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Kunststoffähnliche Polymere wie Polyhydroxyalkanoate (PHA) fanden in den letzten Jahren immer größere Berücksichtigung zur Substitution von Kunststoffen. Die attraktivsten Vertreter dieser Biopolymere sind dabei das Poly-3-hydroxybutyrat (PHB),das Poly-3-hydroxyvalerat (PHV) und das Poly-3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat(PHBV). Für eine kostengünstige Herstellung von PHA sind allerdings biotechnologisch etablierte Erzeuger notwendig. Für eine umweltfreundliche Produktion bieten sich Hefen an. Viele Hefen sind im Gegensatz zu den PHA-synthetisierenden Prokaryoten weder virulent noch pathogen. Allerdings verfügen sie nicht über die notwendige genetische Ausstattung zur PHA-Synthese. In der vorliegenden Arbeit wurden die Gene der PHB- bzw. PHBV-Synthese aus Cupriavidus necator und Methylobacterium extorquens in das Hefegenom von Arxula adeninivorans integriert. Es wurden die Gene phbA (kodiert für eine ß-Ketothiolase), phbB (kodiert für eine Acetoacetyl-CoA-Reduktase) und phbC aus C. necator sowie phaC aus M. extorquens genutzt, wobei die beiden letzteren für PHA-Synthasen kodieren. Für die Integration dieser PHA-Gene wurden sog. YIEC (Yeast Integration Expression Cassettes) konstruiert, mit welchen die Gene in die 25S-rDNA von A. adeninivorans integriert werden konnten. Es wurden jeweils die PHA-Synthasegene phaC oder phbC mit phbA und phbB aus Cupriavidus necator integriert. Dadurch entstanden die sog. 3-fach-Transformanten (3-fach/phaC und 3-fach/phbC). Ebenso wurden die PHA-Synthasegene einzeln integriert, wodurch die sog. 1-fach-Transformanten (1-fach/phaC und 1-fach/phbC) entstanden. Im Mittelpunkt der durchgeführten Arbeiten standen die Bestimmungen der Enzymaktivitäten der rekombinanten PHA-Synthasen, die Determinierung von PHA sowie die Untersuchungen der Veränderungen der Stoffwechselintermediate durch die Integration der PHA-Gene. Bevor die vier PHA-Transformanten generiert worden waren, waren in einer Machbarkeitsstudie die PHA-Gene phbA und phbB integriert und die Expression der rekombinanten Enzyme mit Enzymaktivitätsassays nachgewiesen worden. In den vier verwendeten PHA-Transformanten (1-fach/phaC, 1-fach/phbC sowie 3-fach/phaC und 3-fach/phbC) wurden phbAp und phbBp mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen. Die Expression der PHA-Synthasegene wurde in den PHA-Transformanten durch Enzymaktivitätsassays vorgenommen. Die PHA-Transformanten wurden mit Glukose, Acetat, Ethanol, Propion- und Buttersäure alleinig und im Shift von Glukose auf eine andere Kohlenstoffquelle kultiviert. Dabei wurde festgestellt, dass Ethanol generell von den PHA-Transformanten nicht verwertet werden kann. Parallel zu den Analysen des Wachstumsverhaltens wurden die Enzymaktivitätsassays durchgeführt. Dabei konnten neben der Glukosekultivierung erstmals auch bei Acetatkultivierung Aktivitäten der rekombinanten PHA-Synthasen nachgewiesen werden. Sowohl bei der Glukose- als auch der Acetatkultivierung zeigten die vier PHA-Transformanten verschiedene Verläufe der Aktivitäten. Für die Transformante, in welche das PHA-Synthasegen phaC aus Methylobacterium extorquens integriert worden war (1-fach/phaC), wurden sowohl für die Glukose- als auch die Acetatkultivierung die Aktivitätswerte für die PHA-Synthasen bestimmt. Für die Transformante, welche das PHA-Synthasegen phbC aus Cupriavidus necator trägt (1-fach/phbC), konnten nur bei Glukosekultivierung PHA-Synthaseaktivitäten bestimmt werden. Diese wurden während der Kultivierung geringer. Für die 3-fach-Transformante 3-fach/phaC konnten PHA-Synthaseaktivitäten sowohl für die Glukose- als auch die Acetatkultivierung bestimmt werden, die während der beiden Kultivierungen geringer wurden. Für die Transformante, welche alle drei PHA-Gene inklusive des PHA-Synthasegens phbC (3-fach/phbC) trägt, wurden während der Glukosekultivierung gleich bleibende und während der Kultivierung mit Acetat stark steigende PHA-Synthaseaktivitäten ermittelt. Mit einer Färbemethode sollte in den 1-fach-Transformanten PHB nachgewiesen werden. Dazu wurden die Farbstoffe BODIPY 493/503 und Nilrot, die speziell intrazelluläres PHB bzw. Neutrallipide färben, verwendet. Es konnte mit BODIPY 493/503 kein intrazellulär eingelagertes PHB detektiert werden. Daher handelt es sich bei den Einlagerungen um Lipide. Für eine genauere Analyse der die durch die Integration der PHA-Gene entstehenden Stoffwechselprodukte wurde eine GC/MS-Methode entwickelt. In ersten Messungen zeigte sich für die PHA-Transformanten ein Peak, der die gleiche Retentionszeit wie 3-Hydroxyvalerat (3HV), das Monomer von PHV hatte. Dieser Peak wurde auch im Kontrollstamm G1212k detektiert. Da Cupriavidus necator mit der Kohlenstoffquelle Lävulinsäure (LäS) das PHA Poly-4-hydroxyvalerat produziert, wurde Lävulinsäure in der gaschromatographischen Methode als Referenzsubstanz eingesetzt. Dabei zeigte sich, dass LäS die gleiche Retentionszeit hat wie 3HV. Anschließend wurden die Massenspektren von 3-Hydroxybutyrat (3HB), dem Monomer von PHB, sowie 3HV und LäS verglichen. Dabei erwies sich, dass der Peak gleicher Retentionszeit nicht für 3HB oder 3HV steht, sondern für LäS. Es konnten somit in keiner der PHA-Transformanten 3HB oder 3HV nachgewiesen werden. Anhand der GC/MS-Daten wurde allerdings ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene den Stoffwechsel der Hefe A. adeninivorans stärker beeinflusst als die alleinige Integration der PHA-Synthasegene. Daher wurden Citrat, Succinat, Malat und Fumarat (als Summenparameter für Maleinsäure und Fumarsäure) sowie die Fettsäuren Palmitin-, Stearin- und Linolensäure als weitere Referenzsubstanzen eingesetzt. Es zeigten sich je nach Wahl der Kohlenstoffquelle und der Kultivierungsbedingungen Unterschiede zwischen 3-fach-Transformanten und Kontrollstamm G1212k. In der Glukosekultivierung als auch der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) konnten die meisten Unterschiede zwischen PHA-Transformanten und G1212k festgestellt werden. Es wurden z. B. für die Glukosekultivierung in den 3-fach-Transformanten höhere Gehalte an Fettsäuren detektiert. Daraus lässt sich eine unterstützende Wirkung der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese zur Fettsäurebiosynthese ableiten. Bei der Acetatkultivierung wird neben der PHA-Synthese und der Fettsäurebiosynthese das zentrale Zellintermediat Acetyl-CoA auch im Glyoxylatweg genutzt. Der Glyoxylatweg findet zwar in den Peroxisomen und nicht wie PHA- und Fettsäuresynthese im Zytosol statt, wird aber in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle und durch die Aktivitäten des Zitronensäurezyklus geregelt. Die höheren Gehalte an Citrat bei der Co-Kultivierung von Glukose und Acetat (1:2) geben daher einen Anhaltspunkt zur Nutzung des Glyoxylatweges. Aufgrund der erhöhten Fettsäuregehalte während der Glukosekultivierungen und der Nutzung des Glyoxylatweges bei Kultivierung mit Acetat wird ersichtlich, dass die Integration aller drei PHA-Gene dazu führt, dass vermehrt Acetyl-CoA genutzt und Acetoacetyl-CoA, das erste Zwischenprodukt der PHA-Synthese, gebildet wird. Im Zytosol der Zellen findet aber auch der Mevalonatweg für die Isoprensynthese statt. Daher liegt sowohl eine Konkurrenz um Acetyl-CoA als auch um Acetoacetyl-CoA vor. Diese Konkurrenzen führen dazu, dass keine PHA-Synthese in den PHA-Transformanten stattfindet. Deswegen wird postuliert, dass stattdessen die Fettsäuresynthese, der Glyoxylatweg und der Mevalonatweg unterstützt werden. Intensivere Untersuchungen der Stoffwechselwege in A. adeninivorans müssen noch klären wie Zitronensäurezyklus und Glyoxylatweg sowie Fettsäure- und Isoprensynthese in dieser Hefe gesteuert werden können, um ein „metabolic engineering“ zur PHB-Synthese, wie es in S. cerevisiae bereits möglich ist, auch in A. adeninivorans zu realisieren. Dazu müssen nach der Expression der rekombinanten Proteine der PHA-Synthese auch die Intermediate der Stoffwechselwege gezielter nutzbar und konkurrierende Enzymaktivitäten inhibiert werden.
Background: The association of polyomaviruses BK and JC with other opportunistic infections and graft-versus-host disease (GvHD) in allogeneic stem cell transplantation is controversially discussed. Methods: We conducted a retrospective study of 64 adult patients who received their first allogeneic stem cell transplantation between March 2010 and December 2014; the follow-up time was 2 years. Results: Acute leukemia was the most frequent underlying disease (45.3%), and conditioning included myeloablative (67.2%) and nonmyeloablative protocols (32.8%). All patients received 10 mg of alemtuzumab on day -2 (20 mg in case of mismatch) as GvHD prophylaxis. Twenty-seven patients (41.5%) developed cytomegalovirus (CMV) reactivation. BKPyV-associated hemorrhagic cystitis was diagnosed in 10 patients (15.6%). Other opportunistic infections caused by viruses or protozoa occurred rarely (<10%). There was no association of BKPyV or JCPyV with CMV reactivation, Epstein-Barr virus reactivation, human herpes virus 6, or parvovirus B19 infection requiring treatment. There was a significant correlation of BKPyV-associated hemorrhagic cystitis with toxoplasmosis (p = 0.013). Additionally, there was a significant link of simultaneous BKPyV and JCPyV viruria with toxoplasmosis (p = 0.047). BKPyV and JCPyV were not associated with GvHD, relapse, or death. Conclusion: We found no association of BKPyV or JCPyV with viral infections or GvHD. Only the correlation of both polyomaviruses with toxoplasmosis was significant. This is a novel and interesting finding.
