiments revealed that phytate served as a good alternative phosphate source for the growth of B. licheniformis cells under these conditions. Finally, the inactivation of BLi03719 gene, coding for a putative ribonuclease, resulted in an increase of the total RNA concentration of B. licheniformis cells grown in phosphate limited medium. However, the mutation did not affect the expression of the heterologous reporter gene. Therefore, it could be speculated that the putative ribonuclease BLi03719 plays a role in ribosomal RNA degradation under these conditions.
Der Sepsis sowie einer Reihe von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose und Diabetes mellitus Typ 1 ist, ebenso wie zahlreichen weiteren Krankheitsbildern, gemein, dass für diese eine Beteiligung der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) an deren Pathogenese durch exzessive Freisetzung von Stickstoffmonoxid bewiesen ist bzw. diskutiert wird. Die Auffindung von effektiven und selektiven Inhibitoren der iNOS stellt einen möglichen, erfolgversprechenden Ansatz dar, zumindest die Symptomatik dieser Erkrankungen positiv zu beeinflussen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten neue Wirkstoffe als potentielle Inhibitoren der iNOS zugänglich gemacht und auf ihre Aktivität getestet werden. Ein wesentlicher Ansatzpunkt für das Wirkstoff-Design ist die strukturelle Modifikation des natürlichen Substrats der iNOS, der Aminosäure Arginin. Ein bekannter Arginin analoge Hemmstoff der iNOS ist Aminoguanidin. Das Konzept der vorliegenden Arbeit zur strukturellen Abwandlung dieses Moleküls beinhaltete dessen Integration in ein heterobicyclisches System, mit dem Ziel, die Flexibilität der Aminoguanidin-Struktur herabzusetzen, um somit die Hemmwirkung und die iNOS-Spezifität zu verbessern. Die bisher wenig erschlossene Verbindungsklasse der [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazine erschien sehr gut geeignet, dieses Konzept zu realisieren. So wurden verschieden substituierte Vertreter dieses Grundkörpers als Analoga zu Aminoguanidin dargestellt. Als Hauptsyntheseroute wurde die Darstellung von Hexahydro[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazinen über Ringschluss von Hexadyro-1-carbothioamid mit Aldehyden / Ketonen verfolgt. Anschließend wurden diese durch S-Methylierung mit Iodmethan zu 1-Methylsulfanyl-5,6,7,8-tetrahydro-3H-[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazinen umgesetzt und schließlich mittels S-N-Austausch Tetrahydro-3H-[1,2,4]triazolo[1,2-a]pyridazin-1-amine dargestellt. Die erhaltenen Vertreter der Zielverbindungen aller Synthesestufen wurden auf ihre Aktivität gegenüber der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase und mögliche zytotoxische Effekte mittels eines Zellkultur-Modells getestet. Im Ergebnis der chemisch-synthetischen und strukturanalytischen Arbeiten wurde eine Vielzahl von Verbindungen mit [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazin-Struktur einschließlich entsprechender Vorstufen neu- bzw. resynthetisiert. Alle Verbindungen wurden umfassend strukturanalytisch charakterisiert. So war es möglich eine umfangreiche Substanzbibliothek mit diversen Substitutionsmustern zu generieren, welche für die Überprüfung der generellen Eignung von Abkömmlingen des [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazins als Inhibitoren der induzierbaren NO-Synthase genutzt werden konnte. Für diese biologischen Untersuchungen zur Inhibition der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) durch die synthetisierten Titelverbindungen wurde ein optimiertes Zellkultur-Testverfahren unter Verwendung der Ratten-Insulinom Zelllinie RINm5F für den Arbeitskreis etabliert. Diese wurden mit den proinflammatorischen Zytokinen Interleukin-1β und Interferon-γ zur Expression von induzierbarer NO-Synthase stimuliert. Nach der Inkubation mit den potentiellen Hemmstoffen wurde die verbleibende NO-Produktion der Zellen durch Ermittlung der Nitritkonzentration im Überstand bestimmt. Anschließend wurde an den bereits behandelten Zellen auf mögliche Zytotoxizität der Substanzen durch einen MTT-Assay getestet. Mit diesem Verfahren wurden eine Reihe der Titelverbindungen bezüglich ihrer iNOS-hemmenden und zytotoxischen Eigenschaften untersucht. Davon inhibierten etliche in Position 3 unterschiedlich substituierte [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazin-1-thione dem Aminoguanidin vergleichbar oder stärker die NO-Produktion der iNOS bei nur geringem, zytotoxischem Effekt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, die Verbindungsklasse der [1,2,4]Triazolo[1,2-a]pyridazine mit einer breiter Palette von Derivaten synthetisch zu erschließen und eine iNOS-inhibierende Wirkung für eine Anzahl von Vertretern zu belegen.
Die at-line Expressionsanalyse von Bioprozess-relevanten Markergenen auf der Grundlage von elektrischen Biochip-Verfahren ist eine viel versprechende Strategie für eine prozessbegleitende Beurteilung der Zellphysiologie des Produktionswirtes. Eine derartige direkte Methode für die Bestimmung des physiologischen Status würde zu einer umfassenderen Überwachung und Kontrolle von industriellen Fermentationsprozessen beitragen. Die Expressionsanalyse der Markergene mit den verwendeten elektrischen Biochips beruht auf dem Nachweis der entsprechenden mRNA über eine Sandwich-Hybridisierung und der elektrochemischen Detektion der Hybride. Hierbei sind sowohl Bead-basierte als auch Array-basierte Formate möglich. Der Bead-basierte mRNA-Nachweis nutzt paramagnetische Partikel (Beads) für die Immobilisierung von Gen-spezifischen Fängersonden. Während der Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den Beads gebunden. Gleichzeitig hybridisiert eine Detektionssonde in einem anderen Bereich der mRNA und ermöglicht so die Markierung mit einem Enzym. Dieses setzt para-Aminophenol (pAP) frei, das an den Elektroden des Biochips über zyklische Oxidations- und Reduktionsprozesse (Redox-Recycling) amperometrisch detektiert wird. Der resultierende elektrische Strom dient als Maß für die mRNA-Menge in der Probe. Die Array-basierte mRNA-Detektion nutzt elektrische Biochips mit 16 individuell auslesbaren Elektrodenpositionen. In diesem Format werden die Fängersonden direkt auf der Elektrodenoberfläche immobilisiert. Durch die Hybridisierung wird die nachzuweisende mRNA auf den jeweiligen Elektrodenpositionen gebunden. Die Detektion erfolgt positionsspezifisch über das Enzym-kontrollierte Redox-Recycling von pAP. Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag vor allem auf der Verkürzung, Optimierung und Automation der Bead-basierten mRNA-Detektion. Durch erste Optimierungen einzelner Protokollschritte der Bead-basierten Sandwich-Hybridisierung konnte eine Verkürzung des Protokolls von ursprünglich 4 h auf unter 3 h erzielt werden. Der Übergang zu einer Sandwich-Hybridisierung in Lösung führte vor allem zu einer verbesserten Handhabbarkeit und Reproduzierbarkeit des Protokolls. Die Neuanordnung der Sondenbindestellen auf der Ziel-mRNA und die Einführung einer zweiten Detektionssonde resultierten in signifikanten Steigerungen der Hybridisierungssignale. Dies ermöglichte eine Verkürzung der Detektionszeit auf ca. 75 min. Durch weitere Optimierungen einzelner Aspekte des Protokolls konnte schließlich eine mRNA-Detektionszeit von ca. 45 min realisiert werden. Somit wurde das Protokoll für die Bead-basierte mRNA-Detektion mit dem elektrischen Biochip, ausgehend von isolierter Gesamt-RNA, von ursprünglich 4 h auf 45 min verkürzt. Gleichzeitig konnte die Sensitivität des Protokolls um das etwa Fünffache gesteigert werden. Die Automatisierung mithilfe eines Pipettierroboters erlaubte eine parallele Bearbeitung und die automatische, sequentielle Detektion von 8 Proben innerhalb von ca. 1 h. Weiterhin wurde die Array-basierte mRNA-Detektion etabliert und teilweise optimiert. Dies ermöglichte eine parallele, elektrochemische Detektion von derzeit 4 verschiedenen mRNAs in einer Probe isolierter Gesamt-RNA innerhalb von 20 min. Allerdings sind vor der automatischen Messung noch zusätzliche Schritte für die manuelle Bearbeitung der RNA-Proben (ca. 25 min) erforderlich. Die Anwendbarkeit der entwickelten Protokolle wurde jeweils am Beispiel von ausgewählten Markergenen des industriell bedeutsamen Wirtes Bacillus licheniformis getestet. Die mithilfe der elektrischen Biochip gemessenen Expressionsprofile der Markergene korrelierten mit den mittels real-time RT-PCR bestimmten mRNA-Mengen. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation die Grundlage für eine Bioprozess-begleitende mRNA-Analytik, basierend auf elektrischen Biochips, geschaffen werden.
Die Zusammenhänge zwischen der Aktivität Epigenetik-assoziierter Enzyme und Krankheitsgeschehen neoplastischer Art konnten nicht nur experimentell bestätigt, sondern auch spätestens mit der Zulassung von Inhibitoren der DNA-Methyltransferase und Histon-Desacetylasen kausal bewiesen werden. Die weniger gut untersuchten 2-Oxoglutarat- und Eisen(II)-abhängigen JumonjiC-Domänen enthaltenden Histon-Demethylasen (KDMs) werden aufgrund von Überexpression in einigen Tumorzellen ebenfalls als mögliches epigenetisches Target in der Tumortherapie angesehen.
Die in dieser Arbeit synthetisierten KDM4-Inhibitoren basierten zum einen auf Tetrazol- und Hydrazid-haltigen Motiven, für welche synthetische Routen in weitergehenden Untersuchungen entwickelt wurden, um das aliphatische Rückgrat der Moleküle mit aromatischen Resten zu modifizieren oder komplett durch eines auf Basis der Anthranilsäure zu ersetzen. Zum anderen sollten Synthesewege für verschiedenartige (1H-Tetrazol-5 yl)pyridine gefunden werden. Dafür wurde ein Tetrazol in Position vier des Pyridinrings eingefügt, um anschließend systematische Untersuchungen der Seitenkette in Position zwei des Pyridinrings vorzunehmen. Neben direkten Heteroatomverknüpfungen wurden auch Carbonylverbindungen wie Carbonsäureamide oder eine Hydroxamsäure dargestellt. Über zahlreiche Wege konnten ebenfalls Methylengruppen-haltige Verbindungen erfolgreich synthetisiert werden.
Die biologische Testung der Verbindungen erfolgte mit einem Antikörper-basierten LANCE-Assay gegen KDM4A. Zusätzlich konnten vier der Substanzen röntgenkristallographisch in der Isoform KDM4D vermessen werden. Eine in Position zwei des Pyridinrings eingefügte Hydroxamsäure zeigte relevante Interaktionen im Enzym und veranschaulichte zugleich, dass (1H-Tetrazol-5 yl)pyridine zu einer hohen Affinität bestimmter Isoformen der Histon-Demethylasen neigen können.
Zusätzlich zu den bereits ansatzweise verstandenen Zusammenhängen zwischen Epigenetik und neoplastischen Krankheiten, weisen Experimente im Nagermodell darauf hin, dass epigenetisch modifizierende Enzyme auch an der Entstehung von depressionsartigen Phänotypen beteiligt sind. Die grundsätzliche Erforschung neuer Therapieoptionen abseits der Monoaminhypothese für die Indikation Depression ist jedoch auch deshalb notwendig, weil zugelassene medikamentöse Behandlungsoptionen zum Teil zu starken Nebenwirkungen führen und bis zur Entfaltung der vollen Wirkung oftmals mehrere Wochen vergehen können. Mit dem NMDA-Rezeptorantagonisten Ketamin behandelte depressive Patienten zeigten häufig eine rasche Symptomlinderung bei vergleichsweise günstigem Nebenwirkungsprofil. Welche Moleküle für diese Effekte ursächlich sind, ist noch Gegenstand aktueller Forschung, da neben Ketamin selber auch Metaboliten wie 2R,6R-Hydroxynorketamin mit antidepressiven Wirkungen assoziiert werden. Für die qualitativen und quantitativen Analyse von R- und S-Ketamin sowie den Metaboliten R- und S-Norketamin, R- und S-Dehydronorketamin und 2R,6R- und 2S,6S Hydroxynorketamin in menschlichem Urin wurde in der vorliegenden Arbeit eine chromatographische Methode entwickelt und validiert, welche die Techniken der überkritischen Fluidchromatographie und Massenspektrometrie nutzt (SFC-MS). Die für die SFC charakteristischen Eigenschaften wie hohe Flussraten und Trenneffizienz sowie die Nutzung von Kohlenstoffdioxid als mobile Phase konnten ausgenutzt werden, um das Trennproblem in nur einer Methode mit kurzer Laufzeit zu lösen. Gleichzeitig wurde der Verbrauch von organischen Lösungsmitteln reduziert. Damit kann die erarbeitete Methode einen nachhaltigen Beitrag für zukünftige Ketaminforschung leisten.
Eukaryotische Mikroalgen werden seit einigen Jahrzehnten hinsichtlich ihrer Eignung als Wirkstoffproduzenten intensiv untersucht, wobei bisher nur wenige potentiell nutzbare Verbindungen identifiziert wurden. Trotzdem lässt alleine die riesige Artenvielfalt die Vermutung zu, dass es Produzenten interessanter Sekundärstoffe geben muss. In den letzten Jahren zeigte sich außerdem, dass Mikroalgen Lieferanten von Wertstoffen, beispielsweise im Bereich der regenerativen Energien, sein können. Hier sind vor allem die hohen Kultivierungskosten und die geringe Produktausbeute noch zu überwindende Hürden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden 70 eukaryotische Mikroalgenstämme auf ihre Eignung als Produzenten neuartiger Wirk- und Wertstoffe untersucht. Außerdem wurde durch Variation der Kultivierungsbedingungen ermittelt, ob die Kultivierungskosten gesenkt und die Ausbeuten an relevanten Produkten aus Mikroalgen gesteigert werden können. Die untersuchten Mikroalgen stammten aus der Stammsammlung der Pharmazeutischen Biologie der Universität Greifswald, aus kommerziellen Stammsammlungen oder wurden aus Gewässerproben der Greifswalder Umgebung isoliert. Neue Isolate wurden mit molekulargenetischen Methoden identifiziert. Alle Mikroalgen wurden zunächst unter Standardbedingungen kultiviert, die Biomasse-Raum-Zeit-Ausbeute bestimmt und bewertet. Anschließend wurde die biochemische Zusammensetzung der Biomasse analysiert. Dazu wurden im Rahmen der Arbeit sechs Methoden zur Gesamtlipid-, Gesamtkohlenhydrat- und Gesamtproteingehaltsbestimmung sowie zur Analytik der Lipid- und Kohlenhydratzusammensetzung etabliert.
Die Algen zeigten bei Kultivierung unter Standardbedingungen Biomasseausbeuten bis 90 mg L-1 d-1. Die höchsten Wachstumsraten erreichten verschiedene Scenedesmus spp. Die biochemische Zusammensetzung der Algenbiomasse war sehr variabel. Häufig war jedoch der Proteinanteil mit ca. 50 % am höchsten, gefolgt von Kohlenhydraten mit etwa 30 % und einem Lipidanteil von ca. 10 %. Anhand der Modellalge Scenedesmus obtusiusculus konnte gezeigt werden, dass die Biomassezusammensetzung durch Variation der Kultivierungsbedingungen beeinflusst werden kann. So führten erhöhte Beleuchtung sowie Nitrat- und Eisenmangel zu vermehrter Lipid- und Kohlenhydratakkumulation. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde ein neues Kulturmedium entwickelt, in dem die Modellalge lipid- und kohlenhydratreiche Biomasse ohne Wachstumseinbußen im Vergleich zum Standardmedium produziert. Durch Verwendung natürlicher Wasserquellen als Basis für das Kulturmedium konnten darüber hinaus die Kultivierungskosten deutlich reduziert werden. Durch die gleichzeitige Steigerung der Produktausbeute und Senkung der Kultivierungskosten konnte gezeigt werden, dass auch eine großtechnische Produktion von Wertstoffen aus Mikroalgen wirtschaftlich sein kann.
Zur Bewertung des Potenzials der Mikroalgen als Produzenten von interessanten Sekundärstoffen wurde beispielhaft die antimikrobielle Aktivität von Extrakten der Algenbiomasse untersucht. Es zeigte sich, dass vor allem lipophile Extrakte gegen grampositive Bakterien wirksam waren, wofür wahrscheinlich die in den Extrakten nachgewiesenen mehrfach ungesättigten FS verantwortlich sind. Einige Mikroalgenarten wiesen zudem einen hohen Betaglucangehalt auf. Diesen Polysacchariden werden, wenn bestimmte Strukturvoraussetzungen erfüllt sind, diverse gesundheitsfördernde Effekte zugeschrieben. Durch Optimierung der Kultivierungsbedingungen konnten bei einigen Algenarten mit einem Gehalt von bis zu 35 % deutlich höhere Werte im Vergleich mit anderen betaglucanreichen Lebensmitteln wie Getreide (bis 10 %) oder Pilzen (bis 25 %) erreicht werden. Damit konnte gezeigt werden, dass Mikroalgen neben ihrer Eignung als Wertstoffproduzenten auch interessante Wirkstoffe liefern können.
Symbiotic interactions are a key element of biological systems. One powerful strategy to gain insight into these interactions, and into biological systems in general, is the analysis of proteins expressed in situ using metaproteomics. In this thesis, host-microbe interactions in two mutualistic associations between chemosynthetic sulfur-oxidizing endosymbionts and marine invertebrates, the deep-sea tubeworm Riftia pachyptila and the shallow-water clam Codakia orbicularis, were studied by adapted and optimized metaproteomics methods.
The Riftia symbiosis, which inhabits hydrothermal vents in the deep sea, and in which the host completely depends on its symbiont for nutrition, has fascinated researchers for about four decades. Yet, the interaction mechanisms between both partners have been understudied so far. Additionally, while different aspects of the host’s biology have been described, a comprehensive analysis has been lacking. Moreover, although only one symbiont 16S rRNA phylotype is present in Riftia, the symbiont population of the same host expresses proteins of various redundant or opposed metabolic pathways at the same time. As the symbionts also exhibit a wide variety in size and shape, symbionts of different size might have dissimilar physiological functions, which remained as of now to be elucidated. In this thesis, we addressed both, the host-symbiont interaction mechanisms, and physiological roles of symbiont subpopulations. A comprehensive Riftia host and symbiont protein database was generated as prerequisite for metaproteomics studies by de novo sequencing the host’s transcriptome and combining it with existing symbiont protein databases. This database was then used for metaproteomics comparisons of symbiont-containing and symbiont-free Riftia tissues, to gain insights into host-symbiont interactions on the protein level. The impact of energy availability on host-symbiont interactions was studied by comparing specimens with stored sulfur (i.e., high energy availability) with specimens in which sulfur storages were depleted. We employed optimized liquid chromatography peptide separation to increase metaproteome coverage. With this analysis, we identified proteins and mechanisms likely involved in maintaining the symbiosis, under varying environmental conditions. We unraveled key interaction mechanisms, i.e.: (i) the host likely digests its symbionts using abundant digestive enzymes, and, at the same time, (ii) a considerable part of the worm’s proteome is involved in creating stable internal conditions, thus maintaining the symbiont population. Furthermore, (iii) the symbionts probably employ eukaryote-like proteins to communicate with the host. (iv) Under conditions of restricted energy availability, the host apparently increases digestion pressure on the symbiotic population to sustain itself.
Riftia symbionts of different size apparently have dissimilar metabolic roles, as revealed in this thesis. We enriched symbionts of different sizes using gradient centrifugation. These enrichments were subjected to protein extraction using a protocol optimized for the small sample amount available. Metaproteomics analysis included a gel-based workflow and evaluation of the complex dataset with machine learning techniques. Based on our metaproteomics study, we propose that Riftia symbionts of different cell size correspond to dissimilar physiological differentiation stages. Smaller cells are apparently engaged in cell differentiation and host interactions. Larger cells, on the other hand, seem to be more involved in synthesis of various organic compounds. Supposedly, in large symbionts endoreduplication cycles lead to polyploidy. Our results indicate that the Riftia symbiont employs a large part of its metabolic repertoire at the same time in the stable host environment.
The symbiont of the shallow-water clam Codakia orbicularis, which, like the Riftia symbiont, relies on reduced sulfur compounds as energy source and fixes inorganic carbon, is, unexpectedly, also able to fix atmospheric nitrogen, as shown by metaproteomic, genomic and biochemical analysis. Potentially, this benefits the host, as Codakia digests its symbiont and might thus supplement its diet with organic nitrogen fixed by the symbionts in addition to organic carbon in its nitrogen-poor seagrass habitat.
In drei verschiedenen Teilanalysen wurden Erkenntnisse über die Wirksamkeit von Interventionsmaßnahmen gegen das Vorkommen und die Verbreitung von ESBL/AmpC-bildenden E. coli in der Hühnermast gewonnen. Literaturdaten und praktische Laborergebnisse, die teilweise selbst erhoben wurden, flossen in ein mathematisches Modell ein, um die Auswirkungen von Haltungsparametern und konkreten Interventionsmaßnahmen prädiktiv berechnen zu können. Die zusammengefassten Ergebnisse zeigen einen Einfluss der Maßnahmen „Competitive Exclusion“, „Reinigung und Desinfektion“ sowie den Haltungsparametern „Rasse“, „geringe Besatzdichte“ und „erhöhte Einstreumenge“ auf das Vorkommen von bestimmten ESBL/AmpC-bildenden E. coli. Zusätzlich zu den Einzelmaßnahmen wurden im Modell mehrere Kombinationen getestet, wobei zwei unterschiedlichen Szenarien verwendet wurden, entweder der Stall oder die Eintagsküken waren zu Beginn der Mastperiode positiv. Diese Kombinationen ergaben eine deutliche Reduktion der resistenten E. coli in den infizierten Tieren, in deren Ausscheidungen und in der Einstreu. In diesem Zusammenhang wären Daten aus tierexperimentellen Studien zu kombinierten Maßnahmen interessant. Weitere wissenschaftliche Ergebnisse könnten zu einem optimierten Modell beitragen, damit es die realen Bedingungen besser widerspiegelt. Zu einer weiteren Präzisierung könnte zum Beispiel die dezidierte mathematische Berechnung des Wachstums von resistenten E. coli in den unterschiedlichen Teilen des Gastrointestinaltrakts des Huhns und in der Einstreu führen, unter Berücksichtigung von pH-Wert und Temperatur. Ungeachtet dessen bietet die vorliegende Version des Modells eine nützliche Unterstützung bei der Vorhersage der Auswirkung unterschiedlicher Maßnahmen auf das Auftreten und die Verbreitung von ESBL/AmpC-bildenden E. coli in Masthuhnbetrieben. Diese Ergebnisse können zu einer umfassenden Quantitativen mikrobiologischen Risikobewertung (QMRA) beitragen, mittels derer die Effizienz von Risikominderungsmaßnahmen in der gesamten Broilerproduktionskette, von der Brüterei und Aufzucht über die Mast, Schlachtung, Verarbeitung und den Einzelhandel bis hin zum Verzehr - from farm to fork, bestimmt werden kann.
Massebilanzdefizite
(2013)
Kapitel 1 beschreibt Untersuchungen zu der Fragestellung, ob Matrixalterung eine Ursache für Massebilanzdefizite sein kann. Diese Vermutung blieb bislang in der Literatur unberücksichtigt und wurde nun anhand einer breit angelegten Studie überprüft. Verschiedene Fertigarzneimittel und für die Studie entwickelte Formulierungen mit PCA und E2 wurden in Klimakammern und Trockenschränken gelagert, um unterschiedliche Alterungszustände der Formulierungsmatrices zu simulieren. In definierten Zeitabständen wurden Proben hinsichtlich der PCA- und E2-Wiederfindung analysiert. Ausgewählt wurden Formulierungen mit geringen Konzentrationen der Modellsubstanzen, da dies als worst-case angesehen wurde und auch die Anforderungen für die Aufklärung von Massebilanzdefiziten bei sehr gering dosierten Arzneimitteln stetig steigen. Im vorliegenden Fall konnte bei 67 % aller untersuchten Proben eine signifikante Änderung der Wiederfindung und somit eine potentielle Ursache für Massebilanzdefizite festgestellt werden. Tritt in der Praxis ein Massebilanzdefizit auf, das mithilfe der etablierten Lösungsansätze nicht aufzuklären ist, so ist die Überprüfung der Wiederfindung der betreffenden Substanz aus der gealterten Matrixstruktur sinnvoll und kann unter Umständen eine Optimierung und ggf. Revalidierung der analytischen Methode erforderlich machen. Ausgangsgedanke für Kapitel 2 war die Tatsache, dass die chromatographische Trennung eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte für die Aufstellung einer lückenlosen Massebilanz entscheidend ist. Die E2-Abbauprodukte delta6- und delta9,11-E2 konnten bislang im Rahmen von Stabilitätsstudien mit E2-Formulierungen nicht separat quantifiziert werden. Zum Teil wird in der Literatur delta6-E2 als Abbauprodukt, delta9,11-E2 jedoch mit dem Verweis auf sehr ähnliche Retentionszeiten lediglich als Syntheseverunreinigung angesehen, was im Gegensatz zu praktischen Erfahrungen und Untersuchungen von Vertretern der pharmazeutischen Industrie steht. Das Kapitel 2 beschreibt die Entwicklung einer chromatographischen Trennmethode für E2 und die Abbauprodukte 6alpha-E2, 6beta-E2, 6-Keto-E2, delta6-E2, beta-Equilenol und delta9,11-E2. Die Trennung aller Komponenten wurde mittels einer Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter der Verwendung einer pentafluorphenylierten Kieselgelphase realisiert. Praktische Anwendung konnte anhand des Marktproduktes Vagifem® gezeigt werden, für welches aufgrund der niedrigen Arzneistoffkonzentration und sehr komplexen Tablettenmatrix zunächst die Entwicklung einer geeigneten Probenvorbereitung durchgeführt wurde. Abschließend wurde die Methode hinsichtlich Selektivität, Sensitivität, Linearität, Präzision und Richtigkeit validiert. Kapitel 3 nimmt Bezug auf die Arzneimittelsicherheit von Fertigarzneimitteln unter analytischen Gesichtspunkten. Die Identität und der Verbleib eines Arzneistoffes und aller seiner Abbauprodukte sind bei der Lagerung von Arzneimitteln nicht nur unter dem Aspekt der Massebilanz von Bedeutung. Entstehen während der Lagerung genotoxische Abbauprodukte, müssen diese in engen Grenzen überwacht werden. Diese Aspekte wurden anhand des Fertigarzneimittels Paludrine® (Arzneistoff Proguanil) verdeutlicht. Zunächst wurde der Übergang des genotoxischen Abbauproduktes PCA in die Gasphase während der Lagerung bei erhöhten Temperaturen überprüft. Simultan wurde der Anstieg von PCA sowie der Proguanilgehalt in den Tabletten bestimmt, um Rückschlüsse auf die Massebilanz zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass PCA unter den gewählten Bedingungen in der Gasphase über den Tabletten nachweisbar war. Der entsprechende Gehalt war jedoch in Relation zum PCA-Gehalt und Proguanilgehalt in den Tabletten vernachlässigbar gering. Ein Einfluss auf die Massebilanz konnte folglich ausgeschlossen werden. Für eine Massebilanz entscheidend sind weiterhin Kenntnisse über alle Abbauprodukte. Im Fall von Proguanil lieferte die Literatur Hinweise auf bislang unidentifizierte Abbauprodukte, für welche Strukturvorschläge erarbeitet wurden. Im Hinblick auf die Genotoxizität des Hauptabbauproduktes PCA, wurden auch für die neu vorgeschlagenen Strukturen erste toxikologische Bewertungen mittels DEREK, MCASE und Vitic erstellt. Abschließend wurde die Anwesenheit von allen Abbauprodukten in künstlich gealterten Tabletten überprüft.
