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Während des Replikationszyklus der Herpesviren vermittelt ein heterodimerer Proteinkomplex, welcher als nuclear egress complex (NEC) bezeichnet wird, den Transport neu synthetisierter Nukleokapside vom Zellkern ins Zytoplasma. Ziel dieser Arbeit war es, die molekularen Grundlagen des viralen Kernaustritts weiter aufzuklären und funktionelle Domänen in den NEC-Komponenten, welche beim Pseudorabies Virus als pUL31 und pUL34 bezeichnet werden, zu ermitteln. Bereits durchgeführte Analysen konnten zeigen, dass die Transmembrandomäne des pUL34, die für die Verankerung des NEC an der Kernmembran verantwortlich ist, bei HSV-1 und PrV durch heterologe Sequenzen ausgetauscht werden kann, ohne dass dabei die Proteinfunktion während des viralen Kernaustritts inhibiert wird. Beim PrV pUL34 kann sogar eine Substitution der 50 C-terminalen Aminosäuren toleriert werden, wohingegen die Substitution 100 C-terminaler Aminosäuren zum Funktionsverlust des Proteins führt. Zur Identifikation möglicher funktioneller Domänen im C-Terminus des PrV pUL34 wurde das Protein in der vorliegenden Arbeit zwischen 50 und 100 C-terminalen Aminosäuren schrittweise verkürzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine Deletion von 85 C-terminale Aminosäuren keine Beeinträchtigung der Proteinfunktion verursachte, wohingegen die weitere Deletion und Substitution von 90 Aminosäuren den viralen Kernaustritt blockierte. Somit konnte ein funktionell wichtiger Bereich des Proteins auf die Aminosäuren 172 bis 176 eingegrenzt werden. In dieser Region befindet sich die Sequenz 173RQR175, die einem RXR-Motiv entspricht, das als Signalsequenz für den Transport von Membranproteinen an die innere Kernmembran beschrieben wurde. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Analyse konnte jedoch zeigen, dass es sich hierbei um ein Arginin basierendes ER-Lokalisierungssignal handelt, welches die Anreicherung von Proteinen im endoplasmatische Retikulum (ER) und der damit verbundenen Kernmembran vermittelt. Neben der konservierten C-terminalen Hälfte des PrV pUL34 wurde in dieser Arbeit auch der N-Terminus analysiert. Bereits durchgeführte Studien beim PrV pUL34 ergaben dabei, dass die ersten 161 Aminosäuren für die Interaktion mit pUL31 und damit für die NEC-Bildung verantwortlich sind. In der vorliegenden Arbeit konnte die pUL31-Interaktionsdomäne auf den Bereich von Aminosäure 5 bis 161 eingegrenzt werden. Zur Analyse wichtiger Aminosäuren oder Motive innerhalb der Interaktionsdomäne beim PrV pUL34 wurden in der vorliegenden Arbeit gezielt konservierte Aminosäuren zu Alanin ausgetauscht und die Auswirkungen auf die Bildung des NEC und der Funktion während einer Infektion analysiert. Dabei konnten zwei konservierte Motive identifiziert werden, die für die NEC-Bildung wichtig sind. Zum Einen wurde ein Motiv bestehend aus einer Glutaminsäure (E) und einem Tyrosin (Y) (EY-Motiv) detektiert, welches bereits in anderen pUL34-Homologen als essentiell für die Bildung eines funktionellen NEC beschrieben wurde. Für ein zweites Motiv bestehend aus einem Asparagin (N), einem Threonin (T) und einem Glycin (G) (NTG-Motiv) zeigte sich, dass N und G für die Funktion des NEC wichtig sind. Zusätzlich zu diesen beiden Motiven konnte ein konserviertes Asparagin an Position 103 identifiziert werden, welches zwar nicht für die Bildung des NEC benötigt wird, aber für die Funktion während des Kernaustritts essentiell ist. In dieser Arbeit wurde auch die zweite Komponente des NEC, das pUL31, untersucht. Dabei konnte die Funktion eines vorhergesagten Kernlokalisierungssignals (nuclear localization signal, NLS) im N-Terminus des Proteins bestätigt werden. Außerdem wurde ein Kernexportsignal (nuclear export signal, NES) identifiziert, welches eine wichtige Rolle bei der Knospung der Nukleokapside an der inneren Kernmembran während des Kernaustritts spielt. Hierfür wurden in dieser Studie die entsprechenden Bereiche im N- bzw. C-Terminus von pUL31 deletiert, was die Bildung eines funktionellen NEC und somit den Transport der Kapside aus dem Kern verhinderte. Ausgehend von vorherigen Untersuchungen am PrV pUL31, kann dabei spekuliert werden, dass der Bereich des NLS im N-Terminus neben der Lokalisierung im Zellkern möglicherweise auch für eine Funktion bei der Oligomerisierung von NECs bzw. pUL31-Molekülen wichtig ist. Der Bereich im C-Terminus, welcher das NES beinhaltet, scheint hingegen für die Komplexbildung mit pUL34 relevant zu sein. Zusammenfassend führten die hier durchgeführten Analysen in den beiden NEC-Komponenten pUL31 und pUL34 zu einem besseren Verständnis der molekularen Grundlagen des herpesviralen Kernaustritts. Da es bisher noch nicht gelungen ist eine Kristallstruktur des NEC zu ermitteln, sind Mutagenesestudien eine wichtige Methode funktionelle Domänen zu identifizieren. Die Aufklärung der NEC-Struktur kann in Kombination mit den bereits durchgeführten Mutagenesestudien das Verständnis der Funktion dieses Komplexes weiter komplettieren.