Hantaviruses (family Bunyaviridae) are enveloped viruses with a segmented RNA genome of negative polarity. They can cause two different diseases in humans, the hemorrhagic fever with renal syndrome in Europe and Asia and the hantavirus cardiopulmonary syndrome in America. The transmission to humans is mainly indirect by inhalation of aerosolized virus-contaminated rodent excreta. In contrast to the initial assumption that hantaviruses are mainly carried by rodents, during the last years many novel hantaviruses were detected in shrews, moles and recently in bats. These findings raise important questions about the evolutionary history of hantaviruses, their host association and adaptation, the role and frequency of spillover infections and host switch events. This study aims to prove the presence, geographical distribution and host association of the rodent-borne Tula virus (TULV) and the shrew-associated Seewis virus (SWSV) in Central Europe. For this purpose, novel laboratory techniques for molecular and serological hantavirus detection were developed. Initially, a broad-spectrum molecular assay to identify small mammal species from Central Europe was developed. This novel assay is based on PCR amplification using degenerated primers targeting the cytochrome b (cyt b) gene, nucleotide sequence analysis of the amplified cyt b gene portion and followed by pairwise sequence comparison to published sequences using the BLAST function of GenBank. Different small mammal species prevalent in Central Europe could be determined by this new approach, including not only representatives of various Rodentia and Soricomorpha, but also representatives of the orders Erinaceomorpha, Lagomorpha, Carnivora and Chiroptera. For characterization of insectivore-borne hantavirus Thottapalayam virus (TPMV), specific monoclonal antibodies were generated that detect native virus in infected mammalian cells. For the detection of TPMV-specific antibodies, Asian house shrew Suncus murinus immunoglobulin G (IgG)-specific antibodies were produced in laboratory mice and rabbit. Using this anti-shrew IgG and recombinant TPMV nucleocapsid (N) protein, an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed allowing the detection of TPMV N protein-specific antibodies in immunized and experimentally TPMV infected shrews. A Pan-Hantavirus SYBR-Green RT-qPCR was developed for the search to novel hantaviruses. By this novel RT-qPCR and other conventional RT-PCR approaches, TULV infections were identified for the first time in the Eurasian water vole Arvicola amphibius from different regions in Germany and Switzerland. The phylogenetic analyses of the different partial TULV small (S)-, medium (M)- and large (L)-genome segment sequences from A. amphibius, with those of Microtus arvalis- and M. agrestis-derived TULV lineages, revealed a geographical, but host-independent clustering and may suggest multiple TULV spillover or a potential host switch from M. arvalis or M. agrestis to A. amphibius. In a further comprehensive study, different shrew species (Sorex araneus, S. minutus, S. coronatus, and S. alpinus) were collected in Germany, Czech Republic, and Slovakia and screened by another L-segment-targeting Pan-Hantavirus RT-PCR approach. This screening revealed hantavirus L-segment sequences in a large number of S. araneus and a few S. minutus indicating a broad geographical distribution of this hantavirus. For detailed analyses, S-segment sequences were obtained, from S. araneus and S. minutus. The sequences demonstrated their similarity to SWSV sequences from Hungary, Finland, Austria and Germany. A detailed phylogenetic analysis showed low intra-cluster sequence variability, but high inter-cluster divergence suggesting a long-term SWSV evolution in local shrew populations. In conclusion, the investigations demonstrated a broad geographical distribution and multiple spillover infections of rodent-borne TULV and shrew-borne SWSV in Europe. The finding of putative spillover transmissions described here and in other studies underline the current problem of the hantavirus reservoir host definition. In contrast to the hypothesis of a long-standing hantavirus–rodent (small mammal) host coevolution, the investigations support a more dynamic evolutionary history of hantavirus diversification including spillover infections and host-switch events. In future in vitro and in vivo infection studies as well as field studies has to define factors determining the host specificity of these hantaviruses.
Animals experience climatic variation in their natural habitats, which may lead to variation in phenotypic responses among populations through local adaptation or phenotypic plasticity. In ectotherm arthropods, the expression of thermoprotective metabolites such as free amino acids, sugars, and polyols, in response to temperature stress, may facilitate temperature tolerance by regulating cellular homeostasis. If populations experience differences in temperatures, individuals may exhibit population-specific metabolite profiles through differential accumulation of metabolites that facilitate thermal tolerance. Such thermoprotective metabolites may originate from the animals themselves or from their associated microbiome, and hence microbial symbionts may contribute to shape the thermal niche of their host. The social spider Stegodyphus dumicola has extremely low genetic diversity, yet it occupies a relatively broad temperature range occurring across multiple climate zones in Southern Africa. We investigated whether the metabolome, including thermoprotective metabolites, differs between populations, and whether population genetic structure or the spider microbiome may explain potential differences. To address these questions, we assessed metabolite profiles, phylogenetic relationships, and microbiomes in three natural populations along a temperature gradient. The spider microbiomes in three genetically distinct populations of S. dumicola showed no significant population-specific pattern, and none of its dominating genera (Borrelia, Diplorickettsia, and Mycoplasma) are known to facilitate thermal tolerance in hosts. These results do not support a role of the microbiome in shaping the thermal niche of S. dumicola. Metabolite profiles of the three spider populations were significantly different. The variation was driven by multiple metabolites that can be linked to temperature stress (e.g., lactate, succinate, or xanthine) and thermal tolerance (e.g., polyols, trehalose, or glycerol): these metabolites had higher relative abundance in spiders from the hottest geographic region. These distinct metabolite profiles are consistent with a potential role of the metabolome in temperature response.
Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind Gram-positive und Katalase-negative humanspezifische Kommensalen der oberen und unteren Atemwege. Diese Bakterien sind andererseits auch als schwere Krankheitserreger bekannt und verursachen bei verschiedenen Bevölkerungsgruppen, wie beispielsweise Kindern, Älteren und immungeschwächten Personen sowohl Atemwegs- als auch lebensbedrohliche invasive Erkrankungen wie eine ambulant erworbene Pneumonie, Meningitis und Sepsis. Pneumokokken haben aufgrund ihrer Besiedelung des Respirationstraktes effiziente Mechanismen entwickelt, um in einer sauerstoffreichen Nische überleben zu können. Dabei richten sich die Mechanismen vor allem gegen reaktive Sauerstoffspezies (Reactive Oxygen Spezies, ROS), die einerseits als Abwehrfunktion des Wirts (oxidative burst) vom angeborenen Immunsystem und andererseits von den Pneumokokken selbst produziert werden, um als chemische Waffe zur Bekämpfung bakterieller Konkurrenten in ihrem Habitat eingesetzt zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde ein hochkonserviertes Zwei-Operon-System, das für die extrazelluläre oxidative Stress-Resistenz in S. pneumoniae verantwortlich ist, identifiziert und auf pathophysiologischer sowie struktureller Ebene charakterisiert. Dieses komplexe System besteht aus zwei integralen Cytochrom C-ähnlichen Membranproteinen (CcdA1 und CcdA2), zwei Thioredoxin-ähnlichen Lipoproteinen (Etrx1 und Etrx2) und einer Methioninsulfoxid-Reduktase AB2 (MsrAB2). Die Etrx-Proteine werden zwar in zwei räumlich voneinander getrennten Operonen kodiert, sind aber funktionell miteinander verbunden. Der Einfluss des Systems auf die Pathogenese der Pneumokokken wurde in Maus-Virulenz-Studien und Untersuchungen der Phagozytose unter Verwendung von isogenen Mutanten gezeigt. Sowohl in den in vivo als auch den in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Verlust der Funktion beider Etrx-Proteine beziehungsweise der Methioninsulfoxid-Reduktase MsrAB2 die Virulenz der Pneumokokken stark reduziert. Hieraus resultierte eine erheblich verringerte Letalität des Wirts, eine beschleunigte bakterielle Aufnahme durch die Makrophagen sowie ein schnelleres Abtöten der Pneumokokken durch eine oxidative Schädigung von Oberflächen-lokalisierten Proteinen mittels Wasserstoffperoxid. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Etrx2 die Abwesenheit von Etrx1 und umgekehrt Etrx1 das Defizit von Etrx2 kompensieren kann. Durch Strukturaufklärung der beiden Thioredoxin-ähnlichen Proteine Etrx1 und Etrx2 sowie der Modellierung der beteiligten Komponenten CcdA und MsrAB2 konnte die Rolle jedes einzelnen Proteins dieses Systems (CcdA-Etrx-MsrAB2-System) bei der Reparatur beschädigter Oberflächen-lokalisierter Proteine in einem Modell dargestellt werden. Das postulierte Modell konnte über in vivo und in vitro Untersuchungen des Elektronentransfers innerhalb dieses Systems bestätigt werden. Mit der Bestimmung der Standardredoxpotentiale der rekombinanten Proteine Etrx1, Etrx2 und der Einzeldomänen MsrA2 und MsrB2 konnte in vitro gezeigt werden, dass der Elektronenfluss in Richtung von Etrx1 und Etrx2 zu MsrAB2 erfolgen muss. Die direkte Elektronenübertragung zwischen diesen Proteinen konnte in kinetischen Experimenten gezeigt werden. Die Messungen ergaben, dass Etrx1 bevorzugt mit der MsrA2-Untereinheit interagiert beziehungsweise Etrx2 sowohl mit der MsrA2-Untereinheit als auch mit der MsrB2-Untereinheit in Wechselwirkung treten kann. Der in vivo Redoxzustand von MsrAB2 wurde unter Verwendung der nicht-reduzierenden/reduzierenden „2D-Diagonal“-SDS-PAGE in den isogenen ccdA- und etrx-Mutanten bestimmt. Hierbei konnte ein Unterschied im Redoxzustand von MsrAB2 in den isogenen Einzelmutanten und Doppelmutanten von ccdA und etrx beobachtet werden. Während in den Einzelmutanten der Elektronenfluss innerhalb des CcdA-Etrx-MsrAB2-Systems unverändert war, zeigte sich in den Doppelmutanten ccdA1/ccdA2 und etrx1/etrx2 eine deutliche Beeinträchtigung der Elektronenübertragung auf MsrAB2, welche sich in der Zunahme der oxidierten Form von MsrAB2 deutlich machte. Somit konnte der Elektronenfluss von sowohl von CcdA1 über Etrx1 zu MsrAB2 als auch von CcdA2 über Etrx2 zu MsrAB2 in vivo betätigt werden. In Anbetracht der Ergebnisse dieser Arbeit könnte das hochkonservierte CcdA-Etrx-MsrAB2-System der extrazellulären oxidativen Stress-Resistenz von S. pneumoniae zur Entwicklung proteinbasierter Pneumokokken-Impfstoffe und zum Angriffspunkt für Behandlungen gegen diese wichtigen humanpathogenen Erreger beitragen.
