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In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro und in vivo die Rolle der Thrombozyten in der Sepsis untersucht. In vitro wurde humanes plättchenreiches Plasma und Vollblut mit LPS und TRAP-6 stimuliert und eine mögliche Aktivierung der Thrombozyten durchflusszytometrisch überprüft. Im PRP kam es zu einem leichten Anstieg von P-Selektin, einem Aktivierungsmarker und Adhäsionsmolekül auf Thrombozyten, nach Kostimulation von TRAP-6 und LPS im Vergleich zur TRAP-6 behandelten Gruppe. Im Vollblut zeigte sich nach LPS-Zugabe dagegen ein signifikanter Anstieg von Leukozyt-Thrombozyt-Aggregaten und eine Zunahme der P-Selektin-Expression auf den aggregatbildenden Thrombozyten. In vivo wurde als etabliertes Sepsismodell die Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) durchgeführt. Weibliche C57BL/6-Mäuse wurden einer 16 G CASP unterzogen und nach 20 h untersucht. Unbehandelte Tiere dienten als Kontrollgruppe. Es wurde ein signifikanter Abfall der Thrombozytenzahl im peripheren Blut septischer Tiere beobachtet. Um die Ursache für diese verminderte Plättchenanzahl zu finden, wurden zuerst immunhistochemische Färbungen von Leber, Lunge, Niere und Milz angefertigt um dort mögliche Thrombozytenanreicherungen zu entdecken. In diesen zeigte sich allerdings nur in der Leber eine deutliche Zunahme von Thrombozyten nach CASP. In Lunge, Niere und Milz war kein signifikanter Anstieg zu verzeichnen. Als zweiter möglicher Grund für die Thrombozytopenie wurde die disseminierte intravasale Gerinnung (DIC) als bekanntes Phänomen der Sepsis in Betracht gezogen. Zur Überprüfung wurde der Fibrinogengehalt im Plasma per ELISA bestimmt, da bei starker Gerinnung dessen Gehalt sinkt. Dabei zeigte sich allerdings eine Zunahme von Fibrinogen im Plasma bei den septischen Tieren im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Fibrinogen sank also nicht im Sinne einer Verbrauchskoagulopathie, wie es zu erwarten wäre, sondern stieg im Sinne eines Akute-Phase-Proteins. Weiterhin wurde der Einfluss des Chemokinrezeptors CCR4 in der Sepsis untersucht, da CCR4-/--Mäuse im Vergleich zu C57BL/6-Tieren nach CASP einen Überlebensvorteil haben. Zuerst wurde die Expression von CCR4 auf mRNA-Ebene in mononukleären Zellen des peripheren Blutes und CD4+-Zellen der Milz 20 h nach CASP gemessen. In beiden Zellpopulationen zeigte sich im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe eine signifikant verringerte Transkription von CCR4. Da auch Thrombozyten CCR4 exprimieren, wurde sowohl die Immunhistochemie, als auch der ELISA bei CCR4-/--Tieren nach CASP durchgeführt um mögliche Unterschiede zur Wildtyp-Maus festzustellen. In beidem war allerdings kein Unterschied zwischen C57BL/6- und CCR4-/--Tieren zu sehen. Da Thrombozyten in vitro durch LPS aktiviert wurden, vor allem im Zusammenspiel mit anderen Blutzellen und septische Tiere sowohl eine Thrombozytopenie als auch eine Plättchenakkumulation in der Leber zeigten, sind die Plättchen im Krankheitsverlauf der Sepsis von Bedeutung. Der Chemokinrezeptor CCR4 scheint im Zusammenhang mit Thrombozyten in der Sepsis von untergeordneter Bedeutung zu sein. In anderen Immunzellen, vor allem T-Helfer-Zellen, wird dessen Expression im Zellkern im Verlauf der Sepsis reguliert und könnte damit Einfluss auf den Krankheitsverlauf haben.