Rich knowledge about global nutrient cycles and functional interactions can be gained from the perspective of complex microbial proteomes. In this thesis, the application of environmental proteomics allowed for a direct in situ analysis of habitat-specific proteomes expressed by respective microbial communities from two different marine ecosystems. In the first part of this thesis, unculturable symbiont populations from tubeworms that colonize hydrothermal vents of the Pacific deep sea became accessible by use of community proteomics. This branch of environmental proteomics is generally employed to ascertain simple microbial assemblages derived from in situ samples. The proteome study was aimed at analyzing adaptations of seemingly monospecific symbionts to different hosts, the tubeworms Tevnia jerichonana und Riftia pachyptila. A comparison of the newly sequenced genomes of symbiont populations from both hosts confirmed that both symbioses involve the same bacterial species. Also the proteome analysis by 2D-PAGE showed a high physiological homogeneity for symbionts from both worm species, although the hosts are exposed to different geochemical conditions. Thus, the hosts provide their symbionts with a relatively stable internal environment by attenuation of external influences. Only minor variations in the symbionts proteomes reflected the differential environmental conditions outside the worms. Hence, the symbionts were able to fine-tune major metabolic pathways and oxidative stress in response to only minor chemical changes within their hosts. Moreover, new components of important physiological processes of the bacterial symbionts, like the sulfide oxidation and carbon fixation, were identified by in-depth proteomics of the Riftia symbiosis model system. The in situ protein samples showed as well that, in contrast to an earlier hypothesis, nitrate is used as an alternative electron acceptor. In the second part of this thesis, another branch of environmental proteomics called metaproteomics was applied to investigate the response of a bacterioplankton community to a spring phytoplankton bloom in the North Sea. Recurrent plankton blooms are a common phenomen of coastal areas, which however has only been investigated with limited resolution in biodiversity. Based on large-scale proteomic data sets it was found that specialized populations of Bacteroidetes, Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria exhibited differential protein expression patterns. These involved oligomer transporters, glycoside hydrolases and phosphate acquisition proteins. A successive utilization of algal organic matter by microbes indicated a series of ecological niches occupied by the heterotrophic picoplankton. Key proteins, identified by metaproteomics, were further investigated by studying a model bacterium to define their specificities regarding the utilization of algal glycans. By isotope labeling of proteins, quantitative proteomics of the North Sea isolate Gramella forsetii KT0803, a Bacteroidetes representative could be conducted. The adaptation to the algal polysaccharides alginate and laminarin in comparison with glucose was analyzed. G. forsetii proved to be a specialist for the chosen algal polymers, in particular for glucans like laminarin. Primarily comprehensive clusters, the so-called polysaccharide utilization loci (PULs) were activated. The results of this model study complemented the basic concepts obtained by the metaproteomic approach about carbon cycling in coastal systems. The accessibility of numerous unculturable marine microbes by environmental proteomics allows to improve our understanding of interactions that drive symbioses or complex communities. Adaptations to environmental parameters, such as the abundance of substrates, can be analyzed and associated with respective populations. Thus statements can be made for functional groups of microorganisms, their ability for the creation of niches and their flexibility to respond to varying environmental impacts. The increasing number of marine model bacteria enables targeted analysis of specificities and adaptations and hence to support the environmental proteomics approach.
Marine Organismen haben sich im Laufe der Evolution hervorragend an die besonderen Bedingungen unter Wasser angepasst. Diese Tatsache führte aufgrund von Adaptationsprozessen unter anderem zur Bildung neuer biologisch aktiver Naturstoffe, die sich in ihrer Struktur und Wirkung häufig von bekannten terrestrischen Naturstoffen unterscheiden. Während Makroorganismen marinen Ursprungs schon länger intensiv untersucht werden, nahm das Interesse an marinen Mikroorganismen erst in den letzten zehn Jahren stark zu. Pilze im marinen Habitat wurden sehr spät beschrieben. Die ersten Funde wurden 1869 bekannt, doch erst in den 40er Jahren des 20. Jahrhunderts wurde langsam klar, dass auch im marinen Lebensraum eine reichhaltige Pilzflora zu finden ist. Hierbei stellen besonders Mikroorganismen des marinen Habitats wichtige potentielle Quellen auf der Suche nach neuen pharmakologisch aktiven Wirkstoffen dar, da ihre biotechnologische Fermentation in nahezu unbegrenzter Menge möglich ist, ohne dass eine Ausbeutung begrenzter natürlicher Ressourcen erfolgen muss. Im Vordergrund dieser Arbeit stand daher die Isolierung bioaktiver Naturstoffe aus marinen Pilzen. Die Pilze wurden unter verschiedenen Bedingungen kultiviert, mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert und die Extrakte chemisch analytisch sowie auf ihre antimikrobielle Aktivität hin untersucht. Biologisch aktive sowie analytisch aussichtsreich erscheinende Extrakte wurden zur Isolierung der in ihnen enthaltenen Sekundärstoffe ausgewählt. Die Naturstoffisolierung sowie die nachfolgende Strukturaufklärung erfolgten mithilfe verschiedener chromatographischer sowie spektroskopischer Methoden (HPLC, LC-MS, NMR, DC, verschiedene säulenchromatographische Techniken). Isolierte Reinsubstanzen wurden auf ihre biologische Aktivität gescreent. Aus dem Ethylacetat-Extrakt des taxonomisch bis jetzt nicht einordenbaren marinen Pilzes 222 konnten insgesamt elf verschiedene Verbindungen strukturell aufgeklärt werden. Dabei stellten sich 6-Deoxybostrycoidin (1), 5-Deoxyanhydrofusarubin (2) und Altechromone A (3) als bereits bekannte Verbindungen heraus. Die acht Verbindungen Balticol A-F (4, 5, 6, 7, 8, 9), Balticofuran (10) und Balticolid (11) stellten sich als neue Naturstoffe heraus. In Biotests zeigte 6- Deoxybostrycoidin antibakterielle Aktivität gegen humanpathogene Keime (Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis) und fischpathogene Keime (Vibrio anguillarum, und Pseudomonas anguilliseptica). Die antimikrobielle Aktivität dieser Ver¬bin¬dun¬g gegen fischpathogene Erreger wurde in der Literatur bisher nicht beschrieben. Die neuen Verbindungen Balticol A-F (4-8) und Balticolid (11) zeigten starke antivirale Aktivität gegen Herpes Simplex-Virus Typ 1 und Influenza Virus Typ A. Am stärksten war die Wirkung von Balticol E (8) mit einem IC50-Wert von 0,01 µg/ml gegen HSV 1. Balticol D (7) zeigte auch antiinflammatorische Eigenschaften. Die neue Verbindung Balticofuran A (10) zeigte gute Radikalfängereigenschaften. Aus dem Pilz Lophiostoma sp. konnten drei Verbindungen isoliert und strukturell aufgeklärt werden. Dabei stellten sich Oxasetin (12) , Erogosterolperepoxid (13) und Cerebrosid C (14) als bereits bekannte Verbindungen heraus, die aber zum ersten Mal aus Lophpiostoma sp. isoliert wurden. Das antibakteriell aktive Oxasetin war vorher nur aus dem Pilz Vaginatispora aquatica beschrieben worden. Oxsetin erwies sich im Test als antiviral aktiv gegen Herpes Simplex-Virus Typ 1 und Influenza Virus Typ A . Die antimikrobielle Aktivität dieser Ver¬bin-dun¬g gegen fischpathogene Erreger und die antivirale Aktivität wurden in der Literatur bisher nicht beschrieben.
Antimicrobial resistance (AMR) is of paramount importance in the context of One Health, an integrated and unifying approach that aims to achieve a sustainable balance in the well-being of people, domestic and wild animals, plants, and their shared environments. Whenever bacteria become resistant to the therapeutic effects of antibiotics, they can cause infections that are difficult to treat effectively, increasing the risk of severe disease progression and death. Although AMR can develop naturally over time and is per se “ancient”, the excessive use of antibiotics in human and veterinary medicine over the past century has significantly accelerated its emergence and spread. Opportunistic Gram-negative enterobacteria, particularly Escherichia coli (E. coli ) and Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) strains, increasingly exhibit resistance to multiple classes of clinically used antibiotics, thus presenting multidrug-resistant (MDR) phenotypes. To make matters worse, some of these strains combine multidrug resistance with high-level virulence, posing a threat to both immunocompromised and healthy individuals. Consequently, MDR E. coli and K. pneumoniae have been designated as high-risk pathogens by the World Health Organization, underscoring the urgent need for new antibiotic development.
This thesis is motivated by the fact that only a limited number of international high-risk clonal E. coli and K. pneumoniae lineages stand out across all One Health dimensions and dominate the broad pool of MDR enterobacteria. While we only know little about the underlying drivers and contributing factors impacting their occurrence, emergence, and adaptation across different ecologies, this thesis employs a diverse range of bioinformatics and phenotypic approaches to identify the key factors important for the success of these lineages, also in rather under-explored settings. It includes three main components: (i) the analysis of genomic survey data of MDR E. coli isolates from ecologies in sub-Saharan Africa, (ii) the application of functional genomics and phenotyping techniques to characterize bacterial virulence and assess its clinical relevance in a food-borne E. coli strain, and (iii) the investigation of evolutionary pathways that promote the development of resistance to a novel drug combination and exploring compensatory mechanisms in a K. pneumoniae strain. To achieve these objectives, this research integrates genomics and transcriptomics with molecular biology and functional studies encompassing a comprehensive set of in vitro and in vivo virulence and resilience assays to explore MDR bacteria in-depth.
We provide compelling evidence for the broad occurrence of successful high-risk clonal lineages in the One Health context and their circulation among clinics, wildlife, and food in international locations. In the first study, we isolated extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing E. coli strains from houseflies collected from various wards at the University Teaching Hospital of Butare (Rwanda). In a follow-up study, we then examined in-depth the genomes of additional ESBL-producing E. coli from the same clinic and obtained from hospitalized patients, their caregivers, associated community members, and pets. The analyses revealed that the sample sets from this sub-Saharan African context consisted predominantly of globally recognized E. coli lineages, including sequence types (ST)131, ST167, ST410, and ST617. They play a pivotal role in the further dissemination and stabilization of AMR across diverse habitats within the One Health context. Moreover, our genomic results emphasize that these One Health-related high-risk clonal lineages exhibit the ability to successfully combine multidrug resistance with high-level bacterial virulence.
To gain a more detailed understanding of the sophisticated interplay of virulence and AMR, we developed and refined a set of in vitro and in vivo methods for virulence phenotyping. These methodologies enabled us to characterize pathogens based on crucial clinical aspects such as biofilm formation, siderophore secretion, resistance to complement-mediated killing, and their capacity to cause mortality in Galleria mellonella larvae. By using a food-borne E. coli strain from an internationally recognized high-risk clonal lineage, we verified the remarkable combination of a MDR phenotype with clinically significant virulence properties, including synthesis of curli fibers and cellulose as part of biofilm formation, extensive secretion of siderophores, resilience against complement-containing human serum and pronounced mortality in the infection model.
Nevertheless, the success of One Health-related high-risk clonal lineages does not rely solely on an “ideal” synergistic interplay between bacterial virulence and AMR. It also depends on their ability to rapidly mitigate the fitness costs associated with AMR acquisition, as these costs manifest in the form of reduced competitiveness and virulence in the absence of antibiotics. However, this is at odds with the observation of the global distribution of One Health-related high-risk clonal lineages across various One Health dimensions, even in environments with expectedly low selection pressures. To comprehensively address this, we conducted experimental evolution studies selecting for ceftazidime-avibactam-resistant mutants, which illuminated the rapid adaptations to changing environments. The adaptations and compensatory mechanisms were seemingly driven by major bacterial regulators, including the envelope stress response regulator RpoE on genomic and transcriptomic levels.
In conclusion, the results of this thesis shed light on the fundamental principles that govern the character and interplay between AMR and bacterial virulence and advance our understanding of the contributors and drivers of successful MDR international high-risk clonal lineages in the One Health context. This is also important for effective and alternative intervention strategies to prospectively further address the global threat of AMR.
In vitro assays play a crucial role in the biopharmaceutical assessment of drugs. During the past two decades, biorelevant media became an indispensable tool to forecast the in vivo solubility and dissolution of pharmaceutical drug candidates, and to assess absorption risks like low solubility or drug precipitation. Nevertheless, in vitro set-ups are still a simplification of the conditions in the human GI tract. This thesis aimed to shed light on some of the remaining open questions, aiming at providing a better understanding of the effects of biorelevant media on solubility, dissolution, and precipitation processes, and providing guidance for a more streamlined usage in the future. The results of this work can be outlined in brief as follows: First, a new design of experiment-based method development was introduced which increased the robustness and accuracy of derivative UV spectrophotometric methods for drug quantification in biorelevant precipitation assays. Second, based on this new approach, the impact of SIF powder aging on the supersaturation and precipitation behavior of the model drug ketoconazole was investigated. Recommendations on the use of biorelevant media for precipitation assays were developed to further improve the reproducibility of transfer experiments and to enhance data reliability. Third, it was investigated under which circumstances the physiological bicarbonate buffer should be applied to Fasted State Simulated Intestinal Fluid medium for in vitro solubility, dissolution, and precipitation testing to resemble the in vivo conditions.
Accelerated drug release tests are essential for quality control (QC) of long acting (non-oral) controlled release formulations. Real-time release experiments are usually required for product development, to understand the mechanism of release and to establish a correlation with in vivo release. Ideally, the accelerated test should maintain the biorelevant aspect of the in vitro method and the mechanism of release should not change under accelerated test conditions. At the same time adequate discriminatory ability is a prerequisite as the accelerated test should be able to discriminate between batches with respect to manufacturing variables that can impact on bioavailability. The objective of this thesis was to develop accelerated drug release tests for intravaginal rings (IVRs) and to gain a mechanistic understanding of the principles that facilitate in vitro drug release under accelerated test conditions. A detailed evaluation of the in vitro release characteristics of the formulations under real-time test conditions was considered as a prerequisite for developing predictive accelerated tests. Two formulations were subject of this study, in which the mechanism of release is primarily governed by drug diffusion. One formulation was the commercially available Nuvaring®, a combined hormonal contraceptive IVR that releases etonogestrel and ethinylestradiol with a constant rate over a duration of 3 weeks. The second formulation was a prototype of an investigational IVR that is supposed to be bioequivalent to the marketed formulation. The Nuvaring® provides an example of a reservoir system in which a membrane mediates diffusion, resulting in release rates that are almost constant with time, whereas the investigational IVR is a matrix-type IVR. In these devices drug release is driven by Fickian diffusion through a homogeneous matrix and decays with time. Both IVRs are based on different grades of polyethylene vinyl acetate (PEVA). Accelerated drug release tests were performed at elevated temperature and in hydro-organic solvents since these two parameters were expected to increase drug diffusion through the semicrystalline EVA copolymer. Release experiments with IVRs or endcapped segments were performed in an incubator shaker. The devices were placed in stoppered flasks containing an adequate release medium that was continuously shaken and completely replaced at predetermined time points. Release experiments with endcapped segments were also performed in a small volume version of UPS apparatus 7 (the Reciprocating Holder). Results from release experiments in these two setups were in general comparable when the release from segments was standardized to release per ring with respect to the mass ratio (segment/IVR). Real-time drug release in an aqueous release medium at a temperature of 37 °C from the Nuvaring® was slightly affected by variations in the in vitro test conditions, i.e. media volume and composition (addition of solubility enhancing agents). These variations, however, did not affect the release kinetics that continued to be zero-order with exception of the initial burst. In contrast, real-time drug release from the matrix IVR was affected by the steroid solubility in the release medium, increased with increasing media volume and reached a maximum in release media containing solubility enhancing agents, resulting in distinct release kinetics. Interestingly the steroid solubility had a distinct influence on the release rate under conditions that are commonly assumed to provide sink conditions. Even under experimental conditions that provided minimum drug solubility, the concentration of ethinylestradiol in the receptor medium never exceeded 3 % of the saturation solubility. Accelerated drug release from both IVRs could be observed after exposure to elevated temperature and/or hydro-organic release media. Overall, increased drug release in different hydro-organic media correlated with polymer swelling. The higher swelling capacity of the investigational IVR, when compared with the Nuvaring®, was accounted for a stronger degree of acceleration in different hydro-organic release media. These observations were in agreement with literature sources that report that swelling as well as diffusivity in EVA copolymers increases with increasing VA content, which is lower in the rate-controlling membrane of the Nuvaring®. For the investigational IVR a good correlation between accelerated and real-time release profiles could be obtained if changes in steroid solubility under accelerated conditions were taken into consideration. For example, a good correlation could be observed between accelerated release profiles in hydro-organic media and real-time release profiles in media containing surfactants that provide maximum drug solubility and thus eliminate boundary layer effects. This observation appears reasonable since hydro-alcoholic release media also enhance steroid solubility in the receptor compartment. In case of the Nuvaring® variations in the in vitro test parameters under real-time test conditions did not affect the release kinetics. For this IVR, the mechanism of release was maintained in hydro-organic release media and at elevated temperature. The quantitative relationship between the zero-order release constants and the test temperature could be described by the Arrhenius equation, indicating that accelerated release is governed by an increase in drug diffusion. Validation of the accelerated method with a prototype of the investigational IVR with a different drug load demonstrated that the accelerated methods were able to detect formulation changes with similar discriminatory ability as the real-time test. However, the temperature-controlled accelerated method was less sensitive to detect changes in the release characteristics of a Nuvaring® that have been induced by preliminary heat-treatment, indicating that the accelerated method may be less sensitive to detect changes in IVRs that are a result of physical aging. When the aim is to develop an accelerated method for batch release it is therefore crucial to validate the accelerated method with appropriate samples from non-conforming batches that are out of specification under real-time test conditions and have been obtained by small but deliberate variations in the critical process parameters. In both formulations the degree of acceleration could be further increased by combining the effect of hydro-organic release media with an increase in temperature. Under these test conditions the ability to differentiate between the different prototypes of the investigational IVR was maintained. Moreover, in both IVRs the mechanism of release was not affected by an additional increase in temperature when compared with release profiles in hydro-organic solvents. In conclusion, the results of this study indicate that both temperature and hydro-organic release media are valid parameters to accelerate drug release from delivery systems in which the mechanism of release is primarily governed by diffusion through dense (inert) polymer matrices (i.e. inserts, implants). A correlation between real time and accelerated release will be facilitated if drug release under real-time test conditions is independent of the test parameters. To assure the outcome of the test with respect to quality and safety it is crucial to validate the accelerated method with appropriate batches.
Research on the science and the fiction of supercritical fluid chromatography (SFC) has been ongoing for more than five decades. Today, packed column SFC promises speedy solutions to chiral and semi-preparative separation problems, but academia has been reluctant to incorporate SFC into its curriculum, as doubts linger concerning its practicability. This work sought to explore the merits of SFC in hyphenation with electrospray ionization--single quadrupole mass spectrometry (ESI-MS) and supercritical fluid extraction (SFE) in various aspects of medicinal chemistry and bioanalysis within an academic setting.
SFC was investigated for its usefulness in assessing the purity and the stability of synthesis products, and the quantification of chiral and achiral metabolites - domains conventionally occupied by high performance liquid chromatography (HPLC).
Confronted with analytes prone to hydrolysis (cyclic polysulfides) and UV-induced configurational changes (aza-stilbenes), fast elution by water-free SFC-MS proved complementary to traditional chromatographic techniques.
The quantification of antidepressant ketamine metabolites presented an opportunity to assess supercritical fluid techniques within a bioanalytical context. While SFC hyphenated to single quadrupole MS did not reach the sensitivity levels of HPLC coupled to triple quadrupole MS/MS, exploitation of supercritical CO2 reduced analysis times more than six-fold (60 minutes by HPLC vs 10 minutes by SFC). When coopted for both extraction and analysis, SFE-SFC-MS simplified sample preparation and promoted the transition from off- to on-line bioanalysis. Similar results were obtained when SFC was applied to acidic and basic metabolites of the controversial anodyne flupirtine. Again, SFC featured shorter run times but also expanded the target metabolite spectrum covered within one run.
Finally, a tiered approach to validation demonstrated the reliability achievable by SFC. Critical applications such as quantification of the newly approved antidepressant ketamine or the recently withdrawn analgesic flupirtine were comprehensively validated according to guidelines on bioanalytical method validation by the European Medicines Agency. Notably, this included the first fully validated chromatographic methods for the putative antidepressant (2R,6R)-6-hydroxynorketamine, and the first report of EMA-conforming quantification by on-line SFE-SFC-MS from urine.
Separation scientists find themselves confronted with diverse problems and tools. Although parsing only a microscopic subsection of the available chemical and analytical space, the results obtained here suggest SFC to be a fast and versatile addition to conventional chromatographic methods employed at the intersection of medicinal chemistry and bioanalysis.
The biological decontamination and sterilization is a crucial processing step in producing and reprocessing of medical devices. Since polymer-based materials are increasingly used for the production of medical devices, the application of conventional sterilization processes are restricted to a certain extent. Conventional sterilization techniques on the basis of high temperatures, toxic gases, or ionizing radiation can be detrimental to the functionality and performance of polymeric materials. For this reason, alternative, gentle, and efficient decontamination processes are required. One possible approach is the use of non-thermal physical plasmas. Especially atmospheric pressure plasma is receiving great interest due to the absence of vacuum systems which is highly attractive for the practical applicability. Its mechanisms of action enable the efficient killing and inactivation of micro-organisms which are attributed to the interaction of plasma-generated reactive oxygen and nitrogen species (ROS, RNS) as well as plasma-emitted (V)UV radiation. Owing to the moderate gas temperatures (near or at room temperature) so-called cold plasmas are well-suitable for the treatment of heat-sensitive materials, such as polymers, without affecting their bulk properties. The present work focuses on the investigation of atmospheric pressure plasma processes for the biological decontamination of polymers. The objective is to help elucidate on the one hand the impact of varied plasma process parameters on the inactivation of micro-organisms and on the other hand the influence of plasma on the surface properties of the substrate. The investigations were performed by means of a high-frequency driven plasma jet (from the product line kINPen) operated with argon and argon-oxygen mixtures. Three main aspects were analyzed: 1. The effect of plasma on the viability of micro-organisms dependent on working gas, treatment time, and the sample distance (distance between the jet nozzle and the substrate). 2. The plasma-based removal of microbial biofilms. 3. The effects of the plasma treatment on the surface properties of selected polymers. Additionally to the capability of the applied plasma jet in killing microbes the efficacy of this plasma jet for the removal of complex biological systems (e.g. biofilms) is shown. To model cell constituents of bacteria different synthetic polymers were chosen to gain insight into the decomposition process responsible for biofilm degradation. By investigating the impact of atmospheric pressure plasma on physico-chemical surface properties of various synthetic aliphatic and aromatic polymers the interaction mechanisms between plasma and plasma-exposed material are discussed. These studies are accompanied by applying different optical plasma diagnostic techniques (optical emission spectroscopy and two-photon absorption laser induced fluorescence spectroscopy) to obtain information on the plasma gas phase which contributes to the elucidation of the reaction mechanisms occurring during plasma exposure. Moreover, it is presented to which extent the plasma treatment influences the surface properties of polymers during the plasma-based bio-decontamination process and further, the benefits of surface-functionalized polymers for biomedical application is discussed.
Die meisten der auf dem Markt befindlichen Arzneimittel sind so konzipiert, dass sie ihren Wirkstoff schnell und reproduzierbar im oberen Gastrointestinaltrakt abgeben, um die Absorption aus dem Dünndarm zu erlauben. Für das Zerfalls- und Freisetzungsverhalten dieser Arzneiformen spielt vor allem die gastrale Physiologie eine entscheidende Rolle. Das Zusammenspiel der Formulierung mit bestimmten Parametern des Magens, insbesondere der Magenentleerung, ist aber noch nicht völlig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb mit Hilfe von In vivo- und In vitro-Methoden untersucht, wie das Freisetzungsverhalten fester, oraler Arzneiformen nach nüchterner Applikation von der gastrointestinalen Physiologie beeinflusst wird.
Im ersten Teil der Arbeit beschäftigten wir uns mit den Ergebnissen einer Bioäquivalenzstudie, in der von einem Industriepartner zwei schnell freisetzende N-Acetylcystein-Formulierungen untersucht wurden. Dabei wurde der Originator, eine schnell freisetzende Tablette eingenommen mit Wasser, mit einem Granulat verglichen, welches einmal mit Wasser und einmal trocken eingenommen wurde. In beiden Studienarmen der Granulat-Formulierung konnte die Bioäquivalenz zum Originator gezeigt werden. Darüber hinaus wurden die Bioäquivalenzkriterien ebenso für die beiden Granulat- Studienarme erfüllt. Aufgrund der guten Permeabilität und der hohen Wasserlöslichkeit des N-Acetylcysteins war ein Einfluss der begleitenden Wassergabe auf die Pharmakokinetik erwartet worden. Die Ursachen für das Abweichen von dieser Erwartung wurden mittels In vitro-Freisetzungsmethoden weiter untersucht. Um die komplexen Bedingungen des Magens In vitro simulieren zu können, wurde das von Garbacz und Weitschies entwickelte biorelevante Freisetzungsmodell Dynamic Open Flow-Through Test Apparatus zur Untersuchung der beiden Formulierungen angewendet. Dabei konnte durch Simulation von biorelevanten Magenentleerungsprofilen gezeigt werden, dass die Wassergabe einen geringen Beitrag zum Transport des Arzneistoffes in den Dünndarm hat. Aufgrund dieser In vitro-Versuche konnten die Ergebnisse der Bioäquivalenzstudie umfassender erklärt werden.
Um die physiologischen Begebenheiten, welche für den Zerfall schnell freisetzender Arzneiformen kritisch sind, In vivo untersuchen zu können, wurde die Salivary Tracer Technique entwickelt. Diese Technik beruht auf der Einnahme einer geringen Dosis Koffein zusammen mit Wasser und anschließender Koffeinkonzentrationsmessung im Speichel. In einer MRT-Humanstudie konnten wir zeigen, dass die Entleerungskinetiken des eingenommenen Wassers aus dem Magen eng mit den Koffeinprofilen im Speichel korrelieren. Je nach Kinetik der Magenentleerung, erreichte gelöstes Koffein den Dünndarm und wurde dort schnell resorbiert und über das Blut in die Speicheldrüsen transportiert. Damit war die Magenentleerung der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für das Anfluten von Koffein im Speichel. Somit war es möglich, indirekt, einfach und wenig kostenintensiv, die Magenentleerung einer akalorischen Flüssigkeit zu bestimmen, ohne auf die MRT mit entsprechend geschultem Personal zurückgreifen zu müssen.
In einem nächsten Schritt wurde die Salivary Tracer Technique genutzt, um die In vivo-Zerfallszeiten von Hartgelatinekapseln zu bestimmen. Als Referenz- und Goldstandardmethode diente wiederum die MRT, da es durch die Zugabe von Eisenoxid im MRT möglich war, die Hartgelatinekapseln sichtbar zu machen und deren Integrität zu beurteilen. Um parallel den Zerfall mit der Salivary Tracer Technique zu bestimmen, wurden die Kapseln zusätzlich mit 50 mg Koffein befüllt. In einer Humanstudie wurden die mit den beiden Markersubstanzen beladenen Kapseln auf nüchternen Magen appliziert. Direkt im Anschluss wurden die Probanden im MRT platziert und Messungen in kurzen Zeitintervallen durchgeführt. Nach jeder Messung mussten die Probanden selbständig eine Speichelprobe von geringem Volumen abgeben. Sobald eine Koffeinkonzentration, die größer als die dreifache Bestimmungsgrenze der analytischen Methode war, in einer Speichelprobe nachgewiesen werden konnte, wurde dieser Zeitpunkt als Zerfallszeitpunkt bestimmt. Der statistische Vergleich der Zerfallszeitpunkte der beiden Methoden zeigte eine robuste Korrelation der Werte. Ein geringer Versatz der Zerfallszeitpunkte bei der Salivary Tracer Technique ließ sich dadurch erklären, dass mittels MRT der Zerfall direkt im Magen bestimmt wurde, während für den Koffeinnachweis im Speichel noch das Verteilen, das Lösen und/oder die Entleerung des Koffeins aus dem Magen mit anschließender Resorption im Dünndarm erfolgen muss. Trotz des Versatzes der beiden Methoden von circa 4 min konnte die Studie belegen, dass die Salivary Tracer Technique geeignet ist, mit einer robusten Korrelation zu etablierten Methoden und mit moderatem Studienaufwand den Zerfall schnell freisetzender Arzneiformen zu bestimmen. Besonders der relative Vergleich mehrerer verschiedener Formulierungen in einem Cross-over-Design erscheint mit der Salivary Tracer Technique sinnvoll, da hierbei der Einfluss der Magenentleerung auf die Zerfallszeiten der verschiedenen Formulierungen gleichbleibend sein sollte.