Influenzaviren zählen zu den gefährlichsten Infektionserregern, die im Menschen weltweit schwere respiratorische Erkrankungen auslösen. Von großer Relevanz sind allerdings auch Reservoirwirte, in denen die Infektionen häufig mild verlaufen, aber durch Mutationen und Reassortierung einzelner Genomsegmente neue, potentiell auch humanpathogene Influenzaviren entstehen können. Die im Jahre 2009 aufgetretene humane Influenzapandemie, welche durch ein H1N1 „swine origin“ Influenza A Virus (SoIV) ausgelöst wurde, verdeutlichte die besondere Bedeutung porziner Reservoirwirte. Da Schweine sowohl für aviäre als auch humane Influenza A Viren empfänglich sind, wird ihnen eine wichtige Rolle als „mixing vessel“ für die Entstehung neuer Influenzaviren zugeschrieben. Aufgrund vielversprechender Entwicklungen auf dem Gebiet der Lebendvirus-Vektor-Vakzine war es das Ziel dieser Arbeit, einen neuartigen Vektor-Impfstoff für Schweine gegen das pandemische H1N1 SoIV auf der Basis eines attenuierten porzinen Virus zu generieren. Da das Pseudorabies Virus (PrV) nicht humanpathogen ist und in seinem natürlichen Wirt, dem Schwein, hervorragend repliziert, eignete es sich besonders für die Entwicklung eines rekombinanten Vektor-Impfstoffs. Hierzu wurde der bewährte Impfstamm PrV-Bartha genetisch so verändert, dass anstelle des nicht essentiellen herpesviralen Glycoproteins gG immunogene Influenzavirusproteine wie die Hüll-Glykoproteine Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA), aber auch das Nukleoprotein (NP) und die Matrixproteine (M1 und M2) des pandemischen H1N1 SoIV exprimiert werden. Die Expression erfolgte unter der Kontrolle des humanen oder murinen Cytomegalievirus immediate-early Promotors, wobei sich letzterer als stärker erwies. Durch Insertion eines synthetischen Introns in der 5´-nicht-translatierten Region konnte die Expression der Transgene weiter gesteigert werden. Zu einer substantiellen Verbesserung der Expression führte die Insertion synthetischer HA- (synH1) und NA-Gene (synN1), deren Sequenzen an die Codon-Präferenzen von PrV angepasst waren. In tierexperimentellen Studien wurde gezeigt, dass sowohl die optimierte HA- (PrV-BaMI-synHI), als auch die optimierte NA-exprimirende PrV-Rekombinante (PrV-BaMI-synN1) nach intramuskulärer prime-boost Vakzinierung sieben Wochen alter Saugferkel deutlich höhere Antigen-spezifische Antikörpertiter induzierte als eine intranasale Infektion mit H1N1 SoIV. Auch die ein- bzw. zweimalige intranasale Impfung mit PrV-BaMI-synH1 führte in allen Tieren zur Bildung HA-spezifischer Serumantikörper, allerdings in deutlich geringen Mengen. In allen Fällen führte die 3 Wochen nach Erstimmunisierung durchgeführte Auffrischungsimpfung zu einem beträchtlichen Anstieg der HA- bzw. NA-spezifischen Antikörpertiter. In durchflusszytometrischen Analysen peripherer Blutlymphozyten konnte ebenfalls eine vermehrte Aktivierung und Proliferation von B-Zellen zu Antikörper-produzierenden Plasmazellen nach der Auffrischungsimpfung beobachtet werden. Außerdem wurde festgestellt, dass die durch PrV-BaMI-synN1 induzierte NA-spezifische Immunantwort deutlich später einsetzte als die durch PrV-BaMI-synH1 vermittelte HA-spezifische Reaktion. Versuchstiere, die gleichzeitig mit PrV-BaMI-synH1 und PrV-BaMI-synN1 geimpft wurden, entwickelten sowohl HA- als auch NA-spezifische Antikörper zu vergleichbaren Titern wie mit den einzelnen Viren immunisierte Tiere. Drei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden alle mit PrV-BaMI-synH1 und/oder PrV-BaMI-synN1 geimpften Schweine sowie mit dem leeren Vektor PrV-Bartha