Das Pankreaskarzinom weist unter allen Krebsarten eine der niedrigsten Überlebensraten auf. Der einzige kurative Therapieansatz ist die chirurgische Resektion, unterstützt durch chemotherapeutische Regime. In den aktuellen Leitlinien findet sich keine Empfehlung für eine immunmodulatorische Therapie.
Im Rahmen dieser Dissertation sollte die Wirkung des CCR4-Chemokin-Rezeptors auf die Progression des murinen Pankreaskarzinoms untersucht werden.
Es wurden unter Verwendung der Tumorzelllinie 6606PDA in einem murinen orthotopen Pankreaskarzinommodell CCR4-Knockout-Mäuse und Wildtypmäuse verglichen. Der Rezeptor ist in die gezielte Migration von Immunzellen involviert und wurde unter anderem auf Makrophagen beschrieben. Hierzu liegen im Mausmodell keine Erkenntnisse vor. Daher wurden die Tumoren verglichen, um die Rolle der tumorassoziierten Makrophagen zu analysieren.
In der Tumorvolumenmessung mittels 7-Tesla-MRT zeigten die Wildtypmäuse nach 5 Wochen größere Tumoren (442.1 ± 57.86 mm3) im Vergleich zu den CCR4-Knockout-Mäusen (114.0 ± 19.24 mm3, p<0,0001). Nach Induktion orthotoper Pankreaskarzinome zeigten die CCR4-Knockout-Mäuse in der Überlebenskinetik ein längeres medianes Überleben (76 Tage) im Vergleich zu den Wildtypmäusen (33 Tage, p=0,0039). In der histopathologischen Auswertung zeigte sich bei den Pankreaskarzinomen der CCR4-Knockout-Mäuse eine geringere Makrophagendichte (0,14±0,026 %F4/80+Tumorfläche) im Vergleich zu denen der Wildtypmäuse (0,390± 0,060 %F4/80+ Tumorfläche, p=0,0019). In vitro zeigten Makrophagen mit Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors (6622 ± 839 Makrophagen) im Vergleich zu Wildtyp-Makrophagen (49230 ± 11080 Makrophagen) in modifizierten Boyden-Kammern eine geringere Migration von Makrophagen auf 6606-Tumorzellen hin (p=0,0018).
Im Rahmen dieser Dissertation konnte die Beeinflussung von Makrophagen durch das murine Pankreaskarzinom nachgewiesen werden. Der Verlust des CCR4-Chemokin-Rezeptors führte zu einer verlangsamten Progression des Pankreaskarzinoms, zu einem längeren Überleben der Versuchstiere und zu einer geringeren Makrophagendichte im Tumorgewebe.
Wären diese neuen Erkenntnisse aus dem Mausmodell auf den Menschen übertragbar, so könnten chirurgische und chemotherapeutische Therapien unterstützt und um einen immunmodulatorischen Therapieansatz ergänzt werden. Ein anti-CCR4 Antikörper wurde in aktuellen Studien erfolgreich bei humanen hämato-onkologischen Tumoren angewendet. Zukünftig sollte eine Erforschung des Antikörpers beim Pankreaskarzinom erwogen werden.