Da eine In vivo-Testung von (Entwicklungs-)Formulierungen, trotz der vereinfachten Methodik, nicht immer möglich und angemessen ist, wurde das Fed Stomach Model als In vitro-Freisetzungsmodell im Rahmen dieser Arbeit weiterentwickelt. Die wesentlichen Modifizierungen des GastroDuos gegenüber dem Fed Stomach Model sind die dünnwandige, transparente Magenzelle, welche geringe Volumina von bis zu 25 mL simulieren kann sowie biorelevante Temperaturprofile des eingebrachten Mediums. Weiterhin wurde die Möglichkeit geschaffen, diese Medien anzusäuern und so verschiedene pH-Profile zu simulieren. Eine weitere Neuheit des GastroDuo ist die Fähigkeit der kontinuierlichen Konzentrationsmessung direkt am Ausgang über ein UV- Lichtleitersystem. Das System eignet sich somit dazu, Druck, Bewegung, pH-Wert, Temperatur und Hydrodynamik in physiologisch relevanter Weise zu simulieren. Diese Parameter werden in sechs Testprogrammen, welche sowohl die mittleren Bedingungen im Magen simulieren als auch die physiologischen Extrema berücksichtigen, in unterschiedlicher Weise abgebildet.
In einer ersten Studie wurde das GastroDuo genutzt, um das Freisetzungsverhalten von vier schnell freisetzenden Arzneiformen genauer zu untersuchen. Weiterhin wurden vergleichende Freisetzungsdaten mittels kompendialer Methoden erhoben. In diesem Screening wurde der Zerfall und die Freisetzung von Koffein aus einer Hartgelatinekapsel, zwei verschiedenen HPMC-Kapseln sowie einer Filmtablette verglichen. Die Auswertung der Freisetzungsuntersuchungen zeigte, dass manche Formulierungen empfindlich gegenüber bestimmten Parametern waren, während eine andere Formulierung dies für diesen Parameter nicht war. Im erstellten Datensatz ergab sich so ein sehr heterogenes Bild der Freisetzungsdaten, das abhängig vom Testprogramm und der jeweiligen Formulierung war.
Im Folgenden sollte untersucht werden, ob die in vitro generierten Daten prädiktiv für das Verhalten der Arzneiformen im Menschen waren. Dafür wurden dieselben vier Formulierungen in einer „4-Wege cross-over“- Humanstudie, mit Hilfe der Salivary Tracer Technique, auf ihr In vivo-Verhalten untersucht. Es ließ sich feststellen, dass das GastroDuo in der Lage war zwischen den Arzneiformen zu unterscheiden, die auch in vivo Unterschiede aufweisen. Dies war mit kompendialen Methoden nicht immer möglich. Der signifikante Vorteil des GastroDuo gegenüber anderen Systemen ist die Möglichkeit, physiologische Extrema getrennt voneinander darzustellen und ihren Einfluss zu quantifizieren. Daher bietet das GastroDuo ein wertvolles Werkzeug, um den Zerfall und die Freisetzung von schnell freisetzenden Arzneiformen besser zu verstehen.
Abschließend lässt sich sagen, dass es uns in der vorliegenden Arbeit gelungen ist, wichtige Hilfsmittel für das Verständnis des Zerfalls- und Freisetzungsverhalten von schnell freisetzender Arzneiformen im nüchternen Magen weiterzuentwickeln. Es ist uns gelungen, bestehende In vitro-Modelle technisch zu verbessern, eine neue In vivo-Methode zu entwickeln und zu valideren, welche eine sinnvolle Ergänzung zu bereits bestehenden In vivo- Methoden darstellt.
Im Laufe der letzten Jahre hat sich herausgestellt, dass Transportproteine einen entscheidenden Beitrag zur Absorption, Verteilung und Elimination zahlreicher Endo- und Xenobiotika leisten. Vor allem die hepatobiliäre Elimination nimmt eine Schlüsselrolle in systemischen Clearance-Prozessen ein. Vor dem Hintergrund, dass immer mehr hochmolekulare und metabolisch stabile Stoffe Eingang in die Arzneistoffentwicklung finden und diese vorwiegend hepatobiliär eliminiert werden, wurde es erforderlich, differenziertere Kompartimentmodelle zu entwickeln, um singuläre Substanzeffekte auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Gerade Interaktionen zwischen simultan verabreichten Arzneistoffen können zu erheblichen Nebenwirkungen durch Veränderung pharmakokinetischer Eliminationsprozesse in Kombination mit erhöhter oder eingeschränkter Bioverfügbarkeit führen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, für die frühe Arzneistoffentwicklung ein In vitro-Modell auf Basis des pharmakokinetischen Standardtiermodells der Ratte zu konzipieren, welches eine einfache Analyse hepatobiliärer Elimination auf indirektem Weg über die Interaktion mit fluoreszierenden Modellsubstraten ermöglicht. Die Zielvorgabe wurde umgesetzt, indem auf Basis literaturbeschriebener Methoden ein In vitro-Rattenhepatozytenmodell etabliert wurde. Hierfür war es zunächst unerlässlich, geeignete Kultivierungsbedingungen zu identifizieren und zu optimieren. Es konnte gezeigt werden, dass primäre Hepatozyten nur befähigt wurden, sich in vitro zu repolarisieren und eine in vivo-ähnliche Morphologie anzunehmen, wenn sie eingebettet zwischen zwei extrazellulären Kollagenmatrices kultiviert wurden. Diese sogenannte Sandwichkultivierung der Zellen und die Supplementierung des Zellkulturmediums mit dem Glukokortikoid Dexamethason erwiesen sich hierfür als wesentliche Faktoren. Die Hepatozyten reformierten sich folglich innerhalb von 96 Stunden unter Ausbildung eines vollständigen und sehr einheitlichen Gallengangssystems, welches nahezu jeden Hepatozyten umschloss. Nach Etablierung der Zellkultur wurden die sandwichkultivierten Hepatozyten hinsichtlich der Proteinexpression, ausgewählte Transportproteine und Cytochrome umfassend, über einen Kultivierungszeitraum von 10 Tagen charakterisiert, um die Validität des Zellsystems zu gewährleisten. Unter Bei-behaltung der optimierten Kultivierungsbedingungen konnte mit zunehmendem Repolarisierungsstatus der Zellen ein Anstieg der apikalen Transportproteinexpression unter Begleitung einer Erhöhung der molekularen Masse der Transportproteine verzeichnet werden. Als Grund für die Molekulargewichtszunahme im Laufe des Redifferenzierungsprozesses der Zellen konnte die posttranslationale N-Glykosylierung am Beispiel der Transportproteine P-gp, Mrp2 und Bcrp identifiziert werden. Verifiziert wurden die Proteinexpressionsdaten, die apikalen Effluxtransporter P-gp, Mrp2, Bsep und Bcrp betreffend, über die Bestimmung der funktionellen Aktivität unter Verwendung fluoreszierender Modellsubstrate über einen Kultivierungszeitraum von 8 Tagen. Diese funktionelle Aktivität der Transportproteine wurde durch das Erscheinen fluoreszierender Moleküle in den Lumina der Gallenkanälchen ersichtlich und nahm mit voranschreitender Maturierung des Gallenkanalnetzwerkes sowie mit Verstärkung der Transportproteinexpression, gekoppelt mit dem Grad der N-Glykosylierung, zu. Die Selektivität der einzelnen Modellsubstrate wurde mittels in der Literatur beschriebener Substrate und Inhibitoren untersucht und bestätigt. Auf Basis der funktionellen Charakterisierung wurde im Anschluss eine indirekte In vitro-Methode entwickelt, welche die Voraussetzung schuf, Interaktionspotentiale von Arzneistoffen mit Effluxtransportproteinen zu evaluieren. Die Inhibition eines apikalen Transportproteins resultierte dabei prinzipiell in Abhängigkeit der eingesetzten Substanzkonzentration in einer Reduktion des eliminierten fluoreszierenden Modellsubstratanteils, was mit einer Zunahme der intrazellulären Fluoreszenz korrelierte. So konnte aufgezeigt werden, dass bekannte Inhibitoren und Substrate die Transport-proteinaktivität konzentrationsabhängig reduzierten, ohne dass der sichtbare Effekt auf toxische Effekte der eingesetzten Substanzen zurückzuführen war. Dies konnte mittels des Zelltoxizitätsmarkers Alamar blue nachgewiesen werden. Clonidin, welches nicht als ABC-Transportersubstrat beschrieben worden ist, interagierte erwartungsgemäß auch mit keinem der Transportprozesse. Der Einsatz eines derartigen In vitro-Systems in der frühen Arzneistoffentwicklung könnte helfen, geeignete Arzneistoffkandidaten auszuwählen, welche ein geringes Potential aufweisen, mit hepatobiliären Effluxsystemen zu interagieren, um die Gefahr schwerer Arzneimittelnebenwirkungen zu minimieren.
Oral administration of drugs is the most common, convenient, safest and economical route of drug administration. There is lack of established tools to study the function of transporters in the intestinal absorption of drugs. Because of its favorable physico-chemical, pharmacokinetic and pharmacodynamic characteristics, trospium could be potentially used as a probe substrate to study the function of drug transporters. Therefore, this study was conducted to examine the suitability of trospium chloride as a probe drug to study the function of multidrug transporters in the human body. To this end, two randomized, controlled, four-period, cross-over pharmacokinetic drug interaction studies of oral and intravenous trospium with co-medication of oral clarithromycin or ranitidine were performed in 24 healthy subjects to mechanistically characterize the role of P-gp, OATP1A2, OCT1, OCT2, MATE1 and MATE2-K in the absorption and disposition of trospium. The contribution of the drug transporters in the absorption and disposition of trospium were examined in isolated systems using in vitro uptake and inhibition assays in transporter transfected human cell lines.
OCT1 (Vmax = 0.8 ± 0.1 nmol/min × mg) is a high capacity transporter of trospium compared to OCT2 (Vmax = 0.04 ± 0.01 nmol/min × mg). But the OCT2 (Km = 0.5 ± 0.1 µM) transporter demonstrated a high affinity in the transport of trospium compared to OCT1 (Km = 17.4 ± 2.1 µM). OCT1 genetic alleles *2, *3, *4 and *7 resulted in significant loss of activity and the alleles *5 and *6 caused complete loss of uptake of trospium. The common OCT2 genetic allele Ser270 caused slight but significant increase in activity of OCT2.
Ranitidine inhibits OCT1 (IC50 = 186 ± 25 µM), MATE1 (IC50 = 134 ± 37 µM) and MATE2-K (IC50 = 35 ± 11 µM)-mediated uptake of trospium in vitro. But it is a weak inhibitor of OCT2 transporter (IC50 = 482 ± 105 µM). Using FDA and EMA in vitro to in vivo extrapolation models, ranitidine was predicted to have a potential inhibition effect on intestinal OCT1 ([I]2/IC50 ~40), renal MATE1 ([I]1/IC50 ~0.02) and MATE2-K ([I]1/IC50 ~0.1) transporters in vivo. Clarithromycin was predicted to cause DDI by inhibiting P-gp-mediated efflux of trospium at the intestine ([I]2/IC50 of ~310) and hepatocytes ([I]3/IC50 ~1). Therefore, co-medication of oral clarithromycin was expected to result in an increase in oral absorption and hepatic clearance of trospium but not changes in distribution volume.
In healthy subjects, oral trospium is slowly (MAT ~10 h) and poorly (F ~10 %) absorbed from the jejunum and cecum/ascending colon, widely distributed into the body (Vss = 5 - 6 l/kg) and slowly eliminated (t1/2 = 9 - 10 h) majorly via renal glomerular filtration and tubular secretion (CLR ~500 ml/min). After co-medication of clarithromycin (inhibitor of P-gp), on the contrary to our IVIVE prediction, we found a non-expected but significant expansion of the shallow and deep distribution spaces for trospium by ~27 %. A single dose administration of trospium with co-medication of ranitidine (inhibitor of OCT1) resulted in no effect on the intestinal absorption of trospium. But the renal clearance of trospium decreased slightly (15 %) but significantly.
Intravenously administered trospium (2 mg TC) might be a suitable probe drug to evaluate the effects of a P-gp inhibitor on distribution of a drug. Oral trospium chloride can be selected for DDI studies with new chemical entities (NCE) with predicted inhibitory potential on OCT1 and P-gp and which are available after oral absorption along the small intestine and in the cecum/ascending colon. Another kind of application of trospium chloride might be pharmacogenomics studies in subjects with functionally relevant polymorphisms of P-gp and OCT1 or in patients with suspected transport failure due to intestinal diseases. The function of the efflux transporters MATE1 and MATE2-K in the PTC of the kidneys can be well assessed with the probe drug trospium by measuring its renal clearance.
There is a growing interest in the application of non-thermal atmospheric pressure plasma for the treatment of wounds. Due to the generation of various ROS and RNS, UV radiation and electric fields plasma is a very promising tool which can stimulate skin and immune cells. However, not much is known about the mammalian cell responses after plasma treatments on a molecular level. The present work focusses on the impact of plasma on cell signaling in the human keratinocyte cell line HaCaT by using the methods DNA microarray, qPCR, ELISA and flow cytometry. Here, cell signaling mediators such as cytokines and growth factors which could promote wound healing by enhancing angiogenesis, reepithelization, migration and proliferation were of major interest. Additionally, the crosstalk between keratinocytes and monocytes was studied using a co-culture. For the first time extensive investigations on the impact of plasma on cell signaling in human keratinocytes were conducted. The most prominent cytokines and growth factors which were regulated by plasma at gene and protein level were VEGF-A, GM-CSF, HB-EGF, IL-8, and IL-6. The latter was not activated due to the JAK/STAT-pathway but probably by a combined activation of MAPK- and PI3K/Akt-pathways. By the use of conditioned medium it was found out that ROS and RNS generated directly after plasma treatment induced larger effects on cell signaling in keratinocytes than the subsequently secreted growth factors and cytokines. Furthermore, monocytes and keratinocytes hardly altered their secretion profiles in co-culture. From these results it is deduced that the plasma generated reactive species are the main actors during cell signaling. In order to differentiate the impact of ROS and RNS on the cellular response the ambience of the plasma effluent was controlled, varying the ambient gas composition from pure nitrogen to pure oxygen. Thereby a first step towards the attribution of the cellular response to specific plasma generated reactive species was achieved. While IL-6 expression correlated with ROS generated by the plasma source, the cell signaling mediators VEGF-A, GM-CSF and HB-EGF were significantly changed by RONS. Above all hydrogen peroxide was found to play a dominant role for observed cell responses. In summary, plasma activates wound healing related cell signaling mediators as cytokines and growth factors in keratinocytes. It was also shown that the generated reactive species mainly induced cell signaling. For the first time cell responses can be correlated to ROS and RONS in plasma treated cells. These results underline the potential of non-thermal atmospheric pressure plasma sources for their applications in wound treatment.
Non-thermal atmospheric pressure plasma has drawn more and more attention to the field of wound healing research during the last two decades. It is characterized by a unique composition, which includes amongst others free radicals, ions and electrons. Furthermore, non-thermal plasma exhibits temperatures that are below those inducing thermal cell damage. Next to its well-established anti-bacterial properties, plasma can have lethal as well as stimulating effects on mammalian cells. Therefore, the medical application of non-thermal plasma on chronic wounds seems to be a promising tool to enable healing processes. However, less is known about the plasma-mediated induction of intracellular signaling pathways in human immune cells, which play a leading part in the process of wound recovery and removal of pathogens. Therefore, this thesis examined the cellular effects of a non-thermal atmospheric pressure plasma treatment on human immune cells using the argon plasma jet kinpen 09. Here, the CD4+ T helper cell line Jurkat, the monocyte cell line THP-1 as well as the corresponding primary cells were investigated. First, cell survival and apoptosis induction was assessed in response to non-thermal plasma treatment by growth curves and flow cytometric assays. On the one hand it could be shown that primary cells are more susceptible to plasma treatment than the respective cell lines. On the other hand, monocytes responded less sensitive to plasma exposure than lymphocytes. Furthermore, this thesis outlined the impact of non-thermal plasma treatment on the gene expression level of immune cells. Therefore, DNA microarray analysis was performed with the cell lines Jurkat and THP-1. It became obvious that plasma exposure modulated the expression of several genes in both cell types. Differential expression of distinct target genes was further validated by quantitative PCR in the immune cell lines. Here, elevated gene expression levels of JUN and FOS in Jurkat cells and increased transcription of JUND in THP-1 cells in response to plasma treatment were made visible. JUN, FOS and JUND are components of the transcription factor AP-1, which is involved amongst others in gene expression of IL-8 and HMOX-1. Consequently, transcriptional induction of the inflammatory cytokine IL-8 as well as the enzymes HMOX-1 and GSR was detected in plasma-treated THP-1 cells. In addition, alterations in the protein activation levels were analyzed in plasma-treated Jurkat, THP-1 cells and primary monocytes. Since some of the identified target genes are known to be associated with the MAPK pathways, the regulation of these cascades was further investigated by western blot analysis. In all investigated cell types the pro-proliferative signaling molecules ERK 1/2 and MEK 1/2 as well as the pro-apoptotic signaling proteins p38 MAPK and JNK 1/2 were activated in a plasma treatment time dependent manner. In contrast to Jurkat and primary monocytes, the anti-apoptotic HSP27 was only induced in THP-1 cells in response to plasma exposure. Moreover, modulation of cytokine production and secretion was examined in the different immune cell types and co-cultured THP-1 and HaCaT keratinocytes by ELISA or flow cytometry. While Jurkat cells showed no plasma-mediated regulation of cytokine expression, THP-1 cells revealed an increased IL-8 secretion after long plasma time duration (360 s). Additionally, the intracellular expression levels of IL-6 and IL-8 were modulated in primary monocytes by plasma exposure. While short plasma treatment caused no alteration of the number of cells expressing IL-8 an up-regulation of the intracellular IL-6 level occurred after 30 s of plasma treatment. Long plasma treatment times resulted in a significant decrease of the intracellular IL-8 and IL-6 production levels. Furthermore, co-cultured THP-1 and HaCaT cells as well as mono-cultured THP-1 and HaCaT cells were examined regarding their cytokine secretion profile. Here, cells treated with plasma (180 s) as well as LPS and plasma (180 s and LPS) were compared with untreated cells. IL-6, IL-8 and GM-CSF secretion was induced by both plasma and plasma combined with LPS treatment in mono-cultivated HaCaT cells and co-cultured cells. Though, the highest cytokine secretion levels were reached in the plasma and LPS exposed co-culture. In contrast, mono-cultivated THP-1 cells only showed an increased secretion of IL-6, IL-8 and TNFa after incubation with plasma together with LPS exposed medium. In conclusion, this study revealed for the first time the non-thermal plasma-modulated expression of numerous genes and cytokines and the activation state of various signaling cascades in human immune cells. Thus, it contributes to gain a better understanding of the immune-modulatory impacts of plasma that might promote the wound healing process.
Ein Netzwerk aus Rezeptoren und Signalkaskaden reguliert Wachstum, Differenzierung und Überleben von Zellen. Wird dieses Netzwerk aus dem Gleichgewicht gebracht, können die Zellen zu Tumorzellen transformieren. Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) stellt eine treibende Kraft in diesem Netzwerk dar und ist ein Ziel zahlreicher Tumortherapeutika. Aufgrund weitläufiger Resistenzbildung ist die Identifizierung verantwortlicher Strukturen von großer Bedeutung um die entarteten Signalkaskaden synergistisch einzudämmen. Nach Aktivierung des EGFR wird eine signalspezifische Antwort durch Rekrutierung von Adapterproteinen an die intrazelluläre Domäne initiiert. Die veränderte Zusammensetzung der Signalproteine könnte Angriffspunkte für neue Therapieansätze enthüllen. Um die zugrundeliegenden Mechanismen zu entschlüsseln, wurden mehrere Proteom-Untersuchungen auf Zelllysate angewendet. Ungeachtet der Sensitivität moderner Geräte stellt die Identifizierung niedrig-abundanter Proteine im Proteom einer Zelle jedoch eine Herausforderung dar. Die Identifizierung differentieller Proteinmuster des EGFR-Interaktom in Abhängigkeit von Resistenz und Rezeptor variante war das Ziel dieser Arbeit. Der EGFR samt seiner Interaktionspartner wurde aus Zelllysaten präzipitiert. Anschließend wurden die Proteine in einer SDS-PAGE aufgetrennt und nach in-Gel-Verdau mit LC-MS/MS analysiert. Aus Lysaten von A431-Zellen wurden 183 Proteine in vier Bioreplikaten detektiert. Darunter 15 direkte Interaktionspartner, wie GRB2, SHC1, SOS1/2, STAT1/3, AP2 sowie P85B. Die Berechnung des normalized spectral abundance factor (NSAF) anhand der Anzahl gemessener Spektren und der Molekularmasse eines Proteins ermöglichte eine relative Quantifizierung der Proteinmenge. Die Menge der copräzipitierten Proteine war nach EGFR-Aktivierung durch EGF für 14 Proteine mehr als zweifach erhöht. Davon waren Untereinheiten des AP2 Komplexes am stärksten an aktivierten EGFR assoziiert. Abschließend wurde die Interaktion mit AP2 und die neu aufgedeckte Interaktion mit CIP2A durch Immunfluoreszenz und Western Blot-Analyse bestätigt. Nachdem die Funktionalität der Methode gezeigt werden konnte, wurde die Anwendung um das Modell einer akuten Afatinib-Resistenz erweitert. Im A431-Zellmodell wurde durch die Inkubation in Fibroblasten-konditioniertem Medium eine Resistenz gegen Afatinib beobachtet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ermittelt werden, ob sich der Einfluss der temporären Resistenz am Interaktionsmuster des EGFR widerspiegelt. Die MS-Analyse identifizierte 145 Proteine deren Assoziation an EGFR durch Afatinib mindestens zweifach verringert wurde, darunter GRB2, SOS1, SHC1, STAT2/3 sowie PK3CB und P85B. Aus dieser Analyse wurde ein Pool aus 137 Proteinen ermittelt, die potentiell Teil des induzierten Resistenzmechanismus sein könnten. 32 Proteine, darunter TNAP2, AHNK, SPTCS und der Tumorsuppressor DIDO, weisen funktionelle Ähnlichkeit zu Lungenkrebs auf. Daraufhin wurde die Methode auf das Modell einer chronisch erworbenen Resistenz der Lungenkarzinom-Zelllinie HCC4006 gegen Erlotinib angewendet. Die Analyse sollte zunächst differentielle Proteinmuster des Grundzustandes in Abhängigkeit zur erworbenen Resistenz identifizieren. Die Morphologie der Erlotinib-resistenten HCC4006-Zellen weist Merkmale einer EMT auf, die als Resistenzmechanismus für verschiedene Tumore beschrieben ist. Im Einklang mit dieser Beobachtung wurden Hinweise auf rege Veränderungen des Zytoskeletts in der vorliegenden MS-Analyse der resistenten HCC4006-Zellen gefunden. In unbehandelten Zellen wurden abhängig vom Resistenz-Status der Zellen 178 Proteine mit mindestens zweifach veränderter Assoziation an EGFR detektiert. Darunter fanden sich die Proteine der Zytoskelettreorganisation Plectin, Spectrin und ZO1, welche in resistenten Zellen bis zu 70 fach erhöht waren. Das Angiogenese-Protein Nostrin ist hingegen nach Resistenzentwicklung stark vermindert. Nach Behandlung mit Erlotinib und EGF war die Assoziation von 148 Proteinen durch Erlotinib Resistenz verändert. Darunter befanden sich HEAT1, EF1A1, UBS3B und AP3B1 die in sensitiven Zellen durch Erlotinib stärker dissoziierten als in den resistenten Zellen. Abschließend wurde die differentielle Analyse auf zwei EGFR VarianteIII (vIII) transfizierte Glioblastomzelllinien übertragen. In den P3-Zellen sind 95 Proteine in Abhängigkeit der Rezeptorvariante zweifach verändert an EGFR assoziiert. Darunter waren JAK1, GRB2, PRKDC und SNX-3, 17 und 27 vermehrt an vIII assoziiert, wohingegen PHB2 bevorzugt an Wildtyp-EGFR assoziiert. In den NCH421k Glioblastomzellen ist die Affinität für vIII bei 245 Proteinen zweifach verändert. Darunter die Phosphokinasen P85A und P85B mit stark erhöhter vIII-Affinität. Für vIII ist eine bevorzugte Initiierung des PI3K/AKT Signalweges, sowie eine konstitutive Aktivität bereits beschrieben. Mit dem Abschluss dieser Arbeit liegt ein Protokoll zur differentiellen Analyse der EGFR Interaktionsmuster vor
Das In vitro-Testsystem der Gefäß-simulierenden Durchflusszelle (vessel-simulating flow-through cell, vFTC) ermöglicht die Untersuchung der Wirkstofffreisetzung und -verteilung aus Arzneistoff-freisetzenden Stents (drug-eluting stents, DES) zwischen dem Perfusionsmedium, dem Hydrogelkompartiment und dem in der Stentbeschichtung verbliebenden Wirkstoffanteil. Die vorliegende Forschungsarbeit hatte zum Ziel, die physikochemischen Eigenschaften des Gefäß-simulierenden Gelkörpers (ein 3 %iges Alginat-Gel) unter Erhaltung definierter Materialeigenschaften wie Elastizität, Festigkeit und Formstabilität der Hydrogelkompartimente unter Perfusionsbedingungen zu verändern und den Einfluss der Einbettungsbedingungen auf die Wirkstofffreisetzung und -verteilung von mit Modellwirkstoffen-beschichteten Stents in der vFTC zu untersuchen. Die Modifizierung der physikochemischen Eigenschaften des Alginat-basierten Hydrogelkompartimentes konnte durch Integration des hydrophoben Adsorbens LiChroprep® RP-18 sowie durch den Austausch der wässrigen Phase durch die o/w-Emulsion Lipofundin erfolgreich abgeschlossen werden. Dabei zeigte die 5 %ige LiChroprep-Formulierung eine schnelle Gelierung, ergab formstabile Gelkörper und beobachte Auswaschungseffekte des inkorporierten Adsorbens (bei einem Masseanteil im Gel von ≤ 10 %) unter Perfusion in der vFTC blieben aus. Eine maximale Änderungen der Verteilungseigenschaften ergab sich für die Kombination der hydrophoben Modellsubstanz Triamteren mit dem LiChroprep-Gel (Verteilungskoeffizient von ~ 5). Im Rahmen der Freisetzungs- und Verteilungsuntersuchungen in der vFTC konnte eine Anreicherung im LiChroprep-Gel (gegenüber dem Alginat-Gel) beziehungsweise eine Änderung der Wirkstoffverteilung zwischen den Kompartimenten Freisetzungsmedium, Hydrogel und Stentbeschichtung jedoch nicht bestätigt werden. Die numerische Modellierung der experimentellen Freisetzung mittels Finite-Elemente zeigte jedoch, dass im Fall von Triamteren der Einfluss einer Gelhydrophobisierung auf die Freisetzung und Verteilung mit steigender Entleerungsgeschwindigkeit des Modellwirkstoffes aus der Stentbeschichtung zunimmt. Für die In vitro-Testung von DES in der vFTC über einen verlängerten Versuchszeitraum von 28 Tagen konnten geeignete, Langzeit-stabile Gelformulierungen aus Agar, Agarose, Polyacrylamid und Polyvinylalkohol gefunden werden. Diese unterschieden sich hinsichtlich ihrer Herstellungstechnik, ihren Quellungseigenschaften, ihrer makroporösen Gelstruktur, ihren Verteilungs- und Diffusionseigenschaften sowie den Materialeigenschaften, Gelfestigkeit und Elastizität. Der Vergleich der mit Hilfe des Texture Analyser ermittelten Kraft-Deformations-Profile der Gelkörper vor und nach 28-tägiger Perfusion in der vFTC zeigte, dass die untersuchten Materialeigenschaften, Festigkeit und Elastizität, im Fall der Agarose-, Polyacrylamid- und Polyvinylalkohol-Gelkörper trotz kontinuierlicher Scherbeanspruchung durch Perfusion des Gellumens nahezu unverändert waren. Aufgrund der schnellen und simplen Herstellungstechnik, der milden Gelierungsbedingungen, der elastischen Eigenschaften und der nahezu unveränderten mechanischen Stabilität unter Flussbedingungen in der vFTC erscheint das Agarose-Gel der vielversprechendste Kandidat der für die vFTC neu entwickelten Gelformulierung zu sein. Die Untersuchung der Diffusions- und Verteilungseigenschaften in den Langzeit-stabilen Hydrogelkompartimenten ergab eine Gleichverteilung der hydrophoben Modellsubstanz Triamteren zwischen dem Agar-, dem Agarose- beziehungsweise dem Polyacrylamid-Gel und dem flüssigem Kompartiment, während für die Polyvinylalkohol-Formulierung eine minimale Anreicherung (Verteilungskoeffizient von ~ 2) im Hydrogel gezeigt werden konnte. Die Wirkstoffdiffusion im Gel variierte von 2 x 10-4 mm2/s für Polyvinylalkohol, 5 x 10-4 mm2/s für Alginat und Polyacrylamid bis 8 x 10-4 mm2/s für Agarose. Die theoretische Modellierung der experimentellen Freisetzung mittels Finite-Elemente-Methode ergab in Abhängigkeit unterschiedlicher Entleerungsgeschwindigkeiten aus dem Wirkstoffreservoir und unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Verteilungs- und Diffusionseigenschaften von Triamteren in den Langzeit-stabilen Hydrogelkompartimenten die schnellste Wirkstofffreisetzung in das Gel und die höchste Wirkstoffanreicherung im Gel im Fall des Polyvinylalkohol-Gelkörpers. In Abhängigkeit unterschiedlicher Diffusionsgeschwindigkeiten in einem Modellgel (bei konstantem Verteilungskoeffizienten- und gleichbleibenden Entleerungsgeschwindigkeiten aus der Polymerbeschichtung) konnte gezeigt werden, dass die Geschwindigkeit der Wirkstofffreigabe ins Freisetzungsmedium mit steigender Wirkstoffdiffusion im Hydrogel reduziert ist. Gleichzeitig ist die Entleerungsgeschwindigkeit aus dem Wirkstoffreservoir gesenkt, während der absolut ins Hydrogel eluierte Wirkstoffanteil steigt sowie terminal anschließend langsamer ins Medium rückverteilt wird. So scheinen die physikochemischen Eigenschaften des Hydrogelkompartimentes im Rahmen der experimentell durchgeführten Gelmodifikationen/Gelbildnersubstitution eine untergeordnete Rolle auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten der Modellwirkstoffe aus DES in der vFTC zu spielen. Die numerischen Modellierungen der experimentellen Wirkstofffreisetzung zeigen jedoch, dass eine Änderung der Verteilungs- und Diffusionskoeffizienten im Hydrogel und in der Stentbeschichtung zu Konzentrationsunterschieden in den Verteilungskompartimenten führen kann. So nimmt mit zunehmender Hydrophobisierung des Hydrogelkompartimentes, mit steigender Entleerungsgeschwindigkeit aus dem Wirkstoffreservoir und einer verlangsamten Diffusion im Hydrogel der Einfluss des Hydrogelkompartimentes auf die Wirkstofffreisetzung und verteilung in der vFTC zunimmt.