Die chronische Herzinsuffizienz (HI) bezeichnet das Unvermögen des Herzens, die vom Körper benötigte Blutmenge bedarfsgerecht zu befördern und stellt in der Allgemeinbevölkerung das Endstadium vieler Herzerkrankungen dar. Trotz großer Fortschritte in der medikamentösen Therapie ist die Prognose der HI auch heute noch schlecht. Der progrediente Verlauf erstreckt sich von einer kompensierten Herzhypertrophie mit aufrechterhaltener Pumpfunktion bis hin zu einer massiven Ventrikeldilatation mit stark eingeschränkter Herzfunktion und weist dementsprechend eine schlechte Prognose auf. Die zellulären Veränderungen auf Protein- und Genexpressionsebene während der Progression einer HI sind sehr komplex und trotz ausgiebiger wissenschaftlicher Arbeiten nicht ausreichend geklärt. Dabei ist es von entscheidender Bedeutung, in welcher Phase der Erkrankung spezifische Änderungen in der Genregulation entstehen und inwiefern sich diese auf den Phänotyp auswirken. Auf Grund dessen beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit den zeitabhängigen Veränderungen auf mRNA-und Proteinebene während der Progression der HI. Um alle Stadien beginnend von einer subklinischen Organschädigung bis hin zur Ausbildung einer HI experimentell untersuchen zu können, wurde zunächst ein Mausmodell etabliert, welches durch eine chronische Nachlasterhöhung mittels Einengung des Aortenlumens eine Myokardschädigung durch eine arterielle Hypertonie simuliert (transverse aortic constriction, TAC). Die Herzfunktion der Mäuse wurde an den postoperativen Tagen 4, 14, 21, 28, 42, und 56 durch Messungen im Kleintier-MRT (Magnetresonanztomografie) evaluiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich die linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LVEF) TAC-operierter Mäuse vom postoperativen Tag 4 zu 14 verschlechtert, bis Tag 42 auf einem konstanten Niveau hält und bis Tag 56 nochmals stark absinkt. Im Gegensatz dazu zeigten Sham-operierte Mäuse über den gesamten Zeitraum eine stabile LVEF. Ein vergleichbarer stufenartiger Verlauf konnte bei den Parametern der linksventrikulären Masse und den endsystolischen bzw. enddiastolischen Volumina beobachtet werden. Zusätzlich konnte durch histologische Untersuchungen zu den verschiedenen postoperativen Zeitpunkten eine verstärkte Fibrosierung des Herzgewebes nach der TAC-OP aufgezeigt werden. Für die longitudinalen Transkriptom- und Proteomuntersuchungen wurden die Herzen (jeweils linke und rechte Ventrikel) nach den MRT-Messungen entnommen, gruppen- und zeitpunktspezifisch gepoolt und einer Microarray- bzw. massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Auf Transkriptomebene zeigten sich vor allem an den Tagen 4 und 56 starke TAC-induzierte Veränderungen im Expressionsmuster, wohingegen der Zeitraum zwischen 14 und 42 Tagen weniger differenziell exprimierte Gene aufwies. Der Verlauf der Erkrankung konnte anhand bereits bekannter Hypertrophie- und HI-marker sehr gut charakterisiert werden. So zeigten Nppa (ANP) und Nppb (BNP) im linken Ventrikel bereits kurz nach Aortenstenose stark erhöhte Expressionslevel, die über die gesamte Versuchsdauer erhalten blieben. Weiterhin wurde die Expression von Genen reguliert, die an kardialen Remodelingprozessen maßgeblich beteiligt sind, wie beispielsweise Acta1 (a-Aktin), Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) und Postn (Periostin). Im Vergleich beider Ventrikel zeigte der rechte Ventrikel bezüglich der Anzahl der regulierten Gene als auch bei der Expression HI-assoziierter Gene eine verzögerte und weniger stark ausgeprägte Reaktion. In den linken Ventrikeln wurden vor allem die Gene reguliert, deren Genprodukte der extrazelluären Matrix angehören. Eine Validierung der Microarray-Ergebnisse mittels realtime-PCR konnte die Richtigkeit der Analysemethode sehr präzise bestätigen. Da diese anhand ausgewählter Gene auf Einzeltierebene durchgeführt wurde, konnte zusätzlich auf Korrelation zwischen mRNA-Expression und den kardialen Funktionsparametern getestet werden. Wie erwartet spiegelten die Epressionslevel der HI-assozierten Markergene Nppa (ANP), Nppb (BNP) und Myh7 (b-Myosin Heavy Chain) die progressive Verschlechterung der Herzfunktion wider. Zusätzlich konnten durch die Validierung und Korrelationsanalysen weitere interessante Kandidatengene, wie beispielsweise Sfrp2 (Secreted frizzled-related protein 2) und Wisp2 (WNT1-inducible signaling pathway protein 2) für weiterführende Studien identifiziert werden. Auch auf Proteomebene konnten vergleichbare Ergebnisse erzielt werden. Auch hier zeigte der linke Ventrikel eine deutlich ausgeprägtere Reaktion auf die Drucküberlastung, der rechte Ventrikel antwortete deutlich schwächer und verzögert. Änderungen im Proteinmuster nach TAC waren in den linken Ventrikeln vor allem an den Tagen 14, 21 und 28 stark ausgeprägt. Ingenuity Pathway Analysen der veränderten Proteine weisen auf Veränderungen im Kalzium-, Rho A- und PKA-Signaling vor allem zu den frühen Zeitpunkten hin, wohingegen zu späteren Zeitpunkten hauptsächlich metabolische Prozesse betroffen waren.
Die ADHs aus Rhodococcus ruber (RrADH) und Lactobacillus brevis (LbADH) wurden erstmals in der Hefe Arxula adeninivorans (Blastobotrys adeninivorans) hergestellt und zur Synthese von enantiomerenreinen 1-Phenylethanol eingesetzt. Die entsprechenden Gene wurden hierfür mit dem starken konstitutiven TEF1-Promotor und dem PHO5-Terminator flankiert und unter Nutzung der etablierten Xplor2®-Transformations-/Expressionsplattform in der Hefe exprimiert. Die erhaltenen selektierten Transformanden wiesen dabei ADH-Aktivitäten von 21 bzw. 320 U g-1 dcw für die Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol in Schüttelkultur auf. RrADH und LbADH sind für die Reduktion von Acetophenon und Acetophenon-Derivaten, alpha-Ketoestern und aliphatischen Ketonen geeignet. Die RrADH synthetisiert (S)-konfigurierte Alkohole und ist NAD+/NADH-abhängig, während die LbADH die Reduktion von Acetophenon zu 1-(R)-Phenylethanol mithilfe des Cofaktors NADPH katalysiert. Rohextrakt des RrADH produzierenden Hefestamms konnte erfolgreich für die Synthese von enantiomerenreinem 1-(S)-Phenylethanol mit einer Ausbeute von 90 % und einem Enantiomerenüberschuss (ee) von >99 % über Substrat-gekoppelte Regeneration mit Isopropanol eingesetzt werden. Die Erhöhung der Ausbeute auf 100 % gelang durch Enzym-gekoppelte Regenerierung des Cofaktors NADH mit der GDH aus Bacillus megaterium (Bm) für RrADH bzw. NADPH mit der BmGDH und G6PDH aus Bacillus pumilus (Bp) für LbADH katalysierte Reaktionen. ADHs und Cofaktor-regenerierende Enzyme wurden simultan durch die konstitutive Coexpression der entsprechenden Gene in A. adeninivorans für die Synthese von enantiomerenreinem 1-Phenylethanol hergestellt. Die Enzymrohextrakte der RrADH-BmGDH, LbADH-BmGDH und LbADH-BpG6PDH produzierenden Hefestämme katalysieren ohne Ausnahme die Synthese des jeweiligen Enantiomers von 1-Phenylethanol mit ee >99 % und Ausbeuten von 100 % für Substratkonzentrationen bis 40 mM. Nach der Extraktion des 1-Phenylethanols liegt dieses chemisch rein vor, sodass aufwendige Aufarbeitungs- und Reinigungsschritte erspart bleiben. GDH bzw. G6PDH sind hervorragend für die Regeneration von NADH und NADPH bzw. ausschließlich letzterem geeignet. Dabei wurden standardmäßig 40 mol 1-Phenylethanol pro Mol NAD+ oder NADP+ erreicht. Auch intakte Hefezellen der rekombinanten ADH und BmGDH bzw. BpG6PDH synthetisierenden Stämme wurden für die Synthese von 1-(S)- bzw. 1-(R)-Phenylethanol verwendet. Nach Permeabilisierung mit Triton X-100 wiesen sie vergleichbare Aktivitäten zu den entsprechenden Rohextrakten auf. Der RrADH-BmGDH produzierende Stamm synthetisiert 1-(S)-Phenylethanol mit einer Aktivität von 20 U g-1 dcw, während die LbADH-BmGDH und LbADH-BpG6PDH Hefestämme sogar 45,6 und 87,9 U g-1 dcw lieferten. Die Ausbeuten und ee waren im Vergleich zu den Rohextrakten ähnlich. Die Erhöhung der Konzentration des Ausgangsstoffs Acetophenon reduzierte unabhängig von den verwendeten Enzymen die erhaltene Ausbeute. Die katalytische Produktivität der Biokatalysatoren wurde durch ihre Wiederverwendung erhöht. Hierfür wurden permeabilisierte Zellen, die einfach aus der Syntheselösung abzentrifugiert werden können, genutzt. Außerdem konnten der Rohextrakt und die Zellen nach ihrem Einschluss in unlösliches Calciumalginat in Form von kleinen Kügelchen aus der Synthese abfiltriert und wiederverwendet werden. Permeabilisierte Zellen und Immobilisate wurden wiederholt für die Reduktion von Acetophenon zu 1-Phenylethanol eingesetzt, wobei immobilisierter Rohextrakt und Zellen für drei bis maximal sechs Synthesezyklen verwendet werden konnten. Immobilisierte und permeabilisierte Zellen sind wesentlich stabiler. Sie können ohne erhebliche Aktivitätsverluste 14 (LbADH-BpG6PDH), 29 (RrADH-BmGDH) bzw. mehr als 50 Mal (LbADH-BmGDH) wiederholt zur Acetophenon-Reduktion eingesetzt werden. Auf ihrer Grundlage wurde ein erster Reaktor für die semi-kontinuierliche Synthese von 1-(R)-Phenylethanol im Labormaßstab konstruiert und in Betrieb genommen. Es konnten 206 mol 1-(R)-Phenylethanol pro Mol NADP+ und 12,78 g 1-(R)-Phenylethanol mit einem ee von 100 % und einer Raum-Zeit-Ausbeute von 9,74 g L-1 d-1 oder 406 g kg-1 dcw d-1 erhalten werden. Weitere Optimierungen der Hefestämme, Reaktionsbedingungen und Reaktionsführung sind zur Erhöhung der Ausbeute und zum Erreichen vergleichbarer Produktivität mit derzeitigen Syntheseprozessen für 1-Phenylethanol nötig. Der ee ist bereits optimal. Zusammenfassend ist A. adeninivorans ein hervorragender Wirt zur Herstellung von ADHs für die Synthese enantiomerenreiner Alkohole wie 1-(S)- und 1-(R)-Phenylethanol. Nach Extraktion liegt das Produkt rein und mit optimalen ee vor. Durch die in dieser Arbeit gezeigten Untersuchungen können bisher chemische Synthesen durch enzymatische Reaktionen unter Einsatz von ADHs, deren Produktion in A. adeninivorans erfolgte, ersetzt werden, was Kosten und natürlichen Ressourcen spart.