Neben dem bekannten biologisch-aktiven Angiotensin II sind andere biologisch-aktive Angiotensine wie das Angiotensin IV und Angiotensin (1-7) entdeckt worden. Vor einigen Jahren wurde herausgefunden, dass das Mas-Protoonkogen für einen Rezeptor kodiert, welcher essentiell für den Angiotensin (1-7)-Signalweg ist. Dieses wird nicht nur in der Peripherie, sondern auch im Gehirn exprimiert. Hierauf basierend untersuchten wir die Verteilung von Mas innerhalb des Gehirns der Maus mithilfe eines Antikörpers, welcher gegen die 3. zytoplasmatische Schleife des Rezeptors gerichtet ist. Die stärkste Expression wurde im Gyrus dentatus sowie im piriformen Cortex detektiert. Jedoch wurden ebenfalls Mas-positive Neurone in vielen Bereichen des Cortex, des Hippocampus, der Amygdala, den Basalganglien, dem Thalamus und dem Hypothalamus gefunden. Da der Gyrus dentatus zur adulten Neurogenese fähig ist, untersuchten wir den Einfluss der Deletion von Mas auf eben diese. Im Gyrus dentatus beeinflusste di e Deletion von Mas weder die Zellproliferation (nachgewiesen durch Phosphohistone H3) noch den Zelltod (nachgewiesen durch aktivierte Caspase3). Jedoch resultierte der Knockout von Mas in einer Erhöhung Doublecortin-positiver Zellen. In Bezug auf den pirifomen Cortex wird diskutiert, ob dieser unter physiologischen Gesichtspunkten zur adulten Neurogenese fähig ist. Wir konnten demonstrieren, dass der Mas-Knockout einen Einfluss auf die Zellteilung und die Population Doublecortin-positiver Neurone hat. Da Mas nicht vor dem ersten postnatalen Tag exprimiert wird, lassen unsere Daten vermuten, dass adulte hippocampale Neurogenese und die Neurogenese in der pränatalen Entwicklung mehrere gemeinsame Mechanismen besitzen. Darüber hinaus, da der Knockout von Mas die Zahl Doublecortin-positiver Neurone erhöht, könnte die Blockade von Mas hilfreich sein bei der Stimulation der Neurogenese beim Erwachsenen.
Die Dilatative Kardiomyopathie ist eine multifaktoriell bedingte Erkrankung, bei der unter anderem immunologische Prozesse und Autoantikörper eine wichtige Rolle spielen. Für die Steuerung und Aktivierung von Immunreaktionen ist der FcγRezeptor IIa von wesentlicher Bedeutung. Sein auf einer Punktmutation an Position 131 der Aminosäurekette beruhender H/R131 - Polymorphismus bestimmt dabei maßgeblich die Rezeptoraffinität zu Immunglobulin G. Für eine Vielzahl von Autoimmunerkrankungen konnte bereits der Einfluss des FcγRezeptor IIa - H/R131 - Polymorphismus auf Manifestation und Krankheitsverlauf gezeigt werden. In der vorliegenden Untersuchung wurden 262 Patienten mit Dilatativer Kardiomyopathie hinsichtlich ihrer klinischen Krankheitsmanifestation in Abhängigkeit vom FcγRezeptor IIa - H/R131 - Polymorphismus untersucht. Für Patienten des Rezeptortyps RR131 konnten signifikant niedrigere Werte für NtproBNP, signifikant bessere echokardiographische Funktionsparameter sowie eine höhere Sauerstoffaufnahme zum Zeitpunkt der aerob-anaeroben Schwelle in der Spiroergometrie gefunden werden. Patienten des Rezeptortyps HH131 dagegen wiesen höhere NtproBNP-Werte, eine schlechteres echokardiographisches Outcome sowie schlechtere spiroergometrische Parameter auf. Die Rezeptorgruppe RH131 nahm jeweils die intermediäre Position ein. Somit konnte ein relevanter Einfluss des FcγRezeptor IIa - H/R131 - Polymorphismus auf die klinische Manifestation der Dilatativen Kardiomyopathie gezeigt werden. Zudem unterstreicht die vorliegende Untersuchung die Bedeutung antikörpervermittelter Prozesse bei der Genese der Erkrankung.