Natürliche Metabolite sind Ausgangsstoff für eine Reihe von Arzneimitteln wie zum Beispiel Antibiotika. Doch bis zur Anwendung am Menschen sind viele Analyseschritte notwendig. Da viele Naturstoffe nicht in ausreichenden Mengen zur Verfügung gestellt werden können, wird deren Funktionsanalyse und Anwendung erschwert. Für dieses Defizit sind im Wesentlichen zwei Ursachen zu nennen. Entweder ist eine Vielzahl der Produzenten nicht kultivierbar oder eine ausreichende Synthese ist unter Laborbedingungen im Ausgangsstamm nicht möglich. Aus diesem Grund sind alternative Strategien wie zum Beispiel eine heterologe Expression dieser Synthese-Cluster in geeigneten Wirten notwendig. Dies war der Ansatzpunkt für die vorliegende Arbeit. Eine besondere Bedeutung innerhalb der Naturstoffe kommt der strukturell diversen und mitunter sehr komplexen Gruppe der Polyketide und nichtribosomalen Peptide zu, die oft pharmazeutisch relevante Wirkungen aufweisen. Die für ihre Synthese verantwortlichen Enzyme (PKS und NRPS) sind häufig beachtliche Multienzymkomplexe, die durch Gencluster codiert werden, deren Größe von 10–100 kbp reichen kann. Bisher wurden für die heterologe Produktion dieser Metabolite in erster Linie Actinomyceten wie zum Beispiel Streptomyces coelicolor und Myxococcus xanthus, die selbst eine Vielzahl an Polyketiden und nichtribosomalen Peptiden synthetisieren, oder Escherichia coli genutzt. In der vorliegenden Arbeit wurde Bacillus subtilis, der bereits breite Anwendung in der industriellen Herstellung von technischen und pharmazeutischen Proteinen findet, erstmals als heterologer Wirt für die Synthese eines Polyketids (6-Desoxyerythronolid B) und eines nichtribosomalen Peptids (Enniatin B) eingesetzt. Zu diesem Zweck wurde ein Klonierungsprotokoll für die schnelle und wiederholte Genommodifizierung entwickelt. Dieses basiert auf der Kombination von transformationssteigernden Elementen (sogenannten six-sites) mit der chromosomalen Integration einer induzierbaren Kopie des Kompetenzfaktors ComS. Zur Markerentfernung wurde das Cre-lox-System implementiert. Durch die zusätzliche Deletion des Restriktions- und Modifikationssystems wurde eine weitere Voraussetzung zur chromosomalen Integration großer Gencluster geschaffen. Damit steht nun ein optimiertes Protokoll für die Konstruktion von B. subtilis-Expressionsstämmen und deren weiterer genomischer Modifizierung zur Verfügung. Als Vertreter einer komplexen Polyketidsynthase wurde die Desoxyerythronolid B-Synthase (DEBS) aus Saccharopolyspora erythraea ausgewählt. Dieser aus drei ca. 300–350 kDa großen Proteinen (DEBS1–3) bestehende Enzymkomplex ist für die Bildung des Makrolids 6-Desoxyerythronolid B (6dEB) verantwortlich, das die Vorstufe des antibiotisch wirksamen Erythromycins darstellt. Das korrespondierende Gencluster umfasst drei ca. 10 kb große Gene (eryAI–III) und konnte erfolgreich in drei Operonstrukturen im Genom von B. subtilis lokalisiert werden: als i) natürliches Operon, ii) modifiziertes Operon mit optimierten RBS und iii) drei separate Expressionskassetten. Unter fed-batch-simulierenden Bedingungen (EnBase-System) gelang dabei ein positiver Metabolitennachweis für den Stamm mit drei separaten Expressionskassetten. Um das Zellwachstum und die 6dEB-Synthese zu verbessern, wurden weiterführende Genommodifizierungen des Produktionsstammes vorgenommen, von denen sich einige positiv auf die Produktbildung auswirkten. Mit diesem Versuch wurde erstmals die prinzipielle Eignung von B. subtilis als heterologer Produzent für komplexe Polyketide erbracht. Die Enniatin-Synthetase (ESyn) aus dem filamentösen Pilz Fusarium oxysporum wurde als Beispiel einer nichtribosomalen Peptidsynthetase in die Arbeit einbezogen. Aufgrund der handhabaren Größe des esyn-Gens (10 kb) wurde die Expression auf single- und multi-copy-Level untersucht. Dabei wurde auch der Einfluss verschiedener Genommodifizierungen und Änderungen in den Wachstumsbedingungen auf die Produktbildung analysiert. Die Kultivierungsversuche inklusive Metabolitenanalyse wurden in Kooperation mit dem Institut für Biologische Chemie an der TU Berlin durchgeführt. Abschließende Konzentrationen des entsprechenden Metaboliten (Enniatin B), einem zyklischen Hexadepsipetid mit zahlreichen antiinfektiven Wirkungen, wurden auf 4,5 µg/L (single-copy) bzw. 1,2mg/L (multi-copy) beziffert. Damit konnte in B. subtilis zum ersten Mal die heterologe Produktion eines gattungsfremden nichtribosomalen Peptids demonstriert werden. Zusammengefasst beschreibt die präsentierte Arbeit die erfolgreiche Produktion eines komplexen Polyketids und eines nichtribosomalen Peptids. Obwohl weitere Untersuchungen notwendig sind, um einige unerwartete Effekte bestimmter Genommodifizierungen aufzuklären und eine weitere Steigerung in der Produktausbeute zu erreichen, konnte eindeutig belegt werden, dass sich B. subtilis als Wirt für die heterologe Produktion von Sekundärmetaboliten eignet.
The investigated bacterial strain 64G3 was isolated from an offshore oil reservoir in Vung Tau, Vietnam. By means of 16S rDNA sequence alignment and DNA-DNA hybridization with Petrotoga mexicana DSM 14811, the isolate was identified as Petrotoga mexicana species. Morphologically, the 64G3 cells were rod-shaped and cell sizes varied widely from 1.0 µm up to 60 µm in length and from 0.6 to 1.2 µm in width. The cells appeared single, pairwise or in chains within a sheath-like structure (a typical characteristic of the order Thermotogales) that ballooned over the cell ends. Cells were immobile and no flagella were observed. Strain 64G3 grew anaerobically at temperatures ranging from 30 to 65°C and within the pH range of 5.0 to 8.5 with optimum growth at 55°C and the pH 7.0. Elemental sulfur and thiosulfate served as alternative electron acceptors whereas sulfate did not. Cellular extract of strain 64G3 grown in a basal medium containing soluble starch displayed hydrolytic activity towards soluble starch. The amylase system includes at least two individual enzymes. Amylase activity of the cell extract was detected in a wide temperature range (30-80°C), with optimal enzyme activity at 75°C. By using degenerate primer for PCR amplification of GH13 enzyme coding regions in combination with other molecular methods, a full amylase coding gene containing four conserved regions of α-amylase was obtained. The deduced sequence showed low identities (up to 40%) to other known amylases. This 1992 bp coding gene was heterologously expressed in E. coli and its product (amylase) was characterized. Under common expression conditions, the 77 kDa amylase (rAmyA) was predominantly produced as inclusion bodies (insoluble protein). The minor amount of soluble active amylase was used for purification and characterization of the enzyme. rAmyA was active on starch at temperatures between 30-55°C, with an optimum at 45oC. It is not thermostable because it was completely inactive after incubation at 65°C for 15 min. The enzyme was active over a pH range from 4.5-8.0, with an optimum at pH 6.5. Beside starch, rAmyA also hydrolysed glycogen, amylose, amylopectin and other oligosaccharides. Pullulan and cyclodextrins were not the substrates for this amylase. The enzyme hydrolyzed starch in an endo-acting manner, releasing maltose and maltotriose as major products and a lesser amount of glucose. On the basis of the primary structure, the substrate specificities and the hydrolysis pattern, rAmyA was classified as an endo-acting α-amylase (EC. 3.2.1.1). The cpn10/60 operon from psychrophilic O. antarctica was cloned and expressed in B. subtilis using a multi-copy plasmid. The amounts of soluble 60 kDa Cpn60 and 10 kDa Cpn10 produced at temperature ranging from 10 - 30°C were high and stable during cell growth. To investigate the impact of psychrophilic chaperonin on cold adaptation, cells with (cpn+) and without (cpn-) cpn10/60 operon were grown at 10 and 15°C. Growth comparison between two strains revealed that psychrophilic chaperonin did not support cold adaptation of B. subtilis at 10 and 15°C as it did in E. coli. A single copy of O. antarctica cpn10/60 operon was integrated into the amyE locus of the B. subtilis chromosome. The yeast α-glucosidase, a theoretic protein substrate for this chaperonin, was heterologously produced in B. subtilis at temperatures ranging from 15-30°C. Within this temperature range, the major amount of this protein appeared as inclusion bodies. Co-expression of O. antarctica cpn10/60 operon at 15°C, however, did not result in a higher activity of glucosidase. Moreover, SDS-PAGE analysis of cellular insoluble fractions revealed that the amount of insoluble enzyme produced in cpn+ cells did not decrease in comparison with that produced in cpn- cells, indicating that the recombinant chaperonin had no impact on recovery of active α-glucosidase from the inclusion bodies.
HPMC (Hydroxypropylmethylcellulose) based hydrophilic gel matrix tablets are one of the most commonly used monolithic extended release dosage forms used in the pharmaceutical industry. Drug release from the hydrated HPMC matrix is generally controlled by either diffusion or erosion, or a combination of both. Several studies have shown that for HPMC-based matrices with a high amount of poorly water-soluble additives, erosion is the predominant release mechanism. Erosion rates of these formulations vary significantly with changes in the matrix composition. Depending on the erosion rate, the drug delivery might occur over a shorter or longer time span and thus to different sites of action that are proximal or distal gastrointestinal tract (GIT). Erosion rates of HPMC-based matrices can be modulated by changing the amount and molecular weight of the HPMC. In the present study, four different HPMC-based hydrophilic matrix formulations developed by AstraZeneca R&D, Sweden, were investigated for in vitro as well as in vivo erosion behavior. Formulations F1, F2, and F3 consist of 40% HPMC, which is a mixture of two different HPMC viscosity grades (Methocel K100LV and Methocel K4M). Formulations F1, F2, and F3 contained 23%, 10%, and 0% of Methocel K4M, respectively, while formulation F4 was composed of 20% Methocel K100LV. Calcium hydrogen phosphate dihydrate (a poorly water-soluble compound) was used as the filling excipient. The in vitro HPMC release from the matrices was investigated using a USP dissolution apparatus II equipped with a stationary basket in a phosphate buffer (PB) pH 6.8 and simulated gastric fluid without pepsin (SGFsp) pH 1.2 at various rotation speeds. The HPMC concentration in the dissolution samples were analyzed using size exclusion chromatography coupled with multiangle light scattering and refractive index detectors (SEC-MALS/RI). In order to establish a correlation function between the magnetic moment and HPMC release, the formulations were tested in a magnetic moment dissolution tester (MMDT), a modified in vitro dissolution apparatus equipped with a magnetometer. The in vivo gastrointestinal imaging and erosion behavior of the tablets were investigated by magnetic marker monitoring (MMM) using a superconducting quantum interference devices (SQUIDs) sensor system in five healthy male volunteers at Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB), Berlin. All formulations were administered after an overnight fast of at least 10 hours. However, formulations 3 and 4 were also administered 30 minutes after a standard FDA breakfast. The in vivo HPMC release was calculated using the correlation function from the recorded in vivo magnetic moment data. A linear correlation function was not observed, since the decrease of the magnetic signal was driven by both erosion and diffusion. The in vitro and in vivo erosion-time profiles show that erosion was strongly dependent on the composition of the formulation. The formulations containing a larger proportion of high molecular weight HPMC, or a higher content of HPMC, exhibited relatively slower erosion rates and vice versa. However, unlike in vitro erosion rates, the in vivo erosion rates for different formulations did not always significantly differ from each other. In vivo erosion rates of the investigated formulations were significantly higher under postprandial administration than under fasted state administration. No rapid disintegration of any of the formulations (that is, formulation failure that can potentially cause dose dumping) was observed. A good linear (point-to-point) correlation between the in vitro HPMC release at 50 rpm in PB pH 6.8 and the in vivo HPMC release was observed for all formulations in the individual volunteers for both administration conditions. The predictability of the in vivo HPMC release for all formulations in fasting as well as postprandial administrations was better with phosphate buffer pH 6.8 at 50 rpm in comparison to SGFsp pH 1.2 or higher stirring rate in phosphate buffer pH 6.8. In postprandial administrations, the gastric emptying time was significantly delayed compared to fasting administrations. For postprandial administrations, the localized erosion rate in the distal stomach was significantly higher than in the proximal stomach. The in vivo HPMC release of the investigated formulations under both intake conditions was not dependent on the motility of the tablet in the gastrointestinal tract. The in vivo HPMC release for all the investigated formulations when administered under fasting conditions was underestimated, while under postprandial conditions, the HPMC release was overestimated by the in vitro dissolution method in PB pH 6.8 at 50 rpm.
Crab Spa, is a stable diffuse-flow hydrothermal vent site located at the 9°N hydrothermal vent field on the East Pacific Rise (EPR). Remarkably, the physicochemical conditions at Crab Spa have remained largely constant since its discovery in 2007 providing a uniquely stable environment in which a well-adapted and stable microbial community has evolved. This microbial community is dominated by the class Campylobacteria, accounting for up to 90% of the community. Little is known, however, about the metabolic pathways that allow the Campylobacteria to dominate the bacterial community at Crab Spa. To address this fundamental question, a two-pronged approach was taken consisting of first determining the dominant metabolic pathways in situ, and second to study those same metabolic pathways and their controls in more detail under defined conditions in vitro in the model campylobacterium Sulfurimonas denitrificans.
Metagenomic analysis of two environmental samples provided the blueprint to determine the metaproteomic profile of the Crab Spa microbial community. This allowed to identify the dominant organisms and their major metabolic pathways sustaining the microbial community at Crab Spa. About 90% of the genes for transcription and protein synthesis of the metagenome sequences belonged to just three genera of Campylobacteria: Sulfurimonas, Sulfurovum and Arcobacter. The metaproteomic analyses confirmed that the active microbial community was dominated by Campylobacteria, carrying out carbon fixation via the reductive TCA cycle predominantly fueled by the oxidation of sulfide and sulfur with nitrate and oxygen. The analysis further revealed that pathways might be partioned between different members of the bacterial community. Proteins involved in electron acceptor–related pathways, in particular denitrification, accounted for up to 20% of the whole metaproteome, which could be seen as an adaptation to the scarcity of electron acceptors at Crab Spa. Conversely, proteins related to electron donor–associated metabolic pathways accounted for less than 0.1% of the metaproteome, possibly in response to the high concentration of the electron donor. To follow up on this hypothesis, chemostat experiments with S. denitrificans were performed under either electron-acceptor or -donor limitation. These experiments confirmed that electron-acceptor limitation lead to the elevated expression of electron-acceptor proteins. However, a higher expression of electron-donor proteins was not observed under electron-donor limitation. Besides hydrogen sulfide, elemental sulfur has the potential to serve as an important electron donor at Crab Spa. However, up to know no information was available on how Campylobacteria might be able to utilize elemental sulfur. For this, S. denitrificans grew with either thiosulfate or cyclooctasulfur (S8) as sole electron donors and its transcriptome and proteome was compared. The results revealed a differential expression of the SOX sulfur oxidation pathway (soxCDYZ and soxABXYZ) in response to the two different sulfur compounds. Based on these findings, a model for the oxidation of cylcooctasulfur was proposed that also applies to other sulfur-oxidizing Campylobacteria and helps in the interpretation of environmental metatranscriptomic and –proteomic data (Götz, Pjevac, et al., 2018; Lahme et al., 2020). The presented results help to better understand the microbial processes at hydrothermal vents.
Lungenkrebs ist mit rund 40.000 Todesfällen pro Jahr die häufigste Krebstodesursache in Deutschland. Daher ist es nötig neue Behandlungsmethoden zu entwickeln, die gezielt am Tumor angreifen und möglichst geringe Nebenwirkungsraten aufweisen. Dazu eignet sich möglicherweise das inhalative magnetische Drug Targeting, bei dem superparamagnetische Aerosoltröpfchen als Drug Carrier dienen, welche nach der Inhalation mittels eines extern angelegten Gradientenfeldes gezielt am Wirkungsort angereichert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob es möglich ist superparamagnetische Aerosole mit Hilfe von Magnetfeldgradienten von ihrer Flugbahn abzulenken, um sie an einer definierten Abscheidefläche vor dem Magneten abzuscheiden. Dabei wurden einige Parameter, wie die Kerngröße der magnetischen Nanopartikel, der Tröpfchendurchmesser, die Gradientenfeldstärke, die Ferrofluidkonzentration und die Strömungsgeschwindigkeit der Luft variiert, um deren Einfluss auf die Abscheidung zu beobachten. Die Grundlage dieses magnetischen Aerosols bildet ein Ferrofluid, welches mittels Ammoniak aus Eisen(II)- und Eisen(III)-chlorid-Lösung gefällte Magnetit-Nanopartikel enthält, die durch eine Citrathülle vor Agglomeration und Sedimentation geschützt werden. Nach dem Vernebeln mit zwei Geräten, die auf unterschiedlichen Verneblungsprinzipien beruhen, sind die magnetischen Nanopartikel im Aerosoltröpfchen eingeschlossen. Die mittels Laserdiffraktometrie bestimmten mittleren Massendurchmesser betragen dabei zwischen 2,5 µm mit dem Pari Boy und 5 µm mit dem eFlow. Diese sollten durch Zusatz von Substanzen, die die Oberflächenspannung senken (Cremophor RH 40 und Ethanol), die Viskosität erhöhen (Glycerol, Cremophor RH 40 und Ethanol) oder den Dampfdruck erhöhen (Ethanol) gesenkt werden. Deutliche Effekte zeigen sich insbesondere bei Zugabe von 20 % Cremophor RH 40 und 40 % Ethanol zum Ferrofluid. Dadurch konnten die Durchmesser auf jeweils 2 µm beim Pari Boy und circa 3,4 und 3,9 µm beim eFlow reduziert werden. Die prozentuale Abscheidung des Ferrofluids wurde in verschiedenen Magnetfeldgeometrien unterschiedlicher Gradientenfeldstärke untersucht. Die Variation der Tröpfchengröße des superparamagnetischen Aerosols führt zu unterschiedlichen Ausmaßen der Ferrofluidabscheidung. Tatsächlich ist die Abscheidung des Ferrofluides nach dem Vernebeln mit dem eFlow, dessen Tröpfchendurchmesser etwa doppelt so groß wie der des Pari Boy ist, wesentlich höher. Während mit dem Pari Boy vom 1 molaren Ferrofluid im Gradientenfeld zweier gleichpoliger Stabmagnete (r x l = 15 x 25 mm) mit einer Remanenz von 1450 mT nur circa 30 % des Aerosols impaktiert werden kann, sind es mit dem eFlow unter gleichen Versuchsbedingungen etwa 80 %. Das liegt einerseits an der größeren Magnetitmasse im Tröpfchen und andererseits an der geringeren Aerosolgeschwindigkeit. Je stärker das verwendete Gradientenfeld war, desto mehr Ferrofluid konnte impaktiert werden. Desweiteren wurde die Abscheidung verschieden konzentrierter Ferrofluide (0,5; 1, 2 und 6 M) untersucht. Diese war umso größer, je konzentrierter das Ferrofluid war. Unterschiedliche Strömungsgeschwindigkeiten konnten durch Verwendung einer Vakuumpumpe untersucht werden. Es wurden zwei sehr kleine Strömungsgeschwindigkeiten (0,03 und 0,1 m/s) eingestellt, um möglichst nahe an die realen Strömungsgeschwindigkeiten in den terminalen Bronchien zu kommen. Dabei zeigte sich, dass die prozentuale Ferrofluidabscheidung bei langsamen Strömungsgeschwindigkeiten besonders hoch ist. Allerdings weisen die in dieser Arbeit verwendeten Magnete in größerer Entfernung nur noch sehr schwache Gradienten auf und sind daher für eine Anwendung an der menschlichen Lunge nicht geeignet. Die Einführung eines Modellimplantats in die Versuchsröhre sollte die Abscheidung des Ferrofluides erhöhen. Die erzielte Erhöhung der Ferrofluidabscheidung ist allerdings unbefriedigend. Die Simulation mit Mathematica® hat ergeben, dass die experimentelle Ferrofluidabscheidung geringer ist als die theoretische Abscheidung. Beim Pari Boy und 0,1 m/s unterscheiden sie sich um maximal 10 %. Beim eFlow beträgt die Differenz bis zu 8 %. Die Abweichungen zur Simulation werden durch Sedimentation des Ferrofluides verursacht. Diese ist stärker ausgeprägt als in der Berechnung, da sich die Luft beim Vernebeln durch Verdunsten von Wasser und Ausdehnung der Luft aufgrund des Joule-Thomson-Effektes abkühlt. Die kalte Luft bewegt sich nach unten und reißt das Ferrofluid mit herab. Es konnte gezeigt werden, dass sich superparamagnetische Aerosole mit Hilfe von magnetischen Gradientenfeldern gezielt in definierten Bereichen abscheiden lassen. Das Ausmaß der Abscheidung lässt sich durch Erhöhung des Gradienten und des magnetischen Momentes steigern. Mit größeren Permanentmagneten oder starken Elektromagneten ist auch ein pulmonales Drug Targeting an der humanen Lunge denkbar.
Microalgae are aquatic, unicellular, eukaryotic organisms, which perform photosynthesis. They have gained interest within the last decades not only for biofuel production due to their high amount of lipids, but also for pharmaceutical and for nutraceutical purposes. Interesting compounds are proteins, carbohydrates, or pigments, such as carotenoids. However, microalgae possess strong and rigid cell walls, which hinder a sufficient and yet, gentle extraction of those valuable compounds. Although standard extraction techniques are available, several shortcomings occur, e.g. high energy demand, use of environmentally harmful solvents or alteration of compounds due to heat or chemicals. Therefore, an alternative method is needed, which is able to address these disadvantages. Physical plasmas were thus studied to answer the question whether they are able to disintegrate the cell walls of microalgae effectively and yet, without degradation of the extractives.
First step of the thesis was to find a suitable plasma source that has an effect on the cell walls because plasma effects, such as electric fields, shockwaves, UV light emission, and the generation of reactive species can be tailored with the respective setup. It was found that spark discharges are most effective for the extraction of Chlorella vulgaris, which was chosen as model organism. All extraction yields were compared to reference methods, whereat microwave radiation was found to be the most effective reference method and were hence, applied for comparative studies.
For the next step, proteins were selected as targets to answer the question, which differences can be determined between plasms-treated and microwave-radiated proteins are observable although the extraction yields were equal. Furthermore, plasma effects, especially the effects of reactive species on the extracted proteins had to be studied. Findings indicate that heat sensitive proteins, such as photosystem-related proteins, or histones are better extractable with spark discharges than with microwave exposure and the effect of reactive species is only minor.
The last step was to determine, which plasma effect is responsible for the observed cell wall disintegration. Therefore, the tensile strength of Chlorella vulgaris was determined and compared to the shockwave pressure, which is generated from the spark channel. It was proven that the shockwave pressure exceeds by far the tensile strength of the microalgae an can be thus held responsible for mechanism for cell wall rupture.
In this thesis, it was found that spark discharges are a promising alternative for the extraction of valuable compounds from microalgae. The discharges are not only effective, but also gentle enough for sensitive compounds, such as proteins or pigments.
The investigation of complex molecular systems by molecular dynamics simulations has been successfully established and proven as a standard method during the last decades. The use of highly optimized algorithms and steadily increasing, generally available computing resources enables even larger and longer simulations. However, the dynamics of the system itself is not accelerated, and it can be trapped in low energy minima that can only be overcome slowly. A number of methods have therefore been developed to address this problem.
Within the context of this dissertation, a novel algorithm based on replica exchange was developed to solve problems with existing methods, which can now be used for large molecular systems with a low resource consumption. Parameter dependence was systematically evaluated and optimized to define guidelines for correct application. This algorithm was successfully applied to various pharmaceutical and biochemical problems, such as protein folding or protein-protein interactions.
Im Rahmen des Verbund-Forschungsprojektes KOKON wurde nach systematischer Literaturrecherche eine Datenbank entwickelt; in der KOKONbase sind sowohl die Interaktionsprofile als auch die Interaktionsmatrix die wesentlichen Elemente der Vorhaltung von primärem und bewertetem Wissen. In der Interaktionsmatrix wird mit Hilfe eines Ampelschemas die Möglichkeit der Beeinflussung der Pharmakokinetik von Arzneistoffen durch ausgewählte Drogen dargestellt. Die Droge und die Arzneistoffe werden paarweise abgebildet. Die Interaktionsmatrix wird durch praktisch tätige Onkologen als sehr wertvolles Instrument in der onkologischen Beratungspraxis angesehen, um schnell einen Überblick über das von einer Droge ausgehende Gefahrenpotential bzgl. der Beeinflussung der Wirksamkeit eines in der Onkologie genutzten Arzneistoffs zu bekommen.