The highly oncogenic alphaherpesvirus Marek’s disease virus (MDV) causes immense economic losses in the poultry industry. The main targets of in vivo MDV infection are primary B and T lymphocytes. The cytolytic infection of B cells leads to depletion of lymphoid cells results in severe immunosuppression. Infected B cells recruit and activate T cells. The close interaction between B cells and T cells enables efficient intercellular transfer of MDV. During infection of T cells, the virus enters a latent state. Infection of T cells can lead to transformation of these cells and formation of lymphoma, which manifest in various visceral organs. This study aimed at the characterization of the proteomes of MDV-infected lymphocytes during the lytic and latent phases of infection.
Previous in vitro studies concerning the MDV pathogenesis and host-virus interactions have been mainly conducted with primary fibroblasts or kidney cells, due to the short lifespan of primary lymphocytes in cell culture. Recently, a cultivation system has been established that extents the lifespan of primary lymphocytes through the addition of cytokines to the growth medium. This allowed the infection of B cells in vitro and to conduct quantitative proteomic analysis of primary lymphocytes. Infection with GFP labelled virus recombinants allowed the isolation of infected cells by FACS for the proteome analysis of MDV infected B lymphocytes. An efficient quantitative proteomic workflow was developed, which consisted of a filter-aided (FASP) digest of the extracted proteins, followed by differential dimethyl chemical labeling of the peptides for quantitative evaluation prior to LC-MALDI TOF/TOF mass spectrometry. Only few alterations of the protein and transcript expression profiles were observed after infection of primary B cells with the very virulent RB-1B and the live-attenuated vaccine strain CVI988/Rispens. Relevant changes in relative protein levels were found for only twelve and six interesting host proteins after RB1B and CVI988 infection, respectively. However, the regulations were confirmed by inspection of the spectra from all experiments. The identified candidates play a role in immune response, translation and inflammatory response.
To confirm the potential infection markers, RNA-seq analysis of three biological replicates of each RB-1B -, CVI988- and mock-infected B cells was performed. Eighty expressed MDV transcripts could be identified, which were associated with lytic infection. The same MDV proteins were identified after infection with RB-1B or CVI988. However, transcriptome and proteome analysis of MDV-infected primary B cells showed only poor correlation. This indicates that the changes in protein expression profiles are mostly due to posttranscriptional events. Infection marker candidates were identified by the RNA-seq analysis, for which the gene expression was altered by MDV infection. Although almost 12,000 transcripts were identified, only few transcript levels changed markedly after MDV infection. The biological processes immune response, apoptotic process, signal transduction, cell migration and response to virus were enriched after MDV infection. The RNA-seq results confirm the observation that alterations of protein levels early after MDV infection are rare.
Most notably, MDV induces transformation of lymphocytes leading to malignant T-cell lymphomas in visceral organs with mortalities of up to 100 %. While several factors involved in MDV tumorigenesis have been identified, the transformation process is not fully understood. Therefore, we set out to fill this knowledge gap using proteome analysis of transformed T-cells ex vivo. In addition, the role of the viral telomerase RNA during transformation was assessed by comparison of tumors that had formed after infection with WT-virus or a telomerase RNA negative mutant. A major obstacle for tumor proteome analyses is the preparation of sufficient amounts of homogenous tumor tissue, as tumors appear with a dispersed morphology in the affected organs. The quantitation of cell types within the tumors indicated varying portions of hepatocytes, connective tissue, and CD3+ lymphocytes even with the same virus strain in different animals. However, the ∆vTR-induced tumors contained lower levels of hepatocytes and higher levels of CD3+ lymphocytes compared to WT tumors in all tested tumor samples. Thus, ∆vTR tumors were chosen for determination of differences in protein expression profiles of tumors and naïve T cells for their lower content of liver cells. We developed a workflow for the proteome analysis of T cell tumors from livers of MDV-infected chickens. Samples included laser capture micro-dissected tissue cuts from tumors and surrounding healthy liver tissue as well as naïve T-cells prepared from thymus. To enable quantitative proteome analysis, samples were digested using the FASP protocol and peptides were isotope-coded by differential dimethyl labeling. To improve proteome analysis peptides were fractionated by preparative isoelectric focusing prior to nano-HPLC MALDI/TOF-TOF mass- spectrometric analysis.
Proteomic analyses of LCM dissected ΔvTR tumor compared to naïve T cells, the main targets of transformation, identified nineteen potential transformation markers but again only minor changes in relative levels were observed. Several of the identified markers could also be verified by RT-qPCR on transcript level. The identified transformation candidates were associated with nucleosome assembly, regulation of transcription, inflammatory response, immune response and oxidation-reduction process.
However, further functional analyses are necessary to fully elucidate the role of the identified markers during MDV infection and transformation.
Influence of single amino acid polymorphisms on the in vitro convertibility of goat prion protein
(2010)
Prion diseases or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are fatal neurodegenerative disorders which include, among others, scrapie and bovine spongiform encephalopathy (BSE). The causative agent is composed mainly of a misfolded isoform of a cellular prion protein (PrPC), denoted prion protein scrapie (PrPSc). Genetically determined PrPC polymorphisms can modulate the convertibility of PrPC to PrPSc and thus lead to prolonged TSE incubation times or even complete resistance of the animal. In sheep, such polymorphisms are located at codons 136, 154 and 171. Several disease-associated amino acid polymorphisms also exist in caprine PrPC. However, due to their large number and the limited number of goats carrying them, it is difficult to assess their specific impact on TSE susceptibility in vivo. The susceptibility can be simulated in vitro by a cell-free conversion assay, in which the conversion efficiency of recombinant PrPC is determined. In this study, twelve caprine PrPC variants (M112T, M137I, L141F, I142M, H143R, N146S, N146D, R151H, R211Q, Q215R, Q222K and wild-type PrPC (denoted INRQ) were produced by using PCR mutagenesis amplification and expressed in E. coli M15 cells and purified on Ni-NTA agarose columns. The renatured PrPC variants had molecular masses of approx. 23 kDa and the expected conformation as determined by CD spectroscopy. These variants were then subjected to a cell-free conversion assay using different BSE and scrapie strains. Cross species (mouse and goat) cell-free conversion studies were performed and specific monoclonal antibodies were used to discriminate the exogenous PrPSc molecules used to seed the reaction and newly converted PrPres. The studies with the mouse-adapted strain Me7 revealed that polymorphisms M137I, H143R and L141F did not influence the conversion of PrPC in a significant manner. However, the reduced conversion rate of the variant I142M (harbouring a methionine at position 142 instead of isoleucine) correlated with longer scrapie incubation times in goats with this polymorphism. The polymorphisms M112T, R151H and Q211R showed also reduced conversion rates in comparison to INRQ, an effect that related well to reduced scrapie susceptibility of such goats in vivo. Polymorphisms N146S, N146D and Q222K were to date extremely rarely found in scrapie affected goats. It was intriguing to see that these amino acid substitutions also abolished the in vitro conversion efficiency completely as did the Q215R polymorphism, which had not yet been associated with scrapie resistance in vivo. Results of cell free conversion studies with mouse adapted BSE prions (BSE/Bl6 strain) correlated well with the results obtained with Me7, although the results with BSE/Bl6 showed more variation. Again it was possible to observe a reduction in the conversion with I142M, R151H and R211Q and no or almost no conversion with N146S, N146D and Q222K and with Q215R respectively. In subsequent experiments, caprine PrPC variants were directly biotinylated so that goat or sheep scrapie as well as cattle, sheep or goat BSE derived PrPSc could be used. In these assays I142M, H143R and R211Q clearly reduced the conversion of PrPC with ovine and caprine scrapie isolates, whereas R151H did not influence the conversion efficiency of biotin-tagged PrPC. Conversion with scrapie isolates showed a marked reduction or no conversion in the case of N146S and N146D which correlated again with the Me7 data and the in vivo observations. In the case of bovine BSE isolates, the cell-free conversion mimicked the species barrier observed in vivo. BSE material from cattle barely converted any caprine PrPC variant into PrPres, whereas BSE from sheep converted all variants including the resistance-associated N146S and N146D, suggesting that the resistance is also prion strain specific. A marked reduction in the conversion rate was also observed with I142M and, less pronounced, with H143R and R211Q corroborating the protective role of these polymorphisms against TSEs. When co-incubated, resistance-associated variants N146D, N146S and Q222K produced a dominant negative effect on the conversion of the susceptible wild-type PrPC genotype (INRQ). In a similar way, the incubation of I142M and H143R also reduced the amount of PrPres in a mixture with INRQ. In conclusion, the cell-free conversion assay results show that the caprine PrP polymorphisms M112T, I142M, R143H, N146S, N146D, R151H, R215Q and Q222K correlated clearly with the in vivo susceptibilities of the goats carrying these polymorphisms. Apart from practical implications, like the possibility of breeding TSE resistant goats, these data indicate that scrapie resistance is modulated by thermodynamic changes affecting PrPC-PrPSc interactions and the formation of conversion intermediates.