Die Unreife des Zentralnervensystems (ZNS) bei Neugeborenen, aber besonders bei Frühgeborenen, führt zur Anfälligkeit für Schädigungen des ZNS. Auslöser neurologischer Entwicklungsstörungen bei Frühgeborenen sind daher neben der Unreife selbst vor allem Hyperoxie, Hypoxie-Ischämie und Infektionen. In der Fetalzone der fetalen Nebennierenrinde werden Fetalzonensteroide (hauptsächlich Dehydroepiandrosteron [DHEA]) gebildet, welche in der Plazenta für die Synthese der verschiedenen Östrogene notwendig sind. Die Frühgeburt geht mit dem Verlust dieser „feto-plazentaren Einheit“ einher und führt damit zu einem drastischen Absinken von Östrogenen und Progesteron im Frühgeborenen um den Faktor 100. Bisher wurde der Tatsache, dass die Fetalzonensteroide in hohen Konzentrationen bis zum Zeitpunkt der reifen Geburt weiter synthetisiert werden jedoch kaum Beachtung geschenkt. Da klinische Vorstudien zur Substitution von Estradiol (E2) und Progesteron bei Frühgeborenen keine eindeutigen Verbesserungen des neurologischen Outcomes zeigten, stellte sich die Frage, ob E2 dann noch protektiv wirken kann, wenn Fetalzonensteroide ebenfalls anwesend sind.
Zur Untersuchung der Fragestellung wurde das Schädigungsmodell der Hyperoxie bei drei verschiedenen Typen unreifer Gliazellen verwendet. Dafür wurden zuerst die Rezeptoren bestimmt, die an der E2-vermittelten Protektion bei Hyperoxie-induziertem Zelltod beteiligt sind. Die am häufigsten vorkommenden Vertreter der Fetalzonensteroide DHEA, 16α-Hydroxy-Dehydroepiandrosteron (16OH-DHEA) und Androstendiol (Adiol) wurden untersucht, ob sie wie E2 ebenfalls protektiv wirken. Am Beispiel von DHEA wurden die an der Protektion beteiligten Rezeptoren untersucht. Da intrazelluläre Aromatasen die Fetalzonensteroide in potentere Östrogene umwandeln können, wurde das Ausmaß der Protektion nach Inhibition der Aromatasen untersucht. Die Fetalzonensteroid-Einzelbehandlungen wurden dann gegen die Kombination von E2 und Fetalzonensteroid in Bezug auf das Ausmaß der Protektion untersucht. Zusätzlich wurden genomische und nicht-genomische Aspekte untersucht.
Bei OLN-93 Zellen (unreife Oligodendrozyten [OL], Ratte), Platelet-derived Growth Factor Receptor Alpha positive (PDGFRα+) Primärzellen (unreife OL, Maus) und C6 Zellen (unreife Astrozyten, Ratte) vermittelten klassische Östrogenrezeptoren (ER) die Protektion durch E2. In C6 Zellen waren zusätzlich nicht-klassische ER beteiligt. Die Fetalzonensteroide DHEA, 16OH-DHEA und Adiol induzierten dosisabhängig Protektion bei allen Zelltypen. Der Effekt von DHEA wurde dabei zelltypabhängig über klassische ERs und/oder den Androgenrezeptor (AR) vermittelt. Die Inhibition von Aromatasen führte in C6 Zellen bei 16OH-DHEA zum Verlust der protektiven Eigenschaften. Im Gegensatz dazu führte die Inhibition der Aromatasen in OLN-93 Zellen tendenziell zu einer Steigerung der Protektion aller Fetalzonensteroide. In den PDGFRα+ Primärzellen wurden keine Aromatasen bzw. deren Aktivität nachgewiesen. Die Kombinationsbehandlung mit E2 und Fetalzonensteroid führte bei OLN-93 Zellen zu einem synergistischen Effekt gegenüber den Fetalzonensteroid-Einzelbehandlungen. Das steht im Kontrast zu C6 und PDGFRα+ Zellen, wo die Kombinationsbehandlung keine synergistischen Effekte gegenüber den Einzelbehandlungen aufwies. In C6 und OLN-93 Zellen konnten zudem genomische und nicht-genomische Effekte von E2, sowie genomische Effekte von DHEA nachgewiesen werden.