In Anbetracht der zunehmenden UV-Intensität und des Wissens um die Spätfolgen jedes einzelnen Sonnenbrandes besteht ein großes Interesse an UV-protektiven Wirkstoffen. Daher war es Ziel dieser Arbeit, neue Wirkstofflieferanten aus der Natur für diese Anwendung zu identifizieren. Ein breites Spektrum von verschiedenen Organismen wurde auf ihre protektiven oder regenerativen Effekte auf UVB-behandelte Keratinozyten hin gescreent und anschließend vielversprechende Naturstoffe ausgewählt und genauer untersucht. Zusätzlich war die Auffindung von vitalitätssteigernden sowie zytotoxisch wirkenden Extrakten und Reinstoffen von Interesse. Dazu wurden zunächst in vitro Testmodelle auf Basis der humanen Keratinozytenzelllinie HaCaT etabliert und die Wirkung von UVB-Strahlung auf diese Zellen charakterisiert. Genutzt wurden der MTT-Assay zur Bestimmung der Vitalität und Proliferation, der Neutralrot-Assay zur Bestimmung der Integrität der Zellmembran und Proliferation und der Lactatdehydrogenase-Assay zur Bestimmung der Integrität der Zellmembran. Mittels Durchflusszytometer wurden Zellzyklusanalysen durchgeführt, sowie zur Erfassung von DNA-Schäden die Einzelzellgelelektrophorese (Comet-Assay), außerdem wurde mit Hilfe des Interleukin-6-Assays die zelluläre Zytokinproduktion gemessen. Nach Bestrahlung der HaCaT-Zellen mit UVB ergaben sich zeit- und dosisabhängig folgende wesentliche Effekte: Ein leichter G2/M-Arrest bei geringeren UVB-Dosen (10mJ/cm2-30mJ/cm2), ein G0/G1-Arrest bei höheren UVB-Dosen (50mJ/cm2 und 100mJ/cm2), die dosisabhängige Zunahme des subG1-Peaks (Apoptoseinduktion), die Zunahme der LDH-Freisetzung mit steigender UVB-Dosis, die Stimulation der IL-6-Produktion mit steigender UVB-Dosis, sowie eine dosisabhängige Schädigung der DNA sowohl sofort nach UVB-Bestrahlung als auch nach 24 stündiger Inkubation. Nach Testung verschiedener UVB-Dosen und unterschiedlicher Inkubationszeiten wurde zur Untersuchung der Naturstoffe mit einer Dosis von 20mJ/cm2 UVB und einer Inkubationszeit von 24 Stunden gearbeitet. Die Testung auf UV-protektive Wirkungen der Extrakte gegenüber DNA-Schäden anhand des Comet Assays erfolgte direkt nach UVB-Bestrahlung. In dieser Arbeit wurden insgesamt 100 verschiedene Extrakte und 12 Reinsubstanzen allein oder in Kombination mit UVB-Strahlung untersucht. Die getesteten Naturstoffe stammten von Algen, Cyanobakterien, terrestrischen und marinen Pilzen, sowie von Pflanzen. Im Folgenden sind die wichtigsten Ergebnisse aufgelistet: Eine vitalitätssteigernde Wirkung auf HaCaT-Zellen zeigten 33 Extrakte und Reinsubstanzen. Durch die Inkubation mit 12 Naturstoffen konnte ein Serummangel-induzierter G0/G1-Zellzyklusphasenarrest bei den HaCaT-Zellen verhindert oder überwunden werden. Ein durch UVB-Strahlung induzierter G2/M-Zellzyklusarrest konnte durch Inkubation der Zellen mit 9 Naturstoffen verhindert oder überwunden werden. 11 Naturstoffe führten zu einer verminderten Lactatdehydrogenase-Freisetzung UVB-bestrahlter Zellen. 5 Naturstoffe hemmten die UVB-induzierte IL-6-Produktion der Zellen. 15 Naturstoffe führten auf unterschiedlichen Wegen zu einer Verminderung UVB-bedingter DNA-Schäden an HaCaT-Zellen. Eine zytotoxische Wirkung auf HaCaT-Zellen zeigten 58 Extrakte und Reinsubstanzen Anhand der Ergebnisse sind die drei terrestrischen Pilze Inonotus nodulosus, Piptoporus betulinus und Tricholoma equestre, sowie die beiden Pflanzen Annona muricata und Harpephyllum caffrum aussichtsreiche Kandidaten für eine zukünftige Anwendung als Hautschutz- oder Hautpflegemittel. Des Weiteren haben auch die Extrakte von Nannochloropsis spec., Ganoderma lucidum, Ganoderma pfeifferi, Hydnotrya michaelis, Tricholoma populinum und Tamarix aphylla auffällige Ergebnisse geliefert und verdienen weiteres Interesse. Die Ergebnisse zeigen die Eignung der etablierten Testmodelle zur Auffindung von Wirkstoffen mit UV-protektiven und weiteren Effekten auf Hautzellen. Gleichzeitig wird auch das große Potential von Organismen verschiedener Gruppen zur Bildung von Naturstoffen mit derartigen Eigenschaften deutlich.
Biorelevante In-vitro-Freisetzungsmodelle werden u. a. für das Screening neuartiger Formulierungen, zur Etablierung von In-vitro-/In-vivo-Korrelationen und zur Vorhersage des In-vivo-Verhaltens einer applizierten Darreichungsform angewendet. Die Entwicklung von In-vitro-Freisetzungsmodellen für peroral verabreichte Arzneiformen fokussierte bisher vorwiegend auf die Abbildung der gastrointestinalen Physiologie eines gesunden, „durchschnittlichen“ Erwachsenen. Patientenspezifische Faktoren, wie z. B. das Alter, Erkrankungen oder Geschlecht sowie individuelle Unterschiede, die die gastrointestinalen Verhältnisse und folglich auch das Freisetzungsverhalten einer peroral applizierten Arzneiform beeinflussen können, wurden bisher kaum berücksichtigt. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Entwicklung und Etablierung von patientenspezifischen, bioprädiktiven In-vitro-Freisetzungsmodellen für perorale Darreichungs-formen unter Berücksichtigung der gastrointestinalen Gegebenheiten zweier unterschiedlicher Patientenpopulationen: pädiatrische Patienten und Parkinson-Patienten.
Eine wichtige Voraussetzung für eine sichere und wirksame perorale Arzneimitteltherapie bei pädiatrischen Patienten sind altersgerechte Darreichungsformen sowie eine geeignete Einnahmepraxis. Peroral applizierte Arzneimittel werden pädiatrischen Patienten häufig zusammen mit Applikationsvehikeln verabreicht, um die Einnahme der Arzneimittel zu erleichtern. Es muss jedoch bei einer solchen Anwendungspraxis sichergestellt werden, dass die eingenommene Arzneiform mit dem jeweiligen Applikationsvehikel kompatibel ist. Die Beurteilung der Kompatibilität ist anhand klinischer In-vivo-Studien an gesunden Kindern jedoch aufgrund ethischer Bedenken kaum möglich. Zur Evaluierung der Kompatibilität könnten In-vitro-Freisetzungsmethoden als eine mögliche Alternative eingesetzt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden pädiatrische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt, um zu evaluieren, ob die Stabilität und das In-vivo-Freisetzungsverhalten der neuartigen Alkindi®-Formulierung durch Co-Verabreichung mit alterstypischen Applikationsvehikeln beeinträchtigt werden. Zur Beantwortung dieser Fragestellung wurden im Anschluss an eine intensive Literaturrecherche Physiologie-basierte In-vitro-Modelle auf Basis der Mini-Paddle-Apparatur entwickelt. In der ersten Studie wurde die In-vitro-Wirkstofffreisetzung nach simulierter Applikation der Alkindi®-Formulierung mit typischen Applikationsvehikeln für Kinder unter 6 Jahren, d. h. Muttermilch, Formulamilch und Vollmilch, untersucht. In der zweiten In-vitro-Studie wurde der Altersbereich der adressierten Patientenpopulation auf 2 - 16 Jahre verändert und eine Reihe weiterer flüssiger sowie halbfester Applikationsvehikel, wie z. B. Orangensaft und Joghurt, verwendet. In beiden Studien konnte deutlich gezeigt werden, dass die Alkindi®-Formulierung ein robustes Freisetzungsverhalten aufwies und kompatibel mit den untersuchten Matrices war. Auf Grundlage der Ergebnisse der In-vitro-Untersuchungen wurde geschlussfolgert, dass die In-vivo-Freisetzung und die Bioverfügbarkeit der untersuchten Arzneiform nicht durch die untersuchten Applikationsvehikel beeinflusst werden und folglich diese Vehikel zur gemeinsamen Einnahme mit der Alkindi®-Formulierung geeignet sind. Diese Beobachtungen wurden darüber hinaus durch publizierte Ergebnisse einer korrespondierenden In-vivo-Studie in Erwachsenen bestätigt.
Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Entwicklung eines neuartigen, Parkinson-spezifischen und Physiologie-basierten In-vitro-Freisetzungsmodells. Für die Entwicklung von biorelevanten In-vitro-Modellen zur Simulation der luminalen Bedingungen im Gastrointestinal-trakt einer spezifischen Patientenpopulation sind umfangreiche Kenntnisse über die jeweiligen gastrointestinalen In-vivo-Bedingungen und deren Variabilität unerlässlich. Im Rahmen einer Literaturrecherche wurde der aktuelle Wissensstand zu den gastrointestinalen Gegebenheiten in Parkinson-Patienten recherchiert, ausgewertet und zusammengefasst. Die Ergebnisse der Literaturstudie machen deutlich, dass sich die gastrointestinalen Bedingungen von Parkinson-Patienten teilweise erheblich von gesunden Erwachsenen unterscheiden. Das bedeutendste gastrointestinale Merkmal von Parkinson-Patienten ist die beeinträchtigte Motilität des Gastrointestinaltrakts, was sich u. a. in einer Verlangsamung der Magenentleerung sowie der intestinalen Passage äußert. Demgegenüber steht jedoch ein großer Mangel an Daten für eine Reihe von gastrointestinalen Parametern. Dies betrifft z. B. die Zusammensetzung und physiko-chemischen Eigenschaften der luminalen Flüssigkeiten des Gastrointestinaltrakts.
Als geeignete In-vitro-Testplattform wurde die USP-3-Apparatur – auch als Eintauchender Zylinder (Europäisches Arzneibuch, Ph. Eur.) und Reciprocating cylinder (Ph. Eur. und US-amerikanisches Arzneibuch, USP) bezeichnet – ausgewählt, da sich diese Testplattform insbesondere zur Untersuchung von Darreichungsformen mit modifizierter Wirkstofffreisetzung eignet und bereits in einer Vielzahl von analytischen Laboren etabliert ist. Die Nutzung der kompendialen USP-3-Apparatur ließ aufgrund der geringen Variationsmöglichkeiten keine Simulation typischer Motilitätsmuster im humanen Gastrointestinaltrakt zu und eignete sich noch weniger für die Entwicklung und Etablierung von individuellen, patientenspezifischen Motilitätsprofilen. Um diese technischen Limitationen zu überwinden, wurde für die Weiterentwicklung des arzneibuchkonformen Modells ein Lastenheft erstellt, welches detaillierte Anforderungen für die Entwicklung der neuen Testapparatur enthielt. Auf Grundlage des beschriebenen Übersichtsartikels und unter Anwendung einer auf Basis des Lastenheftes modifizierten USP-3-Apparatur wurden unter besonderer Berücksichtigung von Motilität, Passagezeiten und Flüssigkeitsvolumina Parkinson-spezifische In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt. Für ausgewählte modifiziert freisetzende Levodopa-Fertigarzneimittel wurde anschließend eine vergleichende Serie von In-vitro-Freisetzungsuntersuchungen unter Anwendung von Parkinson-spezifischen- oder „standardmäßigen“ Testmodellen durchgeführt, wobei letztere die gastrointestinalen Gegebenheiten eines „durchschnittlichen“, gesunden Erwachsenen simulierten. Für eine Beurteilung der Aussagekraft der entwickelten Parkinson-spezifischen Testmodelle wurden die generierten In-vitro-Freisetzungsdaten aus den Parkinson-spezifischen- und den „standardmäßigen“ Freisetzungsuntersuchungen in ein In-silico-PBPK-Modell implementiert und die jeweiligen simulierten Plasmakonzentrations-Zeit-Profile von Levodopa anschließend mit klinischen, durchschnittlichen In-vivo-Daten korreliert. Für PBPK-Modelle mit integrierten Parkinson-spezifischen In-vitro-Freisetzungsdaten wurde eine höhere Prädiktivität des In-vivo-Verhaltens der untersuchten Levodopa-Darreichungsformen beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die entwickelten Parkinson-spezifischen In-vitro-Modelle ein vielversprechendes und prädiktives Instrument zur Vorhersage der In-vivo-Wirkstofffreisetzung von modifiziert freisetzenden Levodopa-Darreichungsformen darstellen. Der diskutierte methodische Ansatz der vorliegenden Studie könnte zukünftig das Screening neuartiger Formulierungen deutlich optimieren und somit zu einer verbesserten Arzneimitteltherapie für Parkinson-Patienten, aber auch für andere spezifische Patientengruppen beitragen
With the development of new functional genomics methods that can access the whole genome, transcriptome, proteome and metabolome more comprehensive insights in cellular processes are possible. Largely based on these advances, our knowledge about molecular constituents for many organisms is increasing at a tremendous rate. Until today, the genomes of several organisms including pathogenic bacteria are already sequenced and pave the way for metabolic network constructions. Interest in metabolomics, the global profiling of metabolites in a cell, tissue or organism, has been rapidly increased. A range of analytical techniques, including nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS), liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS), Fourier Transform mass spectrometry (FT–MS), high performance liquid chromatography (HPLC) are required in order to maximize the number of metabolites that can be identified in a matrix. With the help of microbial metabolomics (qualification and quantification of a huge variety of metabolites from a bacterium) deciphering of the bacterial metabolism is feasible. The metabolome pipeline or workflow encompasses the processes of (i) sample generation and preparation, (ii) establishment of analytical techniques (iii) collection of analytical data, raw data pre-processing, (iv) data analysis and (v) data integration into biological questions. The present work contributes to the above mentioned steps in a metabolomics workflow. A specific focus was set to the exo- and endometabolome analysis of Gram-positive bacteria
Durch die vorliegende Arbeit wurde die Relevanz moderner Ansätze in der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung für den Erfolg und die Sicherheit in der Arzneistoffentwicklung aufgezeigt. Neben den theoretischen Grundlagen konnte die praktische Anwendung molekularer Vielfalt mit Hilfe komplementärer Substanzbibliotheken vielfach direkt den resultierenden Nutzen aufzeigen. Dabei galt das Interesse speziell antiproliferativen Zielstrukturen, mit besonderem Schwerpunkt auf der Hemmung der Glutathionperoxidase. Des Weiteren unterstützten in silico-Methoden eine zielgerichtete Arbeitsweise. Durch die Optimierung des GPx 1-Testsystems konnte eine zuverlässige in vitro-Analytik etabliert werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass mit Hilfe der angestellten Untersuchungen die erfolgreiche Entwicklung, Optimierung und Evaluierung mehrerer Leitstrukturen für diverse Zielproteine der Tumortherapie aufgezeigt werden konnte. Es wurden zunächst die Fortschritte auf dem Gebiet der fragmentbasierten Leitstrukturentwicklung über multifunktionale Screeningbibliotheken zusammengefasst und bewertet (Publikation 1). Die vorgestellten Ansätze, wie Halogenbindungen und sp3-Reichtum, fanden in den folgenden Publikationen zu einem Großteil praktische Anwendung. Die Synthese einer umfangreichen Acylhydrazonbibliothek führte zum Ausbau der inhibitorischen Aktiviät gegenüber der bovinen GPx 1 (Publikation 2). Der kombinatorische Syntheseansatz erbrachte eine Vielzahl eng verwandter Analoga, die entgegen der Erwartungen leider kaum Erkenntnisse über SAR erbrachten. Zudem erwiesen sich die angewandten Docking-Studien als irreführend, da keinerlei Korrelation zu den in vitro-Ergebnissen erkennbar war. Dennoch konnte mit den angestellten Untersuchungen ein stabiler Enzymassay etabliert werden, der eine zuverlässige Analyse zukünftiger Produkte unterstützt. Langfristig wäre für Aussagen über quantitative SAR die gezielte Optimierung anhand einer Kristallstrukturanalyse erforderlich. Alternativ wurden bereits erste NMR-Versuche mit Sättigungstransfer-Differenz (STD)-Spektroskopie angestellt, die sich jedoch aufgrund der schlechten Löslichkeit der Acylhydrazone als schwierig erwiesen. Weiterhin wurde Misonidazol als Inhibitor der GPx 1 einer Neubewertung unterzogen (Publikation 3). Während racemisches Misonidazol nach früheren Berichten die Aktivität muriner GPx 1 bei 500 µM signifikant reduzierte, zeigte die in vitro-Testung der reinen Enantiomere gleicher Konzentration an boviner GPx 1 keine inhibitorische Wirkung. Von wissenschaftlichem Nutzen war zudem die Erkenntnis über einen schwachen, aber nachweisbar signifikanten Synergismuseffekt des Racemats verglichen mit den isolierten Enantiomeren. Die ergänzende Beschreibung dieser noch wenig untersuchten Wirkungspotenzierung liefert einen Beitrag zum gesamtheitlichen Verständnis dieses Phänomens. Alle synthetisierten Endstufen sowie ausgewählte Zwischenstufen wurden in einer öffentlich zugänglichen Screeningplattform, dem FMP in Berlin, hinterlegt (Publikation 4). Sie haben als Gemeinsamkeit eine ausgeprägte Reaktionsbereitschaft, wodurch in zukünftigen biologischen Screenings eine gezielte oder auch zufällige Entdeckung neuartiger Interaktionen nicht abwegig ist. Die nukleophilen Verbindungen 1, 2, 4 und 5 könnten mit basischen Aminosäuren, wie dem Histidin der Serinproteasen, oder mit Metalloenzymen wechselwirken, während durch die gezielte Elektrophilie von 3 kovalente reversible Bindungen mit Cysteinresten und deren Selen-Analoga zu erwarten sind. Der Beitrag fragmentbasierter Substanzbibliotheken zur Leitstrukturentwicklung konnte am Beispiel der 4-Amidocyclopentan-1,3-diole gezeigt werden (Publikation 5). Ausgehend von acht trisubstituierten Cyclopentan-Templaten konnte die Synthese von achtzig Produkten mit zum Teil potenter Wirkung gegen mehrere Tumor-Zelllinien beschrieben werden. Die Substanzbibliothek dieser Studie demonstriert den Einsatz moderner Methoden zur Bereitstellung von Werkzeug für offene Fragen der Molekularbiologie aus einem bisher zu wenig bearbeiteten Bereich des chemischen Strukturraums. Mit Hilfe von in silico-Untersuchungen gelang eine gezielte Synthese neuartiger Inhibitoren NAD+-abhängiger Histondeacetylasen (Publikation 6). Die resultierende Klasse N1-substituierter Benzimidazolthione zeichnete sich durch erhöhte physiologische Stabilität gegenüber der Leitstruktur Splitomicin aus. Obgleich eine vollständig selektive Inhibition zwischen den Sirtuinen 1–3 nicht erreicht wurde, gelang durch die Anwendung computergestützter Methoden die Synthese eines potenten Inhibitors mit selektiver Wirkung gegen Sirtuin 1 und 2, dessen Grundgerüst als Leitstruktur weiterer Untersuchungen dienen kann.
In der modernen Augenheilkunde werden Injektionen und Implantate in periokulare Regionen oder direkt in den Glaskörper injiziert. Bei der Entwicklung neuer ophthalmologischer Implantate und Injektionen ist die In vitro-Testung der Wirkstofffreigabe und -verteilung von großer Bedeutung. Dabei stellen viele Testmethoden die In vivo-Situation nicht ausreichend dar. Einerseits bilden die Gewebe des Auges wie beispielsweise die Konjunktiva oder die Sklera Barrieren für den Transport des Arzneistoffes zum Wirkort. Andererseits ist der Einfluss der Gefäßsysteme von Konjunktiva und Choroidea auf die Verteilung und Elimination des Arzneistoffes zu berücksichtigen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Gewebe des Auges hinsichtlich ihrer Permeabilitätseigenschaften untersucht. Als Ergebnis wurden die Permeabilitätskoeffizienten von Ciprofloxacin, Lidocain, Timolol und Dexamethason für die Sklera, Konjunktiva, Kornea, den Retina-Choroidea-Komplex sowie für Kombinationen der aufgezählten Gewebe des Schweineauges erhalten. Als weitere Tiermodelle finden Gewebe von Rinder- und vor allem Kaninchenaugen in der ophthalmologischen Forschung Anwendung. Aus diesem Grund wurden die Permeabilitätsstudien um die Membranen dieser zwei Spezies erweitert. Der Interspezies-Vergleich zeigte sehr große Unterschiede in den Permeabilitäten der Wirkstoffe durch die Gewebe auf, sodass die direkte Übertragbarkeit von Ergebnissen zwischen den Tieren und auf den Menschen nicht gewährleistet ist. Um die Barriere-Eigenschaften der Augengewebe in ein In vitro-Modell zu integrieren wurden synthetische Membranen, die mit den Permeabilitätseigenschaften der Gewebe des Schweineauges übereinstimmen, identifiziert. Diese Membranen wurden zur Simulation der natürlichen Gewebe des Auges in den Mittelteil der neu entwickelten Zwei-Kanal-Durchflusszelle eingespannt. Die Zwei-Kanal-Durchflusszelle besteht aus drei Teilen, wobei die zwei äußeren Akzeptor-Kompartimente je einen Flusskanal, der mit Ringer-Puffer perfundiert wird, enthalten. Durch Etablierung physiologischer Flussraten entlang der korrespondierenden Membranen wurde der konjunktivale und choroidale Blutfluss und somit die Permeabilitäten der Gewebe als auch der Einfluss der Blutgefäße zusammen in einem In vitro-Modell berücksichtigt. Um den Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit in den Flusskanälen und des osmotischen Verhältnis zwischen Probe und Perfusionsmedium auf die Wirkstoffverteilung im System zu untersuchen, wurde eines der zwei Akzeptor-Kompartimente durch eine für Puffer und Wirkstoff undurchlässige Scheibe dicht verschlossen, sodass der Stofftransport nur in eine Richtung sattfinden konnte. Die Ergebnisse zeigten einen bedeutenden Einfluss dieser beiden Parameter auf die Wirkstoffverteilung. Bei Zuschaltung des zweiten perfundierten Akzeptor-Kompartiments der Zwei-Kanal-Durchflusszelle treten zwischen den Kompartimenten vermutlich Kräfte wie zum Beispiel Querströmungen und hydrostatische Druckgefälle auf. Basierend auf den erhaltenen Verteilungskurven der Wirkstoffe in der Zwei-Kanal-Durchflusszelle kann reine konzentrationsgesteuerte Diffusion durch die Membranen als alleiniger Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Die beschriebenen Effekte müssen vor der Etablierung der Zwei-Kanal-Durchflusszelle als biorelevante In vitro-Methode für die Charakterisierung von periokularen Injektionen und Implantaten in weiteren Arbeiten durch Änderungen des Modelldesigns behoben werden. Neben den peripheren Geweben des Auges dient der Glaskörper als Applikationsort für Injektionen makromolekularer Arzneistoffe und Implantate, die den inkorporierten Arzneistoff über einen längeren Zeitraum freigeben. Die intravitreale Freisetzung und Verteilung des Wirkstoffes ist für den therapeutischen Effekt von entscheidender Bedeutung. Um diese Prozesse in vitro zu charakterisieren wurde das Glaskörper-Modell entwickelt. Die Form und das Volumen des kugelförmigen Glaskorpus sind an die Geometrie des menschlichen Glaskörpers angepasst. Als Substitut für den natürlichen Glaskörper wurde ein Polyacrylamid-Gel modifiziert, sodass dieses in ausgewählten physiko-chemischen Eigenschaften dem natürlichen Glaskörper entspricht. Nach der Applikation des Wirkstoffes direkt in den Glaskörper muss dieser durch passive oder aktive Transportprozesse an den Wirkort im hinteren Augenabschnitt gelangen. Dabei wird die Wirkstoffverteilung im Glaskörper durch die Augenbewegung maßgeblich beeinflusst. Die Simulation verschiedener Augenbewegungen wurde mit der Entwicklung des Eye Movement Systems in ein In vitro-Modell umgesetzt. Das System ist in der Lage Geschwindigkeiten und Amplituden von langsamen bis schnellen Folgebewegungen, Sakkaden und Mikrosakkaden des Auges nachzuahmen. In die zentrale Halterung des Eye Movement Systems kann das Glaskörper-Modell integriert werden. Die Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell bietet die Möglichkeit den Einfluss der verschiedenen Augenbewegungen auf das Freisetzungs- und Verteilungsverhalten von intravitrealen Injektionen und Implantaten zu untersuchen. Nach erfolgreicher Inbetriebnahme der beiden Systeme wurden Verteilungsstudien mit Modellarzneistoffen verschiedener Molekularmassen durchgeführt. Die Ergebnisse der Studien zeigten, dass das Molekulargewicht im vollständig mit Gel gefüllten Glaskörper-Modell Einfluss auf die Geschwindigkeit der vermuteten Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Substitut hat. Mit zunehmendem Anteil der flüssigen Phase im Glaskörper-Modell unterschieden sich die erhaltenen Verteilungen zwischen den Versuchen mit und ohne Bewegung deutlich. Bei der Simulation der hinteren Glaskörperablösung besitzt die Bewegung des Modells einen essentiellen Effekt auf die Konvektions- und Umverteilungsprozesse im Glaskörper-Modell. Durch das Ersetzen prozentualer Anteile des Gels durch Ringer-Puffer konnten Bedingungen der hinteren Glaskörperablösung simuliert werden. Die Simulation des Alterungsprozesses bewirkte eine Zunahme der Konvektion im Glaskörper-Modell. Als Folge resultierte eine deutlich schnellere Umverteilung der injizierten Modellarzneistoffe. Die hintere Glaskörperablösung besitzt demzufolge einen großen Einfluss auf die Verteilung und darf in In vivo- und In vitro-Studien nicht vernachlässigt werden. Mit der Zwei-Kanal-Durchflusszelle und der Kombination aus Eye Movement System und Glaskörper-Modell sind Konzepte für die Charakterisierung von periokularen und intravitrealen Arzneiformen entwickelt worden. In den Modellen wurde besonderer Wert auf die Anlehnung an die In vivo-Situation gelegt. Durch die Berücksichtigung der okularen Blutflüsse, die Simulation der Permeabilitätseigenschaften bestimmter Gewebe des Auges durch entsprechende synthetische Membranen, die Etablierung verschiedener Arten der Augenbewegung und der Simulation des Glaskörpers durch das Polyacrylamid-Gel wurden biorelevante Voraussetzungen geschaffen, die bisher in keinen anderen In vitro- Modellen zu finden sind. Vor der Etablierung der Zwei-Kammer-Durchflusszelle sind weitere Maßnahmen zur Unterbindung der physikalischen Störfaktoren nötig. Der theoretische Ansatz der Zwei-Kammer-Durchflusszelle konnte noch nicht in die Praxis umgesetzt werden. Unter Verwendung des Eye Movement Systems und des Glaskörper-Modells wird eine kostengünstige, einfache und schnelle Charakterisierung neuartiger intravitrealer Injektionen und Implantate unter In vitro- Bedingungen möglich. Die methodische Etablierung des Eye Movement Systems ist erfolgt. Durch weitere Modifikationen kann das System in Zukunft noch näher an die In vivo-Situation herangeführt werden.
Revaskularisierende Maßnahmen wie die perkutane transluminale Angioplastie sowie die Stentimplantation zählen heutzutage zu den Standardtherapieverfahren der koronaren Herzkrankheit. Insbesondere die Einführung der mit proliferationshemmenden Wirkstoffen wie Paclitaxel oder Sirolimus beschichteten drug-eluting stents (DES) konnte die Restenoserate der behandelten Gefäße auf unter 10 % senken. Der Erfolg der kardiovaskulären Intervention ist dabei insbesondere auch von der Freisetzungskinetik der Wirkstoffe aus der Polymerbeschichtung der Stents abhängig. Methoden zur Untersuchung des In vitro-Freisetzungsverhaltens sind jedoch weder im Europäischen noch im US-Amerikanischen Arzneibuch monographiert, meist werden aber offizinelle Methoden wie der Eintauchende Halter oder die Durchflusszelle sowie nicht offizinelle, einfache Shake-Flask-Methoden zur Bestimmung der In vitro-Freisetzung verwendet. Dabei bleiben allerdings Besonderheiten von DES wie die Einbettungsbedingungen in das Gewebe der Gefäßwand oder die Flussbedingungen unberücksichtigt. Mit der Einführung der Gefäßsimulierenden Durchflusszelle (vFTC) mit einem Gewebemodell in Form eines Hydrogels als zweitem Akzeptorkompartiment konnten dagegen Parameter wie der Blutfluss, die Verteilung des Wirkstoffes in die Gefäßwand sowie reine Diffusionsprozesse auf der abluminalen Seite der Stents in vitro simuliert werden. Durch Modifikation des Hydrogels mittels hydrophober Zusätze konnte auch bereits ein Einfluss auf die Freisetzung von Modellarzneistoffen aus schnellfreisetzenden Stents gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, auch für die tatsächlich in DES eingesetzten Arzneistoffe Sirolimus und Paclitaxel Gewebemodelle auf Basis von Hydrogelen zu entwickeln und den Einfluss dieser Gewebemodelle auf die In vitro-Wirkstofffreisetzung in der vFTC zu untersuchen.