Coenzym A ist ein essentieller und ubiquitärer Cofaktor, dessen zentrale Bedeutung für den Stoffwechsel aus der Aktivierung und Übertragung von Acylgruppen resultiert. Der Biosyn-theseweg von Coenzym A (CoA) ausgehend von Pantothenat (Pan) umfasst fünf enzymatische Schritte, die in Pro- und Eukaryoten konserviert sind. Die Hefe S. cere¬visiae ist in der Lage, sowohl eine de novo Pantothenat-Synthese durchzuführen als auch mittels Fen2-Transporter dieses Intermediat aufzunehmen. Die Phosphorylierung von Pan durch die Pantothenat Kinase (PanK) stellt vermutlich den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt dar, der in Form einer Inhibition durch das Endprodukt bzw. dessen Derivate erfolgt. Ziel dieser Arbeit sollte es sein, grundlegende Erkenntnisse zu den Enzymen des CoA-Biosyntheseweges, deren Organisation und Regulation in der Hefe zu bekommen. Durch „metabolic engineering“ sollte versucht werden, einen Stamm zu konstruieren, der im Vergleich zu einem Wildtyp einen erhöhten CoA-Gehalt aufweist. Für das Genprodukt von YDR531W in S. cerevisiae konnte aufgrund der Verwertbarkeit von 14C-Pantothenat als Substrat die Vermutung bestätigt werden, dass es sich um eine PanK handelt, so dass dieses Gen die neue Bezeichnung CAB1 („Coenzym A Biosynthese“) erhielt. Es erfolgt eine „Feedback“-Inhibition durch CoA und in stärkerem Maße durch dessen Thioester Acetyl-CoA. Der Einfluss von Malonyl-CoA und Palmitoyl-CoA auf die Aktivität der PanK ist vernachlässigbar. Durch gerichtete Mutagenese konnte eine Acetyl-CoA insensitive deregulierte PanK-Variante CAB1W331R erzeugt werden, die, verglichen mit dem Wildtyp, eine etwa vierfach gesteigerte Aktivität aufweist. Für die vier weiteren Gene YIL083C, YKL088W, YGR277C und YDR196C, die aufgrund von Ähnlichkeiten zu humanen CoA-Genen identifiziert wurden, konnte der Nachweis erbracht werden, dass es sich um CoA-Biosynthesegene handelt. Eine Nullmutation in jedem dieser essentiellen Gene ließ sich durch das entsprechende E. coli Gen, für die der enzymatische Nachweis der Genprodukte vorliegt, heterolog komplementieren. Folgende neue Genbe-zeichnungen wurden aufgrund der Abfolge der Reaktionsschritte vergeben: YIL083C = CAB2 (codiert für die Phosphopantothenyl Cystein Synthetase, PPCS), YKL088W = CAB3 (Phosphopantothenylcystein Decarboxylase, PPCDC), YGR277C = CAB4 (Phosphopante-thein Adenyltransferase, PPAT) und YDR196C = CAB5 (Dephospho-CoA.Kinase, DPCK). Für CAB1, CAB2 und CAB5 war ein moderater Anstieg der Genexpression zu beobachten, wenn Glucose durch Ethanol als C-Quelle ersetzt wurde. Die Abwesenheit von Aminosäuren beeinflusste die Expression der CAB Gene kaum. Mit Hilfe chromatographischer Reinigungsschritte war eine Cofraktionierung der epitopmar-kierten Proteine Cab3 und Cab5 möglich, die einen ersten Hinweis auf die Existenz eines CoA-synthetisierenden Enzymkomplexes (CoA-SPC) lieferten. Dessen durch Gelfiltration bestimmte Größe beträgt ungefähr 327 kDa. In vitro-Interaktionsstudien ergaben, dass Cab1 (PanK) nicht an der Bildung dieses Komplexes beteiligt ist und dass Cab2, Cab3, Cab4 und Cab5 mit Cab3 interagieren. Weiterhin konnten Wechselwirkungen zwischen Cab4 und Cab5 nachgewiesen werden. Durch Konstruktion von Längenvarianten der genannten Proteine wurden die für die Interaktionen jeweils verantwortlichen Proteinabschnitte kartiert. Vermutlich dient Cab3 als zentrales „Gerüstprotein“ des gesamten CoA-SPC-Komplexes. Mit ausschließlich bakteriell synthetisierten Proteinen konnte zumindest für Cab3 gezeigt werden, dass die Interaktionen direkt erfolgen. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, durch Überexpression der CoA-Bio-synthesegene die zelluläre CoA-Synthese zu beeinflussen. Mit Hilfe integrativer Plasmide wurden MET25-Promotor-kontrollierte Überexpressionskassetten aller CAB-Gene sukzes¬sive in einen Wildtypstamm eingeführt. Für das Gen der PanK wurde das Wildtyp-Allel CAB1 bzw. die deregulierte Variante CAB1W331R verwendet. Einen Unterschied zwischen den Stämmen konnte für den Acetyl-CoA-, allerdings nicht für den CoA-Gehalt gemessen werden. Überexpressionsstämme mit der regulierten PanK bzw. der deregulierten PanK-Variante enthielten im Vergleich zum Wildtyp die 3-fache bzw. sogar die 6-fache Menge an Acetyl-CoA. Dieser Befund belegt die Schrittmacherfunktion der PanK für den gesamten CoA-Biosyntheseweg.
Das Genus Pestivirus gehört zur Familie der Flaviviridae und enthält eine Reihe von tierpathogenen Erregern, welche (fast) ausschließlich Paarhufer befallen. Das bei Pestiviren vorkommende Strukturprotein ERNS ist einzigartig in der Familie Flaviviridae, es finden sich keine homologen Proteine in den anderen Genera dieser Familie. ERNS ist ein sehr ungewöhnliches Protein, da es für ein virales Strukturprotein verschiedene untypische Eigenschaften aufweist. Neben einer intrinsischen RNase-Aktivität findet sich am C Terminus eine sehr ungewöhnliche Signalpeptidase-Spaltstelle. Während die RNase Aktivität einen wichtigen Virulenzfaktor darstellt, sorgt die ungewöhnliche Spaltstelle mutmaßlich für die verlangsamte Prozessierung des ERNS-E1-Vorläuferproteins. Inwieweit die verlangsamte Spaltung des Vorläuferproteins für das Virus wichtig sein könnte, ist bis dato noch ungeklärt. Auch ist die Ausbildung von Dimeren wichtig für die Virulenz von ERNS. Darüber hinaus erfolgt eine partielle Sekretion von ERNS in den extrazellulären Raum, während ein Großteil in der Zelle verbleibt. Zusätzlich verfügt ERNS über eine untypische Membranverankerung, die durch eine lange, C-terminale amphipathische Helix vermittelt wird. Innerhalb dieser amphipathischen Helix findet sich eine Reihe geladener Aminosäuren, deren Lokalisation und Anordnung zu zwei spiegelsymmetrisch komplementären Gruppen bei Pestiviren konserviert ist. Es stellte sich die Frage, welche biologische Relevanz dieses Muster an geladenen Aminosäuren haben könnte. Ausgehend von der vorgeschlagenen Ausbildung eines „Charge Zippers“ – durch Rückfaltung und Ausbildung von Salzbrücken zwischen den komplementären Ladungen –, wurden mittels transienten Expressionsexperimenten die sechs hoch konservierten Ladungen im „Inneren“ des möglichen „Reißverschlusses“ untersucht, und es zeigte sich, dass der postulierte Charge-Zipper-Mechanismus bei ERNS vermutlich keine Rolle spielt. Für einige der betrachteten Aminosäuren konnten Hinweise erhalten werden, dass sie eine Rolle bei der Prozessierung, der Retention und bei der Dimerisierung von ERNS spielen. Vor allem ein Austausch der Ladung an der Position 194 im ERNS zeigte einen signifikanten Einfluss auf die Prozessierung und Retention von ERNS. Auch bei der Dimerisierung stach diese Position hervor, da entgegen anderer Mutationen ein Austausch hier zu einer vermehrten Dimerbildung führte. Weiterführend wurden diese Mutationen in rekombinante Viren eingeführt, und es zeigte sich, dass vor allem die spezifischen Ladungen an den Positionen 184 und 191 im ERNS wichtig für die effiziente Virusvermehrung sind. Ladungsaustausche an diesen Positionen sorgten für nicht lebensfähige Virusmutanten, während Alaninsubstitutionen im Lauf von Passagen zur ursprünglichen Ladung revertierten. Diese Ergebnisse zeigen die elementare Bedeutung der Ladungen für die Generierung von infektiösen Viren. Die molekularen Mechanismen, in denen diese Reste von Bedeutung sind, müssen in weiteren Arbeiten noch aufgeklärt werden.