Während der Schutz vor apoptotischen Zelltod durch E2 in Frühgeborenen-Modellen vielfach beschrieben worden ist, konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass auch die Fetalzonensteroide in diesen Modellen zu protektiven Effekten führen. Die zelltypspezifische Reaktion auf die Fetalzonensteroide war dabei von der Wirkstärke der Bindung an die ERs und den AR, aber auch vom Vorkommen intrazellulärer Enzyme abhängig. Bei C6 und PDGFRα+ Zellen führte die Kombination von E2 und Fetalzonensteroid nicht zu synergistischen Effekten, da die E2- und Fetalzonensteroid-vermittelte Protektion hauptsächlich über die klassischen ERs wirkte, was wahrscheinlich zu einer Sättigung des am ER erzeugten Mechanismus führt. Das steht im Kontrast zu den OLN-93 Zellen, wo die Kombinationsbehandlung zu Synergien führte. Hier scheint DHEA gegenüber dem AR eine genauso ausgeprägte Wirkstärke zu besitzen wie E2 gegenüber den klassischen ERs, so dass die Protektion durch E2 über klassische ERs und die der Fetalzonensteroide über den AR ablaufen könnte. Die Ergebnisse zu genomischen und nicht-genomischen Effekte bedürfen weiterer Untersuchungen.
Die Frühgeburt erzeugt ein einzigartiges hormonelles Milieu, welches so nur beim Menschen und anderen höheren Primaten vorkommt. Die hohen Konzentrationen an Fetalzonensteroiden in Frühgeborenen bis zum Zeitpunkt der reifen Geburt könnten zu einer permanenten Aktivierung von klassischen ERs führen, was sich bereits schützend auf das Gehirn von Frühgeborenen auswirken könnte. Da Fetalzonensteroide im µM-Bereich im Frühgeborenen akkumulieren, könnte eine Sättigung durch Bindungskonkurrenz am ER bei E2-Substitution stattfinden und so den klinischen Effekt einer Substitution von E2 bei Frühgeborenen abschwächen. Weiterhin stellt sich die Frage, ob die derzeit verwendeten Frühgeborenen-Modelle eine solide Grundlage für die Entwicklung neuer Therapieansätze bieten, da sie die großen Mengen an Fetalzonensteroiden nicht berücksichtigen.
Die Migration von Endothelzellen unter hämodynamischen Flussbedingungen ist ein komplex regulierter Vorgang. In dieser Arbeit konnten die Aktivierung des Apelin-Rezeptors und die Zugabe von Statinen als Einflussfaktoren auf die Migration der Endothelzellen unter verschiedener Schubspannung identifiziert werden. Dabei wurden folgende Kernaussagen herausgearbeitet:
1. Der Apelin-Rezeptor reguliert die Endothelzellen-Migration in Abhängigkeit von der Schubspannung und dem Gefäßbett. In HUVEC wirkt der APLNR migrationsfördernd unter physiologischen Schubspannungen und migrationshemmend unter höheren Schubspannungen. Keinen Einfluss zeigt der APLNR auf die Migration von HCAEC.
2. Physiologische Statinkonzentrationen reduzieren die EC-Migration in HCAEC. Dies steht im Gegensatz zu der beschriebenen migrationsfördernden Wirkung von statinbehandelten HUVEC. In supraphysiologischen Konzentrationen zeigten sich Unterschiede zwischen dem lipophilen Atorvastatin und dem hydrophilen Pravastatin.
3. Die Wirkung der Statine auf die EC-Migration scheint teilweise über den APLNR zu erfolgen. Dies könnte möglicherweise abhängig von ihrer Lipophilie geschehen.
Hinsichtlich der klinischen Relevanz scheint insbesondere der Einfluss des APLNR auf die endotheliale Migration, sowie sein Zusammenspiel mit Atorvastatin von Bedeutung zu sein. In diesem experimentellen Setting konnte bei Betrachtung von arteriellen EC kein Vorteil eines der Statine bezüglich ihrer Migration herausgearbeitet werden. Inwieweit sich diese jedoch klinisch unterscheiden, müsste in in vivo Studien untersucht werden.