Dazu wurden zunächst analytische Methoden zur Quantifizierung der beiden Wirkstoffe entwickelt und validiert. Zur Identifizierung eines geeigneten Freisetzungsmediums wurde anschließend die Stabilität der Wirkstoffe in verschiedenen pufferbasierten und ungepufferten Medien sowie unter Zusatz von stabilisierenden Additiva untersucht. Eine mit Butylhydroxytoluol und Brij® L23 stabilisierte 0,9 %-ige Kochsalzlösung wurde dabei als geeignet identifiziert, die Stabilität der beiden Wirkstoffe über einen Freisetzungszeitraum von fünf Tagen zu gewährleisten.
Auf Basis vorhergehender Arbeiten wurde für die Entwicklung der Gewebemodelle auf ein 2 %-iges Agarosegel als Grundlage zurückgegriffen. Um die Verteilung der Wirkstoffe in das Gewebemodell zu erhöhen, wurden verschiedene Zusätze wie Lecithin, LiChroprep® RP-18, Lipofundin® MCT/LCT 20 %, mittelkettige Triglyceride und Cholesterol zur Hydrophobisierung beigemischt. Außerdem wurden Elastin und bovines Serumalbumin als Zusätze gewählt, um spezifische Bindungen der Wirkstoffe im Gewebe zu simulieren. Zur Untersuchung der Eignung der entwickelten Hydrogele als Gewebemodell wurde der Verteilungskoeffizient zwischen Hydrogel und Wirkstofflösung ermittelt und mit ex vivo ermittelten Literaturwerten zwischen humanem Aortengewebe und einer Wirkstofflösung verglichen. Zusätze von 10 % Lipofundin®, 0,1 % LiChroprep® + 0,02 % Lecithin sowie 0,1 % Lecithin wurden als geeignet befunden, um die Verteilung von Sirolimus in das Gewebe humaner Aorta mit unterschiedlichem Status zu simulieren und wiesen zudem eine ausreichende Stabilität für Freisetzungsuntersuchungen in der vFTC über einen Zeitraum von fünf Tagen auf.
Die Untersuchung des Einflusses dieser drei Gewebemodelle als Hydrogelkompartiment auf die Wirkstofffreisetzung aus DES in der vFTC wurde mit Sirolimus-beschichteten Stents mit Poly-L-Milchsäure als Beschichtungspolymer über 120 h durchgeführt. Zum Vergleich wurde zusätzlich die Wirkstofffreisetzung in einer einfachen Shake-Flask-Methode sowie in der Durchflusszelle ohne Hydrogelkompartiment beziehungsweise mit einem Agarosegel ohne Zusätze bestimmt. Es konnte ein triphasisches Freisetzungsverhalten mit biphasischem, jeweils nach einer Kinetik 1. Ordnung ablaufenden burst release von 30 - 40 % des Wirkstoffes innerhalb der ersten 12 h sowie nachfolgender langsamer Diffusionsphase beobachtet werden. Ein Vergleich der unterschiedlichen Freisetzungs-methoden zeigte eine langsamere Freisetzung unter Verwendung der Durchflusszelle sowie eine weitere Verringerung des in das Medium freigesetzten Wirkstoffanteils durch die Einführung eines zweiten Akzeptorkompartiments in der vFTC. Statistisch signifikante Unterschiede wurden aber vorrangig in der Verteilung des Wirkstoffes zwischen den Kompartimenten gesehen. So führte die Verwendung von 10 % Lipofundin als Zusatz zu einer Erhöhung des Anteils an Sirolimus im Gewebemodell von etwa 1 % auf fast 14 % der Gesamtfreisetzung nach fünf Tagen (p < 0,05). Im Gegensatz zu vorherigen Untersuchungen mit Modellarzneistoffen ist es für den tatsächlich in DES eingesetzten Wirkstoff Sirolimus also gelungen, ein Gewebemodell mit ausreichend hohem Verteilungskoeffizienten zu entwickeln, mit dem signifikante Unterschiede in der Verteilung zwischen den verschiedenen Kompartimenten der vFTC ermittelt werden konnten. In vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus DES mittels der vFTC können somit durch die Verwendung von Gewebemodellen mit einem den In vivo-Bedingungen angepassten Verteilungskoeffizienten für die betreffenden Wirkstoffe eine noch bessere Abschätzung der In vivo-Verteilung eines aus DES freigesetzten Wirkstoffes in die Arterienwand leisten. Auch für biorelevante In vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus anderen Implantaten können die in dieser Arbeit entwickelten Gewebemodelle möglicherweise einen wertvollen Beitrag leisten.
Das Ziel biorelevanter Freisetzungsmethoden ist es, bereits in vitro prädiktive Aussagen zu treffen, wie die Freisetzung einer Arzneiform in vivo aussehen wird. Während basierend auf den physiologischen Gegebenheiten des Gastro-Intestinal-Traktes von Erwachsenen in den vergangenen 15 Jahren bereits viele solcher Methoden etabliert worden sind, fehlen sie für Kinder verschiedenster Altersklassen. Im Fokus dieser Arbeit stand deswegen, die Grundlagen sowohl der gastro-intestinalen Physiologie als auch der Ernährung der pädiatrischen Population zu legen und erste biorelevante Freisetzungskonzepte und –medien für diese Altersgruppen zu entwickeln. Entwickelt wurden verschiedene Methoden und Medien zur Simulation des Magens, sowohl unter nüchternen als auch unter postprandialen Bedingungen, von Neugeborenen (Kinder im ersten Lebensmonat) sowie Kleinkindern (2. bis einschließlich 24. Lebensmonat). Der Magensaft eines Neugeborenen hat kurz nach der Geburt oft einen neutralen pH. Der pH-Wert im Magen wird schrittweise immer saurer, doch diese Entwicklung ist sehr inkonsistent. Somit muss für einen Freisetzungstest von einer großen, möglichen pH-Spanne ausgegangen werden. In dem entwickelten Testszenario werden sechs pH-Werte zwischen 1,8 und 7,0 mit verschiedenen Medien dargestellt. Die untersuchten Wirkstoffe wiesen eine pH-abhängige Löslichkeit auf und zeigten deswegen auch sehr unterschiedliche Freisetzungsverläufe in den verschiedenen Medien. Die Ernährung in den ersten Lebensmonaten basiert ausschließlich auf Milch, so dass darauf als Freisetzungsmedium für postprandiale Bedingungen zurückgegriffen wurde. Es wurden verschiedene Formulamilcharten sowie Kuhmilch (3,5 % Fettgehalt) getestet, wobei sich Unterschiede zwischen den einzelnen Milcharten gezeigt haben. Außerdem wurde ein Testszenario etabliert, das mit einer Mischung aus Magensaft und zur Arzneiform co-administrierten Flüssigkeiten arbeitet. Hier zeigte sich, dass die Gabe von Milch die unterschiedlichen pH-Werte des Magensafts nivellieren kann und die Freisetzung maßgeblich von den Eigenschaften der Milch dominiert wird. Für Kleinkinder wurde in die Entwicklung von Freisetzungsszenarien miteinbezogen, dass bei Einnahme einer Arzneiform unter nüchternen Bedingungen unterschiedliche Mengen Flüssigkeit dazu getrunken werden. In allen Testverfahren wurde neben der Variabilität des Trinkvolumens außerdem noch die Variabilität des pH-Wertes des Magensaftes zwischen pH 1,8 und 4,0 berücksichtigt. Hierbei zeigte sich, dass die variable Magenphysiologie als auch unterschiedliche, dazu eingenommene Flüssigkeiten bzw. -volumina das Ausmaß der Freisetzung beeinflussen können. Für die Entwicklung eines Freisetzungstests zur Simulation der postprandialen Bedingungen im Magen eines Kleinkindes wurden drei Frühstücksmahlzeiten von einjährigen Kindern ausgesucht. Aus den pürierten Mahlzeiten wurden verschiedene physikochemische Eigenschaften sowie deren Nährstoffgehalt bestimmt. Diese Informationen wurden genutzt, um neue Medien zu entwickeln, die die Eigenschaften der homogenisierten Mahlzeiten zum großen Teil imitieren, aber einfacher und einheitlicher herzustellen sind. Die Freisetzung in diesen neu entwickelten Medien wurde mit dem Standardmedium für die Freisetzung im postprandialen Magen von Erwachsenen sowie wässrigen Medien verglichen. Weder das bisherige Standardmedium noch die wässrigen Medien wiesen die gleichen Freisetzungsverläufe wie die neu entwickelten Medien auf.
Die Applikation von Arzneistoffen erfolgt sehr häufig über die orale Gabe. Die Kenntnis der Arzneistoffkonzentration im humanen Darm ist somit essentiell für das Verständnis der oralen Arzneimitteltherapie. Die intestinale Absorption wird von verschiedenen Faktoren bestimmt. Dazu gehören die anatomischen und physiologischen Gegebenheiten des Gastrointestinaltraktes sowie die Eigenschaften des Arzneistoffes und der Arzneiform. Das komplexe Zusammenspiel dieser Faktoren kann die intestinale Konzentration des Arzneistoffes und folglich dessen Absorption und daraus abgeleitet Wirkung und Nebenwirkung beeinflussen. Zur Bestimmung der intraluminalen Arzneistoffkonzentration und zur Charakterisierung des zugehörigen Absorptionsprozesses werden bisher Systeme und Methoden verwendet, welche die Physiologie des Darmes beeinflussen können oder die im Rahmen einer chirurgischen Intervention angewendet werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung eines Mikrodialysesystems zur Bestimmung intraluminaler Arzneistoffkonzentrationen im humanen Dünndarm. Dabei sollte das System die positiven Eigenschaften der bisher verwendeten Methoden und Systeme kombinieren. Die verwendeten Materialien wurden so ausgewählt, dass ein flexibles aber dennoch robustes System aus biokompatiblen Bestandteilen erhalten wurde. Das entwickelte System kann zudem mit bildgebenden Verfahren, wie der MRT, kombiniert werden. Das neu entwickelte Mikrodialysesystem besteht letztendlich aus einer Mikrodialyseeinheit sowie einem Zufluss- und Ablaufschlauch. Die finale Mikrodialyseeinheit ist aus 30 semipermeablen Kapillaren mit einer Austauschlänge von 10 cm zusammengesetzt, über die der Stoffaustausch zwischen dem Perfusat als Akzeptor-Kompartiment und dem Medium als Donor-Kompartiment erfolgt. Das System kann hierbei kontinuierlich oder diskontinuierlich perfundiert werden. Für den diskontinuierlichen Perfusatfluss war es hierbei nötig, einen zusätzlichen Schlauch in das System zu integrieren, der ein Abtrennen der gewonnenen Proben im Ablaufschlauch mittels Luftblasen ermöglicht. Die vorgesehene Anwendung des Mikrodialysesystems in klinischen Studien am Menschen wurde bei dessen Entwicklung stets berücksichtigt. Die Einbettung der Mikrodialyseeinheit in ein Schlauchsystem ermöglicht die orale Applikation und vereinfacht damit die Anwendung des Mikrodialysesystems im Menschen. Mit der Kombination von zwei Mikrodialysesystemen in einem Set kann weiterhin die gleichzeitige Erfassung von intraluminalen Arzneistoffkonzentrationen in unterschiedlichen Abschnitten des humanen Darmes erfolgen. Nach der erfolgreichen Entwicklung des Mikrodialysesystems erfolgte zunächst die Charakterisierung der Funktionalität des Systems anhand der relativen Wiederfindung des Arzneistoffes in den Dialysatproben. Die Untersuchungen wurden mit den Arzneistoffen Paracetamol, Amoxicillin-Trihydrat und Valsartan, die aufgrund ihres spezifischen Absorptionsverhaltens im Gastrointestinaltrakt ausgewählt wurden, und verschiedenen biorelevanten Donor-Medien sowie Perfusaten durchgeführt. Das Mikrodialysesystem wurde dabei kontinuierlich oder diskontinuierlich vom Perfusat durchströmt. Bei Verwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses wurden jedoch vergleichsweise geringere Werte für die relative Wiederfindung bestimmt. Die Verwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses resultierte dagegen in einer Equilibrierzeit von 1 bis 60 min, welches einen verlängerten Stoffaustausch zwischen dem Donor-Kompartiment und dem Perfusat ermöglichte und somit zu deutlich höheren relativen Wiederfindungen führte. Außerdem wurden die Proben im Ablaufschlauch unverzüglich durch die Zufuhr von Luft, die über den zusätzlich enthaltenen Schlauch zugeführt wurde, separiert. Ein Anstieg der Equilibrierzeit von 1 auf 5 oder 60 min resultierte hierbei allerdings nicht in einer deutlichen Erhöhung der relativen Wiederfindung. Für Amoxicillin und Valsartan wurden ähnliche Werte für die relative Wiederfindung bestimmt, während für Paracetamol höhere Werte ermittelt wurden, die mit dem geringeren Molekulargewicht und der damit verbundenen erhöhten Diffusionsgeschwindigkeit erklärt werden können. Nachdem ein deutlicher Einfluss der Temperatur auf die relative Wiederfindung nachgewiesen wurde, erfolgte die Durchführung der In vitro-Untersuchungen ausschließlich bei Körpertemperatur. Die Sensitivität des Mikrodialysesystems wurde untersucht, um dessen Eignung für In vivo-Untersuchungen zu bestimmen. Dabei sollte geprüft werden, ob und wie schnell Änderungen der Arzneistoffkonzentration im Donor-Kompartiment in den Dialysatproben nachweisbar sind. Bei Anwendung des kontinuierlichen Perfusatflusses erfolgte die Detektion der Erhöhung und Verringerung der Stoffkonzentration im Donor-Kompartiment verzögert. Im Gegensatz dazu konnte bei Nutzung des diskontinuierlichen Perfusatflusses mit einer Equilibrierzeit von 1 min eine Konzentrationsänderung im Donor-Kompartiment sofort in der nachfolgend gewonnenen Dialysatprobe nachgewiesen werden. Dies wurde für alle verwendeten Arzneistoffe bestätigt, sodass alle nachfolgenden Untersuchungen mit dem diskontinuierlichen Perfusatfluss und einer Equilibrierzeit von 1 min durchgeführt wurden. In den folgenden Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass das Mikrodialysesystem mehrmalig für In vitro-Untersuchungen genutzt werden konnte. Anhand von acht untersuchten Mikrodialysesystemen für Paracetamol und jeweils vier Mikrodialysesystemen für Amoxicillin und Valsartan konnte die reproduzierbare Herstellung der Mikrodialyse¬systeme nachgewiesen werden. Die Verwendung unterschiedlicher Donor-Medien und Perfusate führte zu ähnlichen Ergebnissen. Die anatomischen Gegebenheiten des Dünndarms wurden durch Untersuchungen in einem Röhrenmodell simuliert. Erhöhungen oder Verringerungen der Konzentration im Donor-Kompartiment wurden auch bei dieser Versuchsanordnung ohne zeitliche Verzögerung in der darauffolgenden Dialysatprobe nachgewiesen. In Zusammenarbeit mit dem Medizinproduktehersteller RoweMed erfolgte anschließend die Adaption des Mikrodialysesystems an die humane Anwendung. Dabei wurden modifizierte Bestandteile, wie zum Beispiel Schläuche mit verringerten Durchmessern verbaut, um die Anwendung für den Probanden möglichst angenehm zu gestalten. Die Möglichkeit, die Lokalisation der Mikrodialyseeinheit im Gastrointestinaltrakt über die pH-metrische Analyse der Dialysatproben zu bestimmen, wurde anschließend untersucht. Bis zu einem pH-Wert von pH 3 kann über den erniedrigten pH-Wert in den Dialysatproben der Rückschluss auf die Lage im Magen gezogen werden. Dies entspricht dem üblicherweise ermittelten pH-Wert im Magen von pH 2,7 bei nüchternen jungen, gesunden Probanden. Abschließend wurde die Eignung der Braun Infusomat® und Perfusor® Space Pumpen, die zur humanen Anwendung zugelassen sind, für die Nutzung in Kombination mit dem Mikrodialysesystem überprüft, um in einer Studie am Menschen CE-zertifizierte Geräte einsetzten zu können. Die beschränkte Programmierbarkeit beider Pumpen bei der Anwendung des diskontinuierlichen Perfusatflusses erforderte eine erneute Modifikation des Versuchsablaufes. Durch die Reduktion der Pump- und Equilibrierzeiten konnte ein Versuchsablauf ermittelt werden, der ähnliche Ergebnisse wie mit den bisher verwendeten Pumpen lieferte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Mikrodialysesystem zur Bestimmung intestinaler Arzneistoffkonzentrationen entwickelt und in vitro charakterisiert. Die mit dem Mikrodialysesystem gewonnenen Daten könnten genutzt werden, um zukünftig das komplexe Zusammenspiel verschiedener Faktoren während der Arzneistoffabsorption besser zu verstehen. Mit diesem Wissen könnten Nebenwirkungen und Wechselwirkungen oral applizierter Arzneistoffe verringert und deren Bioverfügbarkeit erhöht werden.
Die Verlängerung des Aufenthalts einer Arzneiform im Magen kann enorme Vorteile insbesondere für Arzneistoffe mit einem Absorptionsfenster im oberen Dünndarm oder schlechter Bioverfügbarkeit bieten. Bei gleichzeitig kontrollierter Freisetzung eines enthaltenen Wirkstoffs können Plasmaspitzen und Fluktuationen im Blutplasma vermieden werden. Ziel der Arbeit war die Entwicklung und Charakterisierung solcher potentiell gastroretentiver Darreichungsformen in vitro und in vivo. Der Hauptteil der Arbeit umfasste die Entwicklung einer neuartigen Arzneiform, die bei nüchterner und postprandialer Gabe eine zuverlässige Gastroretention über mehrere Stunden zeigen und den Wirkstoff kontrolliert im Magen freigeben sollte. Das System bestand aus einer wirkstoffhaltigen Kerntablette und einem den Kern umgebenden, quellenden Mantel, welcher durch Expansion die angestrebte Gastroretention ermöglichen sollte. Im Rahmen der Formulierungsentwicklung erwies sich die Mischung aus einem hoch- und niedrigmolekularen Polyethylenoxid als geeignet für die Kontrolle der Wirkstofffreisetzung aus dem Kern. Die Ergänzung wasserlöslicher, osmotischer Hilfsstoffe ermöglichte eine weitgehend pH-unabhängige und vollständige Wirkstofffreigabe. In vitro-Quellungsstudien mit den entwickelten Manteltabletten ergaben eine schnelle und ausgeprägte Größenzunahme bei Testung in einfachen Freisetzungsmedien. Zur Prüfung des tatsächlichen gastroretentiven Potentials der entwickelten Manteltabletten mit dem Diuretikum Furosemid wurde eine Magnetic Marker Monitoring (MMM)-Studie durchgeführt. Das MMM basiert auf der magnetischen Markierung einer Arzneiform und der Bestimmung ihrer Lokalisation im Gastrointestinaltrakt mittels empfindlicher Sensoren. Nach Nüchterneinnahme wurden die Manteltabletten innerhalb von 38 ± 12 min aus dem Magen der Probanden entleert. Bei Applikation der Manteltabletten nach Einnahme einer hochkalorischen, standardisierten Mahlzeit konnte eine durchschnittliche Gastroretentionszeit von 8 ± 3 h erzielt werden. Die AUC(0-24 h) konnte im Studienarm mit Nahrung im Vergleich zur Nüchterneinnahme von 89 ± 56 ng·h/mL auf 708 ± 304 ng·h/mL gesteigert werden. Weiterhin wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuartiges mechanisches Antrummodell entwickelt, mit dem der Einfluss antraler Kontraktionswellen auf die Tendenz zur Entleerung von Objekten untersucht wurde. Große, starre Objekte wie eine Glaskugel wurden aufgrund ihrer geringen Reibung vor der Welle hergeschoben und aus dem Modell entleert. Auch die reibungsverminderte Oberfläche eines Cryogel-Schaums erhöhte die Tendenz zur Entleerung aus dem Modell. Vielversprechend war dagegen die unter allen variablen Testbedingungen beobachtete Gastroretention eines Trichobezoars. Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass weiterhin eine große Herausforderung in der Entwicklung von Arzneiformen besteht, die eine nachweisliche Gastroretention beim Menschen in Abwesenheit von Nahrung zeigen.
Erkrankungen der Speiseröhre waren in der Vergangenheit ein wenig beachteter Themenkomplex in der Forschung und Entwicklung neuartiger Therapieoptionen. Die Behandlung von Erkrankungen wurde in der Regel systemisch oder chirurgisch durchgeführt. Trotz eines geringeren Risikos für unerwünschte Arzneimittelwirkungen im Vergleich zur systemischen Therapie wurde der Ösophagus bisher kaum als Target zur Medikamentenapplikation in Betracht gezogen. Durch die besonders kurze Transitzeit stellt die Speiseröhre einen sehr anspruchsvollen Applikationsort für die Entwicklung lokal wirksamer Darreichungsformen dar. Zur effektiven Therapie von Tumorerkrankungen, Pilzinfektionen, Motilitätsstörungen oder durch Reflux verursachte Schädigungen im Bereich der Speiseröhre wäre beispielsweise eine lokale Arzneimitteltherapie mit niedrig dosierten Wirkstoffen in mukoadhäsiven Darreichungsformen wünschenswert.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiges System zur gezielten lokalen und langanhaltenden Applikation von mukoadhäsiven Filmen in der Speiseröhre entwickelt und charakterisiert. Das dabei entstandene EsoCap-System besteht aus einem aufgerollten Film, der an einem Faden befestigt und in einer geschlitzten Kapsel positioniert ist. Bei der Einnahme der EsoCap mit einem eigens entwickelten Applikationssystem wird der Mechanismus zum Entrollen des Filmes ausgelöst. Durch den Schluckvorgang wird der Film in der Speiseröhre entrollt und haftet aufgrund der mukoadhäsiven Eigenschaften an der Mukosa des Patienten.
Die Funktionalität des Systems konnte in einer Studie mit zwölf gesunden Probanden gezeigt werden. Bei insgesamt 72 durchgeführten Applikationen konnte in 71 Fällen eine erfolgreiche Platzierung des mukoadhäsiven Filmes in der Speiseröhre nachgewiesen werden. Die korrekte Platzierung des Filmes wurde anhand eines neu entwickelten und kontrastierenden Filmes mittels MRT nachgewiesen. Zur standardisierten Evaluation der Akzeptanz wurde ein spezifisch auf die Eigenschaften und Besonderheiten des EsoCap-Systems angepasster Fragebogen entwickelt. Auch die prinzipielle Funktionalität des Systems konnten durch die Studie mit gesunden Probanden, nachgewiesen werden. Das modifizierte EsoCap-System, welches zusätzlich mit einem Sinker zur Erhöhung der Dichte versehen wurde, zeigte in der Befragung eine subjektiv bessere Schluckbarkeit. Zudem konnte ein bereits in der Literatur beschriebener Lern- und Trainingseffekt bei der Einnahme von oralen Darreichungsformen auch beim EsoCap-System beobachtet werden.
Neben der vorteilhaften Erhöhung der Dichte des Systems könnte die Verwendung kleinerer Kapseln (z. B. Größe 0) und die Verwendung eines schnell wasserlöslichen Retainers zum Auslösen des Systems mit einer Steigerung der Akzeptanz korreliert sein. Die Verwendung von kleineren Kapseln sollte durch die Verwendung von, im Vergleich zur MRT-Kontrastierung, dünneren, für die lokale Wirkstoffapplikation genügenden Filme möglich sein. Die Akzeptanz und die Überlegenheit des neuartigen Systems im Patienten sind in klinischen Studien zu beweisen. Zudem ist ein Verfahren zur automatisierten Herstellung des sehr komplexen und bisher vollständig manuell gefertigten Systems zu etablieren.
Neben der Filmdicke haben sowohl die verwendeten Polymere als auch die Wirkstoffbeladung einen Einfluss auf die Charakteristik der verwendeten Filme. Eine Möglichkeit die Funktionalität von Filmen In vivo besser vorherzusagen, besteht in der Verwendung biorelevanter In vitro-Testsysteme. Aus diesem Grunde wurde der EsoPeriDiss, ein neuartiges und biorelevantes In vitro-Testsystem zur Charakterisierung ösophageal applizierter Darreichungsformen entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass mittels des EsoPeriDiss erste Erkenntnisse hinsichtlich des Freisetzungsverhaltens und der Verweildauer von Filmen in der Speiseröhre bei simulierter Speichelflussrate, simulierter Peristaltik sowie bei verschiedenen simulierten Ausrichtungen des Patienten gewonnen werden können.
Durch Variation der Pumpleistung war die Speichelflussrate flexibel steuerbar und ermöglichte, wie auch das modulare Walzensystem, die Simulation verschiedener Einnahmebedingungen. So können Konfigurationen mit niedriger Intensität zur Simulation der nächtlichen Einnahme, aber auch hochintensive Konfigurationen zur Simulation der Einnahme mit Nahrung am Tage zusammengestellt werden. Durch die Ergänzung einer Positionsanpassung war es möglich, sowohl eine waagerechte als auch senkrechte Speiseröhre zu simulieren. Die Simulation von ausgewählten physiologischen Parametern und die In vitro-Charakterisierung verschiedener Darreichungsformen ermöglichten ein besseres Verständnis über die Verhältnisse und Beschaffenheiten von esophageal applizierten Darreichungsformen. Die Zusammenstellung von physiologischen Konfigurationen oder die Übertragung von In vivo-Daten von Patienten auf das System, ergeben für die neuartige modulare Testplattform eine Vielzahl interessanter Möglichkeiten zur Charakterisierung von ösophageal applizierbaren Darreichungsformen. Somit konnte gezeigt werden, dass das modular aufgebaute neue System zahlreiche Möglichkeiten für biorelevante Freisetzungsuntersuchungen bietet.
Das EsoCap-System stellt eine neuartige, innovative und hochvariable Plattformtechnologie dar, die die Applikation von mukoadhäsiven Polymerfilmen in der Speiseröhre ermöglicht. Durch Anpassung der Plattform, beispielsweise durch Verwendung verschiedener wirkstoffbeladener Filme könnte das System neue Möglichkeiten in der Therapie von bisher nur unzureichend therapierbaren Krankheiten der Speiseröhre eröffnen. Die Erkenntnisse aus der In vivo-Studie und den In vitro-Untersuchungen geben Anlass zur Hoffnung hinsichtlich einer In vivo verlängerten lokalen Verweildauer von Filmen in der Speiseröhre, die besondere Bedeutung für die Effektivität einer Therapie hat. Das EsoCap-System hat aus vielerlei Hinsicht das Potenzial eine Durchbruchsinnovation im Bereich der Therapie von Erkrankungen der Speiseröhre darzustellen. Durch diese innovative Applikationsmöglichkeit begünstigt, könnte insbesondere das Screening nach hochaktiven und spezifisch in der Speiseröhre wirkenden Wirkstoffen zusätzlich vorangetrieben werden.