In unserem Alltag sind Polymere weit verbreitet. In Form von funktionellen Polymeren werden sie u.a. als Wirk- oder Effektstoff eingesetzt. Sie bestehen aus einem Träger, an welchen über einen Spacer eine funktionelle Gruppe gebunden ist. Die Spacergruppen beeinflussen die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Polymere bzw. ermöglichen diese erst. Dadurch stellen sie in der pharmazeutischen Industrie und der medizinischen Chemie Schlüsselbausteine dar.
Auch Monoester von symmetrischen Dicarbonsäuren oder symmetrischen Diolen werden für die Einführung von Spacergruppen verwendet. Sie können durch die Hydrolyse von Diestern oder Dioldiestern chemisch synthetisiert werden. Da diese Reaktion nicht selektiv erfolgt, entstehen Nebenprodukte wie Disäuren oder Diole, die die Ausbeuten schmälern und eine aufwändige Aufarbeitung notwendig machen. Selektive enzymatische Verfahren stellen eine echte Alternative dar, denn eine Trennung des Produkts vom Nebenprodukt ist nicht notwendig. Bisher sind nur wenige Enzyme bekannt und verfügbar, die zur Synthese von Monoestern verwendet werden können.
Ziel dieser Arbeit ist die Entdeckung neuer Lipasen und Carboxylesterasen als Biokatalysatoren zur Synthese von Monoestern, die zudem in ausreichender Verfügbarkeit generiert werden sollen. Als Gendonor und Expressionssystem diente hierfür die Hefe Blastobotrys raffinosifermentans. Die nicht-konventionelle, nicht-pathogene und thermotolerante Hefe B. raffinosifermentans weist ein breites Kohlenstoff- und Stickstoff-Quellen Spektrum auf, was sie für industrielle Anwendungen interessant macht. Aufgrund einer bereits vielfach eingesetzten, effizienten Transformationsmethode wurde die Hefe bereits zur Produktion verschiedener Proteine wie humanem Serumalbumin, Interleukin-6, Phosphatasen mit Phytase-Aktivität, Tannasen und einer Lipase eingesetzt. Die exzellenten Wachstumsparameter garantieren hohe Enzymausbeuten.
Insgesamt wurden in dieser Arbeit 30 putative Lipase- und Carboxylesterase-Gene in ihrem Genom durch Annotationsanalysen identifiziert. Diese Gene wurden isoliert, amplifiziert und in der Hefe selbst überexprimiert. Die Proteinextrakte der erzeugten Stämme wurden anschließend auf Esteraseaktivität getestet, wovon sieben Kandidaten das Substrat p-Nitrophenylbutyrat (pNP-Butyrat) hydrolysierten. Anschließend wurde mittels eines Assays untersucht, ob die Enzyme die Hydrolyse der Substrate Adipinsäurediethylester (DEA), Dimethyl trans-1,4-cyclohexandicarboxylat (DMCH), Terephthalsäurediethylester (DETS) und Decandiol-dimethacrylsäureester (DDMAE) katalysieren. Vier Kandidaten hydrolysierten DEA und DMCH und ein Extrakt eignete sich zur Hydrolyse von DETS. Es folgten eine Testung auf Selektivität mittels Gaschromatographie mit gekoppeltem Flammenionisationsdetektor und eine affinitätschromatographische Reinigung der fünf Proteine. Dabei stellten sich die drei Kandidaten Alip2-6hp, 6h-Best1p und 6h-Best2p, eine putative Lipase und zwei putative Carboxylesterasen, als potenziell geeignete Kandidaten heraus.
Anschließend erfolgte die biochemische Charakterisierung der drei Proteine. Das Temperatur-Optimum der Enzyme lag zwischen 31 °C und 41 °C und das pH-Optimum zwischen 6,6 und 7,0. Die Metallionen Fe2+, Fe3+ und Cu2+ inhibierten alle drei Biokatalysatoren und auch die Zugabe verschiedener Lösungsmittel verringerte ihre Aktivität. Die Untersuchung des Substratspektrums mit p-Nitrophenylestern mit Kettenlängen von C2 bis C18 zeigte eine Präferenz von Alip2-6hp für mittelkettige pNP-Ester mit einem Maximum bei pNP-Caproat und von 6h-Best1p und 6h-Best2p für kurzkettige pNP-Ester mit einem Maximum bei pNP-Acetat. 6h-Best1p und 6h-Best2p zeigen damit das für Carboxylhydrolasen typische Substratspektrum. Da Lipasen üblicherweise langkettige Substrate bevorzugen, wurde die Klassifizierung für Alip2-6hp mittels Tween 20- und Olivenöl-Agarplattentest weiter untersucht. Das positive Ergebnis dieser Untersuchung lässt auf eine Lipase schließen.
Zur Bestimmung der Selektivität der Enzyme wurde die Hydrolyse von DEA und DMCH zeitlich per GC-FID verfolgt. Nach Derivatisierung der Carboxylgruppen war die quantitative Auswertung zum Gehalt an Monoester, Diester und Disäure möglich. Es ließ sich damit die Hydrolyse von DEA mit 6h-Best1p bestätigen. Bessere Ergebnisse wurden mit Alip2-6hp für das Substrat DMCH erzielt und mit Abstand die schnellste Hydrolyse wurde mit DEA als Substrat erreicht. In gereinigter Form hydrolysierte Alip2-6hp das Substrat DEA selektiv zu MEA, sodass bis zu 96 % Monoester synthetisiert werden konnten. Im Vergleich dazu wird MEA deutlich langsamer hydrolysiert.
Zusätzlich wurden fünf unterschiedliche Formulierungen des Enzyms Alip2-6hp mit dem Substrat DEA getestet: (1) Rohextrakt, (2) freies, gereinigtes Enzym, (3) immobilisiertes, gereinigtes Enzym (Beads) und als Ganzzellkatalysatoren (4) permeabilisierte (Triton-) Zellen und (5) permeabilisierte, immobilisierte (Triton-) Zellen. Die vielversprechendsten Ergebnisse wurden mit isoliertem gereinigtem Enzym erzielt. DEA wurde vollständig und spezifisch zu MEA umgesetzt.
Zur Gewährleistung einer ausreichenden Verfügbarkeit der Enzyme erfolgte die Kultivierung der Überexpressionsstämme im Fermenter im Fed-batch. Der Alip2-6hp produzierende Hefestamm erbrachte Aktivitäten von 674 U L-1, während der 6h-Best2p Überexpressionsstamm 2239 U L-1 produzierte.
Genome-wide responses and regulatory mechanisms to thiol-specific electrophiles in Bacillus subtilis
(2008)
The soil-dwelling bacterium Bacillus subtilis is regarded as model organism for functional genomic research of low GC Gram-positive bacteria. Recently, the group of Haike Antelmann has monitored the expression profile of B. subtilis after exposure to phenolic compounds. Interestingly, proteome and transcriptome analyses showed a strong overlap in the expression profile after exposure to catechol, MHQ that auto-oxidized to quinones and the thiol-reactive electrophile diamide. The response to electrophilic quinones and diamide is governed by a complex network of transcription factors, including Spx, CtsR, PerR, CymR and the novel MarR-type repressors MhqR (YkvE), YodB and YvaP. The regulatory mechanisms of these novel thiol-stress sensors YodB and YvaP are studied as part of this thesis in collaboration with the group of Peter Zuber (Oregon). YodB negatively regulates the expression of the nitroreductase YodC and the azoreductase YocJ (AzoR1) after exposure to electrophilic quinones and diamide. The azoreductase AzoR1 is a paralog of AzoR2 that is under control of MhqR. Both paralogous azoreductases (AzoR1 and AzoR2) have common functions in quinone and azo-compound reduction to protect cells against the thiol reactivity of electrophiles. DNA binding activity of YodB is directly inhibited by thiol-reactive compounds in vitro. Mass spectrometry approaches suggested that YodB is regulated by a thiol-(S)-alkylation mechanism in response to quinones. Mutational analyses revealed that the conserved Cys6 residue of YodB is required for optimal repression in vivo and in vitro. Recent studies further suggest that YodB is redox-regulated by intersubunit disulfide formation in vivo by diamide. In addition to the azoreductases, several thiol-dependent dioxygenases confer resistance to quinones. In collaboration with Kazuo Kobayashi (Nara), the YodB-paralogous MarR/DUF24-family regulator, YvaP was identified as repressor of the catechol-2,3-dioxygenase encoding yfiDE (catDE) operon. DNA binding activity of YvaP was also directly inhibited by quinones and diamide in vitro indicating that also YvaP is regulated via post-translational modifications. Mutational analyses showed that the conserved Cys7 is essential for YvaP regulation in vivo and serves as sensor for thiol-reactive compounds. In addition, also the basic amino acids K19, R20 are essential for YvaP repression in vivo as well as conserved basic arginine and lysine residues located in the DNA binding helix-turn-helix (HTH) motif. Non-reducing PAGE analysis suggests the formation of an intersubunit disulfide bond in a YvaP dimer upon treatment with quinones and diamide in vitro. Besides quinones, also aldehydes are electrophilic compounds which react via the thiol-(S)-alkylation reaction with thiols. Thus, we were also interested in the response of B. subtilis to the toxic electrophiles methylglyoxal (MG) and formaldehyde (FA). We analyzed the changes in the transcriptome and proteome of B. subtilis after exposure to MG and FA. Like quinone compounds, both MG and FA induce the thiol-specific stress response. Metabolomic approaches confirmed that these reactive aldehydes deplete the cellular thiol pool and thus act like quinones as another class of thiol-reactive electrophiles. Additionally, MG and FA also triggered responses to overcome DNA damage. Our studies further revealed the specific induction of two FA detoxification pathways regulated by the MarR/DUF24 family repressor HxlR, and the novel MerR/NmlR-type regulator YraB (AdhR). HxlR positively regulates the hxlAB operon encoding the ribulose monophosphate pathway. AdhR positively regulates an adhA-yraA operon that encodes the thiol-dependent formaldehyde dehydrogenase (AdhA) and the DJ1/PfpI-like cysteine proteinase (YraA), and the yraC gene that encodes a γ-carboxymuconolactone decarboxylase. Thus, the AdhR regulon is involved in the detoxification of FA to formate via the formaldehyde dehydrogenase AdhA which catalyzes the cleavage of S-hydroxymethylcysteine adducts. In addition, the cysteine proteinase YraA could be involved in the degradation of S-hydroxymethylcysteine-modified and damaged protein thiols. In collaboration with the group of John Helmann (Ithaca), it was shown that AdhR binds in vitro to a conserved inverted repeat between the -10 and -35 promoter elements upstream of adhA, yraB and yraC. In addition, we showed that the conserved Cys52 of AdhR is essential for aldehyde sensing and activation of adhA-yraA transcription in vivo. Thus, we speculate that redox regulation of AdhR involves thiol-(S)-alkylation of this Cys52 residue by aldehydes as another novel mechanism of bacterial physiology.