vakzinierte und naive Kontrolltiere einer Belastungsinfektion mit dem pandemischen H1N1 SoIV A/California/7/09 unterzogen. Beide potentiellen Vektor-Impfstoffe verhinderten die Ausbildung klinische Symptome und hemmten die Replikation und Ausscheidung des Belastungsvirus signifikant, wie real-time RT-PCR Analysen von Nasentupferproben zeigten. Allerdings war die durch intramuskuläre prime-boost Vakzinierung mit PrV-BaMI-synN1 bewirkte Reduktion der Viruslast deutlich geringer als die mit PrV-BaMI-synH1. Die kombinierte intramuskuläre Applikation beider Vektor-Vakzine zeigte keine additiven Effekte, sondern eine ähnliche Schutzwirkung wie PrV-BaMI-synH1 allein. Während die zweimalige intramuskuläre Immunisierung mit PrV-BaMI-synH1 oder beiden Viren die Übertragung des Belastungsvirus auf naive Kontakttiere zwar erheblich verzögerte, aber nicht verhinderte, wurde dieses Ziel durch eine zweimalige intranasale Immunisierung mit PrV-BaMI-synH1 erreicht. Die RNA-Analysen der Tupferproben zeigten dabei eine fast vollständige Inhibition der Belastungsvirusreplikation, obwohl die HA-spezifischen Antikörper in diesen Tieren weitaus geringer waren als in intramuskulär geimpften Versuchstieren. Auch im Vergleich zu einer einmaligen intranasalen Vakzinierung reduzierte die intranasale Auffrischungsimpfung mit PrV-BaMI-synH1 die Replikationsdauer und die nachweisbaren Mengen des H1N1 SoIV erheblich.
Der Kernaustritt der Nukleokapside stellt einen essentiellen Schritt im Replikationszyklus der Herpesviren dar. Aufgrund seiner Größe kann das Kapsid den Kern nicht durch die Kernporen verlassen, sondern wird durch die Kernmembranen transportiert. Die viralen Proteine pUL34 und pUL31 bilden den NEC (nuclear egress complex), der virale und zelluläre Kinasen an die Kernmembran rekrutiert. Diese phosphorylieren die Lamine, wodurch sich die Lamina partiell auflöst und das Nukleokapsid Zugang zur Kernmembran erhält. Die Deletion einer oder beider Komponenten des NEC bewirkt zwar eine deutliche Reduktion der viralen Titer, jedoch wird eine geringe Menge infektiöser Nachkommenviren freigesetzt, die für eine Reversionsanalyse genutzt wurde. Dafür wurde zuerst das UL34-negative Virus und später auch das UL31-negative Virus, auf Kaninchennierenzellen (RK13) seriell passagiert, bis im Überstand Wildtyp-ähnliche Titer erreicht wurden. Aus diesen Überständen wurden Virusmutanten isoliert, die ohne den NEC effizient replizierten und als PrV-ΔUL34Pass bzw. PrV-ΔUL31Pass bezeichnet wurden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die passagierten Viren nicht mehr wie der PrV-Wildtyp durch die Kernmembran transportiert, sondern durch eine partiell aufgelöste Kernmembran ins Zytoplasma freigesetzt wurden. Das Ziel dieser Arbeit war zu untersuchen, wie die Freisetzung der Kapside aus dem Kern ohne den essentiellen NEC abläuft. Um zu ermitteln, welche viralen Proteine für die Auflösung der Kernmembran von Bedeutung sein könnten, wurde zunächst das komplette Genom von PrV-ΔUL34Pass sequenziert und mit dem des Wildtyps (PrV-Ka) und der nicht passagierten UL34-Deletionsmutante (PrV-ΔUL34) verglichen. Die mutierten Gene wurden anschließend in PrV-ΔUL31Pass sequenziert. Zu den sieben Genen, die in beiden passagierten Viren verändert sind, gehören u.a. UL21, UL26, UL46 und UL49. Jedoch konnte durch Deletion der einzelnen mutierten Gene nicht geklärt werden, welches Genprodukt für die Kernmembran-Fragmentierung in PrV-ΔUL34Pass- oder PrV-ΔUL31Pass infizierten Zellen bzw. für die Stabilisierung der Kernmembran während der Wildtyp-Infektion verantwortlich ist. Mit