Der Einsatz von 3D-Druckverfahren für die Herstellung von Arzneimitteln und Medizinprodukten stellt eines der größten neu entstandenen Forschungsgebiete dieses Jahrzehnts dar und gilt als ein technologischer Meilenstein im Bereich der personalisierten Medizin. Neben der Formindividualisierung von Implantaten können durch 3D-Druckverfahren wie dem in dieser Arbeit untersuchten Fused deposition modeling (FDM) auch die Wirkstoffdosis angepasst, deren Freisetzung gesteuert oder mehrere Wirkstoffe und/oder Freisetzungsprofile in einer Darreichungsform patientenindividuell kombiniert werden. Voraussetzung für diese Formulierungsentwicklungen sind geeignete pharmazeutische Polymere und eine genaue Kenntnis ihrer Extrudier- und Druckbarkeit und ihrer Wirkstofffreisetzung, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden sollten. Neben der Identifikation und Evaluation von druckbaren Polymeren sollte auch das Potenzial des FDMs für die Produktion von wirkstoffhaltigen Darreichungsformen sowohl für die parenterale als auch die perorale Applikation mit besonderem Augenmerk auf anspruchsvolle Wirkstoffe geprüft werden. Mit der Aufnahme dieser Arbeit belief sich die Auswahl an druckbaren Materialien für pharmazeutische Anwendungen primär auf die auch im technischen FDM verwendeten Polymere Polylactid und Polyvinylalkohol. Das zunächst begrenzte Spektrum möglicher Freisetzungsprofile der inkorporierten Arzneistoffe konnte unter anderem durch die in dieser Arbeit dargelegten Untersuchungen erweitert werden. Im Bereich des FDMs von Implantaten ergaben das bei nur 53 °C gedruckte Polycaprolacton eine vielversprechende Freisetzung des im Polymer komplett gelösten Modellarzneistoffs Chinin über einen Zeitraum von etwa 7 Wochen mit einer initial schnelleren Freisetzung, die sich sowohl durch die Wirkstoffbeladung als auch durch wasserlösliche Zusätze steuern ließ. Als Alternative zum klassischen FDM wurde darüber hinaus eine Spritzenextrusionsmethode zur Herstellung von flexibleren Hydrogel-Implantaten untersucht. Es konnten erfolgreich wirkstoffhaltige Glycerol-Gelatine-Modellimplantate gedruckt und anschließend quervernetzt werden. Abgesehen von ihrer guten Komprimierbarkeit für eine mögliche endoskopische Applikation sind jedoch die sehr schnelle Wirkstofffreisetzung innerhalb von 6 h und die beobachteten lagerungsabhängigen Volumenveränderungen nur schwer mit einer Anwendung als patientenindividuell angepasstes Implantat vereinbar. Im Bereich des FDMs von oralen Darreichungsformen lag der Fokus dieser Arbeit auf einer sehr schnellen Wirkstofffreisetzung aus der Polymermatrix und der Entwicklung von Lösungsstrategien für das FDM von anspruchsvollen Wirkstoffen, mit denen Forscher auch bei zukünftigen FDM-Anwendungen umgehen werden müssen. Eine der größten Limitationen der thermischen Verfahren Schmelzextrusion und FDM lag bis dato in der Notwendigkeit thermisch stabile Wirkstoffe einzusetzen. Durch ein ausführliches Screening von wasserlöslichen, pharmazeutischen Polymeren bei gleichzeitigem Einsatz des thermolabilen Modellarzneistoffs Pantoprazol-Natrium konnten in dieser Arbeit erfolgreich Formulierungen entwickelt werden, die bei Temperaturen unter 100 °C extrudier- und druckbar sind und eine schnelle Wirkstofffreisetzung aufweisen. Zu den vielversprechendsten Kandidaten gehören die amorphen festen Lösung des Polymers Polyethylenglycol 6000 mit einer sehr niedrigen Drucktemperatur von 54 °C und einer abgeschlossenen Freisetzung innerhalb von 30 min und die Formulierung des Polyvinylpyrrolidons K12, die neben den 10 % Pantoprazol auch 15 % Triethylcitrat enthielt und den kompletten Wirkstoff in etwa 10 min freisetzte. Durch Änderung des Druckdesigns der biplanen Tablette durch Senkung der Füllungsrate und Erhöhung der Tablettenporosität konnte diese Freisetzungszeit noch weiter auf sehr schnelle 3 min reduziert werden. Da das verwendete Pantoprazol zusätzlich säurelabil ist, erfolgte in einem nächsten Schritt eine magensaftresistente Ummantelung dieser schnell freisetzenden Tablettenkerne mittels Zweidüsen-FDM. Aufgrund der hohen Drucktemperatur des dafür verwendeten Celluloseacetatphthalats ergab sich ein zweigeteiltes Manteldesign, das jedoch in anschließenden Freisetzungsuntersuchungen keine komplette Magensaftresistenz erzielen konnte. Für eine ausreichende Dichtigkeit sollte für zukünftige Untersuchungen eine Veränderung im Düsenwechsel und/oder der Druck eines dickeren Mantels in Betracht gezogen werden, der wiederum eine weitere Verzögerung der Arzneistofffreisetzung nach dem pH-Anstieg bei Übertritt der Tablette in den Darm bedingen würde. Zusammenfassend betrachtet, liefert die vorliegende Arbeit wertvolle Erkenntnisse über den Einsatz von verschiedenen Polymeren für das FDM von Tabletten und Implantaten, die für eine gezielte Freisetzung - auch von anspruchsvollen Arzneistoffen – für kommende FDM-Anwendungen genutzt werden können.
Die Kenntnis über die im Gastrointestinaltrakt ablaufenden Prozesse spielt in der Entwicklung neuer Arzneiformen eine entscheidende Rolle. Besonders im Dickdarm ist dabei neben den physiologischen Bedingungen die bakterielle Besiedlung zu beachten, welche sowohl inter- als auch intraindividuell hoch variabel ist. Bislang gibt es keine einheitliche Methode zur Untersuchung des Einflusses der intestinalen Mikrobiota auf die Metabolisierung von Arzneistoffen. Diese Methoden sind jedoch entscheidend für das Verständnis des Einflusses der bakteriellen Metabolisierung auf die Pharmakokinetik und -dynamik der Arzneistoffe.
Übergeordnetes Ziel dieser Arbeit war es, ein In vitro-Modell zu entwickeln und anzuwenden, welches die dynamischen Bedingungen im Colon ascendens, insbesondere im Hinblick auf die pH-Werte, Durchmischung und bakterielle Besiedlung, darstellt.
Um dieses Ziel zu erreichen, wurde im Rahmen erster Versuche untersucht, wie es sowohl mit monographierten als auch biorelevanten Modellen möglich ist, die mechanische Belastung, die auf eine Arzneiform im GIT ausgeübt wird, darzustellen. Die Verwendung der SmartPill™ eröffnete die Möglichkeit, in den Apparaturen auftretende Drücke aufzuzeichnen. Außerdem konnten die gemessenen Drücke anschließend mit Daten aus In vivo-Studien verglichen werden. Die Untersuchungen ergaben, dass in den monographierten Apparaturen keine Drücke auftreten, die den während der Magen-Darm-Passage auftretenden Drücken entsprechen. Im Gegensatz dazu können im DOFTA gezielt Drücke und so auch vollständige Druckprofile simuliert werden.
Im weiteren Verlauf der Arbeit waren die zuvor gewonnenen Erkenntnisse hilfreich für die Entwicklung des neuen Modells zur Darstellung des Colon ascendens. In das MimiCol wurden pH-Wert-Daten aus einer SmartPill™-Studie implementiert. Die Vorteile des neuartigen Bioreaktors MimiCol sind das kleinere Medienvolumen, das den In vivo-Bedingungen näherkommt, die Möglichkeit, Medienwechsel durchzuführen und dadurch Metabolite abzuführen und neue Nährstoffe hinzuzufügen sowie die genauere Simulation von In vivo-Durchmischungsmustern.
Ziel der durchgeführten Untersuchung war der Vergleich der Metabolisierung des Modellarzneistoffs Sulfasalazin in dem neuartigen dynamischen Bioreaktor MimiCol und einem statischen Standard-Batch-Fermenter. Beide wurden mit der gleichen, kryokonservierten fäkalen Standardmikrobiota beimpft. Die Experimente zeigten, dass das MimiCol in der Lage ist, die dynamischen Bedingungen im aufsteigenden Dickdarm zu simulieren. Die dynamischen Bedingungen im MimiCol führten zu einer Verdopplung der Metabolisierungskonstanten im Vergleich zum statischen Batch-Fermenter. Das MimiCol ahmt, besonders in Bezug auf pH-Fluktuationen und Bakterienwachstum, die dynamischen Bedingungen im aufsteigenden Dickdarm nach und könnte sich in allen Phasen der Arzneimittel- und Formulierungsentwicklung als nützlich erweisen.
Zur Erleichterung und Beschleunigung der Datengenerierung wurde im nächsten Schritt eine Erweiterung des Modells angestrebt. Hierbei war es die größte Herausforderung, die ursprünglichen Parameter auf ein erweitertes Modell mit einer anderen Steuerung und anderen Komponenten zu übertragen. Außerdem wurde in diesem Zuge die Charakterisierung komplexer Bakterienkulturen mittels 16S rRNA-Sequenzierung eingeführt. Bei der Erweiterung des Modells wurde besonderes Augenmerk auf die Einfachheit des Designs und die leichte Skalierbarkeit gelegt.
Um zu beweisen, dass die Übertragung der Parameter erfolgreich war, wurde erneut der Abbau von Sulfasalazin untersucht und die bakterielle Zusammensetzung während des Experiments durch 16S rRNA-Sequenzierung analysiert. Die Übertragung der Versuchsbedingungen auf das neue Modell war erfolgreich. Kommerziell erhältliche Komponenten wurden in den Aufbau implementiert. Das Modell MimiCol³ repräsentierte das Colon ascendens in seinen Eigenschaften bezüglich des Volumens, pH-Werts und Redoxpotentials zufriedenstellend. Die 16S rRNA-Sequenzierung führte zu weiteren Erkenntnissen über die bakterielle Zusammensetzung in den drei Gefäßen. Der Abbau von Sulfasalazin stand in guter Übereinstimmung mit den In vivo-Daten und den im MimiCol gewonnenen Daten. Das neue Modell des Colon ascendens MimiCol³ ermöglichte es, zuverlässigere Daten zu sammeln, da drei Experimente gleichzeitig unter denselben Bedingungen durchgeführt wurden.
Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass ein wichtiges Instrument zur Untersuchung des Einflusses unseres Mikrobioms im Darm auf den Abbau von Arzneistoffen und Arzneiformen entwickelt wurde.
Innovative Wirkstoffe stellen die Entwickler und Entwicklerinnen von pharmazeutischen Darreichungsformen vor große Herausforderungen. Viele neue Arzneistoffe weisen eine unzureichende orale Bioverfügbarkeit auf. Die Gründe hierfür sind vielfältig und liegen unter anderem in der ortsabhängigen Löslichkeit und Permeabilität der betreffenden Substanzen. Dieser Problematik kann auf chemischer und technologischer Ebene begegnet werden. Auf der Seite der pharmazeutischen Technologie besteht beispielsweise die Möglichkeit, mukoadhäsive Darreichungsformen zu entwickeln. Darunter versteht man Systeme, die an der Schleimhaut haften und dadurch eine Retention des Arzneistoffes an der entsprechenden Stelle bewirken. Einerseits führt dies zu einer lokalen Erhöhung der Wirkstoffkonzentration, andererseits wird durch die Adhäsion die potenzielle Resorptionszeit verlängert. Beide Faktoren können sich positiv auf die Bioverfügbarkeit auswirken.
Zur Charakterisierung mukoadhäsiver Arzneiformen sind verschiedene Methoden beschrieben worden, von denen jedoch keine standardisiert ist. Mögliche Einflussfaktoren auf die Messung wurden in der Vergangenheit teilweise nicht ausreichend evaluiert, was die Konzeption einer geeigneten Messmethode erschwert. In der vorliegenden Arbeit wurde systematisch eine Methode zur Messung der Adhäsivität von Polyvinylalkohol-Filmen auf Basis der Messung der maximalen Haftkraft erarbeitet. Dazu wurde im ersten Teil der Arbeit ein in vitro-Test durchgeführt, der zur Aufklärung gerätespezifischer Einflussfaktoren diente. Es zeigte sich, dass die Adhäsion von PVA-Filmen an biomimetischen Agar/Muzin-Gelen in erster Linie zeitabhängig ist. Das Maximum der Adhäsion konnte nach 3 min beobachtet werden. In dieser Zeit kommt es zu einer Quellung des zuvor festen Films, wodurch die Beweglichkeit der Polymerketten zunimmt. Dies kann die Vernetzung von Polymer und Muzin begünstigen, wodurch die Adhäsion zunimmt. Nach Überschreiten eines Maximums kommt es zu einer Überhydratisierung des Systems und zu einer Abnahme der Kohäsion, so dass der Gelfilm beim Entfernen der Messsonde in sich reißt.
Die Geschwindigkeit, mit der die Sonde entfernt wurde, beeinflusste ebenfalls die Ergebnisse der Untersuchungen. Höhere Geschwindigkeiten führten zu höheren berechneten Adhäsionsarbeiten Wad, während die maximale Abrisskraft Fmax ein Plateau erreichte. Dieses Verhalten könnte durch die viskoelastischen Eigenschaften der beteiligten Bindungspartner beeinflusst werden.
Bezüglich der gerätespezifischen Parameter schien die Anpresskraft des Mukoadhäsivs an das biomimetische Gel den geringsten Effekt auszuüben. Unter Berücksichtigung der verwendeten Kraftmesszelle und der Integrität des Gels sollten höhere Anpresskräfte verwendet werden. Je nach Applikationsort sind physiologische Drücke zu berücksichtigen.
Ausgehend von den in vitro gewonnenen Erkenntnissen wurden anschließend zwei ex vivo Versuche durchgeführt. Diese Versuche konzentrierten sich auf die Eigenschaften der Substrate selbst, auf denen die PVA-Filme haften sollten. Der Einfluss der Präparation der verwendeten Gewebe auf die Adhäsion wurde sowohl an Dünndarmpräparaten vom Schwein als auch am Menschen untersucht. Die Gewebe wurden zum einen im frischen Zustand unmittelbar nach der Entnahme für die Mukoadhäsionsmessungen verwendet, im zweiten Versuchsabschnitt wurden sie für eine Woche im Gefrierschrank gelagert und für die Experimente aufgetaut. Bei den Schweinedärmen stellte sich die Frage, ob die Reinigung der frischen Därme einen zusätzlichen Effekt haben könnte. Aufgrund der geringen Probenzahl konnte kein eindeutiger Trend festgestellt werden. Bei zwei von drei Versuchstieren erhöhte sich die errechnete Arbeit (Wad) durch die vorsichtige Reinigung. Beim Auftauen der gereinigten Gewebe konnte bei allen Versuchstieren ein Anstieg der Wad sowie der maximalen Abrisskraft beobachtet werden. Diese Daten wurden statistisch mit den Ergebnissen der ex vivo-Humanstudie verglichen. Das Probandenkollektiv, dessen Daten in die Untersuchungen einflossen, umfasste insgesamt 12 Teilnehmer, die sich aufgrund verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen einer geplanten Operation unterziehen mussten. Gesundes Dünndarmgewebe, das aus operationstechnischen Gründen zusätzlich zum erkrankten Gewebe entfernt werden musste, wurde im Rahmen der Studie verwendet. Der statistische Vergleich der Gewebe unterschiedlicher Herkunft zeigte sowohl im frischen als auch im aufgetauten Zustand keine signifikanten Unterschiede. Bei Betrachtung der einzelnen Messwerte konnte jedoch festgestellt werden, dass die berechneten Wad bei menschlichem Gewebe etwas höher lagen als bei Schweinepräparaten. Eine größere Probenzahl könnte einen möglichen statistisch signifikanten Unterschied aufzeigen. Bei menschlichem Gewebe konnte außerdem festgestellt werden, dass die Verwendung einer Messeinstellung mit höherer Anpresskraft, längerer Kontaktzeit und schnellerem Entfernen der Messsonde zu signifikant höheren Wad führte (Einstellung A vs. Einstellung B). Bei allen Messungen wurde deutlich, dass die Adhäsionsarbeit empfindlicher auf Änderungen der Messparameter reagiert und daher möglicherweise der geeignetere Surrogatparameter für die Quantifizierung der Mukoadhäsion ist. Insgesamt zeigte sich bei den biologischen Präparaten eine deutlich größere Variabilität der Messwerte als bei den in vitro-Versuchen. Bei dem humanen Gewebe der ex vivo-Studie handelte es sich um Gewebe, welches von der für den Eingriff ursächlichen Erkrankung nicht betroffen war. In diesem Zusammenhang ist die große interindividuelle Variabilität der Messwerte auf der gesunden Schleimhaut hervorzuheben. Bei der Anwendung mukoadhäsiver Filme auf histologisch veränderter, pathogener Schleimhaut könnte die Mukoadhäsion möglichweise sogar weitaus variabler sein, da in diesem Fall neben der histologischen Veränderung auch eine mögliche Begleitmedikation eine Rolle spielen könnte. Diese Aspekte sollten bei dem Design einer Darreichungsform, aber auch eines geeigneten Testsystems zukünftig berücksichtigt werden.
Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse können zur weiteren Optimierung und Validierung einer Messmethode für die Mukoadhäsion beitragen, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu erhöhen. Um die biologische Relevanz dieser in vitro-Experimente zu verbessern, können physiologische Daten aus telemetrischen Systemen genutzt und in den experimentellen Aufbau implementiert werden.
Biorelevante In-vitro-Freisetzungsmethoden sind im Laufe der letzten Jahrzehnte zu einem unverzichtbaren Hilfsmittel in der Entwicklung von innovativen und generischen oralen Formulierungen geworden. Sie dienen in einer frühen Phase der Produktentwicklung u.a. zur Selektion von geeigneten Formulierungskandidaten im Vorfeld von Bioverfügbarkeits- und Bioäquivalenzuntersuchungen. Mithilfe biorelevanter Freisetzungsmethoden sollen dabei der menschliche Gastrointestinaltrakt (GIT) oder Teile davon simuliert werden, um somit Aussagen zum In-vivo-Freisetzungsverhalten der untersuchten Formulierung treffen zu können. Im Zuge der Entwicklung biorelevanter In-vitro-Testmethoden lag der Fokus bisher vorrangig in der Abbildung der gastrointestinalen Physiologie eines gesunden Erwachsenen. Inter- und intraindividuelle Unterschiede und andere Faktoren, die das Freisetzungsverhalten im GIT beeinflussen können, wie beispielsweise das Alter des Patienten oder zusätzliche Erkrankungen, blieben hingegen größtenteils unberücksichtigt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten daher individualisierte In-vitro-Freisetzungsmodelle entwickelt werden, welche die In-vivo-Variabilität des gastrointestinalen Transitverhaltens von Darreichungsformen und die variablen pH-Bedingungen des GIT nach Nüchterneinnahme widerspiegeln sollen. Auf Grundlage der zu entwickelnden Modelle sollte es demnach möglich sein, die Robustheit des Freisetzungsverhaltens von modifiziert freisetzenden Arzneiformen gegenüber inter- und intraindividuellen Unterschieden im Passageverhalten und den vorherrschenden pH-Bedingungen zu untersuchen. Am Beispiel von magensaftresistenten Acetylsalicylsäure (ASS)-Formulierungen wurde zunächst im Rahmen eines systematischen Screenings der Einfluss der Zusammensetzung des Freisetzungsmediums auf die Wirkstofffreisetzung untersucht. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf dem Vergleich phosphatgepufferter Medien mit dem physiologisch für den nüchternen Dünndarm relevanten Kohlensäure (H2CO3)/Hydrogencarbonat (HCO3-)-Puffersystem. Auf Basis von Literaturdaten zur Elektrolytzusammensetzung der intestinalen Flüssigkeiten wurde als Resultat des systematischen Screenings mit Carbonate-based Fasted State Simulated Intestinal Fluid (CarbFaSSIF) ein Freisetzungsmedium entwickelt, welches die Elektrolytzusammensetzung der luminalen Flüssigkeiten des nüchternen Dünndarms widerspiegelt und auf dem H2CO3/HCO3--Puffersystem basiert. Der Einsatz eines automatischen pH-Regulationssystem (pHysio-grad®) zur Stabilisierung von thermodynamisch instabilen HCO3--basierten Freisetzungsmedien ermöglichte es, mit CarbFaSSIF dynamische intestinale pH- und Transitprofile in hoher zeitlicher Auflösung in einer kompendialen Blattrührerapparatur zu simulieren. Am Beispiel von magensaftresistenten Mesalazin- und Natriumvalproatformulierungen wurde die Robustheit des Freisetzungsverhaltens gegenüber der Variabilität gastrointestinaler pH- und Passagebedingungen untersucht. Mit dem lokal im GIT wirkenden Mesalazin und dem systemisch wirkenden Natriumvalproat wurden zwei Arzneistoffe mit unterschiedlichen Wirkprinzipien ausgewählt, die aufgrund eines individuell variablen Freisetzungsverhaltens zu teils schwerwiegenden unerwünschten Arzneimittelwirkungen oder zu einem Therapieversagen führen könnten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden beispielhaft individuelle pH- und Transit-Bedingungen von vier individuellen Probanden einer in der Literatur beschriebenen In-vivo-Studie für die In-vitro-Simulationen ausgewählt, welche einerseits den Durchschnitt der In-vivo-Studie widerspiegelten, aber auch extreme Passage- und pH-Bedingungen aufwiesen. Die untersuchten Formulierungen zeigten abhängig von der Art der magensaftresistenten Überzüge eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber den individuellen simulierten pH- und Transit-Profilen. Für die Mesalazinformulierungen war es möglich, den Ort und das Ausmaß der Wirkstofffreisetzung, die für eine erfolgreiche Therapie ausschlaggebend sind, in individuellen Probanden in vitro zu bestimmen. Im Gegensatz zu den lokal im GIT wirkenden Mesalazinformulierungen sind für die antiepileptische Therapie mit magensaftresistenten Natriumvalproatformulierungen neben dem Ausmaß insbesondere der Zeitpunkt der Wirkstofffreisetzung für konstante Plasmaspiegel von entscheidender Bedeutung. Darauf basierend wurden unter Verwendung der ermittelten Freisetzungsdaten und mithilfe von individuellen pharmakokinetischen Parametern für die natriumvalproathaltigen Darreichungsformen In-silico-Simulationen mit einem neuen Simulationsprogramm (BioavailabilityDesign expert) zur Vorhersage von Natriumvalproatplasmaprofilen durchgeführt. Die ermittelten In-silico-Plasmaprofile wurden dabei mit dem mathematischen Verfahren des durchschnittlichen Euklidischen Abstands mit In-vivo-Daten aus der Literatur verglichen, um die In-vivo-Vorhersagekraft des Freisetzungsmodells beurteilen zu können. Abhängig von der Art des magensaftresistenten Überzugs und dem daraus resultierenden unterschiedlichen Ansprechen auf die Bedingungen der In-vitro-Freisetzungstests konnten für zwei der drei untersuchten Natriumvalproatformulierungen vielversprechende Vorhersagen zu den resultierenden Plasmaspiegeln getroffen werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit lag in der Implementierung des pHysio-grad®-Systems und der neu entwickelten HCO3--basierten Medien in prädiktiven Freisetzungstestmethoden für pädiatrische Darreichungsformen. Um vor allem das im GIT von Kindern, insbesondere bei Neugeborenen und Kleinkindern, im Vergleich zum Erwachsenen für die Wirkstofffreisetzung zur Verfügung stehende geringere Flüssigkeitsvolumen in einem In-vitro-Test hinreichend wiedergeben zu können, wurde für diesen Zweck eine neue Freisetzungsapparatur entwickelt. Das konstruierte System basierte auf standardisierten Prüfgefäßen und ermöglichte Freisetzungsuntersuchungen in einem Volumen von 30 bis 110 mL. Durch die Einbindung von miniaturisierten Komponenten des pHysio-grad®-Systems konnten zur Simulation der intestinalen Bedingungen von Kindern unterschiedlicher Altersgruppen auch physiologisch-relevante HCO3--Medien eingesetzt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit verdeutlichen, dass individualisierte Freisetzungsmethoden basierend auf physiologischen HCO3--Medien einen vielversprechenden Ansatz zur Beurteilung der Robustheit der Wirkstofffreisetzung von modifiziert freisetzenden Arzneiformen hinsichtlich der Variabilität von gastrointestinalen Transit und pH-Bedingungen darstellen. Darüber hinaus wurde mit einem Freisetzungsmodell für pädiatrische Arzneiformen ein erster Ansatz entwickelt, um die Besonderheiten, die mit der Arzneimittelapplikation an Kindern in Verbindung stehen, in einem In-vitro-Maßstab wiederzugeben. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten In-Vitro-Methoden basieren auf physiologischen Daten von gesunden erwachsenen Probanden, stellen aber eine universelle Plattform dar, die perspektivisch auch zur Simulation von individuellen Patienten eingesetzt werden kann. Die neu konzipierten Freisetzungsmodelle würden daher zukünftig sehr von systematischen In-vivo-Studien an Patienten profitieren, die Einflussfaktoren, wie Alter oder Erkrankungen, auf die Eigenschaften der luminalen Flüssigkeiten und das gastrointestinale Passageverhalten von Arzneiformen untersuchen.
Die Implantation von Arzneistoff-freisetzenden (drug-eluting) Stents in durch Ballonangioplastie revaskularisierte Koronararterien stellt heutzutage eine der wichtigsten Methoden zur Prävention von Restenosen der betroffenen Gefäßabschnitte dar. Die Erzielung wirksamer Konzentrationen der hochpotenten Wirkstoffe in der Gefäßwand unter Vermeidung von unerwünschten systemischen Arzneimittelwirkungen soll durch die kontrollierte Arzneistofffreisetzung im stenosierten Gefäßabschnitt gewährleistet werden. Aufgrund der Unzugänglichkeit des Wirkortes für direkte Konzentrationsbestimmungen liegen bis dato jedoch nur wenige Daten bezüglich der Wirkstofffreisetzung und -verteilung aus Humanstudien vor. Da die zur Verfügung stehenden offizinellen und nicht offizinellen Methoden zur Untersuchung des In vitro-Verhaltens von Arzneiformen lediglich ein Akzeptorkompartiment aufweisen, sind sie ebenfalls nur bedingt zur Vorhersage der Freisetzung aus einem Stent am Implantationsort geeignet. Verteilungprozesse können mit diesen Methoden nicht beschrieben werden. Aus diesem Grund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, einen an die In vivo-Bedingungen am Implantationsort adaptierten In vitro-Freisetzungstest für Arzneistoff-freisetzende Stents basierend auf den Methoden des Europäischen oder US-Amerikanischen Arzneibuchs zu entwickeln. Der Freisetzungstest sollte dazu geeignet sein, sowohl die Wirkstofffreisetzung und -verteilung zwischen verschiedenen Kompartimenten als auch räumliche Verteilungsmuster innerhalb eines Gefäßwand-simulierenden Kompartiments zu untersuchen. Als Basis für die Modellentwicklung wurde aufgrund der am Implantationsort in vivo vorliegenden Bedingungen die Durchflusszellen-Apparatur ausgewählt, die die einzige offizinelle Methode darstellt, bei der ein gerichteter Fluss erzeugt wird. Zur Simulation der Gefäßwand sollte ein zusätzliches Akzeptorkompartiment in die Durchflusszelle eingebracht werden. Da das Kompartiment einerseits formstabil sein sollte und andererseits die Aufnahme und den Transport des Arzneistoffs durch Diffusion ermöglichen sollte, wurden verschiedene Hydrogele hinsichtlich ihrer Eignung zur Integration in die Durchflusszelle untersucht. Calciumalginat wurde als geeignetes Hydrogel für das zusätzliche Akzeptorkompartiment identifiziert und durch Veränderungen an der Durchflusszellen-Apparatur erfolgreich in den Freisetzungstest integriert. Es wurde eine zentrale Aussparung im Hydrogel geschaffen, die im Modell das Gefäßlumen simuliert und in die ein Stent mittels Ballonkatheter implantiert werden kann. Nach der Implantation des Stents kann die Öffnung im Hydrogel mit dem Freisetzungsmedium mit einer Flussrate von 35 ml/min, die dem Blutfluss in Koronarien entspricht, perfundiert werden. Durch Einsatz geeigneter Medienvolumina kann die Einhaltung von Sinkbedingungen, die als das größte Problem der häufig eingesetzten nicht offizinellen Testsysteme gilt, sichergestellt werden. Nach erfolgter Entwicklung wurde die Eignung des Modells durch die Testung verschiedener Stentmodelle geprüft werden. Neben der Bestimmung der Freisetzung der Modellsubstanzen ins Durchflussmedium während der Perfusion und der am Versuchsendpunkt in der Stentbeschichtung verbliebenen Modellsubstanz-Anteile wurden verschiedene Methoden zur Untersuchung des Hydrogels nach Beendigung der Perfusion entwickelt. Zur direkten Quantifizierung der ins Hydrogel diffundierten Modellsubstanz wurde eine geeignete Methode zur Verflüssigung des Gels identifiziert. Zur Untersuchung der räumlichen Verteilung innerhalb des Hydrogels wurden zwei Methoden zur Präparation des Hydrogels entwickelt, die die Untersuchung im Fluoreszenzmikroskop ermöglichten. Einerseits wurde anhand von Mikrotomschnitten die Diffusionstiefe im Querschnitt untersucht. Unter Verwendung von Alginatfilmen war andererseits die Untersuchung der Innenseite des simulierten Gefäßlumens parallel zur Flussrichtung möglich. Unter Verwendung einer Finite-Elemente-Methode konnten zudem ausgewählte Freisetzungsversuche mathematisch modelliert werden. Für die Berechnungen wurden im Rahmen dieser Arbeit experimentell bestimmte Diffusionskoeffizienten zu Grunde gelegt. Die Ergebnisse der Freisetzung mit dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Testsystem wiesen im Vergleich zur Testung mit offizinellen Methoden eine Verlangsamung der Entleerung der Stentbeschichtung bei allen Modellsubstanzen durch die an die In vivo-Situation adaptierten Einbettungs- und Flussbedingungen auf. Diese Beeinflussung der Freisetzungsgeschwindigkeit durch die Freisetzungsbedingungen unterstreicht die Notwendigkeit, für die In vitro-Evaluation von Arzneistoff-freisetzenden Stents spezialisierte, an die In vivo-Bedingungen adaptierte Testsysteme einzusetzen. Mit dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Freisetzungsmodell steht erstmals ein solches Testsystem zur Verfügung.