Allicin (diallyl thiosulfinate) is the major thiol-reactive organosulfur compound produced by garlic plants (Allium sativum) upon tissue damage. Allicin exerts its strong antimicrobial activity against bacteria and fungi via S-thioallylation of protein thiols and low molecular weight thiols. Here, we investigated the effect of allicin on SARS-CoV-2 infected Vero E6 and Calu-3 cells. Toxicity tests revealed that Calu-3 cells showed greater allicin tolerance, probably due to >4-fold higher GSH levels compared to the very sensitive Vero E6 cells. Exposure of infected Vero E6 and Calu-3 cells to biocompatible allicin doses led to a ∼60–70% decrease of viral RNA and infectious viral particles. Label-free quantitative proteomics was used to investigate the changes in the Calu-3 proteome after SARS-CoV-2 infection and the effect of allicin on the host-virus proteome. SARS-CoV-2 infection of Calu-3 cells caused a strong induction of the antiviral interferon-stimulated gene (ISG) signature, including several antiviral effectors, such as cGAS, Mx1, IFIT, IFIH, IFI16, IFI44, OAS, and ISG15, pathways of vesicular transport, tight junctions (KIF5A/B/C, OSBPL2, CLTCL1, and ARHGAP17) and ubiquitin modification (UBE2L3/5), as well as reprogramming of host metabolism, transcription and translation. Allicin treatment of infected Calu-3 cells reduced the expression of IFN signaling pathways and ISG effectors and reverted several host pathways to levels of uninfected cells. Allicin further reduced the abundance of the structural viral proteins N, M, S and ORF3 in the host-virus proteome. In conclusion, our data demonstrate the antiviral and immunomodulatory activity of biocompatible doses of allicin in SARS-CoV-2-infected cell cultures. Future drug research should be directed to exploit the thiol-reactivity of allicin derivatives with increased stability and lower human cell toxicity as antiviral lead compounds.
The function and mode of action of small regulatory RNAs is currently still understudied in archaea. In the halophilic archaeon Haloferax volcanii, a plethora of sRNAs have been identified; however, in-depth functional analysis is missing for most of them. We selected a small RNA (s479) from Haloferax volcanii for detailed characterization. The sRNA gene is encoded between a CRISPR RNA locus and the Cas protein gene cluster, and the s479 deletion strain is viable and was characterized in detail. Transcriptome studies of wild-type Haloferax cells and the deletion mutant revealed upregulation of six genes in the deletion strain, showing that this sRNA has a clearly defined function. Three of the six upregulated genes encode potential zinc transporter proteins (ZnuA1, ZnuB1, and ZnuC1) suggesting the involvement of s479 in the regulation of zinc transport. Upregulation of these genes in the deletion strain was confirmed by northern blot and proteome analyses. Furthermore, electrophoretic mobility shift assays demonstrate a direct interaction of s479 with the target znuC1 mRNA. Proteome comparison of wild-type and deletion strains further expanded the regulon of s479 deeply rooting this sRNA within the metabolism of H. volcanii especially the regulation of transporter abundance. Interestingly, s479 is not only encoded next to CRISPR–cas genes, but the mature s479 contains a crRNA-like 5′ handle, and experiments with Cas protein deletion strains indicate maturation by Cas6 and interaction with Cas proteins. Together, this might suggest that the CRISPR–Cas system is involved in s479 function.
The aquaculture industry has been consistently and successfully growing over the
years, supplying over 50% of the fish humans consume. A large part of this success is due
to the implementation of vaccination, which is by far the most reliable prophylactic method
in large-scale fish farming. Nonetheless, although recent fish vaccines have greatly
contributed to the development and sustainability of the aquaculture industry, they not
always offer sufficient protection to provide acceptable survival rates when infectious
diseases outbreaks occur. Therefore, infectious diseases and effective vaccines still
constitute major problems for aquaculture.
Different practical aspects and biological factors of fish have also contributed to the
unsuccessful outcome of fish vaccines. To date, many of the most effective vaccines for fish
are injectable, and their formulation includes aluminum or oil emulsion adjuvants. Both facts
constitute a major issue for animal welfare due to the stress and side effects they trigger.
Great strides have been made in innovative technologies for fish vaccines. However, as of
today, they are not available on the market. Thus, improvements in vaccine formulations and
delivery routes remain an open topic and leads the to-do list of science with the aquaculture
of the future.
Vaccination provides immunity against a determined pathogen, and this is inherent
to the immune system. Therefore, thorough knowledge about the fish immune system and
how it is influenced by internal and external factors will certainly support rational vaccine
design. Thereby, the immune responses triggered by a vaccine can be exhaustively
characterized, and the formulations improved in case it is needed.
Hence, the goal of this PhD thesis, is to provide knowledge to improve fish
vaccination, both in its formulation and in its efficacy, aiming to promote the rational design
of fish vaccines. Additionally, this work proposes a holistic view of fish, where the
physiology and culture conditions of the fish are the starting points for the development and
application of vaccines. Thus, concepts and considerations for rational vaccine design
specific for fish are presented here.
Article I of this thesis offers a comprehensive review on the current situation in
Chile, but also worldwide aquaculture and the challenges it must face in the future. Namely,
recurrent pathogenic outbreaks and sub-optimal levels of protection due to inefficient
vaccination. This article established an open and flexible ground upon which to reflect on
how and what to improve in fish vaccines, leading the efforts towards rational vaccine
design.
In Article II, we investigated whether the current most used vaccination route,
intraperitoneal, can be improved by reducing the side effects of adjuvants, replacing them
with in the vaccine formulations with Poly-(D,L-lactic-co-glycolic) acid (PLGA)
microparticles, that serve simultaneously as vaccine vehicle and adjuvants.
Article III summarizes the scientific literature about what is known about the teleost
thymus. From this, it became clear how external factors such as photoperiod and seasonality
can modulate this primary lymphatic organ, and probably, immune responses. These are
essential factors to consider if effective and protective vaccines are needed in species highly
influenced by the environment such as fish.
As discussed in Article III, fish are poikilotherm animals, highly sensitive to
environmental factors like light. In Article IV, we reported for the first time, light generates
daily rhythms in cells’ circulation and gene expression, entraining the trout immune
response. Therefore, “when” (time of the day) we stimulate fish matters in order to get
optimal immune responses. Article V provides valuable knowledge about what happens
with fish immune responses, against a bacterial agent, under constant cues like light/dark
cycles and temperature. Once again, “when” we stimulate fish (season), influences the fish
immune status and therefore, their immune responses.
Finally, Article VI reports, for the first time, leukocytes extracted from fins of trout
directly respond to a parasitic infection. This article supports the idea that further research
must be done on fish mucosal surfaces, since they are key to stimulating/vaccinating fish, as
they are a natural entry route for pathogens and modulate the immune responses mounted.
Overall, the information provided by these articles is highly relevant for the
aquaculture industry. Firstly, because the vaccine platform based on PLGA microparticles
is promising for the future of fish vaccination, harmful adjuvants can be avoided, while still
providing enhanced stimulation thanks to the timed-released capacity of the particles.
Additionally, they offer the possibility to adapt them to in-feed vaccine pellets, which is the
ideal delivery route for fish. Secondly, accurate vaccination protocols can be established;
vaccination should be done during daytime, and preferably during the morning, where the
physiological status of fish provide optimal conditions for induction of an ultimately
protective immune response after vaccination. Furthermore, vaccination should be done
during warm months, spring, or summertime, as apparently fish have free-run internal clocks
that negatively modulate adaptive immune responses during wintertime.