In Zusammenschau mit den Studien der aktuellen Literatur zeigte die hier vorliegende Arbeit besonders, wie stark zum Beispiel die Auswahl des Zellmodells die Ergebnisse beeinflusst. So lassen sich Arbeiten mit dem für Arteriosklerose oft gewählten HUVEC-Zellmodell kaum mit Experimenten an HCAEC vergleichen, obgleich es sich bei beiden um vaskuläre Endothelzellen handelt. Außerdem zeigte sich, dass die Wirkung der Statine oder der APLNR-Blockierung unter physiologischen Schubspannungen teilweise gegenteilig zu ihrer Wirkung unter höheren Schubspannungen ist.
In der individualisierten Medizin wird angestrebt für jeden einzelnen Patienten entsprechend seiner Erkrankungen, die optimalste Therapie zu finden. Wo Atorvastatin für den einen Patienten von Vorteil ist, sorgt bei einer anderen Patientin Pravastatin für mehr Sicherheit. Dass diese Wirkstoffgruppe nicht so homogen ist, zeigen die hier erhobenen Ergebnisse. Um den modernen Therapieansatz zu verfolgen, sollten auch die wissenschaftlichen Fragestellungen bezüglich der Wirkstoffgruppe der Statine konkreter abgestimmt beantworten.
Es wurden die Lokalisation des (P)RR/ATP6ap2 in PC12 Tumorzellen neuronalen Ursprungs, kardialen und renalen Zellen und Geweben sowie die funktionellen Folgen nach Downregulation oder Überexpression (paradoxe Downregulation) des Rezeptors untersucht. Er weist sowohl eine ER-spezifische, Membran-assoziierte als auch eine Lokalisation in der löslichen Fraktion auf.
Als akzessorische Untereinheit der vakuolären H+ ATPase beeinflusst der Rezeptor ihre Integrität und Aktivität. Die Vielzahl differenter Daten zwischen den mit einem V ATPase-Inhibitor behandelten und den (P)RR/ATP6ap2-downregulierten PC12 Zellen verdeutlicht, dass die Funktion des (P)RR/ATP6ap2 insbesondere im Metabolismus über eine bloße Regulation der V ATPase-Aktivität hinausgeht und möglicherweise durch die Integration des (P)RR/ATP6ap2 im Wnt-Pathway bestimmt wird.
Sphingosin-1-phosphat beeinflusst als extrazellulärer Botenstoff eine Vielzahl verschiedener Zelltypen und damit zahlreiche biologische Prozesse. In dieser Arbeit wurde die Rolle des S1P-Signallings in murinen BMDM in vitro untersucht. Zunächst wurde das S1P-Rezeptorexpressionsprofil in proinflammatorischen, M1 polarisierten Makrophagen und anti-inflammatorischen, M2-polarisierten Makrophagen vergleichend charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl S1P1 als auch S1P4 in Abhängigkeit vom Polarisierungszustand der Makrophagen differentiell exprimiert werden. Daraus resultierten Unterschiede in der Wirkung von S1P auf grundlegende biologische Eigenschaften von M1- und M2-polarisierte Makrophagen. Klassisch polarisierte Makrophagen zeigten eine konzentrationsabhängige chemotaktische Migration entlang eines S1P-Gradienten. Weiterhin steigerte S1P die Sekretion von TNF-α und IL-6 in unpolarisierten und alternativ polarisierten Makrophagen. S1P begünstigte weiterhin die proinflammatorische Makrophagenaktivierung unter M1-polarisierenden Kulturbedingungen. Das Phagozytoseverhalten sowohl von M1- als auch von M2polarisierten Makrophagen bleibt dagegen von S1P in vitro unbeeinflusst. Aufgrund seiner differentiellen Expression in M1- und M2-polarisierten Makrophagen liegt die Hypothese nahe, dass der S1P4-Rezeptor ein potentielles Ziel zur gezielten pharmakologischen Beeinflussung unpolarisierter und M2-polarisierter Makrophagen ist.