Die Bedingungen im Magen sowie der Prozess der Magenentleerung haben großen Einfluss auf das Anflutungsverhalten schnell freisetzender Arzneiformen. Die intra- und interindividuellen Schwankungen, für die hinsichtlich der Wirkstofffreisetzung bedeutenden Parameter, können daher maßgeblich zur Variabilität von Plasmakonzentrations-Zeit-Profilen beitragen. Über geeignete Formulierungen lassen sich solche Schwankungen minimieren. Voraussetzung dafür sind In vitro Modelle, die frühzeitig eine physiologisch relevante Charakterisierung von Formulierungskandidaten ermöglichen. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, ein In vitro Freisetzungsmodell zu entwickeln, das für die Wirkstoffanflutung wesentliche physiologische Parameter des humanen Magens auf realistische Weise abbilden kann.
Im Rahmen erster Untersuchungen mit dem bereits etablierten Dynamic Open Flow Through Test Apparatus wurde geklärt, welchen Einfluss die Magenentleerungskinetik des Wassers auf das Anflutungsverhalten zweier N Acetylcystein Formulierungen (Granulat und Tablette) hat. In zuvor durchgeführten klinischen Studien war gezeigt worden, dass es aus pharmakokinetischer Sicht keine Unterschiede zwischen den Formulierungen gibt und beim Granulat selbst die Einnahme ohne Wasser keinen nennenswerten Einfluss auf die Pharmakokinetik hat. Die In vitro-Untersuchungen zeigten, dass diese Effekte vor allem auf die, unter den dynamischen Bedingungen der Magenentleerung, begrenzte Lösungsgeschwindigkeit des ansonsten gut wasserlöslichen Wirkstoffes zurückzuführen waren. Infolge der langsamen Freisetzung hatte die Entleerung des gleichzeitig eingenommenen Wassers nur geringen Einfluss auf die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Arzneistoffentleerung in das Duodenum. Vielmehr ist wahrscheinlich, dass der Migrating Motor Complex über die Entleerung ungelöster Partikel das Anflutungsverhalten dominiert.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde mit dem GastroDuo ein neues Modell entwickelt, in das Daten aus verschiedenen Humanstudien zur Charakterisierung der gastrointestinalen Parameter implementiert werden konnten. Über die Entwicklung verschiedener Testprogramme konnte die Simulation kritischer Parameter, sowohl des nüchternen als auch des postprandialen Magens, realisiert werden. Dadurch konnten in zwei Fallstudien, die bei postprandialer Applikation auftretenden pharmakokinetischen Besonderheiten verschiedener Fertigarzneimittel auf mechanistische Weise geklärt werden. So erklärten sich die resultierenden individuellen Plasmaspiegelverläufe der Fertigarzneimittel Viagra® und Adenuric® durch deren unterschiedliche Freisetzungs- und Entleerungscharakteristik. In den In vitro-Versuchen erwiesen sich diese Arzneiformen in ihrem Zerfalls- und Freisetzungsverhalten als unterschiedlich sensitiv gegenüber hydrodynamischen beziehungsweise mechanischen Einflüssen. So zeigten sich in den uns zur Verfügung gestellten pharmakokinetischen Daten für Viagra® vor allem Verläufe einer langsamen und kontinuierlichen Anflutung. Für Adenuric® wurde hingegen ein schnelles Anfluten beobachtet, was sich durch die schnelle Entleerung der fein dispergierten Arzneistoffpartikel über die Magenstraße in vitro erklären ließ.
Ähnliche Beobachtungen konnten für eine neu entwickelte Aspirin®-Formulierung gemacht werden. Diese zeigte aufgrund der angewandten Formulierungsstrategie ein, gegenüber der alten Formulierung, stark beschleunigtes Anfluten unter postprandialen Bedingungen. Wie die In vitro-Daten nahelegten, geschah dies aufgrund der zuverlässigen Entleerung über die Magenstraße. Bei der ursprünglichen Formulierung wurden hingegen deutlich niedrigere maximale Plasmakonzentrationen und ein wesentlich späteres Auftreten dieser maximalen Werte beobachtet. Diese Effekte ließen sich durch die langsame und unvollständige Entleerung aus den Magenzellen des GastroDuo bestätigen und erklären. In diesem Projekt konnte dementsprechend die Bedeutung der angewandten Formulierungsparameter und deren Wechselwirkung mit den physiologischen Begebenheiten aufgezeigt werden.
Abschließend wurde durch eine kombinierte In vitro /In vivo Studie die Eignung des GastroDuo für die prospektive Untersuchungen von Arzneiformen evaluiert. Dazu wurden vier verschiedene Darreichungsformen mit dem Modellarzneistoff Coffein mittels GastroDuo, sowie in einer Humanstudie untersucht. Durch den Nachweis von Coffein im Speichel der Probanden war eine Beurteilung des Zerfallsverhaltens in vivo möglich. Die Resultate der In vivo Studie wiesen gewisse Abweichungen von den erzielten In vitro Ergebnissen auf. Dabei wurde deutlich, dass eine Gewichtung der genutzten Testprogramme zwingend erforderlich ist, da die untersuchten Parameter in vivo mit verschiedenen Häufigkeiten und Auswirkungen auftreten.
Die durchgeführten Untersuchungen zeigen, dass das GastroDuo als vielversprechendes Instrument für die Beurteilungen von schnell freisetzenden Darreichungsformen angesehen werden kann. Der modulare Aufbau ermöglicht die Testung definierter physiologischer Parameter unter kontrollierbaren Bedingungen. Allerdings erfordert dieser Aufbau jeweils einen Satz verschiedener Experimente. Nach unserer Auffassung ist dieser Ansatz jedoch unabdingbar um frühzeitig fundierte Aussagen über die Qualität von Arzneimitteln treffen zu können.
Die Magen-Darm-Passage von Arzneiformen ist ein komplexer Vorgang, der durch starke Variabilität gekennzeichnet ist. Die Inhomogenität der Passagebedingungen betrifft sowohl die physiko-chemischen Eigenschaften des Milieus der einzelnen Abschnitte des Magen-Darm-Traktes als auch deren spezifische Motorik und kann das Wirkstoffabgabeverhalten fester peroraler Arzneiformen beeinflussen. Die Komplexität der Gegebenheiten in vivo macht es notwendig, die peroralen Arzneiformen hinsichtlich der Applikationsbedingungen zu optimieren, um ein gezieltes Wirkstoffabgabeverhalten und somit die therapeutische Wirkung bei Patienten zu erzielen. Dies gilt besonders für Arzneiformen mit modifizierter Wirkstofffreisetzung, die gewöhnlich hohe Dosen von Arzneistoffen enthalten. Die Wirkstoffabgabe und somit die Anflutung in die systemische Zirkulation werden bei solchen Präparaten von der Arzneiform determiniert. Deswegen erscheint die zuverlässige Funktion der Arzneiform von essentieller Bedeutung für die Sicherheit und Optimierung der Therapie. Die Untersuchung des Wirkstoffabgabeverhaltens einer Zubereitung wird vor Anwendung am Menschen laut Arzneibüchern in so genannten Freisetzungstests überprüft. Basierend auf den physiologischen Erkenntnissen wurde versucht die Freisetzungstests an die physiologischen Verhältnisse stärker anzupassen. In zahlreichen Studien wurde der Einfluss der Freisetzungsmedien auf das Freisetzungsverhalten der Arzneiformen erforscht. Diese Adaptation der Freisetzungsuntersuchung an die physiologischen Verhältnisse wurde bereits im Arzneibuch in Form von „biorelevanten Freisetzungsmedien“ berücksichtigt. Die Relevanz des Einflusses der Hydrodynamik und der Mechanik des Magen-Darm-Traktes auf das Freisetzungsverhalten der Arzneiformen ist zwar akzeptiert aber unzureichend untersucht. Zum Anfang dieser Arbeit wurde eine Hypothese formuliert die besagt, dass vor allem die mechanischen Aspekte der Magen-Darm Passage, aber auch der unterbrochene Medienkontakt das Freisetzungsverhalten fester peroralen Arzneiformen mit modifizierter Wirkstofffreisetzung beeinflussen können. Die Stressfaktoren konnten in den bisher entworfenen Testverfahren und Arzneibuchmethoden nicht auf biorelevante Weise simuliert werden. Deswegen wurde in dieser Arbeit ein Freisetzungstestgerät entwickelt, das vermag, die mechanischen Aspekte der GI-Passage monolithischer Arzneiformen realistisch nachzubilden. Die Konstruktion ermöglicht eine parallele Simulation von GI-spezifischen Druckverhältnissen, Diskontinuität und Intensität der physiologischen Transportvorgänge und des unterbrochenen Kontaktes der Arzneiformen zu den Freisetzungsmedien. Das Gerät ist geeignet, vor allem die monolithischen Arzneiformen wie zum Beispiel Tabletten oder Kapseln mit modifizierter Wirkstofffreisetzung zu testen. Im Laufe der Arbeit wurden entsprechende Testprogramme etabliert, die die kritischen Momente der GI-Passage von Arzneiformen simulieren. Die Programme sind Kombinationen aus Ruhephasen, die durch kurze Stressereignisse unterbrochen werden. Die zeitliche Abfolge der Stressphasen wurde so programmiert, dass die physiologischen Passagezeiten der Arzneiformen realistisch imitiert werden. Die Intensität der Stressereignisse wurde dabei so definiert, dass die Maxima der physiologisch relevanten Belastungswerte nachgebildet werden können. Gezeigt wurde, dass die Simulation des biorelevanten Stresses der Magen-Darm-Passage sowohl in Form von Transportvorgängen als auch variablen Druckverhältnissen die Freisetzungscharakteristika der getesteten Retardarzneiformen bedeutend beeinflusste. Die Ergebnisse belegen, dass die mechanische Beständigkeit der hydrophilen Matrixtabletten von entscheidender Bedeutung für deren Freisetzungsverhalten in vitro und in vivo ist. Ferner wurde gezeigt, dass durch Simulation nüchterner Passagebedingungen das In vivo-Freisetzungsverhalten einer Modellarzneiform nachgebildet werden kann. Die Testergebnisse weisen darauf hin, dass die starken Fluktuationen der Plasmaspiegel durch die Anfälligkeit der Arzneiform auf den biorelevanten Stress hervorgerufen werden. Diese Anfälligkeit scheint eine der wichtigsten Ursachen für arzneiformbedingte Interaktionen darzustellen, besonders für dose dumping in vivo, und kann unter Anwendung der offiziellen Methoden nicht erfasst werden. Gezeigt wurde, dass durch den Einsatz des biorelevanten Freisetzungs-Testgerätes die risikobehafteten Formulierungen mit unerwünschter Wirkstoffsfreisetzungscharakteristik in einem einfachen Testverfahren identifiziert werden können. Nachgewiesen wurde, dass die Veränderungen der Freisetzungscharakteristika der Arzneiformen, die durch die Stressereignisse biorelevanter Intensität ausgelöst werden, eine klinische Relevanz aufweisen. Nunmehr wurde die Einsetzbarkeit des Gerätes in den Screeninganalysen von bioäquivalenten Produkten bestätigt.
Die Entwicklung von Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus verschiedenen Arzneiformen hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Einerseits werden diese Methoden im Rahmen der routinemäßigen Qualitätskontrolle genutzt, andererseits können diese Methoden auch in einer frühen Phase der Entwicklung einer neuartigen Darreichungsform hilfreich sein. Weiterhin werden heutzutage auch biorelevante Aspekte in Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung eingebracht, um aus den Ergebnissen der In-vitro-Wirkstofffreisetzung mögliche In-vivo-Profile vorherzusagen. Aufgrund der steigenden Anzahl an langwirksamen Arzneimitteln auf dem Markt wird die Nachfrage nach beschleunigten Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung auch von Seiten der Behörden steigen.
Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von diskriminierenden und beschleunigten Methoden zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus LNGB-haltigen Injektionssuspensionen unterschiedlicher Partikelgrößen. Auf Grundlage der zu entwickelnden Methode sollte es demnach möglich sein, trotz Beschleunigung der Methode zwischen den verschiedenen Partikelgrößen, welche in einem Bereich von 8-41 μm lagen, zu unterscheiden. Zunächst wurde die Sättigungslöslichkeit von LNGB in verschiedenen Medien, welche später in den Freisetzungsuntersuchungen eingesetzt werden sollten, bestimmt. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von LNGB in den Freisetzungsmedien wurde diesen eine variierende Menge an SDS zugesetzt, um die Löslichkeit zu steigern. Für die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung wurden Methoden sowohl für die Blattrührer-Apparatur als auch für die Durchflusszelle entwickelt.
In einer ersten Versuchsreihe in der Blattrührer-Apparatur wurde der Einfluss der zugesetzten Tensid-Menge auf die Wirkstofffreisetzung untersucht. Um in den Versuchen mindestens dreifache Sink-Bedingungen einzuhalten, wurden alle nachfolgenden Versuche mit einem Zusatz von 0,75 % SDS zu dem entsprechenden Freisetzungsmedium durchgeführt. In einem systematischen Screening wurde der Einfluss der Umdrehungsgeschwindigkeit, des Freisetzungsmediums und der Temperatur in der Blattrührer-Apparatur untersucht. In allen durchgeführten Versuchen konnten signifikante Unterschiede in den MDTs zwischen der Gruppe der kleineren Partikel (Suspensionen mit sehr kleinen und kleinen LNGB-Partikeln) und der Gruppe der größeren Partikel (Suspensionen mit mittleren und großen LNGB-Partikeln) beobachtet werden. Den größten Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen zeigte die Erhöhung der Temperatur von 37,0 °C auf 50,0 °C.
Für die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung in der Durchflusszelle wurde sowohl eine Methode unter Verwendung eines offenen Systems als auch eine Methode für die Verwendung der Durchflusszelle im geschlossenen System entwickelt. Für beide Modi wurde der Einfluss der Flussrate (10 mL/min vs. 20 mL/min) untersucht. Die Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen im offenen System brachte einige Nachteile mit sich. So wurden innerhalb der ersten Minuten trotz entsprechender Filterpackung die LNGB-Partikel aus der Zelle herausgespült. Darüber hinaus wurde durch die relativ hohe Flussrate eine große Menge an Freisetzungsmedium benötigt. Aus diesem Grund wurde der Einfluss der Temperaturerhöhung auf die Wirkstofffreisetzung aus den LNGB-haltigen Injektionssuspensionen unter Verwendung der Durchflusszellen-Methoden nur im geschlossenen System untersucht. Ähnlich wie bei den Ergebnissen der Wirkstofffreisetzung in der Blattrührer-Apparatur zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den Ergebnissen der Wirkstofffreisetzung aus den Suspensionen bei 37,0 °C und 50,0 °C. Eine Unterscheidung zwischen der Gruppe der kleineren LNGB-Partikel und den größeren LNGB-Partikeln war bei den verschiedenen Flussraten und auch unter den Testbedingungen der erhöhten Temperaturen möglich.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines neuen bioprädiktiven Freisetzungsmodells für Vaginalringe. Dieses neue Modell sollte in der Lage sein, den sogenannten burst release, welcher für Vaginalringe des Reservoir-Typs beobachtet werden kann, in vitro zu erfassen. Als burst release wird eine im Vergleich mit der täglichen Freisetzungsrate initial höhere Freisetzungsrate bezeichnet, welche zu unerwünschten Nebenwirkungen führen kann. Die untersuchten Formulierungen, der NuvaRing® und der Cyclelle®-Ring, sind Vertreter der Vaginalringe vom Reservoir-Typ. Vaginalringe vom Reservoir-Typ bestehen aus einem Kernpolymer, welches die beiden Steroidhormone EE und ENG enthält. Das Kernpolymer wird wiederum von einer wirkstofffreien Membran umgeben, welche die Wirkstofffreisetzung der Steroidhormone aus dem Kernpolymer maßgeblich steuert. Während der Lagerung solcher Vaginalringe vom Reservoir-Typ diffundieren EE und ENG in die Membran, bis in dieser die beiden Wirkstoffe in einem gesättigten Zustand vorliegen. Aufgrund der Sättigung der Membran kommt es nach Einsetzen des Vaginalrings zum Auftreten des burst release. In bisherigen Versuchen zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus Vaginalringen mit einfachen Shake-flask-Methoden wurde der burst release nicht erfasst, da häufig nur alle
24 h eine Probennahme und anschließend ein kompletter Tausch des Freisetzungsmediums erfolgte.
Das neu entwickelte Freisetzungsmodell sollte biorelevanter gestaltet werden als die bisherigen Shake-flask-Methoden. Daher wurden in dem neuen Modell zwei weitere Kompartimente integriert, welche die Absorption der Steroidhormone ähnlich der In-vivo-Situation, berücksichtigen sollten. Da die Daten, welche mit dem neu entwickelten Freisetzungsmodell erhoben wurden, später mit In-vivo-Plasmaspiegeln aus klinischen Studien mit dem NuvaRing® und dem Cyclelle®-Ring korreliert werden sollten, wurden die Probennahmezeitpunkte für die In-vitro-Wirkstofffreisetzungsuntersuchungen aus den klinischen Studien adaptiert. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von EE und ENG und der geringen Volumina, welche im neuen Freisetzungsmodell eingesetzt wurden, wurde den Freisetzungsmedien 0,5 % SDS zugesetzt, um zehnfache Sink-Bedingungen zu gewährleisten. Die Wirkstofffreisetzung aus dem NuvaRing® und dem Cyclelle®-Ring wurde sowohl mit der modifizierten Shake-flask-Methode als auch mit dem neu entwickelten Freisetzungsmodell bestimmt. Der burst release wurde mit dem neuen Freisetzungsmodell besser als mit der modifizierten Shake-flask-Methode erfasst. Auch die deklarierten täglichen Freisetzungsraten von 120 μg ENG und 15 μg EE aus den untersuchten Vaginalringformulierungen wurden in dem neu entwickelten Freisetzungsmodell erreicht. Nach dem sogenannten burst release setzten beide untersuchte Formulierungen EE und ENG nach einer Kinetik 0. Ordnung frei. Die In-vitro-Freisetzungsdaten, welche einer Kinetik 0. Ordnung folgten, wurden mit den dekonvulierten In-vivo-Plasmaspiegeln korreliert. Für beide In-vitro-Methoden konnte für EE ein linearer Zusammenhang gefunden werden.
Das neu entwickelte Freisetzungsmodell stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Prüfung der Wirkstofffreisetzung aus Vaginalringen dar. Mit Hilfe des neuen Modells konnte der burst release aus Vaginalringen vom Reservoir-Typ besser erfasst werden als mit den bisher verwendeten Shake-flask-Methoden. Trotz der geringen Volumina, welche im neu entwickelten Freisetzungsmodell eingesetzt wurden, konnten durch den Zusatz von 0,5 % SDS zehnfache Sink-Bedingungen in beiden Kompartimenten erreicht und während der Versuche eingehalten werden. Erste Korrelationen mit den aus In-vivo-Plasmaspiegeln berechneten absorbierten EE-Fraktionen und den kumulativ freigesetzten EE-Mengen zeigten einen linearen Zusammenhang zwischen der in vivo absorbierten Fraktion und der in vitro kumulativ freigesetzten Wirkstoffmenge.
In dieser Arbeit wurden systematisch mehrdimensionale chromatographische Systeme unter Verwendung von Alkyl-, Calixaren- und Resorcinarenphasen untersucht. Deren Analyse bildet einen grundlegenden Schritt on-line gekoppelte Trennungen in der HPLC schneller und effektiver planen und optimieren zu können. Neue Ergebnisse über den Einfluss der Säulenschaltsysteme auf die Retention der Analyten wurden dargestellt. Sowohl Erkenntnisse über die Retentionsmechanismen während der Schaltung als auch mathematische Modelle zur Beschreibung der Retention auf der sekundären stationären Phase wurden ermittelt. Um eine umfassende Betrachtung zu gewährleisten, wurden 43 Analyten verschiedener Struktur (unpolare, polare, ionische Analyten chemischer Leitstruktur sowie pharmazeutisch genutzte Stoffe) verwendet. Mit diesen Analyten erfolgten zunächst eindimensionale Analysen, um anschließend den exakten Einfluss der Säulenschaltungen zu ermitteln. Die Ergebnisse wurden unter Berücksichtigung bestehender Retentionsmodelle interpretiert. Dabei zeigten sich Unterschiede zwischen konventionellen alkylgebundenen und neuartigen calixarengebundenen stationären Phasen. Erweiterungen und Präzisierungen der bestehenden Modelle wurden vorgeschlagen. Diese vertiefen das Verständnis der Retentionsmechanismen in der RPLC.
Diese Arbeit war Teil eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten interdisziplinären Forschungsnetzwerks (#1HealthPREVENT) und stellte eine einmalige peri-operative antibiotische (Penicillin/Gentamicin (P/G)) Prophylaxe (PAP) im Zuge eines operativen Eingriffs nach diagnostizierter Kolik beim Pferd der bislang üblichen fünf-Tage-Antibiose gegenüber, mit dem Ziel den Einfluss der PAP auf die Häufigkeit von (engl.) Extended Spectrum β-Lactamase produzierenden Escherichia coli (ESBL-EC) und die Veränderungen im enteralen Mikrobiom der Pferde zu untersuchen und zur Verbesserung des sorgfältigen Einsatzes von Antibiotika in der Veterinärmedizin beizutragen. Die per Los jeweils einer der zwei Gruppen („single shot“ Gruppe (SSG); „5 days“ Gruppe (5DG)) zugeordneten Pferde wurden dafür jeweils an drei verschiedenen Zeitpunkten (Klinikaufnahme (t0), Tag 3 (t1) und Tag 10 (t2) postoperativ) beprobt (Kotproben und Nüsternabstriche). Zusätzlich zur Gruppe der hospitalisierten Pferde wurde auch eine nicht-hospitalisierte Kontrollgruppe ohne klinische Auffälligkeiten einbezogen. Alle Proben wurden hinsichtlich positiver ESBL-EC untersucht und die identifizierten Isolate phänotypisch (durchgeführt vom Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen, Freie Universität Berlin) und genotypisch charakterisiert. Unabhängig vom P/G PAP-Schema stieg für die Pferde die Wahrscheinlichkeit von t0 zu t1 sowie von t0 zu t2 an, positiv für ESBL-EC zu sein. Die Ganzgenom-Sequenzierung der Isolate ergab außerdem eine enge räumliche und zeitliche Beziehung zwischen Isolaten mit gemeinsamen Sequenztypen, was auf eine lokale Ausbreitung hindeutete. Die 16S rRNA-Gen Sequenzierung der Kotproben (durchgeführt vom Institut für Klinische Molekularbiologie der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel) zur Untersuchung der Veränderungen im enteralen Mikrobiom zeigte nach der bioinformatischen Aufbereitung (durchgeführt von Silver Anthony Wolf, Robert Koch-Institut) und Fach-übergreifenden Analyse eine Beeinträchtigung in der Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota (Alpha-Diversität) für Pferde mit akuter Kolik im Vergleich zur Kontrollgruppe, welche jedoch nicht signifikant war. Die mikrobielle Gesamtkomposition der untersuchten Proben (Beta-Diversität) wies vor allem für die 5DG an t1 erhebliche Einschränkungen auf, was höchstwahrscheinlich auf die fortlaufende Verabreichung von Antibiotika zurückzuführen war. In beiden Studiengruppen wurde zudem an t1 eine erhöhte Abundanz von Enterobacteriaceae, insbesondere Escherichia, festgestellt. Insgesamt wiesen die Ergebnisse dieser Arbeit einen starken Einfluss des Krankenhausaufenthaltes an sich auf, vor allem auf die ESBL-EC-Isolationsraten, wodurch möglicherweise Unterschiede zwischen den verschiedenen PAP-Behandlungen überdeckt wurden. Trotzdem stellen die in dieser Studie gesammelten Ergebnisse und gewonnenen Erkenntnisse einen ersten wichtigen Schritt in der Etablierung von Antibiotic Stewardship-Programmen in Pferdekliniken dar und könnten somit einen langfristigen Einfluss auf die lokale Verbreitung von ESBL-EC haben.
Pentathiepine sind siebengliedrige, heterocyclische Polysulfane. Sie gehören damit zur Gruppe organischer Polysulfide und somit zu einer Stoffklasse, die in den letzten Jahren wachsendes Interesse hinsichtlich pharmazeutisch/medizinisch nutzbarer Eigenschaften geweckt hat. Sie besitzen unterschiedliche biologische Wirkungen, die möglicherweise auf die Aktivierung durch Thiole, wie zum Beispiel Glutathion (GSH), zurückzuführen sind. Dazu gehören die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies und die oxidative Fragmentierung von DNA.
Pentathiepine zeigen sich als gelbe, schwer lösliche Feststoffe und sind in sauren Lösungen sehr stabil. In Lösungen, die Basen oder Nukleophile enthielten, nahm der Gehalt an Pentathiepinen jedoch sehr schnell ab. In dieser Arbeit sollte hauptsächlich untersucht werden, inwieweit sich die Stabilität der Pentathiepine auf die biologischen Eigenschaften auswirkt. Neben der Ermittlung der Verteilungskoeffizienten 23 verschiedener Pentathiepine, wurden auch enzymbasierte Assays durchgeführt.
Dazu gehörte die Bestimmung der Reversibilität der Hemmung an boviner Glutathionperoxidase-1 (GPx-1) sowie der Einfluss unterschiedlicher Inkubationsbedingungen auf die inhibitorische Wirkung. Dabei wurde für das untersuchte Pentathiepin mittels jump dilution keine irreversible Hemmung an boviner GPx-1 gefunden. Eine irreversible Inhibierung konnte jedoch für Mercaptobernsteinsäure gezeigt werden. Die Ergebnisse der unterschiedlichen Inkubationsbedingungen erlauben die Schlussfolgerung, dass der intakte Pentathiepinring wahrscheinlich nicht an der Hemmung der GPx-1 beteiligt ist, sondern die aus der Reaktion mit GSH gebildeten Abbauprodukte. Es konnte jedoch auch gezeigt werden, dass der Pentathiepinring mindestens als „Schwefeltransporter“ benötigt wird. Ein Übertrag des GPx-Assays auf die HPLC konnte als prinzipiell möglich, für die Pentathiepine jedoch als nicht geeignet gezeigt werden.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden sechs Pentathiepine mit vier unterschiedlichen Grundgerüsten hinsichtlich ihrer Stabilität in Gegenwart von GSH untersucht. Dabei gab es hinsichtlich der Reaktivität der Pentathiepine sehr starke Unterschiede. Trotz dieser großen Unterschiede konnten keine Unterschiede hinsichtlich der GPx-Hemmung und der antiproliferativen Eigenschaften beobachtet werden. Auch eine Absenkung der intrazellulären GSH-Konzentration durch Inkubation mit DL-Buthioninsulfoximin in drei humanen Krebszelllinien mit unterschiedlichem Glutathiongehalt ergab keine Unterschiede zwischen den getesteten Substanzen. Sie waren nach Vorinkubation der Zellen durchgehend aktiver.
Aufgrund der vergleichsweise hohen Reaktivität in Gegenwart von GSH sollte ein Pentathiepin in einem proof of concept in Liposomen formuliert werden. Diese Formulierung sollte einerseits das Pentathiepin vor Reaktionen mit Thiolen wie GSH schützen, andererseits die Wasserlöslichkeit erhöhen. Dabei ergab sich, dass die Wasserlöslichkeit der Pentathiepine durch Formulierung in DOPC-Liposomen von unter 3 μM auf über 400 μM erhöht werden konnte. In Hinsicht auf die Stabilität ergab sich eine erhöhte Stabilität des untersuchten Pentathiepins in Anwesenheit von 10 mM GSH um den Faktor 4 in der Zeit bis zum vollständigen Abbau. Hinsichtlich der antiproliferativen Eigenschaften ergab sich keine Abnahme der Wirkung des Pentathiepins durch Formulierung in Liposomen.