In summary, the present thesis provides a novel concept for vaccination of
aquacultured species based on new data for rational vaccine design, with optimal application
procedures based on the optimal timing (season and daytime), reduced stress by oral
application and considerations about improving “first-line defenses” by vaccination via
mucosal surfaces of gut or skin.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ausgehend vom nicht zytopathogenen (nzp) Wildtypvirus BVDV-2 Stamm 890 (v890WT) erstmalig ein infektiöser cDNA Volllängenklon (p890FL) konstruiert. In vitro synthetisierte RNA des Volllängenklons p890FL replizierte nach Transfektion in bovine Zellen autonom und aus dem Überstand transfizierter Zellkulturen konnte infektiöses Virus (v890FL) isoliert werden. Die in vitro Charakterisierung ergab ein ähnliches Wachstumsverhalten des rekombinanten Virus v890FL im Vergleich zum Wildtypvirus v890WT. Im Tierexperiment zeigte v890FL jedoch einen geringfügig attenuierter Phänotyp gegenüber dem Wildtypvirus v890WT. Mit Hilfe des nzp Volllängenklons p890FL konnte zudem gezeigt werden, dass auch ein nzp BVDV-2 -Stamm stabil messbare Mengen an freiem NS3-Proteins bilden kann, wie es bisher nur für zytopathogene (zp) BVDV Stämme beschrieben worden ist. Der Volllängenklon p890FL diente weiterhin als Basis für die Etablierung zweier Deletionsmutanten, p890dNpro und p890dC, welche sich jeweils durch eine partielle Deletion des Nichtstrukturproteins Npro bzw. durch eine partielle Deletion des Kapsidproteins C auszeichnen. Die Deletion der Autoprotease Npro resultierte in einem verminderten viralen Wachstum auf Interferon-kompetenten bovinen Zellen, auf Interferon-inkompetenten Zellen können jedoch mit dem rekombinanten Virus v890FL vergleichbare Titer erreicht werden. Die Deletion des Strukturproteins C resultierte in der Bildung eines sogenannten Replikons, die in vitro synthetisierte virale RNA von p890dC war zwar in der Lage nach Transfektion in bovinen Zellen autonom zu replizieren, jedoch können keine Virusnachkommen isoliert werden. Für die Generierung infektiöser Virusnachkommen (sogenannter „Pseudovirionen“) wurde das Replikon p890dC unter Verwendung der Helferzelllinie WT-R2 in trans komplementiert und zu (einmal infektiösen) Pseudovirionen verpackt. Beide Deletionsmutanten offerieren einen neuartigen Ansatz in der Etablierung von sicheren und effizienten BVDV-2 Vakzinen und stellen einen wichtigen Schritt bei der Entwicklung neuer BVDV-Impfstoffe dar. Der infektiöse cDNA Volllängenklon p890FL ist mit seiner 228 nt großen Insertion im NS2-kodierenden Bereich zudem ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung von Insertionen im NS2/3 und dem Verständnis für die Ursachen der Zytopathogenität von Pestiviren.
Hantaviren gehören zu den „Emerging Viruses“ mit einer weltweiten Verbreitung. Sie sind Erreger von Zooanthroponosen und werden von Nagetieren auf den Menschen übertragen. Humane Hantavirusinfektionen können je nach Erreger schwerwiegende Erkrankungen mit einer Letalitätsrate von bis zu 50 % hervorrufen. In den Jahren 2004/2005, 2007 und auch in diesem Jahr wurde in einer Reihe europäischer Staaten, einschließlich Deutschland, ein deutlicher Anstieg der Zahl der humanen Hantavirusinfektionen beobachtet. In Deutschland waren hauptsächlich Baden-Württemberg, Bayern, Niedersachsen und Nordrhein-Westfalen betroffen. Zu den Risikogruppen zählen Personen, welche aufgrund ihres Berufes in engen Kontakt zu dem Reservoirwirt und dessen Ausscheidungs¬produkten kommen und somit auch gegenüber den Viren besonders exponiert sind. Die Hanta¬virus¬diagnostik basiert größtenteils auf serologischen Nachweismethoden wie Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) und Western Blot-Tests. Um humane Hantavirusinfektionen in Deutschland mit hoher Sensitivität und Spezifität zu diagnostizieren, wurden in dieser Arbeit serologische Testverfahren für die in Europa vorkommenden Hantaviren Dobrava-Belgrad-Virus (DOBV), Puumalavirus (PUUV) und Tulavirus (TULV) etabliert und validiert. Weiterhin wurden Protokolle zur Durchführung seroepidemiologischer Studien und für den Einsatz der neuen Testsysteme in der Diagnostik entwickelt. Gemäß dieser Protokolle wurden die Tests bei seroepidemiologischen Untersuchungen eingesetzt und lieferten Auf¬schluss über die Hantavirusprävalenz in verschiedenen Bevölkerungsgruppen in unter¬schiedlichen Gebieten Deutschlands. Auf der Basis Hefe exprimierter Nukleokapsidproteine (N-Proteine) von PUUV, Stamm Vranica-Hällnäs (PUUV-Vra) und Stamm Niederbayern (PUUV-Bava), DOBV, Stamm Slovenia (DOBV-Slo), und TULV, Stamm Moravia wurden ELISA und Western Blot-Tests zum Nachweis von humanen IgM- und IgG-Antikörpern entwickelt. Die Validierung mit deutschen und internationalen Seren ergab für die neuen Tests eine Sensitivität zwischen 94 % und 100 % und eine Spezifität von 96-100 %. Bei der Validierung der Tests mit Seren aus Finnland erreichte die Sensitivität 89-100 % und die Spezifität 95-100 %. Der Anteil an Seren, bei denen keine eindeutige Einteilung in „reaktiv“ oder „nicht reaktiv“ erfolgen konnte, lag bei maximal 2,7 %. Die indirekten DOBV-Slo- und PUUV-Vra-IgG/IgM-ELISA und Western Blot-Tests wurden durch INSTAND e.V. im März, September 2009 und April, September 2010 zertifiziert. Die TULV spezifischen Tests konnten aus Mangel an Referenztests und damit fehlender Referenzseren nicht validiert werden. Für die epidemiologischen Studien wurde das indirekte ELISA-Format eingesetzt, da das capture ELISA-Format in seiner diagnostischen Sensitivität schlechter als das indirekte Format abgeschnitten hatte. Die jeweiligen Western Blot-Tests und Immunfluoreszenztests dienten als Bestätigungstest. Die seroepidemiologische Studie bei 484 humanen Serumproben aus einem PUUV-Endemiegebiet in Niedersachsen zeigte eine Hanta-virusprävalenz von 7 %. Dieser Wert entspricht etwa dem Vierfachen der durchschnitt¬lichen Prävalenz des gesamten Bundesgebietes (1-2 %). Die Untersuchung von 178 Personen aus einem PUUV-Ausbruchsgebiet in Bayern ergab eine Hantavirusseroprävalenz von etwa 11 %. Interessanterweise waren 40 % der positiv getesteten Seren aus¬schließlich mit dem TULV-Antigen reaktiv. Es wurden auch die Seren von 208 in Bayern statio¬nierten Soldaten untersucht. Obwohl diese zu einer der Risikogruppen gehören, lag die Hantavirusprävalenz lediglich bei 2 %. Dagegen ergab eine Studie bei Wald¬arbeitern aus Branden¬burg dass 9 % der 563 ge¬testeten Personen Hantavirus spezifische Antikörper besaßen. Von diesen waren 43 % aus¬schließlich in den TULV-Tests reaktiv und 33 % reagierten exklusiv mit dem DOBV-Slo-Antigen. Eine ¬epidemiologische Studie bei Primaten aus dem deutschen Primatenzentrum in Göttingen zeigte, dass 12 % von den 251 getesteten Tieren mit mindestens einem der verwen¬deten Antigene reagierten. Dies stellt den ersten Nachweis von natürlichen Hantavirusinfektionen bei Primaten dar. Die Ergebnisse der epidemiologischen Studien zeigen die Bedeutung der Verwendung „homologer“ Antigene für eine hochsensitive serologische Diagnostik. Aus diesem Grund sollte zukünftig das PUUV-Bava Antigen für den serologischen Nachweis von Hantavirusinfektionen in Deutschland eingesetzt werden. Die epidemiologische Bedeutung des TULV muss weiter erforscht werden. Daher sollten bei zukünftigen epidemiologischen Studien die jeweiligen Serumproben auch auf TULV reaktive Antikörper untersucht werden. Mit den hier entwickelten serologischen Testverfahren wird es zukünftig möglich sein, Hantavirusinfek¬tionen mit hoher Sensitivität und Spezifität zu diagnostizieren.
Gallic acid, protocatechuic acid, catechol, and pyrogallol are only a few examples of industrially relevant aromatics. Today much attention is paid to the development of new microbial factories for the environmentally friendly biosynthesis of industrially relevant chemicals with renewable resources or organic pollutants as the starting material. The non–conventional yeast, Blastobotrys raffinosifermentans, possesses attractive properties for industrial bio-production processes such as thermo- and osmotolerance. An additional advantage is its broad substrate spectrum, with tannins at the forefront. The present study is dedicated to the characterization of catechol-1,2-dioxygenase (Acdo1p) and the analysis of its function in B. raffinosifermentans tannic acid catabolism. Acdo1p is a dimeric protein with higher affinity for catechol (KM = 0.004 ± 0.001 mM, kcat = 15.6 ± 0.4 s–1) than to pyrogallol (KM = 0.1 ± 0.02 mM, kcat = 10.6 ± 0.4 s–1). It is an intradiol dioxygenase and its reaction product with catechol as the substrate is cis,cis-muconic acid. B. raffinosifermentans G1212/YIC102-AYNI1-ACDO1-6H, which expresses the ACDO1 gene under the control of the strong nitrate-inducible AYNI1 promoter, achieved a maximum catechol-1,2-dioxygenase activity of 280.6 U/L and 26.9 U/g of dry cell weight in yeast grown in minimal medium with nitrate as the nitrogen source and 1.5% glucose as the carbon source. In the same medium with glucose as the carbon source, catechol-1,2-dioxygenase activity was not detected for the control strain G1212/YIC102 with ACDO1 expression under the regulation of its respective endogenous promoter. Gene expression analysis showed that ACDO1 is induced by gallic acid and protocatechuic acid. In contrast to the wild-type strain, the B. raffinosifermentans strain with a deletion of the ACDO1 gene was unable to grow on medium supplemented with gallic acid or protocatechuic acid as the sole carbon source. In summary, we propose that due to its substrate specificity, its thermal stability, and its ability to undergo long-term storage without significant loss of activity, B. raffinosifermentans catechol-1,2-dioxygenase (Acdo1p) is a promising enzyme candidate for industrial applications.