Hilfe von Inhibitorstudien wurde untersucht, welche zellulären Prozesse von den passagierten Viren manipuliert werden könnten, um die Kernmembran-Fragmentierung zu induzieren. Der Cdk (Cyclin dependent kinase) 1, Cdk2 und Cdk5-Inhibitor Roscovitin, der in höheren Dosen auch ERK1/2 (extracellular regulated kinase 1/2) hemmt, reduzierte die Titer der passagierten Viren deutlich, während der PrV-Wildtyp kaum beeinflusst wurde. Einen ähnlichen Effekt konnte auch mit einem Inhibitor für die ERK1/2 vorgeschaltete Kinase MEK1/2 (mitogen activated protein kinase/ERK kinase 1/2) erzielt werden. Spezifische Inhibitoren von ERK1/2, Cdk1, Cdk2 oder Cdk5 zeigten jedoch keinen spezifischen Einfluss auf die passagierten Virusmutanten oder den Wildtyp. Zur selben Zeit konnte eine andere Arbeitsgruppe zeigen, dass das Varizella Zoster Virus pUL46 Homolog ORF12 die Aktivierung von ERK1/2 induziert (Liu et al., J. Virol. 86, 2012). Basierend auf dieser Studie wurde untersucht, ob PrV pUL46 ebenfalls ERK1/2 aktivieren kann und ob diese Aktivierung für die Auflösung der Kernmembran von Bedeutung ist. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl PrV-Wildtyp als auch PrV-ΔUL34Pass pUL46 ERK1/2 und die entsprechenden Zielgene aktivierte. Die Deletion von UL46 aus dem Genom der passagierten Viren resultierte außerdem in einem deutlich höheren Anteil von Zellen mit einer fragmentierten Kernmembran, wobei dies nicht ausschließlich auf die Aktivierung von ERK1/2 durch pUL46 zurückgeführt werden kann, da sich die beiden passagierten Viren in ihrem ERK-Aktivierungspotential unterscheiden. Während PrV-ΔUL31Pass ERK1/2 vergleichbar zum Wildtyp induzierte, war die Aktivierung durch PrV-ΔUL34Pass deutlich geringer. Diese Abweichung lässt sich nicht auf die unterschiedlichen pUL46-Proteine der beiden passagierten Virusmutanten zurückführen, da der Austausch der jeweiligen UL46 Sequenzen gegen Wildtyp UL46 das ERK1/2-Aktivierungsmuster nicht veränderte. Somit scheint pUL46 einen Einfluss auf die Stabilität der Kernmembran und die Aktivierung von ERK zu haben. Beide passierte Viren bilden verstärkt Synzytien im Vergleich zum PrV-Wildtyp oder den nicht-passagierten Vorläufern aus. Um zu untersuchen, ob diese Deregulierung der Membranfusion auch die Kernmembranen betrifft und möglicherweise eine Ursache für die Fragmentierung sein könnte, wurden die Glykoproteine gB und gH aus den Genomen der passagierten Virusmutanten deletiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen sowie Untersuchungen von Replikationsverhalten und Plaquebildung ergaben, dass die Fragmentierung der Kernmembran auch in Abwesenheit von gB oder gH stattfindet. Dagegen sind beide Glykoproteine, wie auch im PrV-Wildtyp, für die Virusreplikation essentiell.
Herpesviren weisen einen komplexen Replikationszyklus auf, innerhalb dessen die einzelnen Schritte der Morphogenese der Nachkommenviren in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten ablaufen. Während die Kapsidmorphogenese und Genomverpackung im Zellkern der infizierten Zelle stattfinden, erfolgt die weitere Reifung zu infektiösen Virionen im Cytoplasma. Voraussetzung hierfür ist ein als nuclear egress bezeichneter Prozess, durch den die Kapside mittels eines envelopment-deenvelopment-Mechanismus an der Kernhülle Zugang zum Cytoplasma erhalten. Zielstellung der vorliegenden Arbeit war, mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie eine geeignete live-cell imaging-Methodik zu entwickeln, mit der der Transport der Kapside durch die Kernhülle dargestellt werden konnte, um die Dynamik dieses Prozesses aufzuklären.