Das Das Verständnis zellulärer Signaltransduktionswege ist ein zentrales pharmakologisches Forschungsthema. Dabei ist die Interaktion von Arzneimitteln mit Rezeptorproteinen, entweder als Agonisten oder Antagonisten, essentiell für die Wirkung vieler Arzneimittel. Die Aufklärung der sich daran anschließenden Signaltransduktionswege ist für das molekulare Verständnis vieler Arzneimittelwirkungen deshalb von besonderem Interesse. Viele Forschungsanstrengungen in der Vergangenheit haben sich intensiv mit der Aufklärung solcher Signaltransduktionsvorgängen beschäftigt. Während die Grundzüge solcher Signalwege häufig sehr gut erforscht sind, fällt auf, dass von vielen Signalproteinen zahlreiche Isoformen existieren, die vermutlich am Zustandekommen von Rezeptor-und Effektorspezifitäten beteiligt sind und häufig gewebespezifisch exprimiert werden. Über die Bedeutung solcher Isoformen – insbesondere für Signaltransduktionsvorgänge in vivo – ist wenig bekannt. So kennt man 5 G-Protein beta-Untereinheiten und 12 G-Protein gamma- Untereinheiten, die spezifischen Funktionen bleiben aber offen. Ähnliches gilt für das Netzwerk von PLC-Isoformen, wobei die Entdeckung der PLC epsilon und weiterer Isoformen darauf hindeutet, dass es hier zeitliche und räumliche Integrationsfunktionen der neu entdeckten Mitglieder gibt. Wesentliche Elemente der durch die PLC vermittelten Signaltransduktion sind die Spaltung von PIP2 in DAG und IP3 sowie der temporäre Anstieg der [Ca2+]i. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die Etablierung und Adaptation eines Systems zur retroviralen Infektion von Zellen mit siRNA-Molekülen angestrebt, die in der Generierung stabiler knock down Zellen resultieren sollte. Im zweiten Schritt sollte diese Technik auf Fragestellungen zur Gbeta-Protein Spezifität und des PLC-Netzwerkes angewendet werden. Bei der RNA-Interferenz (RNAi) handelt es sich um einen hochkonservierten posttranskriptionellen Mechanismus zur Regulation der Genexpression in eukaryotischen Zellen. Eine zentrale Rolle in der RNAi spielen kurze RNA-Moleküle wie siRNAs und miRNAs. Es wurde ein retroviral basiertes Expressionssystem zur siRNA-Expression erstellt und validiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dieses System erfolgreich zum knock down der Expression von PLCbeta1 PLCbeta 3, PLC epsilon, Gbeta1, Gbeta2 und Gbeta5 eingesetzt. Außerdem wurde mit Hilfe dieses Systems ein erfolgreicher knock down der Expression von Epac1 (Lopez De Jesus et al., 2006), von Cathepsin B (Dr. Bien, persönliche Mitteilung) und MRP5 (multidrug resistance related protein 5; Nambaru, Hübner, Köck, Jedlitschky, Rimmbach, Rosskopf, Kroemer, Weiss, Mayerle, Lerch, und Ritter: Modulation of drug efflux transporter MRP5 affects sensitivity to the nucleoside anticancer drug 5-fluorouracil in pancreatic cancer cell lines; Molecular Cancer Therapeutics; eingereicht) durchgeführt. Wesentliche Befunde zur spezifischen Signalübertragung dieser Arbeit waren die Beobachtung, dass der knock down von Gbeta 1 keinen Einfluss auf die Signalübertragung der Transmitter Bradykinin und Histamin besitzt. Die funktionelle Ausschaltung von Gbeta 2 oder Gbeta 5 – zweier Gbeta-Untereinheiten, die zu unterschiedlichen Gbeta-Familien gehören – führte jedoch zu einer signifikanten Hemmung dieser Signale. Es handelt sich bei dieser Beobachtung um einen der wenigen Befunde, die eine Spezifität bei der Gbeta-vermittelten Signaltransduktion herausarbeiten können. Auf ähnliche Weise konnte plausibel gemacht werden, dass die PLCbeta3 – nicht aber die PLCbeta1 – an der Signalübertragung von LPA-Rezeptoren beteiligt ist. Ein funktioneller knock down der PLC epsilon wirkte sich nicht auf die frühen Calciumsignale nach Stimulation von GProtein- gekoppelten Rezeptoren für LPA, S1P oder Acetylcholin aus. Interessanterweise waren aber nach Ausschaltung der PLC epsilon Calciumsignale, die durch den EGF-Rezeptor – einer Rezeptortyrosinkinase – vermittelt wurden stark gehemmt. Bei der Analyse des Zeitverlaufs der durch LPA stimulierten Calciumsignale fiel ferner auf, dass eine länger anhaltende Plateauphase in Abwesenheit der PLC epsilon unterblieb. Dies deutet auf eine Integrationsfunktion der PLC epsilon in späteren Phasen der Signalübertragung hin, die zu einem anhaltenden Anstieg der Ca2+-Konzentration beiträgt. Es ist bekannt, dass diese Anstiege z.B. bei der Proliferationskontrolle eine wichtige Rolle spielen. Im Einklang mit diesen Befunden fiel auf, dass nach Stimulation mit dem Lysolipid LPA die Proliferationsrate von PanC1 Pankreaskarzinomzellen, denen die PLC epsilon durch retroviralen Transfer von siRNA Molekülen ausgeschaltet wurde, signifikant erniedrigt war. Schließlich wurde eine neue Methode zur Quantifizierung von Transkriptmengen homologer Transkripte basierend auf dem Pyrosequencing Verfahren etabliert und validiert. Gerade bei hoch homologen Genen – wie es bei Gbeta -Untereinheiten der Fall ist – kann diese Methode der relativen Quantifizierung sehr gut eingesetzt werden, da im Gegensatz zu anderen Techniken, die wesentlichen Messungen in einem Ansatz durchgeführt werden können. Abschließend bleibt festzuhalten, dass es gelungen ist, die innovative Technik der RNA Interferenz auf Fragen der Signalübertragung unter Verwendung retroviraler Infektionstechniken anzuwenden. In ersten Experimenten konnten bereits bislang unbekannte Spezifitäten bei der Signalübertragung über heterotrimere G-Proteine bzw. PLC-Isoformen heraus gearbeitet werden. Damit ist der Grundstein für zukünftige systematische Analysen dieser Zusammenhänge mit Hilfe der hier etablierten Techniken gelegt.
Fruktoselysin-spezifische Rezeptoren auf Zellmembranen von Monozyten und Makrophagen binden Amadori-modifizierte Proteine. Die Ligandenbindung führt zu Endozytose und Degradation der gebundenen Proteine sowie zur Produktion proinflammatorischer Zytokine. HL-60 und THP-l sind Vorläuferzellen reifer Monozyten, welche ebenfalls Fruktoselysin-Rezeptoren exprimieren. Affinitätschromatographisch wurden zwei Proteinfraktionen mit molekularen Massen von 100 und 200 kDa isoliert und als Homologe zu Nukleolin und der schweren Kette zellulären Myosins identifiziert. Die membrangebundenen Proteine sind im Gegensatz zu den nukleären bzw. zytosolischen Formen glykosyliert. Entsprechende Rezeptorproteine wurden bereits auf Zellmembranen der monozytären Zelllinien MonoMac 6 und U937 nachgewiesen. Somit werden Fruktoselysin-spezifische Bindungsproteine bereits auf Vorläuferzellen reifer Monozyten exprimiert.